JPH05501107A - 画像用放射標識抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 画像用放射標識抗体 本発明は、画像用の放射標識抗体又は他の蛋白様物質に関するものである。

さらに明確に言えば、本発明はヒトを含む哺乳類の血栓のシンチグラフィー検出 と関連するものである。しかしながら、血栓の検出を容易にするために開発され た物質又は方法は、腫瘍など他の結像に対しても有用性があると考えられる。

シンチグラフィー又は治療に応用するため、抗体に関する様々な蛋白を放射性金 属イオンで標識することは既に提案されている。テクネチウム−９９ｍはその有 利な物理的特性のために、これで標識されてきた。特定の抗体に対して生じるモ ノクローナル抗体を使用することに、特に関心が寄せられてきた。放射性金属イ オンでこのような抗体を標識すると、その抗原に特異的に局在するので、診断又 は治療の道具としてそのような抗体抱金物（ＣｏｎｊＢａｔｅ）を使用すること ができる。

ジチオトレイトール（ＤＴＴ）のようなジスルフィド結合還元剤を使用して抗体 のスルフヒドリル基を露出し、テクネチウム−９９ｍに結合する。テクネチウム −９９ｍによる抗体の特異的標識が記述されている（例えばヨーロッパ特許明細 １第０−２３７１５０号及び特許協力条約明細１綽０８８１０７３８２参照）。

しかしながら、経済的で、簡単かつ容易に実施でき、しかも適当な放射性核種に よる標識が可能な適切な媒体を提供でき、その媒体が比較的迅速かつ効果的に血 清部位に選択的に位置し、それによって有効な画像ができるような、新しく有用 な方法及び製品を開発する必要性があると考えられる。

本発明は、この分野において少なくとも新しく有用な、公知提案の代替法を提供 するための開発に関するものである。

本発明の一態様によれば、ヒトを含む哺乳類の血栓のシンチグラフィー検出用キ ットを作製する方法を提供するものであり、その工程は、血清に対して特異的に 向けられた物質を取得し、なお該物質は蛋白様物質、モノクローナル抗体、単一 ドメイン抗体、或いはモノクローナル抗体又は単一ドメイン抗体のエピトープ結 合フラグメントからなる群のものであり、そして該物質をチオール化剤により抱 合し、それにより許容しうる放射性核種による標識に適合する、抱合された物質 が提供されることを含むものである。

少なくとも本発明の幾つかの実施態様を用いれば、チオール化剤との抱合により 、高水準の標識効率を提供することが可能で、それによって最も有効な血栓検出 用キットを作製できることがわかった。　１００ｇとという高い標識効率が可能 である。

驚くべきことには、少なくとも本発明の好ましい実施態様では、効果的かつ迅速 に優先的に血栓に局在する、標識抗体又はフラグメントが製造されることがわが っな。

これは効果的なシンチグラフィー画像を非常に容易にする。

モノクローナル抗体はＭａｂ　３　Ｂ６／２２　（３８６）が好ましい。

モノクローナル抗体３Ｂ６は、ヒト架橋フィブリンのＤ−二量体（ＤＤ）エピト ープを認識する。モノクローナル抗体３Ｂ６は、オーストラリア、クインズラン ド、ブリスベンのＡＧＥＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ１社から入手でき、オーストラ リア特許第５７２，１２５号に記述されている。

１１＋ｍ７ｃ（テクネチウム−９９ｍ　）は、１４０　ＫｅＶの純粋なガンマ線 エミッターであることや半減期が短いことなど都合のよい物理的特性を持ち、し かも容易に利用できるため、好ましい放射性核種である。しかしながら、レニウ ムなど他の放射性核種も使用することができる。レニウムには幾つかの同位体、 即ち１８６　、１８８．１８９及び１９１があり、またベータ線及びガンマ線の エミッターであって、化学的特性がテクネチウム−９９−と類似していることか ら、蛋白担体に抱合させて使用するには有望である。レニウム−蛋白抱合体は治 療に有用である。

本発明は、適当なモノクローナル抗体のＦ　ａｂ’　フラグメントを使用して、 有利に実施できることがわかった。

本Ｆ　ａｈ’　フラグメントは以下の様に作製できる。

（ｉ）抗体をペプシン消化してＦ（ａｂ’）２フラグメントを製造し、次に（ｉ ｉ）ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の様な適当な還元剤で該フラグメントを還元 し、Ｆ　ａｂ’　フラグメントを製造する。この工程は、内部のチオール化され た基を活性化し、次の処理が受入れやすい基にすると考えられる。しかしながら 、ＤＴＴを使用しなくても還元を実施することができる。　ＤＴＴのような還元 剤を使用して、Ｆ（ａｂ’）ｚの様なフラグメントのジスルフィド結合を還元す ると、より小さいフラグメントＦ　ａｂ’　が得られるが、これは可逆的な処理 であることをここで指摘しておく。

対照すると、本発明はチオール化剤を使用しており（ＤＴＴの様な薬剤で還元す る予備工程の有無にかかわらず）、最も重要なことは、千オール化剤の使用はＦ 　ａｂ’　フラグメントが再結合してＦ　（ａｂ’　）２になるのを抑制又は防 止するのに特に有益であることがわかったことである。さらに抗体のチオール化 Ｆ　ａｂ’　フラグメントを使用すると、標識効率が増大することがわかった。

さらに、ＤＴＴのような薬剤を用いる最初の還元工程は不必要であることがわか った。

還元剤としてのジチオトレイトールの使用、チオール死刑処理及び標識抗体の最 終的精製の後、放射標識抗体の分析を行い、テクネチウム組み込みの程度及び抗 体の免疫反応性に対する影響を還元剤の濃度の関数としてめた。還元剤／抗体モ ル比１２：１で高水準のテクネチウム組み込みが生じた。標識組み込み増加はた ぶん、抗体ヒンジ部周囲のジスルフィド結合の還元に反映される。

比較的低い濃度の還元剤を使用すれば、本処理は抗体の免疫反応性にほとんど影 響を与えない。

本発明の好ましい実施態様は、標識増大による抗体のＦ　ａｂ’　フラグメント の使用にあるが、本発明は抗体ならびに、そのＦ（ａｂ’）２を含む他のフラグ メントの標識にまで及ぶものである。塞栓障害などの血管系の問題を扱う場合、 シンチグラフィーにはＦ　（ａｂ’　＞２フラグメントが最良の成績を示すと信 じられている。Ｆａｂ’　フラグメントのサイズは比較的小さく、血液クリアラ ンスが迅速であるとともに直情穿通も可能で、シンチグラフィー検出に適する、 優れた標的−血液比を与える。

特に、Ｆａｂ’　フラグメントが使用される場合は、チオール化剤ＤＬ　Ｎ−ア セチルホモシスティン−チオラクトンを使用することが好ましい。

本発明の好ましい実施態様には、例えば、放射性核種標識グルコン酸塩を使用し てチオール化抗体又は還元フラグメントの標識を交換することが、続いて、例え ば、ゲルカラムクロマトグラフィー又は高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ ）を使用して精製することが含まれる。

得られた生成物は、次いで注入の準備が整っている。

本発明の有利な実施態様は、使用する直前に行われる放射性核種標識により、使 用の準備が整ったバイアル３本のキットを提供する。バイアルは下記のようにし て製造される。

−ル　フーグメントバイアル 血栓に特異的なモノクローナル抗体のＦ（ａｂ’）ｚフラグメントを既知の方法 で調製する。フラグメントをチオール化してＦ　ａｂ’　フラグメントを製造し 、精製を行ってチオール化フラグメント源を用意し、これを凍結乾燥してバイア ル内で安定化させることができる。適当な触媒を用いることにより、チオール化 が最適に実施される。蛋白及び特に抗体のチオール化が知られており、ここでも 確かに触媒を使用している（例えば、１ｌｌａｒｚｙｎｓｋｉ　らのＪ、　Ｉ＋ ＊ｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３５．１５７−１６８．１９８０参照）、特定 の抗体に適する正確な処理条件の決定には定常の実験が用いられる。Ｎ−末端α −アミノ基に影響を及ぼさずに、ε−アミノ基によって、程度の低い抗体のチオ ール化が達成されると考えられる。これは抗体の結合部位に影響することが避け られ、それによって抗体の免疫反応性及び親和性の低下が回避できると信じられ ている。

驚くべきことに、Ｆ　（ａｂ’　）、をチオール化した本発明の実施態様では、 千オール化Ｆ（ａｂ’）２を得る代わりに、より小さなＦ　ａｂ’　フラグメン トが得られた。チオール化は、Ｆ　（ａｂ’　＞２フラグメントを分解し、Ｆ（ ａｂ’）２のジスルフィド結合の分解により外来的に結合したスルフヒドリル基 及び内因性スルフヒドリル基の双方を備えたＦ　ａｂ’　フラグメントにするも のと信じられている。この反応メカニズムは解明されていない、得られたチオー ル化Ｆ　ａｂ’　には、ＤＴＴを使用する還元的開裂により生じるＦ　ａｂ’　 と比べて、著しく優れた特性を有することがわかった。その長所としては下記の 事項を含む。

（ａ）チオール化Ｆ　ａｂ’　フラグメントは外来的に加えられた、テクネチウ ム−９９ｍを最も効率的に結合すると信じられている、スルフヒドリル基を含有 している。

（ｂ）チオール化工程で化学的に変化したＦ　ａｂ’　フラグメントは、抗体の 類似した配列中に、内因性スルフヒドリル基を１つより多く、たぶん３つまで有 すると考えられ、これらはテクネチウム−９９ｍの安定した結合に特に適してい ると信じられている。

（ｃ）テクネチウム−９９ｍの結合は、抗体フラグメン）　Ｆ　ａｂ’　のポリ ペプチド主鎖に存在する内因性スルフヒドリル基及び外来的に加えられたスルフ ヒドリル基の両者に基づくものと信じられている。

（ｄ）凍結乾燥してキットにすると、Ｆ（ａｂ’）ｚに再結合する証拠はチオー ル化Ｆ　ａ＆’　からは何も確認されておらず、これがＤＴＴで生じるＦ　ａｂ ’　と比較した場合の最も顕著な違いである。これは、再結合に都合がよくない 変化を受けた蛋白構造を有するチオール化Ｆ　ａｈ’のためであろう、しかしな がら、これに関する化学現象については十分に理解されていない、　Ｆ　（ａｂ ’　＞２への再結合により、フリーのスルフヒドリル基の利用性が低下する結果 として、抗体のテクネチウム−９９ｍに結合する能力が大きく低下すると信じら れている。

＜ｅ）標識したチオール化Ｆ　ａｂ’　キットは、フラグメントの免疫反応性に ほとんど影響を及ぼさないことがわかった。

級１■［バ／二乙ル 適当なＭｆｒ液のバイアルは、標識する前に、凍結乾燥したチオール化フラグメ ントに加えるために用意される。

１１五バエ１丑 バーテクネテートの形で通常供給されるテクネチウム−９９鳳と結合するリガン ドを提供するために、Ｓｎ−グルコン酸塩の様な、適当な腎又は肝結像剤が用意 される。

適当な薬剤としてはグルコヘフオネート、ＭＤＰ、ピロリン酸塩、及びＨＩＤＡ 酢酸誘導体がある。

本キットは、第２のバイアルからの無菌緩衝液を抗体バイアルに加えることによ り使用される。結像剤の）くイアルにバーテクネテートを加え、次に本物質の適 当量を抗体バイアルに加える。代表的には本混合物を５〜１０分間インキュベー トし、テクネチウム−９９ｍを結像剤キットから抗体に定量的に移す、得られた テクネチウム−９９ｍ標識抗体は、さらに精製しなくても患者に注入する準備が できている。

本発明を使用すると、キット作製のために使用される、簡単で、容易に調節され る化学反応を可能にし、しかも本キットを実際に使用するのは比較的簡単である １重量−重量を基準にした、比放射活性の高いテクネチウム−標ＪＦａｂ’　を 得ることができる。

別の態様では、本発明は、上記の手法のいずれか１つに記述されている方法で製 造されるチオール化物質および放射性核種による標識に適する形の交換複合体の 補給品を含有する、哺乳類の血栓のシンチグラフィー画像に使用するキットにま で及ぶものであり、本キットはチオール化物質と交換複合体く標識されている場 合には）との反応が、さらに精製するか否かにかかわらず、哺乳類に注入するた めの溶液を作るような形態のものである。

検討によれば、ＨＰＬＣ又はゲルカラム分離の後、直ちに凍結乾燥した場合には 、還元されたチオール化Ｆａｂ”又はチオール化Ｆ　ａｂ’、フラグメントは、 ３力月後にもその標識能を保持していた。

さらに別の態様は、本発明は、上述のキットの使用を含むシンチグラフィー画像 法にある。

下記の考察では、以下に示した商業的に利用しうる物質を用いることができるよ うに、照会先を付した。アンチフィブリンモノクローナル抗体ＤＤ−３Ｂ６／２ ２及びそのＦ（ａｂ’）２フラグメントならびにフィブリンＤ二量体は、＾［； ＥＮ　Ｂｉｏａ＋ｅｄｉｃａｌ　Ｐｔｙ社により供給された（オーストラリア、 ブリスベン）、ジチオトレイトール及び免疫グロブリンを含まないウシ血清アル ブミン（ＢＳ＾）は、Ｓｉｌ（ｍａＣｈｅｍｉｃａ１社（セントルイス）から購 入した。グルコン酸カルシウム、塩化第一スズ及びＴｃ９９ｍバーテクネテート を含む腎画像キットＲＭ　６は、＾ｕｓｔｒａｔｉａｎ　Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏ ｐｅ（オーストラリア、シトニー）から得た。Ｂｉｏｇｅｌ　Ｐ−６ＤＣはＢｉ ｏｒａｄのものである。セファロース６　ＭＢはＰｈａｒ＋＊ａｃｉａ（スウェ ーデン、アップサラ）から購入した。

塞」Ｌ倒」２ 本実施例では、テクネチウム−９９−で標識した完全なチオール化モノクローナ ル抗体を調製した。製造方法は下記の通りである。

１　、２ｍＭ　ＥＤＴ＾を含有する０、１Ｍ炭酸水素アンモニウムを完全なアン チフィブリンモノクローナル抗体ＤＤ−３８６／２２に作用させ、その混合物を 氷上で冷却した。

２、炭酸水素塩緩衝液中の０．２５８２−ビリジンアルドキシムメチオダイド３ ３μｍ及び炭酸水素塩ＭＩｒ液中の０．２５８　Ｎ−アセチルホモシスティンチ オラクトン３３μｍを工程１の溶液に加えた。２ｏｚのトリスを使用してｐＨを ９．０に調整し、容器をＮ２で満たしてから混合物を種や力）に２時間攪拌し、 その間に３０分ごとにｐ■を確認して９．０に保った。

３、インキュベート期間終了時に、ｐＨ５，６の０．１Ｍ酢酸ナトリウムｗＩ衝 液で平衡化したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−６ＤＣ：を用いて遠心力説塩により混合物を 精製した。

４、テクネチウム発生器から溶離した、３０〜３００ｍＣ１／ａ＋１の範囲の放 射能を有するパーテクネテートＬ、ＯｍＮで腎結像剤ＲＭ６を構成した。このテ クネチウム−９９−混合物０．１１をチオール化した抗体に加えた。

５、最終蛋白濃度０．９５　Ｂ／ｍｌの混合物を約３７℃でインキュベートした 。既知のモニタリング方法により、１５分以下で抗体の定量的標識（＞　９９％ ）が達成されることが確認された。

え１勇ユ 本実施例では、下記の様にチオール化モノクローナル抗体フラグメントＦ　ａｂ ’　を製造し、放射標識した。

１゜アンチフィブリンモノクローナル抗体ＤＤ−３８６／２２をペプシン消化し て、Ｆ（ａｂ’）ｚフラグメントを製造した。

２、ジチオトレイトール還元を行い、Ｆ　ａｂ’　フラグメントを製造した。還 元剤：抗体モル比１２：１を用いると、次の工程で高放射性核種組み込みが可能 であった。リン酸緩衝食塩水中のＦ（ａｂ’）ｚフラグメント１．０ｗ４ｇを、 １０−Ｍジチオトレイトール溶液１２．０μ！とともに、最終量３００μＩ、３ ７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳで平衡化したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−６ Ｄにを用いて遠心力説塩で過剰な還元剤を除去した。希釈されていない形で還元 抗体が得られ、直ちに使用した。

特定の理論と結び付けずに、本発明者は、これは抗体ヒンジ部周囲のジスルフィ ド結合の還元によるものと考えている。

３、触媒として２−ビリジンアルドキシムメチオダイドを使用し、ＤＬ−アセチ ルホモシスティンチオラクトンでＦ　ａｂ’　フラグメントをチオール化した。

４、グルコン酸カルシウム２０μｇ及び塩化第一スズ０．５μｇを含有する混合 物２．５μｍをパーテクネテート２５０μｍに加え、テクネチウム−９９鋤リガ ンド複合体を調製した。

５、還元したチオール化抗体フラグメントを、上記Ｔｅ９９ｍ／グルコン酸塩混 合物１２０μｍとともに室温で１０分間インキュベートした。遠心力説塩で過剰 なテクネチウム−９９ｍを除去した。

線量計（Ｎｕｃｌｅａｒ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅ）によるガンマ計測で標識の程度 を測定し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法で蛋白を測定した。　５０ｍＣ１／ｍｇまでの抗 体蛋白比放射活性が得られ、この水準は満足ゆくものと考えられた。

６、次に高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で標識抗体フラグメントを精 製した。

ｐＨ７，２の０．２１４）リス／塩酸緩衝液で平衡化したｂｉｏｓｉｌ　ＴＳＫ −２５０カラム（７，５Ｘ　３００　＋＊ｍ）を使用し、流速１．０　ｍｌ７分 でゲル透過高圧液体クロマトグラフィー（Ｉ（ＰＬＣ）を実施した。蛋白は２８ ０ｎ−における紫外線吸収で連続的にモニタリングし、放射能は１４０　ＫｅＶ に達するＴｃ９９ｍのガンマ放射線の、ガンマ検知器を通る流れで同様に測定し た。非標識抗体物質及び非反応Ｔｃ−複合体を除去することにより、本溶液は十 分に精製されることが本試験で立証された。得られた液体は、等張に調整した場 合、哺乳類への注入に適していた。

固相検定法で標識抗体の免疫反応性を測定した。最も満足すべき水準である、７ ５１以上という免疫反応性に達していた。

抗体フラグメントの放射標識の安定性を調査した。新たに調製した、２４及び４ ８時齢のＴｃ９９＋ｓ標諏Ｆａｂ“抗体も、ｐＨ７，０の１０　ＩＩＮＥＤＴＡ 中、３７℃で３０分間インキュベートした標識抗体も、同様にＨＰＬＣで分析し た。結果からは、抗体の標識は安定で、テクネチウム−９９−がＤＴＰ＾にトラ ンスキレ−ジョンする証拠は皆無であった。

支１Ｍユ 本実施例は、チオール化Ｆ　ａｂ’　の凍結乾燥キットの調製を記述するもので ある。方法は下記の通りである。

１　アンチフィブリンモノクローナル抗体ＤＤ−３８６／２２フラグメントＦ　 （ａｂ’）２１２．０　ｍｇを、脱気した０、ＩＭ　炭酸水素アンモニウム７２ ｍＭ　ＥＤＴ＾と混合し、水上で冷却した。

２．２−ビリジンアルドキシムメチオダイド０．４　ｍｌ及びＮ−アセチルホモ システィンチオラクトン０．４　ｍｌを加えて本混合物をチオール化し、ｐＨを ９０に調整した。

３、本混合物を氷上で２時間インキュベートし、その間、ｐＨを９．０に維持し た。

４、脱気水で平衡化したＢｉｏｇｅｌ　Ｐ−６Ｄにを用いて遠心力説塩で本抗体 混合物を精製し、精製Ｆａｂ“　フラグメントを製造した。

５、本フラグメントを０．７　Ｂのロットに分けて凍結乾燥し、バイアルの凍結 乾燥が完了すると直ちにバイアルを真空密閉し、−２０℃で保存した。

６、後日、ｐｉｔ　５．６の０．１Ｈ酢酸ナトリウム緩衝液０．３１をフラグメ ントに加えることを含む第１工程で、凍結乾燥したチオール化Ｆ　ａｂ’　フラ グメントを標識した。

７、グルコン酸テクネチウム−９９ｍ　０．３　ｍｌを本フラグメントに加え、 結果として生じた混合物を３７℃までインキュベートした。

■ 標識効率をモニターした結果、テクネチウム−９９鴎のＦａｂ”への定量的組み 込みは１５分未満で完了し、サンプル中の結合していないパーテクネテートは０ ．５ｚ未満てあった。同一の抗体フラグメントをＤＴＴ還元剤で処理したばかり の比較例をモニターした。標識工程では放射能の取り込みに要しだ時間は有意に 長く、取り込み最大量は９７．５ｒであった。

チオール化した標１Ｆａｂ’　フラグメントについて重要なことは、Ｆ　ａｂ’ 　がＦ（ａｂ’）ｚに組み換えられる証拠が何も無かったことである。対照して みると、ＤＴＴの有意の組み換えを示した相当する実験では、Ｆ　ａｂ’　をＦ （ａｂ’）２に差し戻していた。

水を加えて元に戻した凍結乾燥Ｆ　ａｂ’　キ・ントを用いてさらに実験を進め た。　Ｆ　（ａｂ’　）２及びＦ　ａｂ’　を示す溶離では２つの紫外吸収ピー クが確認されたが、テクネチウム−９９ｍを検出するための溶離は、Ｆ　ａｂ’ 　のみがテクネチウム−９９ｍを組み込んだことを示した。主要な紫外吸収ピー クはＦ　ａｂ’　である。

免疫反応性も調査したところ、標識チオール化Ｆ　ａｂ’の免疫反応性は７５％ 結合能を示し、満足する結果であった。

３７℃で５時間以上、血清中で標識したチオール化Ｆ　ａｂ’　フラグメントを インキュベートすることにより、さらに実験を行った。　ＨＰＬＣ分析では、放 射能はチオール化抗体にかなりに結合したままであることがわかった。

ウサギで生体分布及び局在性実験を実施した。チオール化標識Ｆ　ａｂ’　とジ チオトレイトールにより生した標識Ｆ　ａｂ’　間で比較した。注入４時間後に 調査したところ、両サンプルともに類似した結果が得られた。腎臓において主な 組織取り込みが確認されたが、これは急速な血液クリアランス、望ましいシンチ グラフィー診断試験像と一致している。さらに標識Ｆ　ａｂ’　の実験的血清へ の局在性は優れており、相当するコントロール領域では取り込みはほとんど無か った。

支ＬＬ４ 本実施例では、シンチグラフィーモニタリングを目的とするテクネチウム−９９ ＋ａ　［Ｋ識した千オール化蛋白様物質を製造した。調製法は下記の通りである 。

１　、０．１Ｍ炭酸水素アンモニウム／２ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ緩衝液中の血清アミ ロイド蛋白（ＳＡＰ）　２５μｇをＮ−アエチルホモシステインチオラクトン（ （１，２５Ｍ）　４．０μｍで処理した。本混合物を一晩０〜４℃に保った。

２　、２０１１Ｈ）リス／塩酸、ｐＨ７，２，０、１５Ｍ食塩で平衡化したＢｉ ｏＢＩ　Ｐ〜６ＤＣを用いて、遠心力説塩でチオール化血清アミロイド蛋白ＳＡ Ｐを精製した。

３、テクネチウム−９９ｎ＋　５．０μｍで標識し、水を加えて元に戻した腎結 像剤Ｒｍ６をチオール化血清アミロイド蛋白ＳＡＰに加え、最終血清アミロイド 蛋白濃度０．６　ｍｇ／ｍｌ　を得た。室温でインキュベートをした。

検討結果では、標識効率は９０１に達していた。

１工ｌｙ叉Ｉ 上記実施例２では、代替としてリン酸緩衝食塩水の代わりに脱酸素水で平衡化し たカラムで抗体を脱塩することができる。

上記実施例２では、即座に使用することを指示しているが、非常に都合の良いこ とに、チオール化Ｆ　ａｂ’　フラグメント及びグルコン酸塩複合体を別々の容 器内で凍結乾燥すると好結果が得られることがわかった。これらの成分に水を加 えて元に戻した後、テクネチウムでグルコン酸塩を標識し、次にこの２種の溶液 を混合すると有効な生成物を生じた。

もう１つの代替法は、抗体の精製に、ＨＰＬＣの代わりにゲルカラムクロマトグ ラフィーを使用することである。

国際調査報告 ＩｎＴｅｒｎａ＋１ａｎａｌ　Ａｏ：　：５ｔｉａ１１１１６．ｆｑｉμＪＪ９ ０／αｎｉＡｏ　２０６８５／８１１　ＥＰ　３０６１６８　ＩＩ、　８１４０ ５　ＪＰ　１１５６９３０ＥＮＤ　ＯＦ　ＡＮＮＥＸ

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 　１．ヒトを含む哺乳類の血栓をシンチグラフィーで検出するためのキットの製 造法であって、その工程は、血塊に対して特異的に向けられた物質を取得し、該 物質は蛋白様物質、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、或いはモノクロー ナル抗体又は単一ドメイン抗体のエピトープ結合フラグメントからなる群のもの であり、そして該物質をチオール化剤により抱合し、それにより許容しうる放射 性核種による標識に適合した抱合された物質が提供されることを含み、その工程 は、モノクローナル抗体又は血塊に対して特異的に向けられたそのフラグメント を取得し、そしてその抗体又はフラグメントを許容しうる放射性核種で標識する ことを含む、キットの製造法。
2. 　２．選択される物質が、ヒト架橋フィブリンのＤ−二量体（ＤＤ）エビトープ を認識するものである請求の範囲第１項に記載の方法。
3. 　３．選択される物質が、３Ｂ６であると同定されたモノクローナル抗体である 請求の範囲第２項に記載の方法。
4. 　４．該方法が、モノクローナル抗体のＦ（ａｂ′）２フラグメントを得、そし てチオール化Ｆａｂ′フラグメントを製造することを含むものである上記請求の 範囲のいずれか１項に記載の方法。
5. 　５．Ｆａｂ′フラグメントが、ジチオトレイトールを使用することによる抗体 のＦ（ａｂ′）２フラグメントの還元に由来するものであり、この工程の後でチ オール化される請求の範囲第４項に記載の方法。
6. 　６．Ｆ（ａｂ′）２フラグメントが、チオール化剤と直接反応してＦａｂ′フ ラグメントを生成する請求の範囲第４項に記載の方法。
7. 　７．チオール化が、ＤＬＮ−アセチルホモシステイン−チオラクトンを使用し て行われる上記請求の範囲のいずれか１項に記載の方法。
8. 　８．チオール化抗体物質の標識が、標識グルコネート又は他の反応中間体関連 物質の複合体で標識を交換することにより行われる上記請求の範囲のいずれか１ 項に記載の方法。
9. 　９．放射性核種テクネチウム−９９ｍを使用して標識が行われる上記請求の範 囲のいずれか１項に記載の方法。
10. 　１０．さらに、ゲルカラムクロマトグラフィー又は高圧液体クロマトグラフィ ーを使用して、チオール化された抱合体を精製することを含む上記請求の範囲の いずれか１項に記載の方法。
11. 　１１．　該方法が血清アミロイド蛋白をチオール化することにより行われる請 求の範囲第１項に記載の方法。
12. 　１２．哺乳類のシンチグラフィー画像に使用する注入可能な物質を製造するた めのキットであって、該キットは上記請求の範囲のいずれか１項に記載した方法 で製造されるようなチオール化抗体又はそのフラグメンド、及び放射性核種を用 いる標識に適する形の交換複合体の補給品を含有し、チオール化抗体又はフラグ メントと交換複合体（標識されている場合）との反応で、さらに精製するか否か にかからず、哺乳類への注入に適する溶液を生じるような形態のものであるキッ ト。
13. 　１３．上記請求の範囲のいずれか１項で製造される物質を取得するか、または 請求の範囲第１２項のキットから製造される標識溶液を取得し、その物質を哺乳 類へ注入し、そしてシンチグラフィー画像にすることを含む、哺乳類におけるシ ンチグラフィー画像法。
14. 　１４．哺乳類におけるシンチグラフィー画像法に使用するための、実質的に実 施例のいずれか１つに記述されている、物質の製造法。
15. 　１５．実施例のいずれかに１つ記述されているようにして製造された凍結乾燥 したチオール化物質、および放射性医薬品による標識に適し且つ水分を加えて元 にもどす時にチオール化物質に加えるのに適する交換複合体の補給品を含む、シ ンチグラフィー画像法用の注入可能な溶液を製造するためのキット。