JPH05501497A - リン脂質のエステル交換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リン脂質のエステル交換 技術分野 本発明は、酵素的エステル交換を用い、リン脂質中のアシル基を遊離脂肪酸エス テル又は遊離脂肪酸で交換する方法に関する。

前景技術 リン脂質（グリセロリン脂質）、例えばホスファチジルコリンは、２個の脂肪ア シル基でエステル化されたグリセロールと１個のホスフェートもしくはエステル 化ホスフェート基もしくは栄養上の価値を改善するためリン脂質中のアシル基を 交換することが望ましい。

特開昭６３−１８５．３９１は、リン脂質および脂肪酸（もしくはエステル）を 適当な酵素で２４〜４８時間処理し脂肪酸の１０〜２０％交換を得るプロセスを 開示する。プロセスにおいて、セライト化の如き担体の使用が提案されている。

本発明の目的は、反応後容易に分離できかつ再使用でき更に固定床反応器に対し 有用である触媒を用い短時間でリン脂質中に所望の脂肪酸の高程度の導入を達成 できるようなリン脂質に対する改良された酵素的エステル交換プロセスを提供す ることにある。

発明の開示 固定化された酵素を用いて得られることを見出した。従って、本発明は、酵素的 エステル交換を用い遊離的エステル又は遊離脂肪酸でリン脂質中のアシル基を交 換するプロセスを提供し、このプロセスにおいて酵素は粒状マクロポーラス担体 上に固定されていることを特徴とする。

四足火 本発明で用いられる酵素は、粒状マクロポーラス担体上固定されている。酵素は 単に担体上に吸着されていてもよく、又は当業者に公知のグルタルアルデヒド又 は他の架橋剤を用いた架橋により担体に結合している。

好ましい担体の型は例えばアクリル、ポリスチレン又はフェノール−ホルムアル デヒド型の弱塩基性アニオン交換樹脂である。商業製品の例は、レバチット（Ｌ ｅｗａｔｉｔ）　（登録商標）Ｅ１９９９／８５　（バイエル製品、西ドイツ） およびシュオライドＤｕｏｌｉｔｅ（登録商標）　Ｂ　Ｓ　−５６８（ローム　 アンド　ハース）である。

他の好ましい担体のタイプは、例えばフェノールホルムアルデヒド型、アクリル 型又はポリプレン型の吸着剤（非イオン）担体である。商業製品の例は、レバチ ット（Ｌｅｗａｔｉｔ）２００１／８５　（アクリル、バイエル製品）およびア キュレル（Ａｃｃｕｒｅｌ）　Ｅ　Ｐ　−１００（ポリプロピレン、アクゾの製 品）である。

他の好ましい固定化方法は、無機の支持物質を用いる方法であり、更に酵素は好 ましくは吸着又は共有結合により支持体に結合される。このような支持物質およ び固定化技術は、Ｋ、モスバッハ（補習）　：　Ｍｅｔｈｏｒａｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ、　４４’Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　Ｊ　（ アカデミツクプレス、１９７６　）に記載されている。

好ましい無機支持物質は、マクロポーラスシリカもしくはシリケート担体、例え ばＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔ　５ｕｐｐｏｒｔｓ　ＳＣ４ＢＣＩＥ／１９８７年６ 月に記載されているプレス　チミカル社販売のマクロポーラスシリカであり、こ こにおいて粒子の９０％以上は粒径１００〜１０００　ｐ　ｍの範囲にあり、こ こにおいて粒子の径の８０％以上は酵素法の直径の５〜４５倍の直径を示す。

リン脂質のエステル交換に有用な固定化酵素は触媒１ｇ（乾燥重量）当たり２０ ．０００〜２００．０００　Ｌ　Ｕで吸着される（ＬＵ１リパーゼ単では米国特 許４．８１０．４１４に記載されている）Ｍ案 使用すべき酵素は、動物、植物もしくは微生物起源のリパーゼである。経済的理 由に対し、微生物産生リパーゼ、例えば細菌もしくは菌類リパーゼが好ましい。

適当な酵素の幾つかの例は次の起源開示のリパーゼであるニーリゾムコール（Ｒ ｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　（ムコール（Ｍｕｃｏｒ）　とも称す）、特にＲ，マイヘ イ（ｍｉｅｈｒｉ）　（Ｍ、ｍ１ｅｈｅｉ）自長の位置特異性リパーゼ、リボザ イム（Ｌｉｐｏｚｙｍｅ）　（登録商標）としてノボノルディスクａ　／　ｓか ら商業的に入手可能。

−フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）　、特にＨ，ラヌギノサ（サーモマイセス　ラ ヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓとも称す）由来 の位置特異性リパーゼ、米国特許４，８１０，４１４　、ヨーロッパ特許３０５ ．２１６参照。

−カンジダ　ムゴサ（Ｃａｎｄｉｄｄ　ｒｕｇｏｅ＠ン（Ｃ，シリンドラセア（ Ｃ、Ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａｅ）とも称す）由来の位置非特異的リパーゼ、該リ パーゼはリパーゼＯＦ（多糖産業（株）として入手可能。

−プソイドモナス　セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｓｏａｓ　ｃｅｐａｃｉａ）由来の 位置非特異性リパーゼ（Ｗ　０８９１０１０３２）。

他の酵素は、参考のため記載された特開昭６３−１８５．３９１第６欄〜７欄に 記載された酵素である。

１三皇五粂作 反応系における水の量は、制御されるべきである。何故なら、一定の水分活性が 固定化酵素に対しては要求されるが、余りに高い水分含量はリン脂質の余りに多 くの好ましくない加水分解を引きおこすからである。しかし、以下の内容は注目 されるべきである。すなわち、所望の脂肪酸を含有する、期待した高価値のリン 脂質はエステル交換プロセス中に高程度の加水分解を許容するであろう。

好ましくは、反応系中の水の量は、固定化リパーゼの乾燥の５〜１５％又は全反 応系の０．５〜１．５％、好ましくは０．１〜１．０％に想到すべきである。驚 くべきことに、このような低水分含量が十分であることが見出された。

バッチ系において、固定化酵素は好ましくは５〜１５重量％までに反応前に水和 されるであろう。連続カラム系において、水は前記の如く触媒を水和することに より、更に基質中に幾分かの水を溶解せしめることにより導入できる。

エステル交換プロセスは、リン脂質並びに脂肪酸もしくは脂肪間エステルの双方 が流動態中で混和する、例えば酵素触媒を又活性化せしめるようなヘキサン、ヘ プタン、石油エーテル、又は塩素化炭化水素中に溶解するような条件下で行なわ れるべきであろう。別に、リン脂質は脂肪酸又は脂肪酸エステル中に直接溶解さ れるであろう。

プロセス温度は、固定化酵素の熱的安定性を考慮して選ばれるべきである。　の 場合、２０〜６０°Ｃが適当であろう。

極めて熱安定化の酵素に対しては８０°Ｃ程度の温度を用いることができる。

プロセスは、バッチ反応として行うことができ、ここで成分は反応時間中種やか に撹拌される。反応後、反応産物は単にデカント法又は濾過法により固定化酵素 から分離される。

反応混合物中の固定化酵素の量は、典型的には１〜１０％ｗ　／　ｗであり、反 応時間は一般的には０．５〜７２時間、好ましくは０．５〜２４時間である。

別に、プロセスは基質混合物（もし使用するなら更に溶剤）を固定化酵素の固定 床カラムに導入せしめることにより連続脂肪酸を酸化から保護するたことが必須 である。これは、窒素、ヘリウムもくしはアルゴンのような適当な非酸化性ガス でおおった状態で反応を行うことによって達成できる。

エヱｌｉ 本発明のプロセスは、脂肪アシルエステル基を有する所望種類のリン脂質に適用 することができる。このような天然リン脂質の例は、ホスファチジル　セリン、 ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル　イノシトール、ホスファチジル 　エタノールアミン、およびジホスファジルグリセロールである。ホスフェート 基に対しエステル化される種々のヒドロキシ化合物を有する合成リン脂質も又処 理され得る。

れるベ　アシル 本発明方法は、所望の脂肪酸をリン脂質に導入するために用いることができる。

特に興味ある脂肪酸の幾つかの例は次の如くであるニ ー長鎖（Ｃ，〜Ｃ２□）多不飽和脂肪酸、例えばリルン酸、アラキドン酸、α− リルン酸、エイコサペンクエン酸、ドコサヘキサエン酸、又はγ−リルン酸であ る。これらは、リン脂質の生理学又は栄養学上の価値を改善するため導入される 。

一中鎖（Ｃ，〜Ｃ，ｚ）又は長鎖（Ｃ＋□〜Ｃ１，）飽和脂肪酸。

これらは、リン脂質の乳化性の改質、生理学的価値の改質又は酸化安定性の改善 のため導入される。

はエスール 本発明によれば、リン脂質に導入されるべきアシル基は遊離的又はそのエステル として与えられる。エステルは、特に短鎖（Ｃ１〜Ｃ３）アルキルエステル、特 にメチルエステル又はエチルエステルである。別に、エステルはトリグリセリド 、特に天然トリグリセリドである。

実施例 次の固定化リパーゼが実施例中に使用のため調製された：形質転換アスペルギル スオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）を培養することによって得 られたりシムコール　マイヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｎ＋１ｅｈｅｉ）を、 マクロポーラスシリカ担体（ブース６、グレースケミカルズ社の製品）上に固定 化された。吸着は、触媒１ｇ（乾燥重量）当たり１６６．５６０　Ｌ　Ｕであっ た。

カンジダ　シリンドラセア（Ｃａｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）　（リ パーゼ６Ｆ、多糖産業）をアキュレルＥＰ−１００上に固定させた。吸着は触媒 １ｇ（乾燥重量）当たり３４，２００ＬＵであった。

例１ リン脂質として、ルーカスバイエル社製の商品エピクロン２００を用いた。これ は最小９５％のフオスファチジルコリン、最大４％のりゾーフオスファチジルコ リンおよび湿分並びに最大３％のオイル含量を含有する分別大豆レシチンである 。５．５ｇのエピクロン２００を、１２．０　ｇのデカン酸および９０ｍ１の石 油エーテル（沸点８０〜１００℃）と混合した。

この混合物中でフォスファチジルコリンに対するデカン酸のモル比は約１０対ｌ である。

乾燥重量１２５■に相当する固定化Ｒ，マイヘイ（Ｒ。

ｎ＋１ｅｈｅｉ）　リパーゼおよび固定化Ｈ，ラヌギノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓ ａ）リパーゼの各々を秤量してバイアルに入れた。リパーゼをＲマイヘイリパー ゼ（Ｒ，僧１ｅｈｅｉ）　リパーゼに対し１ｏ％Ｗ／Ｗの水分含量までおよびＨ ，ラヌギノサ（Ｈ、Ｉａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼに対し１１．３％ｗ　／　 ｗの水分含量まで室温で一夜加湿させた。

１．５ｍｌの上記混合物を固定化リパーゼに添加した。次いで４０℃で２４時間 穏かに撹拌した。次いで基質を酵素触媒から分離した。

基準として、１．５ｍｌの基質を４０″Ｃで２４時間リパーゼなしで撹拌した。

ファスファチジルコリン中の脂肪酸の組成は、次の如く分析した：フォスファチ ジルコリンを脂肪酸から分解し次いで溶剤としてＣ）ＩＣｈ　：　Ｃ１ｈＯＨ： 　Ｈ２Ｏ（６５：　２５　：　４、ｖ　／　ｖ　／　ｖを用いシリカゲル６０プ レート（メルク製品５７２１　）を有する薄層クロマトグラフィー法により脂肪 酸から分離した。溶出後、プレートを乾燥し、次いでヨード薫気によりバンドを 可視化した。フォスファチジルコリンに対応するバンドを引きさいて剥離した。

剥離中のフォスフブチジルコリン中のエステル化された脂肪酸をメチル化し次い で脂肪アシルメチルエステルをガスクロマトグラフィー法で測定しかつ定量化し た。

結果は次の如くであった： 基準サンプル中のフォスファチジルコリンはデカン酸を含有しなかった。

Ｒ，マイヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）で処理したフォスファチジルコリンは、脂肪酸全 量の６７％（Ｗ／Ｗ）Ｉでデカン酸を含有していた。

Ｈ，ラヌギノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）　リパーゼで処理したフォスファチジ ルコリンは、脂肪酸全量の４３％（ｗ／ｗ）Ｉでデサン酸を含有していた。

両方の酵素触媒化実験に於て、反応基質中の約半分のフォスファチジルコリンは 、反応中に加水分解されていた（薄層クロマトグラフィー法から推定される）■ −又 例１と同様に行うが、１２．０ｇのラウリン酸の代りに１５．９ｇのミリスチン 酸を用いた。フォスファチジルコリンに対するミリスチン酸のモル比は約１０対 １である。

Ｒ，マイヘイ（ｎ＋１ｅｈｅｉ）　リパーゼで処理したフォスファチジルコリン は、脂肪酸含量の７３％（Ｗ／Ｗ）および５６％（ｗ　／　ｗ　）量でそれぞれ ミリスチン酸を含有した。

例１に記載した如（、酵素触媒化実験における約半分のフォスファチジルコリン は加水分解したものと推定した。

前記基質および前記の如く同量のリパーゼ（ＬＵで測定）を用いたエステルな種 に対して可溶性Ｒ，マイヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼを用いる場合、本質中に 特開昭６３−１８５．３９１に記載の如く、すなわち１０％の水との反応混合物 中心で、本発明者等は２４時間後、当初存在していたフォスファチジルコリンの 半分よりも著しくより多い量が加水分解され更に残りのフォスファチジルコリン がわずが３８％（Ｗ／Ｗ）のミリスチン酸を含有していることを観察した。これ は、特開昭６３−１８５、３９１に比較して本発明による改善を実証するもので ある。

廿Ｂ ５．５ｇのエピクロン２００を、１４．０　ｇのラウリン酸および９０ｍ１の石 油エーテル（沸点８０〜１００°Ｃ）と混合した。

この混合物において、フォスファチジルコリンに対するラウリン酸のモル比は約 １０対１であった。

乾燥重量１２５■に相当する固定化Ｒ，マイヘイ（ｍｉｅｈｅｉ）、Ｈ，ラヌギ ノサ（ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）およびＣ，シリドラセア（Ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅ ａ）リパーゼの各々を秤量しバイアルに入れた。

Ｒ，マイヘイリパーゼおよびＣ，シリンドラセアリパーゼに対し１０％ｗ　／　 ｗおよびＨ，ラヌギノサリバーゼに対しＩｌ、３％ｗ　／　ｗの水分含量まで、 リパーゼを室温で一夜加湿させた。

次いで例１における如く反応および分析を行った。

結果は次の如くであった。： 参考サンプル中のフォスファチジルコリンは、脂肪酸の全量の１．６％（Ｗ　／ 　Ｗ　）の量でラウリン酸を有していた。

Ｒ，マイヘイ、Ｃ，シリンドラセア、又はＨ，ラヌギノサリパーゼで処理したフ オスファチジルコリンは、脂肪酸全量の５１％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）　 、および４０％（Ｗ／Ｗ）の量でそれぞれラウリン酸を含有していた。

例１における如く、酵素触媒化実験における約半分のフオスファチジルコリンは 、加水分解されたものと推定した。

例４ Ｒ，マイヘイリパーゼおよび次の基質を用い先の実施例と同様に行う二 ０、１８３３　ｇのエビクロン　２０００．６４３３ｇのα−リルン酸 ３ｍｌの石油エーテル（沸点８０〜１００°Ｃ）この基質において、フォスファ チジルコリンのα−リルン酸に対するモル比は約１０対１である。

α−リルン酸の過剰酸化を避けるため、反応をアルゴンのおおいのもとで行った 。

結果は次の通りであった： 参考サンプルにおけるフォスファチジルコリンは、実質的にはラウリン酸は含有 していなかった。

Ｒ，マイヘイ又はＨ，ラヌギノサで処理したフォスファチジルコリンは、それぞ れ脂肪酸全量の５３％（Ｗ／Ｗ）および４３％（Ｗ　／　Ｗ　）量でラウリン酸 を含有していた。

先の例におけると同様に、酵素触媒化実験におけるフォスファチジルコリンの約 半分は加水分解されたものと推定した。

例６ １ｎ＋１の石油エーテル（沸点８０〜１００°Ｃ）当たり、５０■のラウリン酸 および１０■のフォスファチジルエタノールアミン（リビノドブロダクツ社製、 等級１）を有する基質を調製した。

１２５■の乾燥重量に相当する固定化Ｒ，マイヘイリパーゼを秤量してバイアル に入れた。リパーゼを５％（Ｗ／Ｗ）の水分含量まで一夜加湿した。１．５ｍｌ の上記基質をリパーゼに添加し、次いで４０°Ｃで１２時間穏やかに撹拌した。

反応生成物の分析は先の実施例におけると同様に行った。

結果は次の通りであった： 参考サンプル中のフォスファチジルエタノールアミンは、実質的にラウリン酸（ ０，５％（Ｗ／Ｗ）未満）を含有していなかった。

リパーゼで処理したフォスファチジルエタノールアミンは、脂肪酸全量の４０％ （Ｗ／Ｗ）の量でラウリン酸を含有していた。

薄層クロマトグラフィーから、反応基質中のフォスファチジルエタノールアミン の約半分が反応中に加水分解されたものと推定した。

例７ フオスフアチジルエタノールアミンの代りにフォスファチジルグリセロール（リ ピノドプロダクツ社製、等級１）およびわずか３０分の反応時間を用い、例５と 同様に行った。

結果は次の通りであった： 参考例におけるフォスファチジルコリンは、実質的にラウリン酸（０，５％（％ ）未満）を含有していなかった。

リパーゼで処理したフォスファチジルグリセロールは、脂肪酸全量の２２％（Ｗ ／Ｗ）の量でラウリン酸を含有していた。

酵素処理した反応生成物に関しての薄層クロマトグラフィーによれば、わずか小 量のりゾフォスファチジルグリセロールが観察された。しかし、未同定化合物の 新しいバンドが観察された。この化合物は、フォスファチジルグリセロールにお ける遊離のヒドロキシ基に対するラウリン酸のエステル化により生成されたもの であろう。未同定化合物の脂肪酸組成を分析し、３９％（Ｗ／Ｗ）のラウリン酸 を含有することが見出された。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年２月２８日

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．酵素的エステル交換を用い、リン脂質中のアシル基を遊離脂肪酸エステル又 は遊離脂肪酸で交換する方法であって、酵素が粒状マクロポーラス担体上に固定 されていることを特徴とする、前記方法。
2. ２．マクロポーラス担体が弱塩基製アニオン交換樹脂、吸剤剤担体、シリカ又は シリケート担体である、請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．反応系中の水の量が、０．０５〜１．５％（重量）、好ましくは０．１〜１ ．０％である請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。
4. ４．固定化酵素がリン脂質と接触する前の水分含量を５〜１５％（重量）の範囲 で有する、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の方法。
5. ５．酵素が、リパーゼ、好ましくは微生物産生リパーゼである請求の範囲第１〜 ４項のいずれかに記載の方法。
6. ６．リパーゼが、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）（特に、Ｈ．ラヌギノサ（Ｈ． ｌａｕｇｉｎｏｓａ）又はリゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）（特にＲ．マ イヘイ（Ｒ．ｍｉｅｈｅｉ）から好ましく由来する位置特異性リパーゼである、 請求の範囲第５記載の方法。
7. ７．リパーゼが、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）（特に、Ｃ．シリンドラセア（Ｃ ．ｃｙｌｉｎｄｒａｃｅａ）、又はプソイドモナス（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ）（特に、Ｐ．セパシア（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）から好ましく由来する位置特異 性リパーゼである請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．リン脂質が、フォスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホス ファチシルイノシトール、ホファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセ リン、フォスファチジン酸、ジフォスファチジルグリセロール、エステル化脂肪 酸を含有する合成リン脂質、又はこれらの２種又はそれ以上の混合物である、請 求の範囲第１〜７項のいずれかに記載の方法。
9. ９．脂肪酸がＣ１８〜Ｃ２２多不飽和脂肪酸、好ましくはエイコサペンタエン酸 、ドコサヘキサエン酸、γ−リノレン酸、α−リノレン酸、リノレン酸又はアラ キドン酸である、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載の方法。
10. １０．脂肪酸がＣ６〜Ｃ１８飽和の脂肪酸である、請求の範囲第１〜８項のいず れかに記載の方法。
11. １１．エステルがＣ１〜Ｃ３アルキルエステル、好ましくはメチルもくしはエチ ルエステルである、請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載の方法。
12. １２．脂肪酸エステルが、トリグリセリドである、請求の範囲第１〜１０項のい ずれかに記載の方法。
13. １３．温度が２０〜８０℃である、請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の 方法。
14. １４．有機溶剤、好ましくはヘキサン、ヘプタン、石油エーテル又は塩素化炭化 水素の存在下で行う、請求の範囲第１〜１３項のいずれかに記載の方法。
15. １５．基質および所望により溶剤の混合物を、１〜１２時間の帯留時間で固定化 酵素の固定床を通す請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。
16. １６．固定化酵素、基質および所望により溶剤の混合物を、０．５〜７２時間、 好ましくは０．５〜２４時間撹拌し、次いでその後固定化酵素を混合物から分離 する、請求の範囲第１〜１４項のいずれかに記載の方法。
17. １７．反応混合物中との固定化酵素の量が１〜１０％（ｗ／ｗ）である、請求の 範囲第１６項記載の方法。
18. １８．当初存在するリン脂質の多くて９５％、好ましくは多くて９０％更に最も 好ましくは多くて７５％が加水分解される、請求の範囲第１〜１７項のいずれか に記載の方法。
19. １９．リン脂質のアシル基の少なくとも５％、好ましくは少なくとも１０％、更 に最も好ましくは少なくとも２０％が置換される、請求の範囲第１〜１８項のい ずれかに記載の方法。