JPH05501202A - インフルエンザ菌ｂ型の外膜タンパク質ｐ１およびペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ４町郵１ ンフルエンザ　Ｂ　ンバ　Ｐｌ　びベブ　ド楚咀豊立１ 本発明は、ンフ　：ｘ、ン　ｍ　ｈｉｌｕ　ｉｎｆ　ｚａ旦）ｂ型から得られた 外膜タンパク質Ｐ１に関する。このタンパク質の遺伝子またはこの遺伝子の一時 変異体は、適切なベクターにクローニングされかつ適切な宿主中で発現すると、 前記天然のタンパク質の一部または全ての免疫特性を保持したタンパク賀謬を付 与する。さらに、ＰＩ遺伝子の誘導アミノ酸配列に基づくペプチド類は、［上ユ で合成できる。これらのタンパク質類およびペプチド類は、結合の有無に関わら ず、ン　エン　Ｈｍｏ　ｈｉｌｕ　１ｆｌｕｅｎｚ　ｅ）ｂ型疾患に対するワク チンとして使用できる。前記タンパク質類は、また、他のハプテンＷｌｉ３よび 多１１煩と結合しＴｅａ依存性抗ｌおよび担体として使用できる。

免暖公貢遣 ン　エン　Ｈｅｍｏ　ｈｉｌｕ　１ｎｆｌｕｅｎｚ　）ｂ型が原因である疾患は 、５ｍｍ以下の小児に右ける細菌性髄膜炎の主な原因である。本疾患に対する防 臂抗体票は本ａ醒の莢膜多糖によりて誘発され、抗原としてｊＩＩ製ポリリボシ ルリビトールリン酸（ＰＲＰ）を利用したワクチンが、開発された。

このワクチンは、成人および月齢２４力月以上の小児において９０％の防御を付 与したが、２４力月以下の小児においては効果がなかった。このＰＲＰは、他の 多糖ワクチン類と同様、Ｔヘルパー細１１Ｗの増殖を誘発せず、再免疫しても追 加免疫応答または記憶ｍ胞の増加のいずれも惹起できない。ジフテリア毒素に連 結されたＰＲＰを用いる新規結合ワクチンが開発され（欧州特許第０．　０９８ ．　５８１号参照）１本ワクチンは、Ｔｌｌ胞依存性の追加免疫応答およびＰＲ Ｐ特異的ＩｇＧ抗体類産生を想起する０月齢２乃至６力月詳およびある高すスク 詳で広範囲の防御を達成するため、ある莢膜外抗原讃の取り込みが必要であろう 。１エン　Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂの外膜タンパク 質Ｐ１に対して作製されたモノクローナル抗体は、菌血症の乳児ラットモデルに おいて防御活性を有することが示されている。また、精製Ｐ１に対して作製され たウサギ抗血清も同様に前記ラットモデルにおいて防御活性を有することが立証 されている。本発明者らは、単離物３種由来Ｐ１かもの構造遺伝子をクローニン グし、配列決定し、　Ｅ、　ｏｌｉ　中において発現させた。

疾患に対する免疫性を誘発する方法は常に改良されており、より小さくかつより 明確に規定された物質類を抗原として使用する方向に現在向かつている。このこ とは、ある天然の免疫原による潜在的副作用を最小とするかまたは消失させ、一 方、それらの免疫原性および本疾患に対する防御を付与する能力を維持するため に進められている。

楚吸似１１ 本発明の１ｇ１面によれば、Ｐ１遺伝子は、適当な宿主／ベクター発現系中で発 現すると、免疫原として使用したときに　ンフ　エン　Ｈｍ　ｈ’ｌｕｓ　１ｎ ｆｌｕ　ｎｚ　ｅｌｂ型によって産生されたタンパク質に反応性の抗体類を誘発 するタンパク質生成物を産生ずる。さらに、本発明者らは、本発明のもうひとつ の面に従って本遺伝子を改良して種々のタンパク質アナログ類を発現させたが、 これらは、ン　エン　Ｈｍ　ｈ’　ｕ　１ｎｆ１１且ｊＪＬＪ：ｌｂ型によって 産生された前記タンパク質の免疫特性の一部または全てを保持している。

本発明者らは、前記Ｐ１タンパク質は潜在的に防御性抗原であるので、本発明の 別の面に従ってそれを結合ワクチンの一部として使用したが、前記結合物のハプ テン部分は、ヘ　フ　ルス　Ｈｍｏｈｉｌ　生物体の莢膜多糖部分である。この ことによって、ジフテリア毒素を担体タンパク質として使用した際のジフテリア に対する免疫過敏可能性の問題を回避しく欧州特許第０．０９８゜５８１号参照 ）、かつ、特に乳児における本疾患をより良好に確実に防御する。

また、さらにもうひとつの本発明の側面によれば、本発明者らは、成熟Ｐ１の残 ！＆６０から８８，１６５から１９３．１８９から２１８，２２６から２５３゜ ２４８から２８３，３０７から３３１，３３９から３７０，３８４から４１２８ よび４００から４３７までに対応する配列を有する１０１ｍ１のペプチド類を固 相ペプチド合成を用いて合成し、これらは、免疫原性でありかつ合成ワクチン中 で抗原類としておよび単独または複合してのいずれかで結合ワクチン中で潅在的 担体贋として作泪できる。

また１本発明によって提供される生体合成タンパク質およびペプチドは、本疾患 検出のための臨床検査キット中で使用できる。

１１立腹星皇盈朋 第１図は、ＭｉｎｎＡ株（ＯＩｉｆＰサブタイプＩＨ）、１６１３株（○ＭＰサ ブタイプ３Ｌｌ、および８３５８株（ＯＭＰサブタイプ６Ｕ）由来Ｐ１遺伝子煩 のＤＮＡおよび誘導アミノ酸配列項を示している。これらのデータは、先に報告 されている（Ｍｕｎｓｏｎら、インフエクション・エンド・イミユニティ（Ｉｎ ｆｅａｔ、Ｉｍｍｕｎ、Ｌ　Ｌユ、３３００　（１９８ＬＩ　Ｊ　；第２図は、 組換えＰｉ産主のためにＷ築された２個の発現プラスミド類の構造を示している 。Ｉｎｏｕｙｅａよび共同研究者らによって記載されたベクター類ｐＩＮＩＩＩ Ａ３および共通１ｐｐプロモータを含有するこのベクターの一時変異体を使用し た。Ｐ１遺伝子は、ＭｕｎｓｏｎおよびＧｒａｓｓによって記載されたように（ インフェクション・エンド・イミユニティ（Ｉｎｆｓｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、＞５旦 、２２３５　（１９８８））、ｐＲ３Ｍ１８８からサブクローニングした。ｐＲ ３Ｍ２２７およびｐＨ３Ｍ２９１中の合成リーダーペプチド類のＤＮＡおよび誘 導アミノ酸配列を示しである。この構築体の詳細については、下記の実施例■に 示しである； 第３図は、界面活性剤に不溶で外膜タンパク質類を高含量とした側製物のクーマ シープル＝（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｂｌｕｅｌ染色ＳＤＳ　ＰＡＧＥゲルを示し ている。レーン１は、ンフ　エン　Ｈｍ　ｈｉｌｕ　１ｎｆｌ止旦且又１１）由 来ｌｌ１Ｉ物を含んでいる。レーン２１３よび３は、それぞれＰｌを発現しない 　Ｅ、０１１　および発現する　Ｅ、Ｃｌｉ　Ｆ！ｉ来＊ａ物を含有している。

別の実験では、　Ｅ、ｃｌｉ　の更旦旦Ａ遺伝子が変異を受け、外膜からｏｍｐ ａｍルミタンパク去する。

第４図は、Ｐ１遺伝子の略図、ベクターｐＥＸ２中のｃｒｏ　１ａｃＺ　ｏｎ以 ■ユ融合遺伝子（ｐＲ３Ｍ７３４）、およびＰ１遺伝子の３′部分を含有する遺 伝子融合物（ｐＲ５Ｍ７９３１を示している。本構築体の詳細については、下第 ５図は、ＭｉｎｎＡ株由来Ｐ１遺伝子の部分配列およびｐＨ８Ｍ７９３中におけ るｑ」」ＬＰ」２遺伝子とｃｒｏ−１２との融合の結合点を示している。融合点 は、矢印によって示しである；矢印に対する配列３′は、前記融合タンパク質の 部分として発現される；および 第６図は、組換えＰ１１タンパク質のマウス単一特異性抗血清のウェスタンプロ ット分析を示している。マウスを下記に詳細に述べたように組換えＰｌまたは融 合タンパク質類で免疫して、血清をヘ　）　ルス　Ｈａｅｍｏ　ｈｉｌｕによっ て産生されたＰｌに対する反応性を試験した。本方法は、下記の実施例■に示し である。レーン１は、免疫マウスと同一コロニーから由来するマウスから得た正 常マウス血清；レーン２は、組換えＰｌに対する抗血清；レーン３は、大Ｅ、０ １１／　ｐＲＳ　Ｍ　７３４によって産生されたＣＲＯ−１ａｃＺ−ｐＨｔ合タ ンパク質に対する抗血清；レーン４は、　、１゛／ｐＲ３Ｍ７９３によって産生 されたＣＲＯ−１ａｃＺ−ＰＬ融融合タンパクシ対する抗血清；レーン５は、陽 性対照であるｒＭは、モノクローナル抗Ｐ１抗体類を含有する組織培養上清によ ってプロービングした。

外膜タンパク質Ｐ１をコードする遺伝子、ＭｉｎｎＡ株、１６１３株および８３ ５８株をクローニングし、それらのヌクレオチド配列順は先に決定されている。

Ｐｌの部分を含有する組換えＰｌおよび融合タンパク質類は、　Ｅ、ｒで産生さ れたＰ１タンパク質と反応しｌＩ′：、、このことは、組換えＰ１ｊ５よび融合 タンパク質類が、天然の２１を１！識する抗体類を誘発することを示唆している 。

前記遺伝子またはその断片類は、他のプロモータ煩のｌｌ１１ｗ下に太１１ユニ 、１１１１丁中で発現でき、リーダーペプチドがなくても発現でき、または他の クローニング系中で発現できる。ダラム陽性層薗発現系、ワクチニアウィルス、 アデノウィルス、バキュロウィルス、酵母、真菌、ＢＣＧまたは哺乳類発現系中 における発現は、別の適切な発現系となることができる。

Ｐｌの精製は、Ｍ　ｕ　ｎ　ｓ　ｏ　ｎおよびＧｒａｓｓ　（ｒｌ１上）によっ ておよびＬｏｅｂ（インフェクション・エンド・イミユニティ（Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ、）ΣＭ、２４３１２　（１９８７１）によって報告されている。下 記の実ｔｐｉｇ４ｍでは、ＰｌのｔｓＨａｓｆｘを詳細に示している１本物質は 、結合ワクチンの合成のために使用したａ”　ＨｔとＩ」Ｌｌ」−猛Ｊ、）オリ ゴ糖（ＨＰＲＰ）は、制御下の酸加水分解によってｌＩ！されかつ臭化シアン活 性化によって精１１ＰＩタンパク質と結合させた。結合に用いたＰＲＰ分子の平 均分子径は、約２０．　０００ダルトンと決定された６本結合にリンカ−分子は 、全く用いなかった。本結合物の免疫原性をウサギで検定し、　（下記の第１表 に記載のように）１次および２次抗ＰＲＰ免疫応答を観察した。さらに、ウサギ 抗ＰＲＰ−ＰＬ抗血清は、イムノプロット分析においてＰｌに対して強い反応を 示した。本データは、Ｐｌが結合ワクチン中において担体タンパク質として使用 できること、従って、ジフテリアまたは破傷風Ｓ嵩類を結合タンパク質として使 用した層にジフテリアまたは破傷Ｍに対する免疫過敏可能性の問題が回避される ことを示唆している。さらに、ワクチンとしてのＰＲＰ−ＰＬは、前記Ｐ１タン パク質に対する抗体類によって付与されたホモタイピック防卿の結果として、特 に乳児におけるＬ乙ｚ反五之１菌−［■」Ｌも迎ユ旦ｌ上ユニ　’ｎｕｎｚａｌ ｂ型疾患に対してより連続的な防御を確実とすると見なされる。

Ｐｌに対する抗体類はラット薗血症モデルにおいて防御性であるので、本発明者 らは、Ｐｌの免疫優性抗原決定基（ｇＩｌｌを同定すること乞決定しかつＰｌを 基礎としたｄ　Ｈｅｍｏ８Ｌ辷　ｕｓ　ＬｎｆＬｕｅｎｚ　）ｂＩｘ！ワクチン に取り込まれるＰＩ機能性禦填を局在化しかつ特性解析するためのプローブ類を 作製した。ペプチドｇ１１４種がＰ１タンパク質のカイト・ドーリットル（Ｋｙ ｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）プロット（ジャーナル・オブ・モレキュラーバイオ ロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、ｌ、１５７，１０５　（１９８２））において 親水性であると予測されており、従って、最初に厘べることにした（下記の第２ 表を参照）。合成ペプチド［ＨＩＢｌｌ−１（残基１から２９）、ＨＩＢｌｌ− ２（残基６０から８８１．ＨＩＢＩＩ−３（残基１０３から１３７）、ＨＩＢｌ ｌ−４（残ＩＥ１８５から１９３）、ＨＩＢＩＩ−５（残基１８９から２１８） 、ＨＩＢＩＩ−６（残基２２６から２５３）、ＨＩＢｌｌ−７（残基２４８から ２８３）、ＨＩＢＩＩ−８（残基２７９かも３１２）、ＨＩＢＩ　１−９（残基 ３０７から３３１）、ＨＩＢｌｌ−１０（残基３３９から３７０）、ＨＩＢｌｌ −１１（残基３８４から４１２）、ＨＩＢＩＩ−１２（残基３９から６４）、Ｈ ＩＢＩＩ−１３（残基４００かも４３７）、およびＨＩＢＩ　１４４　（６Ｕ株 の残基４００から４３３）をＣ末端またはＮ末端のいずれかにおいてさらにシス チンを添加して化学的に合成した。このペプチドの１端におけるこの特徴的なシ スティンは、特異的な１方向において担体タンパク質に対するその結合を可能と 全ての合成ペプチド類は、マウス（６種の異なる系統）およびモルモットにおい て天然のＰｌに対して作製された抗血清に対するそれらの反応性をペプチド特異 的ＥＬＩＳＡ類で評価した。下記の第３表に示したように、全てのマウス抗Ｐ１ 抗血清は、ＨＩＢｌｌ−３、ＨＩＢＩＩ〜７、ＨＩＢｌｌ−９、およびＨＩＢｌ ｌ−１３ペプチド類を極めてよく認識し、一方、モルモット抗Ｐ１抗血清は、同 一アッセイによってＨＩＢＩＩ−１３以外の全ての上記ペプチド類を認識した。

このデータは、主な免疫優性のＰｉ　Ｂ細胞抗原決定基類がＨＩＢｒｌ−３（残 基１０３から１３７）、ＨＩＢＩＩ−７（残基２４８から２８３）、ＨＩＢＩＩ −９（残基３０７から３３１）、およびＨＩＢＩＩ−１３（残基４００から４３ ７）内部に局在していることを示唆している。

この合成ペプチド層がワクチンの候補として可能であるかどうかを決定するため 、遊離のペプチド類およびペプチドＫＬＨ結合物履をそれらの免疫原性について それぞれ評価した。ウサギを検疫し、ＥＬ　Ｉ　ＳＡ、二重免疫拡散およびイム ノプロット法によって抗ペプチド抗血清を検査した。下記の第４表に示したよう に、ＨＩ　Ｂ　Ｉ　］、−８またはＨＩＢＩ　１１−８−ＫＬＨ合物に対して作 製したものを除く全てのウサギ抗血清が、それらのそれぞれの免疫ペプチド類に 対して単一特異性であることがＥＬＩＳＡによって示さｔＮな。遊離ペプチドに よるペプチド特異的抗体類のＳ発は、このペプチドが、Ｔヘルパー決定基および Ｂ細胞抗原決定基（類）の両方からなることを示唆している。さらに、抗ＨＩＢ ＩＩ−４、抗ＨＩＢ　Ｉ　１．−５、抗ＨＩＢＩＩ〜７、抗ＨＩ　Ｂ　Ｉ　１− ９、抗ＨＩＢＩ　１−１０、抗ＨＩＢ１１−１１、および抗ＨＩＢＩＩ−１４抗 血清が、使用した全てのアッセイでＰｌをｉ！識し、このことは、これらの領域 が露出しかつ遊離しており、抗体類と相互作用することを示唆している。これら のペプチド類は潜在的Ｔヘルパー決定基を含有しておりかつペプチド−ＫＬＨ結 合物ｔａｉ１がウサギにおいて強力な抗体反応を誘発したので、それらがワクチ ン調製物中において抗原として作用できることが明らかである。

犬直コ 分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫化学およびハイブリドーマ法の方法を使用 したが、本開示およびこれらの実施例には詳細には説明しておらず、これらは、 化学文献に詳細に報告されておりかつ十分当業者の能力の範囲にある。

叉１−例」−り 本実施例は、大量の組換えＰｌを産生ずるように意図した発現系の構築を示しＩ ｎｏｕｙｅおよび共同研究者らによって記載のベクターｐｌＮＩＩＩＡ３を使用 した。このベクターは、タンｒＡ（ｔａｎｄｏｍ）プロモータｆｆｆｌｐｐおよ び１ａｃ）を含有している。本系中では、遺伝子の発現は、ラクトース制御系に よってＬＩＩ４ｗさｔている。我々の構築では、二〇Ｐ１遺伝子は、Ｍ　ｕ　ｒ ｌ、　ｓ　ｏ　ｎ　１３よびＧｒａｓｓ　（同上）によって記載のようにプラス ミドｐＲ３Ｍ１８８のＰｓｔ　ＩからＥｃｏＲｒまでの断片として前記ベクター のＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた。このベクターのＥｃｏＲＩ部位とＰｓ ｔ１部位の間のリーダーペプチドをコードするセグメントは、合成オリゴヌクレ オチド煩によって再構築された。

このプラスミドは、ｐＲ３Ｍ２２７と命名された。Ｐｌの発現は、さらに、ａ） 前記１ｐｐプロモータを共通に変化させることＢｎｏｕｙｅら）、ｂ）部位特異 的変異によって前記リーダーペプチドの配列を改変すること、およびＣ）カナマ イシンカセットを前記構築体中にクローニングして前記プラスミドを安定させる こと、によって、さらに増強させた。最終構築体は、ｐＲ３Ｍ２９１と命名され る。Ｐｌの合成がｌａｃ制御系の制御下にあるので、Ｐ１合成は、イソプロピル チオガラクトシドの培地への添加によって誘発された。

裏ｌ遺１ま 本実施例は％　Ｐ１産生をコードするプラスミド爆の厘製を例示している。

Ｒ〜１　−ｍＰ　融合遺伝子は、ベクターｐＥＸ２中に構築さ九た。プラスミド ｐＲ５Ｍ１８８はＰゴ遺伝子を含有し、Ｐ１遺伝子の下流部位でＥｃｏＲＩによ って消化された（第２図参照）。このＥｃｏＲＩ末端は平滑末端であり、Ｐ１遺 伝子は、Ｐｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ平滑末端断片として単離された。

順番にＨｉｎｄｌＩ［によって消化し、平滑末端として、かつＰｓｔｌによって 消化したｐＥｘ２ベクター中にこの断片をクローニングした。この構築体を、ｐ Ｒ８Ｍ７３４と命名した（第４１！Ｉ）、成熟Ｐ１の配列類の全てを含む融合タ ンパク質は、４２’Ｃへ（Ｄ温１１移行１１　Ｅ、　ｌ’　ｐｏｐ２１３６／ｐ Ｒ３Ｍ７３４によって産生される。

ｐＥＸ２中ＸｂａＩ部位を除去後、ｐＲ３Ｍ７３４をＰａｔｈおよびＸｂａ　１ によって消化しくＸｂａｌは、Ｐ１遺伝子中で一口切断する）、ＥｘｏｌＩＩに よって消化した。平滑末端化、連結および形質転換後、前記融合タンパク質の部 分として前記Ｐ１遺伝子の３′部分のみを発現するクローンを単離しかつ特性解 析した。組換え融合が、イムノプロット分析でウサギまたはモルモットＰ１特異 的抗血清によって認識されることが判明した。このプラスミドを、ｐＲ３Ｍ７９ ３と命名した（第４１！！および第５図参照）。

Ａｉ）ｂ型培養物由来タンパク賀Ｐ１の精製を例示している。

天然のＰ１タンパク賀は、Ｅａｇｅｎ株発酵培＊＊のセタブロン（Ｃｅｔａｖ１ ｏｎｌ　（０，１％）沈ｌｌ物からＩＩｇ！Ｉした。、ＭＩ養ペーストを、０． 　４Ｍ　ＮａＣ１存在下ポリトロンによってホモジナイズし、この畳濡物を室温 で２時間、撹拌した。８，０００ｇで３０分間遠心分離後、このベレットを１０ ｍＭ　ＥＤＴＡｌｏ、５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎｌ　１５０ｍＭ　トリス（Ｔ ｒｉｓ）塩酸、ｐＨ８，０を含む緩衝液で抽出した。この抽出物は、ａｉｍｓか らＰｌを優先的に可溶化した。１ｉＰ１抽出物をさらにエタノール沈澱、ＤＥＡ Ｅおよびハイドロキシアパタイトクロマトグラフィによって精製した。これらの 操作後、このＰ１調製物は、さらにＳＤＳ　ＰＡＧＥ分析および走査レーザーデ ンジトメトリで決定した純度が９５％以上であった。

寛五透Ｎ二 本実施例は、オリゴ糖／Ｐ工結金物のｍ製を例示している。

１　エン　ｍ　ｈｉｌ　ｉｎ　ｎｚ　ｌｂ型由来精製多糖（ＰＲＰ）（米国特許 第４，４９６，５３８号）を８０−９０’　Ｃに十分な時間加熱して、セファロ ースＣＬ−４Ｂカラムによるゲルろ過によって決定した分子量範１！！１２０， ０００−２，０００，０００ダルトンを達成した。

ＰＲＰの容量を０．８５％塩化ナトリウムで２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、このｐＨ をＩＮ　ＮａＯＨによって１０，５に調整した。水浴中で撹拌し、総量で容量０ 、　１の濃縮臭化シアン溶液（５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３，ｐＨ１０，８中１ｏ％Ｗ ／Ｖ］を添加した。このｐＨは、１．ＯＮ　水酸化ナトリウム溶液の添加によっ て１０．０と１１．０の間に維持した。最ｉｓ加６０分後、反応混合物のｐＨを ｌ。

ＯＮ塩化水素酸によって６．０に低下させた。この活性化多糖を、４’Ｃで０゜ ８５％塩化ナトリウムに対する透析ろ過によって精製し、低分子量の反応物を除 去した。ＰＲＰ濃度は、２５ｍｇ／ｍＬに保持した。

精製したＰ１タンパク質はおよそ１ｍｇ／ｍＬで、４°Ｃで０．５％トリトンｆ Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００含有０．８５％塩化ナトリウムに対して透析し、トリ スをに去した。１容量の透析精製Ｐ１タンパク質、０．１容量の透析ろ過活性化 ＰＲＰおよびＯ１ｌ容量の１．　０Ｍ　ＩｊｌＷＩナトリウムを密封可能な容器 中で混合した。このｐＨを９．４に厘節し、この反応混合物を４’Ｃで１５−１ ８時間倒立させた。この時点では、未反応タンパク質またはＰＲＰから結合物を 精製除去しなかった。本混合物中の多１１およびタンパク質濃度を標準的試験に よって決定した。ＰＲＰ−Ｐｉ結合物を、次に、ウサギ免疫化における免疫原と して用いた。ＰＲＰ−Ｐｉ結金物の免疫原性を下記の第１表に示した。

実１１１ｙヨ一 本実施例では、ペプチド類の合成およびペプチド担体層のｌＩｇを例示した。

成熟Ｐ１の配列類に対応するペプチド類は、市販のペプチドシンセサイザー中で 合成しく下記の第２表参照）、さらに、その後、フッ化水素酸を用いてレジンか ら切断し、パイダック（Ｖｙｄａｃｌ　Ｃ４カラムおよび０．　１％トリフルオ ロ酢酸中のアセトニトリル直線勾配（０−４０％）を用いて逆相ＨＰＬＣによっ てｍａｌ、た、免疫１性試験のために使用した全ての合成ペプチド類は、ＨＰＬ Ｃ分析によってめた純度が９５％を越えていた。ペプチドヒドロライゼート順の アミノ酸分析は、それらの理論的組成と良好に一致していた。

それぞれのペプチド類は、ＫＬＨ（キーホールリンベットヘモシアニンフまたは ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）に対して、担体タンパク質に対するペプチドの ゛モル比１０：１で下記のように改良した標準釣力ｍ（Ｌｉｅら、バイオケミス トリ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１旦、８９０　（１９７９））によって結 合した。担体タンパク質は、最初にスルホサクシニミル（４−ヨードアセチル） −アミノベンゾアート（Ｓｕｌｆｏ−３ＩＡＢＩによって改質された。さらに、 この改質タンパク質をゲルろ過ＨＰＬＣによって精製した。このペプチドは、そ の後、改質タンパク質担体と４−６時ＩＲ１［合し、前記ペプチド−担体結合物 をゲルろ過によって単離した。

見立透ｌま 本実施例は、動物の免疫および抗血清の調製に使用したプロトコール煩を例示Ｐ １タンパク質特異的およびペプチド特異的抗血清を下記のようにして調製した。

ウサギ、モルモットまたはマウスを、完全フロインドアジュバント中に乳化した Ｐｉ、ＰＲＰ−ＰＬまたはそれぞれのペプチド−ＫＬＨ結合物類を筋注して免ｇ ｉした。１００−５００μｌの！Ｊ：／Ｍｉｌｌ衝生１１食塩水ｆＰＢＳＩ中２ ０乃至５００ｇｇの間の物質璽を各注射に用いた。追ｍ光疫投与Ｉｆ不完全フロ インドアジュバント中の免疫１量の半分）を２週おきに投与した。血液を第１回 注射後２遍おきに動物から採取した。遠心分離によって血清を凝集血液試料から 分離して、５６”Ｃで３０分間加熱して不活化後、−２０’　Ｃで保存した。

実ｍ 本実施例は、Ｐｉペプチド票に特異的なＥＬ工ＳＡの調製を例示している。

それぞれのＰ１ペプチドｍｌ（５００ｔｔｇ／ウェル）を４’Ｃで１６時間イン キュベーションすることによって、直接、マイクロタイタープレートに塗布した 。

このウェルを次にリン酸緩衝液生理食塩水、７．４　（ＰＢＳＩ中３％ウシ血清 アルブミン（ＢＳＡ）によってブロックした。ペプチド特異的抗血清に特異的な 順次希釈したウサギ、モルモットまたはマウスＰ１をウェルに添加して、このプ レートを２時間、室温でインキュベーションした。過剰の抗体を洗浄緩衝液（Ｐ ＢＳ中０．　１％ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）で３回洗浄して除去した。市 販のタンパク質Ａ−アルカリホスファーゼｆｐｈｏｓｐｈａｓｅ）結合物を各ウ ェルに５ｔＩＪシ、本プレートをさらに！！！濃で１時間インキュベーションし た。この過剰のタンパク質Ａ・パーオキシダーゼ結合物を＃去後、本プレートを 洗浄緩衝液で４回洗浄して、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）基質０．２ｍｌ をＨ２０２とともに各ウェルに添加した。本プレートを発色するまで暗所でイン キュベーションした。本反応をＩＮＮａ１５０μｍを添加して停止させ、ウェル を４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーで読み取った。得られた結果を下記の第３！ ！に示した。

見立ヨに 本実施例では、イムノプロッティング法を使用した抗Ｐ１抗血清の特性解析を例 示し之。

天然のタンパク質ｐＨ組換えＰｌ１合成ＫＬＨ−ペプチド結合物贋まｋはＰＲＰ −ＰＬ結合物頂に対してウサギで調製した抗体類の特異性を、イムノプロッティ ング法を用いて試験した。文献（Ｔｏｗｂｉｎら、プロシーディングズ・オブ・ ナショナルアカデミ−・オプ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）＋　７６．４３５０　（１９７９１）に記載のように、精製した天然 のＰｌまたは組換えＰｌを電気泳動して、その後、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルから電 気的にニトロセルロース片に移行した。次に、このニトロセルロース片を天然の タンパク質Ｐ１１組換えＰ１１合成ＫＬＨ−ペプチド結合物類またはＰＲＰ−Ｐ １結合物類に対してウサギで調製し適当に希釈した種々のウサギ抗血清と２乃至 ４時間インキュベーションした。この抗血清を洗浄緩衝液（０，１％トリトンＸ −１００含有リン酸緩衝生理食塩水）で１　：　５００に希釈した。過剰の抗体 は、前記の洗浄緩衝液で３乃至５回洗浄することによって除去した。アルカリホ スファターゼに結合したヤギ抗つサギＴｇＧ抗体は商業源から購入して、製造業 者の指示に従って第２抗体として使用した。

罠１班１ユ 本実施例は、ウェスタンプロット煩のＳＷａを例示している。

Ｅ、°／　ｐＲＳ　Ｍ　２９１由来ザルコシル不溶性ｉｗｇ＊をマウスの免疫に 用いた。注射３［ｉｌを行った。第１［ｉｉｌは、フロイント完全アジュバント とともに投与して、その後の２回の免疫は、フロインド不完全アジュバントとと もに投与した。ＣＲＯ−１ａｃＺ−ＰＬ融合タンパク質類は、ｐＲ８Ｍ７３４ま たはｐＲ３Ｍ７９３を含有する　Ｅ、　１１　株ｐ０１１）２１３６中で産生さ れた（上記実ｍＮｎ参Ｊｌ）、この融合タンパク質類は５ＤＳ−ＰＡＧＥによっ て精製し、ニトロセルロース上に電気プロットした。マウスは、電気プロット免 疫厘含有ニトロセルロース片を移植することによって皮下で２回免疫した。

ウェスタンプロット分析は、界面活性剤不溶性の　フ　エン　ＪｉｌｊＪｈｉｌ ｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　）ＭｉｎｎＡ株ＷＩｉ物の５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

ニトロセルロース片への電気的移行後、マウス抗血清（免疫マウス３匹からプー ルし、最終希釈１／１００）およびアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスエ ＫＧとともに順次インキュベーションした。前記プロットおよび展開条件は、Ｍ ｕｎｓｏｎおよびＴｏｌａｎ　（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、５７．８８　（１ ９８９））によって記載のように行った。得られた結果を第６図に示した。

ｌ丞立！韮 本開示の要約として、ンフルエン　ｍ　ｈｉｌｕ　ｎｆ１１旦且スｊＬ４ｕ）ｂ 型のＰ１タンパク質を、前記成熟Ｐ１タンパク質の特異的配列に対応する合成ペ プチドを産生じたのと同様に、Ｐ１遺伝子から組換え法によって産生１．また。

、：れらの材料類は、会」七二、仁ル□左利−１１−↓ｇ」口り」ＬＹシｉ　１ 　ｕ　ｓ±生物体が原因の疾患に対する１ツクチン１１Ｍ１およびタンパク質− オリゴｌ１１１ｓ合物煩の提供において有用である。本発明の範囲内で、改良も 可能である。

ウサギにおけるＰＲＰ−ＯＭＰ結合物の免疫原性前出血　第１回注射擾　第２回 注射後 ＧＭＴ本　＜＝２０　＜＝２０　６１ （ＲＸ　Ａｌｌｌｌ位） 抗ＰＲＰ抗体頂中に　Ｎ　／　Ａ　Ｏ／　５　２　／　５おける＞４ｘＬ昇の動 物数 零〇　Ｍ　Ｔ　ニラジオイムノアッセイで決定した抗ＰＲＰ抗体胤位の幾何平均 イーンニｚノに再−ンゴ」　ＣＨａ　ｅ　ｍ　ｈ　」−Ｊ−二見−ミー、ｉ　ｎ 　ｊ−１−１−ｅ　ｎ　ｚ　ａ、４　）　ｂ　型外膜タンパク質Ｐ１の潜在的Ｔ −およびＢｍ胞抗原決定基頂ペプチド類　配列類 （１０３−４３７）　”　−−′ＨＸＥＰｌ−３Ｂ　−−＞マウス株対Ｐ１ペプ チド煩 ｐｌ４　６４００　３２００　４６０１１　１２００　＜　３２０１１　１２６ ００　６４００　１２ａＯＯｐ＋−４＜６４４）０＜＜＜＜３２０１１１１６Ｄ Ｏ＜ｐｌ−５Ｋ２００６ｍＯ３２（１０＜：＄２００６４００６４ＯＯ＜＜ｐｌ −６＜＜＜４（＜＠シ真コ６シ、００ｇｃ。

ｐｌ−７５１２００１２ｍＯ１２ＢＤｏ１０２４ｊ）０　１６００　５１２１Ｘ ｌ　５１２００　５１２００　８００吐δ＜＜４００＜＜＜１１００＜＜ ｐｌ−９６４００’５２００６４００＋２６００１Ｚ８ＤＯ６Ａ４）０１１ｘｍ ６４００１６００ｐ＋−１０１６００＜＜３２００＜＜ＮＸＪ６４００５２００ ｐ＋−４１＜＜＜ｆｒＱ４ｔ１ｏ＜２５６００１２１Ｅ０２５６０１１２５６１ Ｘ＋ｐ＋−１２＜＜＜＜（＜３２００（＜ ｐｌ−１３６４ｊ１０６１−ＤＯＸ２ｊＸ）５ｔ？ｏｏ１６００２５６００５１ ２００１０２４００ｊ２１ｆｆｉ。

ｐｌ−１３１１＜４００３０１コ＜＜＜１６００８ＣＫ１１６００全ての番号は 、反応力価の逆数を示してし）る、全ての反応力価逆数は、正常マウス血清を用 ４ｔで算出した。

全抗体反応は、ＩｇＧ＋ＩｇＭ ＜　＝　＜　ｌ　／　２００ Ｐ１ペプチド順に対して作製したウサギ抗血清の免疫化学特性抗血清 特異的ＥＬＩＳＡ類　ウェスタンプロット免疫原　ペプチド　ｐｌ　ｐｔ ＨよりＭ−２ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳ Ｉ（よりＰＩ−２−口　ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳ旧ＢＰ１−３　ＹＥＳ　Ｎｏ　Ｙ ＥＳ ＨよりＰＩ−３−ＫＬＨＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳＨよりＰＩ−４ＹＥＢ　πＢ　Ｙ ＥＳ ＨよりＰＩ−４−ＫＬＨＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳＸＩＢＰ　１−５　ＹＥＢ　ＹＥ １３　ＹＥＳ［ＢＰ　ｌ−５−ＩＣＪ　ＹＥＢ　ＹＥＢ　ＹＥＳＲよりＭ−６Ｙ ＥＳ　Ｎｏ　Ｎ。

ＨＩＢＰＩ−６−ＫＬＨＹＥＳ　Ｎｏ　Ｎ。

ＨｒＢＰｌ、−７ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳ［ＤＰｌ、−７−４ＣＪ　ＹＥＢ　ＹＥ Ｓ　ＹＥｆｌＨＩＢＰＩ−８Ｎｏ　Ｎｏ　Ｎ。

ＨよりＰＩ−８−ＫＬＨＮｏ　Ｎｏ　Ｎ。

ＨＸＢ７？１−９　ＹＥＳ　ＹＥＳ　ＹＥＳＨよりＰＩ−９−４ＣＪ　Ｙ部　Ｎ ｏ　江ＳＨよりＰＩ−１０ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳＩ［ＩＢＰｌ−４０−ＫＩＪＩ 　ＹＥＢ　Ｙｌ！Ｓ　ＹＥＳＨよりＭ−１３，ＹＥＳ　ＹＥＳ　ＹＥＳＩＩＸＢ Ｐｌ−１１−ＫＩＪＩ　ＹＥＥＩ　ＹＥｓ　ＹＥＳＨＩＢＰＩ−１，２ＹＥＳＮ ｏ　ＹＥＳＨよりＰＩ−］、２−ＫＬＨＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳＨ工ＲＰ’Ｌ−１ ，３ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥＳ）（ＩＢＰＩ−１３−ＫＩＪＩ　ＹＥＳ　Ｎｏ　ＹＥ Ｓ参考文献 Ｌ　Ｂａｒｅｎｋａｍｐ　ｅセミ１．　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ−、、ｌ ｆｉ、　６６Ｂ、　（１９８１）２、　Ｇｏｎｚａｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、Ｉｎｆ ａｅｔ、、工ｍｍｕｎ、５５．　２９９３．　（１９８））３、Ｇｏｒｄｏｎ、 　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、　４，４９６，５３８４、Ｇｒａｎｏｆｆ　 ｅｔ　ａｌ、　、”ムｌ四ユ江Ｌ１ｉｘ江り鵡ユ■旦ｉｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇ ｙ、ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｐｒａｖａｎｔｉｏｎ　ｏｆｄｉｓａａｓ ｅ、”　Ｅ工５ｅｖｉａｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　１９８２５、Ｇｒａｎｏｆ ｆ　ａｔ　ａｌ、、　、ｒ、工ｎｆｅｃ凱Ｄｉｓ、、　耳は、　４４Ｂ、　（１ ９８６１６＋　工ｎｏｕｙａ、　Ｍ＋、　ｐｅｒｓｏｎａｌ　ｃｏｍｍｕｎｉｃ ａｔｉｏｎ７、Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、　、ｆｆ、　Ｍｏｂ、 　Ｂｉｏｌ、、　Ｌ２：Ｌ、　１０５．　（１９８２）８、Ｌｏａｂ、　Ｉｎｆ ｅｃｔ、　工ｍｍｕｎ、、　５５２６１２．　（１９８７）９．２イａｓｕｉ、 　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　ｉｎ　”Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｏｎ　ｏｆｃａｎｅ　Ｅｘｐｒａｓｓｉｏｎ”、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ５５ｇ、　１９Ｂ３．　ｐａｇｅ　１５−３２１０、Ｍｕｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｇ ｒａｓｓ、工ｎｆａｃｔ、　工ｍｍｕｎ、、　皿、　２２３５．　（１９８８） １１　Ｍｕｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｎｆｅｃｔ、　工ｍｍｕｎ、、　皿、 　３３００．　（１９８９）１．２−　Ｔｈｏｌｅ　ｅセミ１．、　Ｉｎｆｅｃ ｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　５ｆ２．、１６：ｌη（１，９８８）１コ、　Ｍａｎｊａ ｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、、　阿ｏ１ａｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ；　ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｐ ｒｅｓｓ　（１９８２）１４、Ｍａｒｒｎｕｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、 、ユ、　２０Ｂ、　（１９６１）１５、Ｍｕｎｓｏｎ　＆　Ｔｏｌａｎ、工ｎｆ ａｃｔ＋工ｍｍｕｎ、　：ＬＬ、　８Ｌ　（１９８９）１６、　Ｐｒｏｕｌｘ　 ａｔ　ａｌ、、ｓｕｂｍｉセｔａｄ　（１９９０）１７、　５ｉｌｈａｖｙ　Ｑ ｔ　ａｌ、、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｇａｎｅ　ｆｕｓｉｏｎ、 　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｊ　ｑｂｏｒａｔｏｒｙ１８、Ｓｔ ｅｗａｒｄ　ａｎｄ　Ｉ（ｏｗａｒｄ、工ｍｍｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ、　ｆｌ 、　５７．　（１９８７）６υ　、、−、、、、、、、、、、、、、、、、、、 、、、、、、、、、、、Ｔ、、Ｇ、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、 、、。

６０　、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、−、、、、、−、−、、、 、、、、−−−０−−−１０．−−−１−０．−−０−−０Ｆ工ＧＵＲＥ　ｌａ Ｆ工ＧＵＲＥ　１ｂ ＩＬ　、、、、、、、、、、、、、、、、、０．−、−０．−０．−１．−−６ ．−−０．−−−０−８−−０．−８．−−−−−−−９゜Ｆ工ＧＵＲＥ　ｌｃ Ｐ工ＧＵＲＥ　１ｄ ９４　Ｋ　嘲− ６７Ｋ　・ ２０、Ｉ　Ｋ　・ Ｉ４゜４Ｋ　・ Ｆ工ＧＵＲＥ　３ ｐＰｓＭ７３４ 区習因−−−−−−−−−−、、−％コーＰ工ＧＵＲＥ　４ Ｐａｒｔｉａｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｉ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ 　５ｔｒａｉｎ　ＭｉｎｎＡ　（ＯＭＰ　５ｕｂｔｙｐｅ　P８）。

Ｐ工ＧσＲＥ５ Ｆ工ＧＯＲＥ　６ 国際調査報告 ＋−１−＋、＝−１＋　Ａｅｅｈｔ−１＋−Ｎ−ＰＣＴ／ＣＡ　９０１００３７ ４国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．第１図の誘導アミノ酸配列またはそれに実質的に相同の誘導アミノ酸配列を 有するインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚｚａｅ） ｂ型由来遺伝子工字処理された外膜タンパク質Ｐ１。
2. ２．前記インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ） ｂ型がＭｉｎｎＡ株（ＯＭＰサブタイブ１Ｈ）、８３５８株（ＯＭＰサブタイブ ６Ｕ）および１６１３株（ＯＭＰサブタイブ３Ｌ）から選択されることを特徴と する請求の範囲第１項に記載のタンパク質。
3. ３．第１図のヌクレオチド配列またはそれに実質的に相同のものを有する遺伝子 の断片または変異体であり、かつ、ベクター中で発現されると、インフルエンザ 菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の天然タンパク質の 免疫特性の少なくとも部分を保有するタンパク質またはペプチドを提供する遺伝 子。
4. ４．インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型 のゲノム中に染色体的に再組み込みされた変異Ｐ１遺伝子であることを特徴とす る請求の範囲第３項に記載の遺伝子。
5. ５．請求の範囲第３項または第４項に記載の遺伝子から産生された遺伝子工学処 環されたタンパク質またはペプチド。
6. ６．インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型 の天然Ｐ１タンパク質の免疫特性の少なくとも部分を保有するタンパク質または ペプチド。
7. ７．有機体からの発現によって産生される請求の範囲第６項に記載のタンパク質 またはペプチド。
8. ８．合成的に産生される請求の範囲第６項に記載のタンパク質またはペプチド。
9. ９．インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型に 対するワクチンで、薬剤学的に許容できるそのための担体中の請求の範囲第６項 に記載のタンパク質またはペプチドからなることを特徴とするワクチン。
10. １０．前記タンパク質またはペプチドが担体タンパク質に結合している請求の範 囲第９項に記載のワクチン。
11. １１．インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ 型に対する結合ワクチンで、ヘモフイルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）生物体の 莢膜多糖部分に結合した請求の範囲第１項に記載のタンパク質からなるワクチン 。
12. １２．放熱Ｐ１タンパク質のアミノ酸残基６０から８８、１６５から１９３、１ ８９から２１８、２２６から２５３、２４８から２８３、３０７から３３１、３ ３９から３７０、３８４から４１２、または４００から４３７に対応するアミノ 酸配列を有する免疫原性合成ペプチド。
13. １３．請求の範囲第１２項に記載の合成ペプチドおよびそのための担体タンパク 質からなる結合物。
14. １４．アミノ酸航の点でインフルエンザ菌（インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈ ｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型の天然Ｐ１タンパク質に対応するタンパ ク質をベクター中で産生する方法で、 ｐＲＳＭ２９１，ｐＲＳＭ７３４およびｐＲＳＭ７９３から選択されたＰ１遺伝 子を含有するプラスミドを構築すること、前記プラスミドで有機体を形質転換す ること、および前記形質転換有機体からＰ１タンパク質を産生することからなる 方法。
15. １５．インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ型 の生物体的に純粋な天然のＰ１タンパク質。
16. １６．インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）ｂ 型が原因の疾患による感染の診断におれる請求の範囲第６項に記載のタンパク質 の使用。