JPH05501419A - 生体適合性、両親媒性ポリマー混合物中の細胞、細胞―様物質および小板の凍結乾燥法 - Google Patents
生体適合性、両親媒性ポリマー混合物中の細胞、細胞―様物質および小板の凍結乾燥法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
生体適合性、両親媒性ポリマー混合物中の細胞、細胞一様物質および小板の凍結
乾燥法
発明の分野
本発明は生化学および医学の一般的分野に係わり、より詳しくは細胞、特に赤血
球および小板並びに細胞一様物質（例えば、ヘモソーム（ｈｅｍｏｓｏｍｅｓ
））の保存、貯蔵並びに復元法に関するものである。
本発明の背景および概要
種々の植物および動物細胞に関連して、実験室での細胞の保存および貯蔵は重要
な問題である。水性溶液中で細胞を凍結し、その使用前に該細胞を解凍すること
は通常みられないことではないが、この工程後の該細胞の生存率が影響される可
能性かある。更に、細胞を凍結状態に維持するための経費は、特に該凍結細胞を
一１９６℃に維持するために液体窒素を使用する場合には重大である。液体窒素
による貯蔵は、膨大な数の凍結サンプルまたは細胞培養血統種を維持しなければ
ならない場合には面倒である。
例えば、血液および血液成分の改良された貯蔵法に対する需要がある。肺から抹
消組織に酸素を搬送するという主要な役割はエリスロサイト即ち赤血球（ＲＢＣ
）により果たされる。酸素は、ヘモグロビンと呼ばれる赤色の鉄−含有蛋白によ
る交換−拡散系により肺から供給される。該ヘモグロビンは成熟赤血球中の全細
胞蛋白の大部分を構成する。ヘモグロビンが酸素と結合した場合、オキシヘモグ
ロビンが形成され、酸素が組織に渡された後、該オキシヘモグロビンはデオキシ
ヘモグロビンに還元される。
赤血球膜は２種の主な構造単位、即ち２重層膜および細胞骨格を含む。脂質２重
層および内部膜（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ）蛋白が該膜２重層を形
成し、これは殆ど構造強度をもたず、小胞化（ｖｅｓｉｅｕｌａｔｉｏｎ）によ
り容易にフラグメント化する。もう一つの主要な成分、該膜骨格は該膜２重層を
安定化し、かつ変形に対する抵抗性を与える。この細胞骨格は、多分脂質−蛋白
並びに蛋白−蛋白会合により、該エリスロサイト膜中の２重層に結合している。
ヘモグロビンおよび他のＲＢＳ成分は該赤血球膜内に含まれている。
成人において、骨髄は活発に新たな赤血球の形成を行う。一旦新鮮なエリスロサ
イトが血液中に入ると、該細胞は約１２０日という平均寿命をもつ。平均的なヒ
トにおいて、該エリスロサイトの約０．８３％が食作用、溶血または身体の機械
的破損により毎日破壊され、該減少分の細胞は骨髄から新たに供給される。
様々な傷害や医学的処置は全血または種々の血液成分の輸注を必要とする。全て
の患者が全血を必要とする訳ではな（、事実血液成分全ての存在は医学的問題を
起こす可能性がある。分離血液画分は、輸注の時点においてその生物学的活性を
保証するのに最も適した特定の条件下で貯蔵できる。例えば、ドナー血液を処理
センターが受け取った際に、エリスロサイトを分離して、種々の方法で貯蔵する
。このような細胞は、一般に２００〜３００ ｍｌの体積およびヘマトクリット
（小体容積％で表して）７０〜９０を有する包装されたエリスロサイト単位とし
て、４℃にてシトレート／ホスフェート／デキストロース中で５週間貯蔵できる
。エリスロサイトはまたグリセリンで処理し、次いで＝３０〜−１９６℃で凍結
し、グリセリン溶液中で７年まで貯蔵できるが、輸注に対して十分な生存率を得
るためには、低温で凍結状態を維持しなければならない。これら２つの方法は貯
蔵温度を注意深く維持して、該エリスロサイトの所定の生物学的活性の劣化を防
止することを必要とする。通常の実務では、−８０℃の機械的フリーザー中で、
４０ｗ／ｖ％のグリセリン中で、包装した赤血球を凍結貯蔵することを含む。輸
注前に解凍した細胞を滅菌塩水で十分に洗浄して、該グリセリンを除去する必要
がある。このグリセリン凍結−解凍法は輸注細胞の少な（とも７０％に対して２
４時間の生存時間を与えるが、この値はアメリカンアッソシエーションオブブラ
ッドバンク（Ａｍｅｒｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ
Ｂａｎｋ）基準に従って輸注実務で使用するのに許容されるレベルであると思わ
れる。
かくして、特定の貯蔵温度の保持または他の貯蔵条件の保持に依存しない、細胞
、特に赤血球の貯蔵方法を開発することは切実な要求であった。このような方法
は医学上の目的のためにエリスロサイトおよび小板の入手性を容易にし、かつ研
究並びにハイブリッド細胞培養物発育のために種々の哺乳動物細胞および植物細
胞、特に原形質体の貯蔵および輸送に役立つであろう。
このような望ましい方法の一つは細胞の凍結乾燥であった。というのは、凍結乾
燥された細胞は長期間に渡り室温で貯蔵し、使用に際して容易に復元できるから
である。凍結乾燥された細胞（例えば、エリスロサイト、小板またはヘモソーム
などの細胞一様物質）はかくして輸注で使用するために容易に貯蔵できる。しか
し、本発明以前には、エリスロサイトの場合に、該細胞の復元を可能とし、真の
細胞膜、細胞骨格および生物学的に活性なヘモグロビンを有するエリスロサイト
、即ち生きた赤血球を形成することができるように細胞を凍結乾燥することは実
際上実施不可能であった。ＲＢＣを上記の方法で、例えば水性溶液または燐酸緩
衝塩水（ＰＢＳ）中で凍結乾燥した場合、復元された細胞は代謝し得ず、該細胞
のヘモグロビンは酸素を搬送せず、復元の際に溶解し、力り輸注には利用できな
い程度まで該復元細胞は破壊される。グルタルアルデヒドで固定したエリスロサ
イト（これは凍結乾燥されカリ復元されたもの）は、主としである細胞表面抗原
のみの保存が望まれる凝集アッセイでの用途が見出された。これらの固定化細胞
は代謝的には非生存であり、かつ輸注医薬での使用には適さない。
本発明の方法は、細胞の構造および生物学的活性に無害な条件下で赤血球または
小板の凍結乾燥を可能とし、しかも該凍結乾燥した赤血球または小板を復元した
際に、新たに収集された細胞にみられる生物学的活性が有用なレベルで保存され
ている細胞を形成することを可能とする。細胞は生体外培養、抹消血液細胞、血
液幹細胞、あるいは細胞一様物質例えばリポソーム、ヘモソームもしくは細胞膜
ゴースト由来のものであり得る。更に、該細胞は哺乳類細胞、ノゾブリドーマ細
胞または任意の他の型の細胞であってもよい。
簡単にいえば、本発明の方法は、複数の細胞を炭水化物および少な（とも２種の
両親媒性ポリマーの混合物を含む本質的に等張性の水性溶液中に浸漬し、該溶液
を凍結し、該溶液を乾燥して、復元した際に有意な割合で完全なかつ生きた細胞
を与える凍結乾燥細胞を得る工程を含む。
本発明は広範な動物および植物細胞に適用できるが、本発明の方法は好ましくは
赤血球または小板に適用され、該細胞の構造およびヘモグロビンの生物学的活性
を維持し、かつ凍結乾燥された赤血球または小板を復元して治療レベルでの使用
を可能とする条件下で該細胞を凍結乾燥することを可能とする。本発明で使用す
る炭水化物は生物学的に該細胞と適合し、即ち該細胞に対して無毒かつ非破壊性
であり、かつ該細胞の膜を透過もしくは透過し得るものである。このような膜透
過性の炭水化物は明らかにオキシヘモグロビンを包含する細胞間成分を凍結およ
び乾燥障害から保護する。
このような炭水化物は重着類からなる群から選ぶことができる。というのは、２
単糖類は有意な程度に該層を透過しないように思われるからである。単糖類のペ
ントースおよびヘキソースは約７．０〜３７．５％、好ましくは約２３％の濃度
で使用することが好ましい。キシロース、グルコース、リボース、マンノースお
よびフルクトースが特に有利に使用される。
該炭水化物と共に水溶性の生物学的に適合性の両親媒性ポリマー混合物を使用す
ることは、（赤血球の場合）細胞中に残されるかつ凍結乾燥した赤血球の復元後
に回復される生物学的に活性なヘモグロビンの割合を大幅に高める。細胞ヘモグ
ロビンの維持は細胞の溶解または漏出に関する容易なアッセイをもたらし、本発
明のポリマーの使用は細胞ヘモグロビンの損失を最小限度にし、結果として細胞
の一体性を保存するものと思われる。このポリマーは、好ましくは両親媒性であ
り、このことは該ポリマーの単一分子内に親水性部分と疎水性部分とが存在する
ことを意味する。該ポリマー混合物は緩衝された凍結乾燥溶液中に、０．７％（
重量基準）乃至飽和までの濃度で存在することができる。好ましくは、該混合物
中の各型のポリマーの各々は約ＩＫ〜６００Ｋ Ｃ数平均分子量）の範囲内の分
子量を有する。好ましくは、該混合物中のポリマーの型の少な（とも一つは好ま
しくは約５に〜４００におよびより好ましくは２０に〜３６（ＩＫの範囲の分子
量を有する。また、該混合物中のポリマーの型の一つは好ましくは約１００に〜
約６００Ｋ、より好ましくは約１００〜５００にの範囲の分子量を有する。２種
の異なる型のポリマーを含む混合物に対して、該ポリマーの各々は約０．３５％
（重量基準）乃至該緩衝凍結乾燥溶液に対する溶解度の限界までの濃度で存在で
きる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ） 、ポリビニルピロリドン誘導体、デキ
ストラン、デキストラン誘導体、アミノ酸を主成分とするポリマー（即ち、蛋白
）およびヒドロキシエチル澱粉（ＨＥＳ ）からなる群から選ばれるポリマーを
使用できる。他の両親媒性のポリマー、例えば種々の形状におけるポロキサマー
（ｐｏｌｏｘａｍｅｒｓ）を使用してもよい。好ましい態様においては、ＰＶＣ
（約２０Ｋ 〜３６０Ｋ（７）範囲ノ分子量を有ｔル） トＨＥＳ （約１００
に〜５００に）範囲の分子量を有する）との混合物を該緩衝された凍結乾燥溶液
中で使用する。
赤血球の凍結乾燥における炭水化物−ポリマー溶液の使用は、完全な細胞の回収
を可能とし、該細胞のかなりの割合が生物学的に活性なヘモグロビンを含む。
いかなる特定の理論にも拘泥するつもりはないが、該ポリマーの両親媒性は該ポ
リマーが細胞膜に結合することを可能とし、しかもその親水性部分を該水性環境
に伸ばすことにより該層の表面を保護することを可能とする。このことは該細胞
膜の損傷を軽減する。該細胞膜の損傷は他の問題、例えば細胞凝集を引き起こす
。
更に、凍結乾燥緩衝液並びに復元緩衝液または洗浄用緩衝液は更にいくつかの補
充物を含むことができ、該補充物は該細胞が赤血球、小板、白血球、幹細胞を包
含する細胞状血液物質、あるいは他の細胞一様物質、例えばリポソーム、ヘモソ
ームまたは膜ゴーストなどである場合に特に有用である。理論に拘泥するつもり
はないが、該補充物は３つのカテゴリーに分けられ、ある様式で凍結乾燥、復元
または洗浄工程を改善するように機能するものと考えられる。補充物の一つの組
は酸化防止剤、例えばグルタチオンまたはα−トコフェロールなどを含む。この
ような酸化防止剤は、細胞の酸化による損傷（例えば、細胞膜脂質の過酸化など
）の低減を援助する。この酸化による損傷は凍結乾燥中または復元中に起こる可
能性がある。補充物の第二の組はＥＤＴＡまたはデフエリオキサミン（ｄｅｓｆ
ｅｒｒｉｏｘａｍｉｎｅ）などの錯化剤を含み、これらは細胞ヘモグロビンの分
解により放出される遊離の鉄を捕獲する能力を有する。この遊離の鉄またはヘミ
クロム（ｈｅｍｉｃｈｒｏｍｅｓ）は、細胞の酸化損傷を触媒する可能性がある
ことから有害である。補充物の第三の組はアミノ酸を主成分とするポリマー（即
ち、ペプチドおよびタンパク）、例えば被覆剤として機能して、細胞の表面を被
い、結果として細胞−細胞凝集物の形成を最／Ｉｎヒする血清アルブミンなどを
含む。
特に好ましい補充物は、好ましくは緩衝液（凍結乾燥、復元または洗浄用緩衝液
の何れか）中で１〜６０−の濃度のグルタチオン（ＧＳＨ） 、好ましくは１〜
３■／ｇＲＢＣの濃度のα−トコフェロール、好ましくはｌ−１０−の濃度のＥ
ＤＴＡ、Ｉ ＳＩＯｒｆＭの濃度のデフエリオキサミン、および０．５〜１４％
（＊／ｖ）の濃度のアルブミンを含む。
ヒトまたはウシ血清アルブミンが好ましい。
以下の態様に示されるように、記載される溶液は、細胞特に赤血球を凍結、水の
昇華および復元のストレスに付すことを可能とし、また復元して正常に機能でき
る細胞を得ることを可能とする凍結乾燥された細胞を形成することを可能とする
媒体を与える。
用語論的にあるいは文章で特に述べない限り、ここに示す全ての％はＷ／Ｖ％（
即ち、溶質の重量対溶液の全体積）である。
図面の簡単な説明
第１図は、本発明に従って凍結乾燥され、かつ復元されたＲＢＣおよび凍結乾燥
されていないＲＢＣの試料中のメトヘモグロビンの半−減期のグラフであり、第
２図は、本発明に従って凍結乾燥され、かつ復元されたＲＢＣおよび凍結乾燥さ
れていないＲＢＣ中のメトヘモグロビンの経時線形回帰のグラフである。
好ましい態様の説明
上記の如く、本発明の方法はエリスロサイトの凍結乾燥用媒体を与える。
用語凍結乾燥とは、ある物質を凍結し、次いで溶媒の１つ、即ち水を昇華および
脱着により、最早生物学的および化学的反応を維持できないレベルまで減するも
のとして広い意味で定義される。通常、乾燥工程は高真空下で達成される。しか
し、細胞および特にエリスロサイトの貯蔵に関連して、乾燥の程度（残留水分の
量）は、細胞が長期に渡る室温での貯蔵に耐え得る能力において極めて重要であ
る。本発明の方法において、細胞は残留水含有率が１０％未満、好ましくは５％
未満および最も好ましくは３％未満までに凍結乾燥できる。
緩衝された凍結乾燥溶液は、単糖類および両親媒性ポリマー混合物の他に、アジ
ュバント、緩衝剤、塩、補助因子などを含むことができる。特に好ましい凍結乾
燥緩衝液は以下の成分を含む。
１０．０ 菌 グルタチオン（還元）３．０７ｇ／ｌｔｏ、ｏ ｍＭ イノシン
２．６８ ｇ／１５．０ｍＭ アデニン ０．６９ ｇ／１０．７５ｍＭ ニ
コチン酸 ０．０９ｇ／１０．７５− グルタミン ０．ｌ１ｇ／１０．４９ｍ
Ｍ ＭｇｃＩｔ書６Ｈｔ０ ０．１０ ｇ／１１．４７ ｍＡ Ｋ）ｂＰＯ＜
０．２０ ｇ／１８、１ ｍ１ｉｌ Ｎａ２ＨＰＯ４” ７ Ｈｔｏ ２．１７
ｇ／１１．７ Ｍ デキストロース ３０６．３ ｇ／１３、Ｏｖｔｔ／ｖ％
ＰＶＰ （Ｍｗ ３６０Ｋ） ３０．０ ｇ／１１５、Ｏｗｔ／ｖ％Ｍ−１（
ＢＳ （！ｌ１ｗ ５００Ｋ） １５０．０ ｇ／ｌ典型的な凍結乾燥法におい
て、全血または包装した赤血球は、白血球を含まない包装された赤血球を得るよ
うに工夫された自動化プロトコールにより、Ｃ０ＢＢ ２９９１細胞洗浄器上で
デキストロース塩水で洗浄される。
この細胞を３０％〜４０％のへマドクリットにて凍結乾燥用緩衝液と混合する。
この凍結乾燥用緩衝液は、上記のようなものであって、表１に示した各テストで
使用するポリマー混合物を含む。コントロールとして、−実験を該ポリマーとし
て２０％２４Ｋ ＰＶＰのみを使用して実施した。
次に、試料を公知の薬品用棚型凍結乾燥器に入れ、該試料を冷凍された棚上で凍
結し、次いで真空引きし、該試料が５８％の重量損失を示すまでに十分に乾燥さ
れるまで該試料を乾燥する。
該乾燥試料を復元するために、等量の予め３７℃に温めた復元用緩衝液を該試料
に添加し、試料が十分に水和されるまで撹拌する。好ましくは、該復元用緩衝液
は、該凍結乾燥用緩衝液に関連して上記したようなポリマー（好ましくは、約１
〜２０ｗｔ％の濃度）を含み、該ポリマーは１〜６００Ｋ、好ましくは１〜３６
０にの範囲内の畑を有する両親媒性のものである。
好ましい復元用の緩衝液は以下のとおりである。
５、ＯｍＭ ＡＴＰ ２．７６ｇ／１
１．４７ ｒｄＡ ＫＨ２ＰＯ４０，２０ｇ／１８、ｌ ｍＡ Ｎａ２ＨＰＯ４
＠ ７ ＨｔＯ２゜１７ ｇ／１１９．０ ％ ｌ０ＫＰＶＰ １９０．Ｏｇ／
ｌテストのために、復元試料を等量の復元用緩衝液で予備希釈し、十分に混合さ
れるまで撹拌する。該復元されかつ予備希釈された細胞を室温にて遠心分離に掛
ける。
もう一つの復元用緩衝液は以下のとおりである。
２．０ ｍＭ ＫＣＩ ０．１５ｇ／１１．４７ − ＫＩ（ｔＰＯａ ０．２
０ ｇ／１１００．７ ｍＭ ＮａＣ１６，４７ｇ／１８．１ −Ｎａ、ＨＰＯ
，１，１５ｇ／１１９．０ ％ ２４ＫＰＶＰ １９０．Ｏｇ／ｌこの復元試料
を等量の復元用緩衝液で予備希釈し、十分に混合されるまで撹拌する。この時点
で該細胞懸濁液はＣ０ＢＢモデル２９９１細胞洗浄器などの滅菌密閉式細胞洗浄
装置に無菌的に移すことができる。該復元されかつ予備希釈された細胞を室温に
て遠心分離に掛けて該細胞を回収する。
得られるペレットを洗浄用緩衝液に再懸濁し、遠心分離する。該洗浄用緩衝液は
、該凍結乾燥用緩衝液に関連して上記したようなポリマー（好ましくは、約１〜
２０ｗｔ／ｖ％の濃度）を含み、該ポリマーは１〜６００に、好ましくはｌ 〜
３６０にの範囲内の麹を有する両親媒性のものである。
好ましい洗浄用緩衝液は以下の通りである。
１０．０ ｍＭ イノシン ２．ｅｓｇ／１５．０ 菌 アデニン ０．６９ｇ
／１０．７５酬 ニコチン酸 ０．０９ｇ／１０．７５− グルタミン ０．１
１ ｇ／１０、４９ ｒｒＭ ＭｇＣＩｔ ・６ＨｔＯＯ，１０ｇ／１３０．０
ｍ ＫＣＩ ２．２４ ｇ／１３０．０ ｍＭ ＮａＣｌ １．７５ｇ／１１
０．０ ［ＯＭ Ｎａｇ）ｆＰＯｓ ” ７ Ｈｔｏ ２．６８ ｇ／１２０．
０ 酬 グルコース ３．６０ｇ／１１６．０ ％ ４０ＫＰＶＰ １６０．Ｏ
ｇ／ｌもう一つの洗浄用緩衝液は以下の通りである。
１０．０ ｒｒＭ イノシン ０．１５ ｇ／１５．０ 酬 アデニン ０．６
９ｇ／１０．７５ｍＭニコチン酸 ０．０９ ｇ／１０．７５ｍＭ グルタミン
０．１１ｇ／１０．４９ ！ｉ１ｇｃｌｚ・６Ｈ２００，ｌｏ ｇ／１５、
ＯＫＣＩ ０．３７ ｇ／ｌ
？５．ＯｍＭ ＮａＣ１４，４０ｇ／１１０．３ ７ Ｎａｇ）Ｄ’０４１．４
６ ｇ／１２０．０ − グルコース ３．６０ｇ／１１６．０ ％ ２４ＫＰ
ＶＰ １８０．Ｏｇ／ｌ随意の工程として、あらゆる脆弱な細胞を除去するため
の希釈緩衝液工程を含む。該ペレットを希釈緩衝液に１０〜５０倍の希釈率で再
懸濁し、遠心分離する。
好ましい希釈緩衝液は以下の通りである。
１２９．５ ｔｒｊＡ ＮａＣ１７，５７ｇ／１５、Ｏｍ Ｎａ！）ｔＰＯ４−
７ｎｔｏ １．３４ ｇ／ｌ別の希釈緩衝液は以下の通りである。
６１、１ − ピロリン酸ナトリウム １６．２３ ｇ／１１．１９ ７ ＫＣ
Ｉ ０．１５ ｇ／１０．８８ ｄ Ｋｌｆ囮４０−１２ｇ／１１１．１ ｄｉ
ＮａＣ１０，６５ｇ／１４．８６ ｔＭ ＮａｔＨＰＯｔ ０．６９ ｇ／１
８．８９ ｍＭ ＡＴＰ ４．９ ｇ／ｌこのペレットを最終溶液、即ち輸注緩
衝液に再懸濁し、遠心処理する。この工程を１回繰り返す。この輸注緩衝液は好
ましくは該凍結乾燥用緩衝液に関連して上記したようなポリマー（好ましくは、
約１〜２０ｗｔ／ｖ％の濃度）を含み、該ポリマーは１〜６００Ｋ、好ましくは
１〜ＩＯＫの範囲内の−を有する両親媒性のものである。
好ましい輸注緩衝液は以下の通りである。
７７、ＯｍＭ ＮａＣ１４，５０ｇ／１５、ＯｍＡ Ｎａ２ＨＰＯ４” ７ Ｈ
ｔｏ １．３４ ｇ／１ＩＯ００−グルコース １．８０ｇ／ｌｌｏ、０ ％
２．５Ｋ ＰＶＰ １００． Ｏｇ／ｌ別の輸注緩衝液は以下の通りである。
６８．４ ｍ ＮａＣ１４，００ｇ／１５．０ ｍ！ｔｌ Ｎａ、ＨＰＯ４０，
７１ｇ／１１０、ＯｒｆＭ グルコース １．８０ｇ／１１０．０ ％ ２．５
ＫＰＶＰ １００．Ｏｇ／ｌヘモグロビンの回収率を測定するために、細胞の試
料２００μｌを５分間５０００ｒｐｍにて遠心処理する。得られるペレットと上
澄液を分離し、該ペレットに１８０μｌの水を添加し、撹拌して溶解させる。各
試料に、１ｍｌのドラブキンス（Ｄｒａｂｋｉｎｓ ）試薬を添加し、室温にて
１５分間放置した後、５４０ ｒｉｍでの吸光度を測定する。
回収率＝Ａ６４゜ペレット／Ａｓ＜。ペレット＋Ａ１４゜上澄液。
復元細胞の全血安定性を測定するために、クロム酸ナトリウムとしての５１Ｃｒ
の１ａＩＣ４／ｍｌ無菌ＮａＣ１溶液を復元細胞の試料に添加する。５μＣｉの
Ｓ ＩＣｒを包装したＲ１１ｌＣペレット各０．１ｍｌに添加する。この標識し
たペレットを３７℃にて１５分間インキュベートし、その後ペレット各０．１ｍ
ｌにｌμｌのアスコルビン酸（緩衝液中５０■／ｍｌ）を添加することにより該
標識反応を停止する。次いで、該ペレットを室温にて更に５分間インキュベート
する。次に、該標識試料を輸注緩衝液で２〜３回洗浄する。該標識細胞のアリコ
ートを次に自己由来の全血５の１に移し、２４時間までの標識細胞の溶解により
安定性を測定する。
遠心処理後に上澄液中に存在する遊離５１Ｃｒの量は溶解した細胞の量を示す。
便宜的に、４一時間のインキュベートを利用する。というのは、溶解が（あると
すれば）これまでに完了するからである。
（”Ｃｒｈレーサーを使用した）細胞安定性のデータは凍結乾燥かつ復元された
赤血球の安定性並びに保全性を示す。ｓ＋Ｃｒは細胞内ヘモグロビンに結合し、
該細胞が溶解されるとアッセイ上澄中に遊離する（即ち、失われる）。かくして
、ペレット中の５ＩＣ，の保持は細胞の保全性の尺度となる。高い細胞安定性は
、診断用途および輸注医薬用途において有用な十分な細胞保存性を示す。
以下の実施例は例示の目的で与えられる。
実施例１
上記の方法を使用して、凍結乾燥し、復元したヒト赤血球をテストした。赤血球
を一種のポリマーまたはポリマー混合物を使用して凍結乾燥し、Ｓ ＩＣｒ標識
した復元細胞の全血安定性を調べた。この復元細胞は実施例２に記載するような
自動細胞洗浄器を使用して処理した。結果を以下（表■）に記載する。
２０ｊｉ ２４Ｋ ＰＶＰ （）ントｏ−ル） ２４．３ ＋２．２％８７．６
±６．２ｆｉ’ ５０．５＋１５．５％５％ ２４Ｋ ＰＶＰ、 １５％５００
Ｋ ＨＥＳ ２７．３ ＋２．０％７４．７ ＋１１．３ｆＩ！７３．７＋ ９
．６％１０ｉ％ ２４Ｋ ＰＶＰ、 ｌｏｇ ５００Ｋ ＨＥＳ ２ｇ、１ ＋
２．７％Ｆ ８４．３ ＋ ８．１ｆｌ！ ６７．８＋ ９．５％１０％２４Ｋ
ＰＶＰ、 ５％ ５００Ｋ ＨＥＳ ２３．２％ ６７、ＯｆＩｌ、７８．７
％ポリマー混合物を使用することにより、凍結乾燥し、復元した赤血球の全血安
定性は、単独のポリマー（ＰＶＰ ）を使用した場合と比較して著しく改良され
ることを理解できる。
器内で、ヘマトクリット３０％にて凍結乾燥緩衝液と混合する。この凍結乾燥緩
衝液は上記のもので、使用したポリマー混合物は３ｘの３６０Ｋ ＰＶＰおよび
１５％の５００Ｋ ＨＥＳを含む。
次いで、該容器を標準的な棚式凍結乾燥器（ビルティス（ｖｉｒｔｉｓ） ５Ｒ
Ｃ−１５ライオフイライザー（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｒ））に入れ、凍結する。
次に、該凍結試料を１０〜３０ミリトールの真空下に置く。この試料を、５８±
２％の減量で乾燥する。この試料を室温に戻し、真空を解除する。
該乾燥試料を復元するために、等量の３７℃に予備加温した復元用緩衝液を試料
に添加し、該試料が十分に水和されるまで撹拌する。
この復元用緩衝液は実施例１で使用したものである。
この復元した試料を等量の復元用緩衝液で予備希釈し、十分に混合されるまで撹
拌する。該復元かつ予備希釈された細胞をＣ０ＢＥ ２９９１ブラッドセルウオ
ッシャ−（Ｂｌｏｄ Ｃｅ１ｌ Ｗａｓｈｅｒ）に移し、３０００ ｒｐｍで２
０分間遠心処理し、この操作を該復元用緩衝液の全容量がコーベバッグ（Ｃｏｂ
ｅ ｂａｇ）に添加されるまで繰り返す。該セルウオッシャ−の自動化プロトコ
ールに従って、実施例１記載の以下の溶液を使用して該細胞を洗浄する。
１、洗浄緩衝液＋ ５００ ｍｌ、ＩＸ、３０００ ｒｐｍ、２０分：２、 ペ
レットを希釈緩衝液で洗浄： ５００ ｍｌ、ＩＸ、３０００ ｒｐｍ、５分；
３、輸注緩衝液： ５００ ｍｌ、４Ｘ、３０００ ｒｐｍ、５分。
１ ２７．３ ８０．０ ７３．３
２ ２６．２ ７６．１ ７３．３
３ ２９．６ ７８．７ ８２．５
４ ２７．２ 、’８０．５ ７０．９５ ２９．４ ７６．１ ７０．６
６ ２４．７ ？６．１ ７１．７
７ ２６．５ ８０．０ ６８．２
平均 ２７．３±１．７７ ７８．２±２．０ μｍ’ ７０．１±３．８注：
ＭＣＶ＝平均細胞体積
本例は、復元かつ洗浄したヒト赤血球の調製のために記載の遠心条件下での、物
中の５００Ｋ ＨＥＳを２００Ｋ ＨＥＳに代えて、繰り返した。他の条件全て
は実施例１と同一であった。結果を表３に記載する。ポリマー混合物中での５０
０Ｋ 皿ｓの使用は、２００Ｋ Ｉ（ＢＳの使用と比較して僅かに好ましい。
５％２４ＫＰＶＰ、１５！％２００ＫＨＥＳ １４．７％ ７７．３ｆ４７ ６
５．１％ＩＯ％２４Ｋ ＰＶＰ、 １０％２００Ｋ ＨＥＳ ２７．７ ＋４．
４％ ８１．８±１．８ｆ ｆ ６１．６％実施例４
実施例１記載の手順を、洗浄赤血球との４０％へマドクリット混合物を使用し、
凍結乾燥緩衝液を用いて繰り返した。これらの凍結乾燥緩衝液で使用したポリマ
ー組成物は５：１５％ ２４Ｋ ｐｖｐ：５ｏｏＫ）ＩＥＳであった。４０％凍
結乾燥緩衝液中のグルコース濃度を２．３ Ｍ （４４１，３７ｇ／Ｉ）に増大
する。他の全ての条件は実施例１における条件と同一であった。結果を以下に記
載する。
４０％ ２０％２４Ｋ ＰＶＰ （ｆｆ ントｏ −ル） ２８．２ ＋３．５
％ ８０．０±７．９ｆ１ ３９．５±１． （Ｈ４０％ ５％２４ＫＰＶＰ、
１５％５００ＫＨＥＳ ２９．２＋３．０％ ８２．９＋１２．９ｆｊ２ ７
０．１±１４．８％４一時間全血安定性は、単一のポリマーを使用した場合と比
較して、ポリマー混合物を使用した場合には著しく増大した。
実施例５
表５に示すデータは、種々の補充物で改良した緩衝液を使用して凍結乾燥した細
胞中の浸透安定性、最大細胞変形能（Ｄｒｍａｘ）および細胞密度における顕著
な改善を示す。この浸透安定性アッセイは５１Ｃｒ放射性標識した細胞を使用し
て行った。
細胞密度は標準的な実験室手法である不連続（工程）密度勾配遠心法により測定
した。Ｄｌｍａｘの測定法および装置はモハンダス（Ｍｏｈａｎｄａｓ ）、
Ｎ、 、クラーク（Ｃ１ａｒｋ）。
Ｍ、Ｒｏ、ヘルス（Ｈｅａｌｔｈ）、 Ｂ、Ｐ、、 ロッジ（Ｒｏｓｓｉ）、
ＭＬ、ウォルフエ（Ｗｏｌｆｅ）、 Ｌ、Ｃ，、ルス（Ｌｕｓ）、 Ｓ、Ｅ、、
およびシヨヘット（Ｓｈｏｈｅｔ）、 Ｓ、Ｂ、、 Ｂｌｏｏｄ、 １９８５．
５９． ｐｐ、 ７６８−７７４に開示されている。
密度（ｇ／ｍｌ） １．１０ １．０８３＋／−０，００２１，０９２１，０８
３５＋／−０，０００該補充物で処理した細胞中の浸透安定性は新鮮な細胞の少
なくとも約７５％であることに注意すべきである。好ましくは、本発明の利用に
より、浸透安定性は全血の安定性の少なくとも６０％であり、カリＤＩ（ｍａｘ
）は新鮮な赤血球について測定したＤＩ（ｍａｘ）の少なくとも５０％である。
注意・Ｉ）室温にて生理塩水に懸濁した５１Ｃｒ標識赤血球の浸透安定性。
２） ＭＣＶはフェムト！で表した平均小体体積である。
３） ＭＣＨはｐｇで表した平均の小体ヘモグロビンである。
４） ＭＣＨＣはＷ／Ｖ％で表した平均の小体ヘモグロビン濃度である。
５） ０ｘｙＨｂは最終段階（細胞の輸注緩衝液での洗浄）における％回収率と
して測定した官能性オキシヘモグロビンである。
６） ＭｅｔＨｂは酸化メトヘモグロビンであるにれも最終段階における％回収
率）。
７）ヘミクロームは不可逆的に分解されたヘモグロビンのいくつかの形状の１つ
の組である（最終段階における％回収率）。
の尺度である。
９）細胞密度における僅かな変化は、全体としての細胞特性および形態における
大きな変化を反映する。
１０） ＧＳＨは還元されたグルタチオンである。
１１） ＥＤＴＡはナトリウムエチレンジアミンテトラ酢酸である。
１２）アルブミンはヒト血漿またはウシ血漿から調製した血清アルブミンである
。
１３） ＧＳＨ以外の他の酸化防止剤は赤血球１ｇ当たり１〜３■の量で使用さ
れるα−トコフェロールを含む。
１４） ＥＤＴＡ以外の錯化剤はｌ−ＬＭで使用されるデフエリオキサミンを包
含する。
１５） 全てのデータはヒト赤血球を使用して得た。
実施例６
以下の表６および７において、凍結乾燥緩衝液にアルブミンを含めることの一つ
の特別な利点が、細胞密度プロフィールにおける著しい改良により示される（表
７の実験は表５の４０ｄｌ ＧＳＨ＋１４％アルブミンの欄と同一である）。
表６および７は、既知の溶液密度をもつ溶液（段階的密度勾配「クッション（ｃ
ｕｓｈｉｏｎ） Ｊ ）の上方または下方に沈降する、凍結乾燥かつ復元したヒ
ト赤血球の両分を示す。該密度クッション下部（即ち、該溶液密度より高い細胞
密度を有する）細胞の割合が示されている。コントロールとしての正常なヒト赤
血球の割合のプロフィールも示されている。該凍結乾燥緩衝液はＧＳＨまたはＧ
ＳＨ／アルブミンを補充した実施例１に記載の緩衝液であった。ＧＳＨおよびア
ルブミン補充物を含む上記の凍結乾燥緩衝液中で凍結乾燥したヒト赤血球は正常
値近傍にシフトし、このことは同様に高い平均細胞密度（表５に示したように、
１．０９２ ｇ／ｍｌ）に反映される。このような殆ど一正常な密度をもつ細胞
の集合は優れた細胞形状、低い加工による損傷、および最小の細胞−細胞凝集を
有することが予想される。ＧＳＨなどの酸化防止剤を単独で使用した適合性テス
トはこのような高い細胞密度（表５に示したように、１．０８３＋／−０，００
２ｇ／ｍｌ ；または表６に示したように４０ｍＭ ＧＳＨを単独で使用した場
合の１．０８６）を示さない。このデータから、細胞密度における僅かな差異が
、最小の細胞−細胞凝集を伴う細胞特性における著しい改良をもたらすことを理
解するであろう。
表６：４０−〇ＳＨ凍結乾燥緩衝液
密度勾配分離
密度 上方 下方 ％ 平均
１．０４６ ０．５ ３７，０ ９８．７ １００．０１．０５４ １．．０
４０．０ ９７．６ １００．０１、Ｑ６２ ４．５ ３６．０ ８９．９ ９
９．７１．０６６ ５．０ ３３．０ ８６．８ ９９．４１．０７８ １１．
０ ２７．０ ７１．１ ９９．１１．０８６ １４．０ １４．０ ５０．０
９７．２１．０９６ １９．５ ９．０ ３１．６ ９６．０１．０９４ ２
２．５ ５．０ １８．２ ９０．０１、＋０２ ３４．０ １．０ ２．９
３５．３１、．１．ＩＯ３３，５０，００，０５，６表７ ： ４０ｍＭ ＧＳ
Ｈ＋ １４％ｗ／ｖアルブミン凍結乾燥緩衝液密度勾配分離
試料Ｎｏ、 ： ９１−０４７０
密度 上方 下方 ％ 平均
１．０４６ ３．０ ４３．０ ９３．３ １００．０１．０５４ ３．５ ４
６．５ ９３．０ １００．０１．０６２ ６．０ ３３．０ ８４．６ ９９
．７１．０６６ ８．０ ３１．５ ７９．７ ９９．４１．０７８ １１．５
３０．５ ７２．６ ９９．１１．０８６ １４．０ ２７゜０ ６５．９
９７．２１．０９０ １９．０ ２４．０ ５５．８ ９６．０１．０９４ ２
５．０ １７．０ ４０．５ ９０．０１．１０２ ３１．０ ４．０ １１．
４ ３５．３１．１１０ ４０．０ ０．５ １．２ ５．６実施例７
異常ヘモグロビン症またはＲＢＣ代謝異常のいずれの病歴もない健康な６名の成
人から血液を採取した。血液は、公知の血液貯蔵法を利用して、各ドナーから６
３ｍ１のシトレート燐酸塩デキストロース−アデニン（ＣＰＤ−Ａ）凝固防止剤
を含むプラスチック製の移送バッグ（イリノイ州、ディアフィールドのフェンウ
オールラボラトリーズ（Ｆｅｎｗａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に取り出
した。血液単位（各々５００ ｍｌ）を室温（２２℃）にて５分間１５００ ｇ
で遠心処理して、もみ本状の被膜および血漿を除去した。包装したＲＢＣを、自
動細胞洗浄器（コロラド州、レイクウッドのコーベ（ＣＯＢＥ）のモデル２９９
１）を使用して、標準的な洗浄法［１１）に従って等張デキストロース塩水で洗
浄した。この洗浄した包＃ＭＢＣ（ヘマトクリット約８５％）を実施例２記載の
ような凍結乾燥緩衝液（１８００Ｉ！ＩＯｓｍｏ１． ｐＨ７，４）中に約４０
％で再懸濁した。
約３６０ｇのＲＢＣ懸濁液をプラスチックの凍結乾燥バッグに移し、公知の薬品
用棚型凍結乾燥器（カリフォルニア州、パサデナのクライオファーム社（Ｃｒｙ
ｏｐｈａｒｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に入れ、次いで実施例２記載のように
凍結乾燥した。凍結乾燥サイクル終了時点で、該乾ｍＢｃを、２２℃にて、実施
例２記載の燐酸緩衝再水和緩衝液（３６０ｍＯｓｍｏｌ； ｐＨ７，４）中で再
水和かつ復元した。簡単に言えば、該ＲＢＧを再水和するために、該乾燥ＲＢＣ
に６００ｇの再水和緩衝液を添加し、次いで該ＲＢＣが十分に再水和するまで手
首の作用による振盪器（ペンシルバニア州、ピッツバーグのバーレル社（Ｂａｒ
ｒｅｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））上で撹拌した。この再水和工程の終了時点
で、該試料に６００ｇの再水和緩衝液を追加し、１５００ｇにて３分間遠心処理
した。沈降ＲＢＣを、Ｃ０ＢＢ自動細胞洗浄器を使用して、１５００ ｇの遠心
力下で、２回実施例２記載のような洗浄用緩衝液で洗浄した。復うＢＣを、公知
の方法で解糖酵素活性および中間体につきアッセイした。
コントロール血液試料を凍結乾燥ＲＢＣの復元の際に自己ドナーから採取した。
コントロールＲＢＣは洗浄に関して凍結しかつ復元したＲＢＣと同様に処理した
。更に、血液銀行で貯蔵したＲＢＣの解糖酵素活性を測定した。表１および２参
照。
アデニンヌクレオチド合成速度： アデニンヌクレオチド合成速度を、セレノ（
Ｚｅｒｅｚ）等のＪ、 Ｌａｂ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｍｅｄ、、 １９８９．旦４．
ｐｐ、 ４３−５０に記載の方法に従って元のＲＢＣ中のアデニンヌクレオチ
ドプールに１４Ｃで標識したアデニンを導入した後に測定した。簡単に言えば、
該ＲＢＣを種々の時間に渡り３７℃にて１４ｃで標識したアデニンと共にインキ
ュベートし、アリコートを取り出し、塩水と混合し、即座に沸騰水中に６０秒間
浸漬した。この混合物を０℃に冷却し、次いで遠心処理して凝集タンパクを除去
した。生成する上澄液は過剰の１４０で標識したアデニンと共に１４０で標識し
たアデニンヌクレオチドを含んでいた。改良したヘルシュコ（Ｈｅｒｓｈｋｏ）
［１９）の方法を１４Ｃで標識したアデニンからＩ４Ｃで標識したアデニンヌ
クレオチドを分離するのに使用し、液体シンチレーション分光器（モデルＬＳ７
５００、カリフォルニア州、フラートンのベックマンインスツルメント社（Ｂｅ
ｅ）ｃｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））中で放射能を計数した。
メトヘモグロビンの還元速度・完全なＲＢＣ中のメトヘモグロビン（ｍｅｔＨｂ
）の還元速度を公知の方法（セレノ等のＢｌｏｏｄ、 １９９０．７６、 ｐｐ
、 １００８−１０１４）で測定した。
簡単に言えば、ヘモグロビン（Ｈｂ）をｍｅｔＨｂに転化するために、洗浄した
ＲＢＣを、０．１％（ｗ／ｖ）のＮａＮＯｓ 、６０５−のＮａ５ＨＰＯａ 、
ｐＨ７，４および１５４−のＮａＣｌを含む溶液中で最終充填細胞体積２５％に
て、３７℃で１０分間インキュベートした。これにより９５−１００にの転化率
でＨｂかｍｅｔＨｂに転化された。ＮａＮＯｓを除去するために、ＲＢＣを６回
５倍容量の等張塩水で洗浄した。この洗浄ＲＩＩＩＣを１０ｒＩＭＤ−グルコー
スを含有する燐酸緩衝塩水に再懸濁し、３７℃で・ｒンキュベートした。アリコ
ートを種々の時間で取り出した。残留するメトヘモグロビンの割合は、分光光度
法により測定した。ヘゲッシュ（Ｈｅｇｅｓｈ）などのＣｌ１ｎ、 Ｃｈｉａ
Ａｃｔａ、 １９７０．３０． ｐｐ、 ６７９−６８２参照のこと。恐らくオ
キシヘモグロビンへの転化によると思われるメトヘモグロビン復元率はセレノな
どにより記載されたように評価した。第１図参照のこと。
球代謝（Ｒｅｄ Ｃｅ１ｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）：生化学的方法のマニュア
ル（Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｃｌｓ）
、ボトラーＥ、Ｈ４、グルン＆ストラットン、第２版、１９８４．１）Ｉ）、
１２２−１４６に記載の方法により測定した。
統計的解析：凍結乾燥したＲＢＣと凍結乾燥してないＲＥＣとの差異を、対のデ
ータについてツーティルト（ｔｗｏ ｔａｉｌｅｄ）スチューデンツｔ−テスト
で解析した。凍結乾燥したＲＢＣと血液銀行で保存したＲＢＣとの間の比較はツ
ーテイルドスチューデンツｔ−テストを利用して独立のデータに対して行った。
第２図参照。
表１： 凍結乾燥かつ再水和したおよ赴東結乾燥してないＲＢＣからの溶血物中
の解糖酵素活性の概要
）［Ｘ １．２６＋０．２２ １．６５＋０．ｌＯ１，２０＋０．１２ ０．９
８−１．３ ＮＳにＩ ４４．７±４．５７ ４４．３±２．５６ ４８．５±
６．０３ ４３．７−６５．８ Ｎ５ＰＦＫ １２．１＋１．６１ １１．７±
０．９７ ９．７３±２，１８８．４４−１２．７ Ｎ５Ａｌｄ ３．５９±０
．４１ ３．７２±０．５４ ２．３９±０．３４ １．９７−３．５９ Ｎ５
ＴＰＩ １７５０±４６０ ３１４０±４９０ ２９００±７７７ ２１３０−
３３４０ Ｐ＜０．００５ＣＩ３ＰＤ ３１８±６８．４ ３１１±４３．０
２４４±７２．０ ２３８−３４６ ＮＳＤＰＧＭ ５．５４±０．７２ ４．
６４±０．９１ ８．４３±２．２３ ８．４３±２．２３ Ｐ＜０．０１５Ｐ
ＧＫ ３４０±１４７ ３４０±１１５ ３４９±４７．７ ２１２−２４１
ＮＳＰＧＭ ３５．２±５．０９ ２８．１±５．９９ １７．３±６．７０
１３．９−３８．０ Ｎ５Ｅｓｏ ４．９９±０．９９ ７．５０±０．８７
４．９４±０．８９ ４．２−６．５８ Ｐ＜０．００１ＰＫ １８．９±５．
７１ ２１．１±５．４０ １５．０±２．１４ １２．５−１７．２ Ｐ＜０
．０３２ＬＤＨ２１１±２９．０ １９０±１９．２ １４１±５６．４ １４
５−２０３３ Ｐ＜０．００１Ｇ６ＰＤ １２．４±１．５５ １４．７±１．
８２ ＮＤ ９．９０−１３．２ Ｎ５６ＰＧＤ” １１．１±０．９９ １０
．０±１．０９ ＮＤ ７．２７−１０．０ Ｎ５ＴＡ Ｏ，９７±０．２１
１．１０±０．３４ ＮＤ Ｏ，７ｇ±１．３２ Ｎ５ＴＫ Ｏ，６８±０．１
３ ０．９３±０．６６ ＮＤ Ｏ，５０−１，０３ＮＳデータは６個の試料に
関する平均上標準偏差（ｓｄ）を表す。血液銀行で保存したＲＢＣから得たデー
タは凍結乾燥かつ再水和したＲＢＣとの比較のためにここに含めた。分析した血
液銀行試料の全数は３であった。略号： ｌｙｏ、凍結乾燥した； Ｎ−１ｙｏ
。
凍結乾燥してない、 ＢＢ、血液銀行、 Ｎ−Ｒ，正常な範囲；Ｐ、凍結乾燥し
たＲＢＣと凍結乾燥してないＲＢＣとの比較に係わる確率；ＮＤ、測定せず、
ＮＳ、有意な値ではない；＊、解糖経路の酵素奮＋、ペントースホスフェート経
路の酵素。
好ましい有用な復元ＲＢＣは少なくとも０．９μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビ
ンなる活性のへキソキナーゼ（ＨＸ）、少なくとも３．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇ
ヘモグロビンなる活性のジホスホグリセロムターセ（ＤＰＧＭ）、少な（とも８
．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなる活性のホスホフルクトキナーゼ（Ｐ
ＦＫ） 、少なくとも１２．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなる活性のピ
ルベートキナーゼ（ＰＫ）、少なくとも９．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビ
ンなる活性のグルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＰＤ）
、少なくとも７．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなる活性の６−ホスホグ
ルコネートデヒドロゲナーゼ（６−ＰＧＤ） 、それぞれ少なくとも０．５μｍ
ｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなる活性のトランスケトラーゼ（ＴＡ）およびト
ランスケトラーゼ（ＴＫ）、および少なくとも６．０μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｇヘモ
グロビンなる活性のグルタチオンリダクターゼにより特徴ずけられる。
表２：凍結乾燥かつ再水和したＲＢＣおよび新鮮な凍結乾燥してないＲＢＣにお
ける解糖中間体の濃度の比較
ＧａＰ ４９．８±７２．１ ７６．５±１０．２ １００±２８．０ Ｎ５Ｆ
６Ｐ ０．９２±２．２６ ３．０５±７．４７ ２５．６±６．３０ Ｎ５Ｆ
ＤＰ ７．６０±４２．５ １４９±１７９ ４．７０±１．６０ Ｎ５ＤＨＡ
Ｐ ｌ７７０± ６８７ １７４±１４７ ３７．５±３．１０ Ｐ＜０．０１
２ＧＡＰ １１２±４６．８ ４４．９±４３．５ ９．３８±６□３０ ＮＳ
２．３−ＤＰＧ ３１５２±９３８６ ９６３３±２６４０ １３５００±２０
００ Ｐ＜０．００４３ＰＧ ６１１±２１０ １３４±５６．１ １２２±２
８．０ Ｐ＜０．００６２ＰＧ ３３８±２５２ ２１６±１６５ ３１．３±
１３．０ Ｐ＜０．０４６ＰＥＰ ２１６±１０４ ６７．５±５０．８ ５０
．０±１６．０ Ｐ＜０．０１Ｐｙｒ １７０±５２．２ １９３±１２５ ８
４．４±２５．０ Ｎ５Ｌａｃｔ ６０３２±２７３０ ９４９５±３５４２
１１４０±３７０ Ｎ５ＡＴＰ １７５８±３９２ ３８７５±７８０ ３２２
０±２８０ Ｐ＜０．００８ＡＤＰ １７４３±３１６ ７００±１３３ ４０
９±５６．０ Ｐ＜０．００３Ｍ ２３７０±３４３ ２０４±１２５ １３４
±２５．０ Ｐ＜０．００１データは６個の試料に関する平均上標準偏差Ｃ５ｄ
）を表す。正常値は本発明のデータとの比較のためにここに含めた。略号： ｌ
ｙｏ、凍結乾燥した； Ｎ−１ｙｏ、凍結乾燥してない；間、正常な値；Ｐ、凍
結乾燥したＲＢＣと凍結乾燥してないＲＢＣとの比較に係わる確率。
好ましい有用な復炭Ｃは少なくとも５０ ｎｍｏｌ／ｇヘモグロビンのグルコー
ス−６−ホスフェＭＧ６Ｐ） 、少な（とも１００ ｎｍｏｌ／ｇヘモグロビン
のフルクトース−１，６−ジホスフエー ト（ＦＤＰ） 、少な（とも２０００
Ｎｍｏｌ／ｇヘモグロビンの２，３−ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ
）および少なくとも５０ ｎｍｏｌ／ｇヘモグロビンのピルベート（Ｐｙｒ）に
より特徴ずけられる。
上記データは、本発明の方法により凍結乾燥され、カリ復元されたヒト赤血球が
メトヘモグロビン（非官能性）を生理的かつ酸素担持状態に還元し、またかぎ解
糖酵素活性を常法で保存した非凍結乾燥赤血球または凍結乾燥赤血球に匹敵する
レベルに保つ能力を維持するという証拠をもたらす。かぎ酵素は正常細胞中で最
低の活性を有し、従って該経路において律速段階と考えられるヘキソキナーゼ（
［（Ｘ）および反応が基質と生成物との間の最大の理論自由エネルギー変化を含
むホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）およびピルベートキナーゼ（ＰＫ）を含む
。
該凍結乾燥かつ復元された赤血球はジホスホグリセロムターゼの活性を維持し、
該酵素はヒト赤血球中で１．３−ジホスホグリセレート（１，３−ＤＰＧ） 、
解糖中間体を２゜３−ＤＰＧ （これはヘモグロビンのかぎアロステリックエフ
ェクタである）にシャンＭｓｈｕｎｔ） Ｌ、カリヘモグロビンの酸素結合およ
び放出能力を調節する。データは、ヘキソキナーゼ活性の生成物であるグルコー
ス−６−ホスフェート（０６Ｐ） 、ホスホフルクトキナーゼ活性の生成物であ
るフルクトース−１，６−ジホスフェート（ＦＤＰ） 、ジホスホグリセロムタ
ーセ活性の生成物である２、３−ＤＰＧ、およびビルベ−トキナーゼ（ＰＫ）活
性の生成物であるピルベート（Ｐｙｒ）の濃度を含む、代謝中間体の定常状態濃
度を示す。更に、ペントースホスフェートシャントの酵素は機能性であり、この
経路は赤血球において２つの重要な機能を果たす。即ち、該経路は細胞の正常な
酸化防止防御系の一部としての還元グルタチオンを生成するのに使用されるリポ
ース−５−ホスフェート（Ｒ−５−Ｐ）およびエネルギー（ＡＴＰ）を生成し、
かつ５−ホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）を生成し、該ＰＲＰＰは
外因性のアデニンからアデニンヌクレオチドを生成するのに利用される中間体で
あり、該外因性のアデニンは血漿から細胞中へ持ち込まれるか、もしくは市販の
保存溶液、例えばＣＰＤＡ−１、即ちシトレート／ホスフェート／デキストロー
ス／アデニンから凍結され貯蔵された細胞に持ち込まれる。最後に、該データは
高エネルギーかぎ中間体、例えば還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（
ＮＡＤＨ）および還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ−） （
ＮＡＤＰＨ）が該復元された細胞中の正常な解糖経路を介して生成でき、かつこ
れらの還元ジヌクレオチドが該酵素メトヘモグロビンリダクターセ（ＮＡＤＨ）
およびグルタチオンリダクターゼ（ＮＡＤＰＨ）用のかぎ補助因子であることを
示唆している。
上記の記載から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を確認でき、本発明の精
神並びに範囲を逸脱せずに、本発明を種々の用途並びに条件に適合せしめること
ができる。諸状況が示唆しかつ有１１としているような形式上の変更および等価
なものの置き換えをも本発明は意図しており、またここでは特定の用語を使用し
ているが、これらは記載上の便宜であり、限定を意図するものではない。
図１
図２
要 約 書
細胞（小板を含む）を凍結乾燥する方法並び（こ媒体を開示する。該方法（まヘ
キソースおよびペントースを包含する単糖、および少なくとも２種の生体適合性
で両親媒性のポリマーの混合物を含有する溶液の使用を含む。
平成 年 月 日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．細胞または細胞一様物質の凍結乾燥法であって、約７．０〜３７．５％の濃 度で存在する単糖と、それぞれ数平均分子量１Ｋ〜約６００Ｋを有し、全濃度が 約０．７％〜飽和までの範囲にある少なくとも２種の異なるポリマーの混合物と を含む緩衝された溶液に、複数の細胞を浸漬し、該溶液を凍結し、および 該細胞を、水の昇華により乾燥する ことを特徴とする上記凍結乾燥方法。 ２．該ポリマーか両親媒性である請求の範囲第１項記載の方法。 ３．該ポリマーの一種か約２０Ｋ〜約３６０Ｋの範囲の分子量を有し、かつ該ポ リマーの他方が約１００Ｋ〜５００Ｋの範囲の分子量を有する請求の範囲第１項 記載の方法。 ４．該単糖かペントースおよびヘキソースからなる群から選ばれる請求の範囲第 １項記載の方法。 ５．該単糖がキシロース、グルコース、リボース、マンノースおよびフルクトー スからなる群から選ばれる請求の範囲第４項記載の方法。 ６．該ポリマー混合物かポリビニルピロリドンとヒドロキシエチル澱粉とを含む 請求の範囲第３項記載の方法。 ７．該緩衝された溶液が、更に酸化防止剤、錯化剤、タンパクまたはその混合物 をも含む請求の範囲第１項記載の方法。 ８．該酸化防止剤がグルクチオンを含む請求の範囲第７項記載の方法。 ９．該酸化防止剤がα−トコフェロールを含む請求の範囲第７項記載の方法。 １０．該錯化剤かＥＤＴＡを含む請求の範囲第７項記載の方法。 １１．該錯化剤かデフェリオキサミンを含む請求の範囲第７項記載の方法。 １２．該タンパクがウシ血清アルブミンを含む請求の範囲第７項記載の方法。 １３．該タンパクがヒト血清アルブミンを含む請求の範囲第７項記載の方法。 １４．約７．０〜３７．５％の濃度で存在する単糖と、それぞれ数平均分子量１ Ｋ〜約６００Ｋを有し、全濃度か約０．７％〜飽和までの範囲にある少なくとも ２種の異なるポリマーの混合物とを含有する緩衝された溶液を含む、細胞凍結乾 燥用媒体。 １５．該ポリマーが両親媒性である請求の範囲第１４項記載の媒体。 １６．該ポリマーの一種が約２０Ｋ〜約３６０Ｋの範囲の分子量を有し、かつ該 ポリマーの他方が約１００Ｋ〜５００Ｋの範囲の分子量を有する請求の範囲第１ ４項記載の媒体。 １７．該単糖がペントースおよびヘキソースからなる群から選ばれる請求の範囲 第１４、１５または１６項記載の媒体。 １８．該単糖がキシロース、グルコース、リボース、マンノースおよびフルクト ースからなる群から選ばれる請求の範囲第１７項記載の媒体。 １９．該ポリマー混合物がポリビニルピロリドンとヒドロキシエチル澱粉とを含 む請求の範囲第１８項記載の媒体。 ２０．該ポリビニルピロリドンが分子量約２４Ｋを有し、かつ該ヒドロキシエチ ル澱粉が分子量約５００Ｋを有する請求の範囲第１９項記載の媒体。 ２１．該ポリビニルピロリドンが分子量約２４Ｋを有し、かつ該ヒドロキシエチ ル澱粉が分子量約２００Ｋを有する請求の範囲第１９項記載の媒体。 ２２．該ポリビニルピロリドンが分子量約３６０Ｋを有し、かつ該ヒドロキシエ チル澱粉が分子量約５００Ｋを有する請求の範囲第１９項記載の媒体。 ２３．更に、酸化防止剤、錯化剤またはタンパクをも含む請求の範囲第１４項記 載の媒体。 ２４．該酸化防止剤がグルタチオンを含む請求の範囲第２３項記載の媒体。 ２５．該酸化防止剤がα−トコフェロールを含む請求の範囲第２３項記載の媒体 。 ２６．該錯化剤がＥＤＴＡを含む請求の範囲第２３項記載の媒体。 ２７．該錯化剤がデフェリオキサミンを含む請求の範囲第２３項記載の媒体。 ２８．該タンパクがウシ血清アルブミンを含む請求の範囲第２３項記載の媒体。 ２９．該タンパクがヒト血清アルブミンを含む請求の範囲第２３項記載の媒体。 ３０．約１Ｋ〜６００Ｋの範囲内の数平均分子量を有するポリマーを含有する緩 衝された溶液を含む凍結乾燥された血液細胞を復元するための媒体。 ３１．該ポリマーが両親媒性である請求の範囲第３０項記載の媒体。 ３２．該分子量が１Ｋ〜３６０Ｋの範囲内にある請求の範囲第３１項記載の媒体 。 ３３．該ポリマーがポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第３２項記載の媒体 。 ３４．該ポリマーが１〜２０Ｗ／Ｖ％の範囲内の濃度で存在する請求の範囲第３ ３項記載の媒体。 ３５．約１０％の２４Ｋポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第３４項記載の 媒体。 ３６．約１９．０％の１０Ｋポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第３４項記 載の媒体。 ３７．約１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、約１００．７ｍＭのＮａＣｌおよび約８ ．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を含む請求の範囲第３５または３６項記載の媒体。 ３８．更に、酸化防止剤、錯化剤またはタンパクをも含む請求の範囲第３０項記 載の媒体。 ３９．該酸化防止剤がグルタチオンを含む請求の範囲第３８項記載の媒体。 ４０．該酸化防止剤かα−トコフェロールを含む請求の範囲第３８項記載の媒体 。 ４１．該錯化剤がＥＤＴＡを含む請求の範囲第３８項記載の媒体。 ４２．該錯化剤がデフェリオキサミンを含む請求の範囲第３８項記載の媒体。 ４３．該タンパクがウシ血清アルブミンを含む請求の範囲第３８項記載の媒体。 ４４．該媒体がヒト血清アルブミンを含む請求の範囲第３８項記載の媒体。 ４５．約１Ｋ〜６００Ｋの範囲内の数平均分子量をもつポリマー、イノシン、ア デニン、ニコチン酸、グルタミンおよび単糖を含有する緩衝された溶液を含む復 元された血液細胞を洗浄するための媒体。 ４６．該ポリマーが両親媒性である請求の範囲第４５項記載の媒体。 ４７．該分子量が１Ｋ〜３６０Ｋの範囲内にある請求の範囲第４６項記載の媒体 。 ４８．該ポリマーがポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第４７項記載の媒体 。 ４９．該ポリマーが１〜２０Ｗ／Ｖ％の範囲内の濃度で存在する請求の範囲第４ ７項記載の媒体。 ５０．該単糖がペントースおよびヘキソースからなる群から選ばれる請求の範囲 第４９項記載の媒体。 ５１．該単糖がキシロース、グルコース、リボース、マンノースおよびフルクト ースからなる群から選ばれる請求の範囲第５０項記載の媒体。 ５２．約１６％の２４Ｋポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第５１項記載の 媒体。 ５３．約１６％の４０Ｋポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第５１項記載の 媒体。 ５４．約１０．０ｍＭのイノシン、５．０ｍＭのアデニン、０．７５ｍＭのニコ チン酸、０．７５ｍＭのグルタミン、０．４９ｍＭのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５ ．０ｍＭのＫＣｌ、７５．０ｍＭのＮａＣｌ、１０．３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４お よび２０．０ｍＭのグルコースを含む請求の範囲第５２項記載の媒体。 ５５．１０．０ｍＭのイノシン、５ｍＭのアデニン、０．７５ｍＭのニコチン酸 、０．７５ｍＭのグルタミン、０．４９ｍＭのＭｃＧｌ２・６Ｈ２Ｏ、３０．０ ｍＭのＫＣｌ、３０．０ｍＭのＮａＣｌ、１０．０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ ２Ｏおよび２０．０ｍＭのグルコースを含む請求の範囲第５４項記載の媒体。 ５６．更に、酸化防止剤、錯化剤、タンパクまたはその混合物をも含む請求の範 囲第４５項記載の媒体。 ５７．該酸化防止剤がグルタチオンを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ５８．該媒体がα−トコフェロールを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ５９．該錯化剤かＥＤＴＡを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ６０．該錯化剤がデフェリオキサミンを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ６１．該タンパクがウシ血清アルブミンを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ６２．該媒体がヒト血清アルブミンを含む請求の範囲第５６項記載の媒体。 ６３．ピロリン酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４およびＡ ＴＰを含有する緩衝された溶液を含む洗浄した血液細胞を再懸濁するための媒体 。 ６４．約６１．１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１．１９ｍＭのＫＣｌ、０．８ ８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１１．１ｍＭのＮａＣｌ、４．８６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ ４および８．８ｍＭのＡＴＰを含有する請求の範囲第６３項記載の媒体。 ６５．約１Ｋ〜６００Ｋの範囲の数平均分子量を有するポリマーを含有する緩衝 された溶液を含む、輸注のために血液細胞を懸濁するための媒体。 ６６．該ポリマーが両親媒性である請求の範囲第６５項記載の媒体。 ６７．該分子量が１Ｋ〜１０Ｋの範囲内にある請求の範囲第６６項記載の媒体。 ６８．該ポリマーがポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第６７項記載の媒体 。 ６９．該ポリマーが１〜２０重量％の範囲の濃度で存在する請求の範囲第６８項 記載の媒体。 ７０．更に、ペントースおよびヘキソースからなる群から選ばれる単糖をも含む 請求の範囲第６９項記載の媒体。 ７１．該単糖がキシロース、グルコース、リボース、マンノースおよびフルクト ースからなる群から選ばれる請求の範囲第７０項記載の媒体。 ７２．約１０％の２．５Ｋポリビニルピロリドンを含む請求の範囲第７１項記載 の媒体。 ７３．約６８．４ｍＭのＮａＣｌ、５．０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４および１０．０ ｍＭのグルコースを含む請求の範囲第７２項記載の媒体。 ７４．更に、約１Ｋ〜６００Ｋの範囲の数平均分子量を有するポリマーを含有す る緩衝された溶液中で該乾燥された細胞を復元する工程をも含む請求の範囲第１ 項記載の方法。 ７５．更に、約１Ｋ〜６００Ｋの範囲の数平均分子量を有するポリマー、イノシ ン、アデニン、ニコチン酸、グルタミンおよび単糖を含有する緩衝された洗浄溶 液中で該復元された細胞を洗浄する工程をも含む請求の範囲第７５項記載の方法 。 ７６．該細胞がエリスロサイトを含む請求の範囲第１〜６、７４または７５項の 何れか１項に記載の方法。 ７７．該細胞が小板を含む請求の範囲第１〜６、７４または７５項の何れか１項 に記載の方法。 ７８．該細胞が生体外で培養された細胞を含む請求の範囲第１〜６、７４または ７５項の何れか１項に記載の方法。 ７９．該細胞が抹消血液細胞を含む請求の範囲第１〜６、７４または７５項の何 れか１項に記載の方法。 ８０．該細胞が幹細胞を含む請求の範囲第１〜６、７４または７５項の何れか１ 項に記載の方法。 ８１．該細胞一様物質がリボソームを含む請求の範囲第１〜６、７４または７５ 項の何れか１項に記載の方法。 ８２．該細胞一様物質がヘモソームを含む請求の範囲第１〜６、７４または７５ 項の何れか１項に記載の方法。 ８３．該細胞一様物質が細胞膜ゴースト処方物を含む請求の範囲第１〜６、７４ または７５項の何れか１項に記載の方法。 ８４．該培養細胞が哺乳類細胞を含む請求の範囲第７８項記載の方法。 ８５．該哺乳類の培養細胞がハイブリドーマ細胞を含む請求の範囲第８４項記載 の方法。 ８６．少なくとも６０％の全血中における浸透安定性を有する、凍結乾燥され、 復元された血液細胞組成物。 ８７．新鮮な赤血球について測定したＤＩ（ｍａｘ）の少なくとも５０％のＤＩ （ｍａｘ）を有する、凍結乾燥され、復元された赤血球組成物。 ８８．少なくとも１．０８３±０．００２ｇ／ｍｌの平均細胞密度を有する、凍 結乾燥され、復元された赤血球組成物。 ８９．該赤血球がヒト赤血球を含む請求の範囲第８６〜８６項の何れか１項に記 載の組成物。 ９０．輸注に有用な赤血球組成物であって、該赤血球が少なくとも６０％の全血 中における浸透安定性、新鮮な赤血球の少なくとも５０％のＤＩ（ｍａｘ）およ び少なくとも１．０８３±０．００２ｇ／ｍｌの平均細胞密度を有することによ り特徴ずけられる上記の赤血球組成物。 ９１．上記請求の範囲第１〜１３項の何れか１項に記載の方法により調製される 生成物。 ９２．上記請求の範囲第７６項に記載の方法により調製される生成物。 ９３．上記請求の範囲第７７項に記載の方法により調製される生成物。 ９４．上記請求の範囲第７８項に記載の方法により調製される生成物。 ９５．上記請求の範囲第７９項に記載の方法により調製される生成物。 ９６．上記請求の範囲第８０項に記載の方法により調製される生成物。 ９７．上記請求の範囲第８１項に記載の方法により調製される生成物。 ９８．上記請求の範囲第８２項に記載の方法により調製される生成物。 ９９．上記請求の範囲第８３項に記載の方法により調製される生成物。 １００．上記請求の範囲第８４項に記載の方法により調製される生成物。 １０１．上記請求の範囲第８５項に記載の方法により調製される生成物。 １０２．該エリスロサイトが３０時間未満のメトヘモグロビン回復半−減期を維 持する請求の範囲第７６項に記載の方法。 １０３．該エリスロサイトが、解糖経路の酵素の生理学的活性レベルを維持して いる請求の範囲第７６項に記載の方法。 １０４．該酵素活性が少なくとも０．９μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるヘキ ソキナーゼ（ＨＫ）活性を含む請求の範囲第１０３項に記載の方法。１０５．該 酵素活性が少なくとも３．０μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるジホスホグリセ ロムターゼ（ＤＰＧＭ）活性を含む請求の範囲第１０３項に記載の方法。 １０６．該酵素活性が少なくとも８．０μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるホス ホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）活性を含む請求の範囲第１０３項に記載の方法。 １０７．該酵素活性が少なくとも１２．０μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるピ ルベートキナーゼ（ＰＫ）活性を含む請求の範囲第１０３項に記載の方法。 １０８．該エリスロサイトが、解糖化学中間体の生理学的レベルを維持している 請求の範囲第７６項に記載の方法。 １０９．該化学中間体が少なくとも５０ｎＭ／ｇヘモグロビンなるグルコース− ６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）を含む請求の範囲第１０８項に記載の方法。 １１０．該化学中間体が少なくとも１００ｎＭ／ｇヘモグロビンなるフルクトー ス−１，６−ジホスフェート（ＦＤＰ）を含む請求の範囲第１０８項に記載の方 法。 １１１．該化学中間体が少なくとも２０００ｎＭ／ｇヘモグロビンなる２，３− ジホスホグリセレート（２，３−ＤＰＧ）を含む請求の範囲第１０８項に記載の 方法。 １１２．該化学中間体が少なくとも５０ｎＭ／ｇヘモグロビンなるピルベート（ ｐｙｒ）を含む請求の範囲第１０８項に記載の方法。 １１３．該エリスロサイトが、ペントースホスフェートシャントの酵素の生理学 的活性を含む請求の範囲第７６項に記載の方法。 １１４．該酵素が少なくとも９．０μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるグルコー ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（Ｇ−６−ＤＰ）を含む請求の範囲第１ １３項に記載の方法。 １１５．該酵素が少なくとも７．０μＭｍｉｎ／ｇヘモグロビンなる６−ホスホ グルコネートデヒドロゲナーゼ（６−ＰＧＤ）を含む請求の範囲第１１３項に記 載の方法。 １１６．該酵素が少なくとも０．５μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるトランス アルドラーゼ（ＴＡ）を含む請求の範囲第１１３項に記載の方法。 １１７．該酵素が少なくとも０．５μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビンなるトランス ケトラーゼ（ＴＫ）を含む請求の範囲第１１３項に記載の方法。 １１８．該エリスロサイトが、少なくとも６．０μＭ／ｍｉｎ／ｇヘモグロビン なる酵素グルタチオンリダクターゼの生理学的活性レベルを含む請求の範囲第７ ６項に記載の方法。 １１９．該エリスロサイトがヒトエリスロサイトを含む請求の範囲第１０２〜１ １８項の何れか１項に記載の方法。 １２０．上記請求の範囲第１０２項に記載の方法による生成物。 １２１．上記請求の範囲第１０３項に記載の方法による生成物。 １２２．上記請求の範囲第１０４項に記載の方法による生成物。 １２３．上記請求の範囲第１０５項に記載の方法による生成物。 １２４．上記請求の範囲第１０６項に記載の方法による生成物。 １２５．上記請求の範囲第１０７項に記載の方法による生成物。 １２６．上記請求の範囲第１０８項に記載の方法による生成物。 １２７．上記請求の範囲第１０９項に記載の方法による生成物。 １２８．上記請求の範囲第１１０項に記載の方法による生成物。 １２９．上記請求の範囲第１１１項に記載の方法による生成物。 １３０．上記請求の範囲第１１２項に記載の方法による生成物。 １３１．上記請求の範囲第１１３項に記載の方法による生成物。 １３２．上記請求の範囲第１１４項に記載の方法による生成物。 １３３．上記請求の範囲第１１５項に記載の方法による生成物。 １３４．上記請求の範囲第１１６項に記載の方法による生成物。 １３５．上記請求の範囲第１１７項に記載の方法による生成物。 １３６．上記請求の範囲第１１８項に記載の方法による生成物。 １３７．上記請求の範囲第１１９項に記載の方法による生成物。 １３８．解糖経路を含む酵素の生理学的活性レベルを有する凍結乾燥され、復元 された赤血球組成物。 １３９．メトヘモグロビン回復の生理学的半減期を有する凍結乾燥され、復元さ れた赤血球組成物。 １４０．グルタチオンリダクターゼの生理学的活性レベルを有する凍結乾燥され 、復元された赤血球組成物。 １４１．ペントースホスフェートシャントを含む酵素の生理学的活性レベルを有 する凍結乾燥され、復元された赤血球組成物。 １４２．解糖経路を含む化学中間体の生理学的レベルを有する凍結乾燥され、復 元された赤血球組成物。 １４３．該赤血球がヒト赤血球を含む請求の範囲第１３８〜１４２項の何れか１ 項に記載の組成物。 １４４．輸注に有用な赤血球組成物であって、該赤血球が解糖およびペントース シャント経路を含む酵素の生理学的活性レベル、グルタチオンリダクターゼの生 理学的活性レベル、メトヘモグロビン回復の生理学的半減期、および解糖化学中 間体の生理学的レベルにより特徴ずけられる上記の赤血球組成物。 １４５．該赤血球がヒト赤血球を含む請求の範囲第１４４項に記載の輸注に有用 な赤血球組成物。
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