JPH05501803A - 改変されたＮα―アセチルトランスフェラーゼ活性を有するサッカロミセス・セレビシエ株の単離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

発明の名称 改変されたＮ＃−アセチルトランスフェラーゼ活性を有するサツカロミセス・セ レピンエ株の単離関連出願 本出願は、米国特許出願０７／２８４，３４４　（１９８８年１２月１４日出願 ）および０７／１５３．３５１　（１９８８年２月８日出願）の一部継続出願で ある。 発明の技術分野 本発明は改変されたＮ’−アセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵母株、す 、カロミセス・セレビ／工（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ）の単離、精製および特性化に関する。本発明はまた、そのような株で生成さ れた改変Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ酵素をも包含する。 アミノ末端のアシル化は原核性および真核性細胞におけるタンノくり質の重要な 同時翻訳修飾（コ・トランスレーンヨナルモデイフイケーション）である。ホル ミル、ピルボイル、α−ケトブチリル、グリコリル、グルクロニル、α−アミノ アンル、ｐ−グルタミル、ミリストイル、およびアシルは周知のＮ”−アシル化 基であるが、アセチル化は真核性タンパク質のα−ＮＨ，基の最も一般的な化学 修飾であることは明らかである［ツナサワら（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、　Ｓ、　） 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１０６：　１６５−１７０　（１９８４） ；　ドリーセンら（Ｄｒｉｅｓｓｅｎ、　）１．Ｐ。 Ｃ，）、　ＣＲＣＣｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：　２８１−３ ２５　（１９８５）］。 ］Ｎ″Ｎモーチルは正常な真核性翻訳とプロセシングに重要な役割を果し［ワル ド（胃ｏ１ｄ、Ｆ、）、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｓｃｉ、　９：　２ ５６−２５７（１９８４）］　、タンパク加水分解による分解から保護する［ジ ョーンボール（Ｊｏｒｎｖｏｌｌ、Ｈ，）、　Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、　５ ５：１−１２　（１９７５）；ルーベンスタインら（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、Ｐ 、）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５４：　１１１４２−１１１４７　（１９ ７９）］。 さらに、ユビキチン依存性分解システムに触媒されるタン）４１）質のターンオ ーバーは遊離のタンパク質のＮ−末端のα−ＮＨ”の存否に依存するらしく［ハ ーシコら（Ｈｅｒｓｈｋｏ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＩＪ ＳＡ　８１：９０２１−９０２５（１９８４）およびバソヒマーら（Ｂａｃｈｍ ａｉｒ）　５ｃｉｅｎｃｅ２３４：１７９−１８６（１９８６）　］、これはＮ ”−アセチル化がタン／す質のターンオーバーを阻害するらしいことを示唆して いる。 アセチル部分がタバコモザイクウィルス［ナリタら（Ｎａｒｉｔａ、　Ｋ、　） Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　２８：１８４−１９１　（１９５ ｇ）］および］α−メラニン細胞刺激ペプチド）翫リスら（Ｈａｒｒｉｓ、Ｊ、 　１．）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、　７１：　４５１−４５９（１９５９）］のコ ートタンパク質のＮ−末端保護基であること力く発見されて以来、種々の生物の 多くのタン１＜り質がアセチル化されたＮ−末端残基を有することが示された［ ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ几、　）Ｊ、　Ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、　２５１： １００９−１０１４　（１９７６）；ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ 、Ｂｉ。 １、ｃｈｅｍ、　２５４：１４４７−１４４９　（１９７９）］　。例えば、マ ウスＬ−細胞およびエルリノヒ腹水細胞はその細胞内可溶性タン／　ＸＨり質の 約８０％力ＣＮ　６−アセチル化されティる［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、 Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅＩｌ。 ２５１：１００９−１０１４　（１９７６）ニブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、 Ｌ、）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＋＋、　２５４：１４４７−１４４９　（１９７ ９）］。下下等真核性物では可溶性タンノくり質の約５０％がアセチル化されて いる［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、　Ｌ、　）　Ｉｎｔ’　ＩＣｏｎｇｒ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ａｂｓｔｒ、　（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　 ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｃａｎａｄａ）　Ｖｏｌ、　１１：　９０ 　（１９７９）］　、これらのデータはＮ”−アセチル基が非常に重要な保護基 であることを証明するものである。この保護基の生物学的な機能は未成熟タンパ ク質のカタポリズムの防止［ジョーンボール（Ｊｏｒｎｖｏｌｌ、）！、）、　 Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、Ｂｉｏｌ、　５５：１−＋２　（１９７５）］およびタンパク 質のタンパク加水分解による分解［ルーベンスタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、 　Ｐ、　）およびトイヒラ−（Ｄｅｕｃｈｌｅｒ、Ｊ、）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ ｅｍ、　２５４：１１１４２　（１９７９）］の防止にあると示唆されている。 しかしマウスＬ−細胞では、そのようなＮ′−アセチル化はこのような生物学的 な機能を有しないようである［ブラウンら（Ｂｒｏｗｎ、　Ｊ、Ｌ、）Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｔ２５４：１４４７　（１９７９）］。 Ｎ“−アセチル化の明確な一般的機能は確実に査定されてはいなか、少数のタン パク質について、幾つかの特異的な作用が知られているｏ３ニーロスポーラ０ク ラノサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）の変異株が有する非アセチル化 ＮＡＤＰ特異的グルタミン酸デヒドロゲナーゼは、アセチル化形のものと対照的 に熱に不安定である［シデイノヒら（Ｓｉｄｄｉｇ）　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 １３７・１２５（１９８０）］。リポソームタンノくりＳ５がアセチル化されて いない大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）変異株は温度過敏性を示す しクンバーリッジ（Ｃｕｍｂｅｒ　Ｉ　ｉｄｇｅ、＾、Ｇ、）、イソメ（Ｉｓｏ ｎｏ、Ｌ）　、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１３１：１６９（１９７９）］　。前 駆体タンパク質プロオピオメラ／コルチンからの２つの生成物のＮ”−アセチル 化はこれらポリペプチドの生物学的活性に大いに制御効果を示す、即ちＮ’−ア セチル化されるとβ−エンドルフィンのオピオイド（モルヒネ様）作用は完全に 抑制されるか、α−ＭＳＨのメラノトロビ。 り（メラニン細胞刺激）作用は増大する［スミスら（Ｓｍｙｔｈ）　、　Ｎａｔ ｕｒｅ　２７９°２５２（１９７０）　；スミス（ＳｍｙＬｈ、　Ｄ、　Ｇ、　 ）およびザカリアン（Ｚａｋａｒｉａｎ、Ｓ、）　Ｎａｔｕｒｅ２８ｇ：６１３ （１９８１；　ラマンチャントラン（Ｒａｍａｃｈａｄｒａｎ、Ｊ、）、リ　（ Ｌｉ、　Ｃ，Ｈ，）　＾ｄｖ、Ｅｎｚｙｍｏ１．　２９：３９１（１９６７）　 ］　、培養された／ヨウショウバエ細胞のアセチル化および非アセチル化細胞質 アクチンは微小線維の集合に関与するか、後者は効果か低い「バーカーら（Ｂｅ ｒｇｅｒ）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｇｅｎｅｔ、　１９：３２１　（１９８１）］　 ｏさらに最近では、ユビキチン依存性分解システムに触媒されるタンパク質のタ ーンオーバーは遊離のタンパク質のＮ−末端のα−ＮＨ’の存否に依存するらし く［ハーンコら（Ｈｅｒｓｈｋｏ）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 　ｔｌｓ＾８１：９０２１−９０２５（１９８４）およびハノヒマーら（Ｂａｃ ｈｍａｉｒ）　５ｃＩｅｎｃｅ２３４：１７９−１８６（１９８６）　］、］コ ｔ’ＬハＮ’−アセチルがタンパク質のターンオーバーヲ阻害するらしいことを 示唆している。 Ｎ”−アセチル化は少なくとも１個のＮ１−アセチルトランスフェラーゼによっ て触媒される。これはアセチル補酵素Ａからタンパク質およびペプチドのα〜Ｎ Ｈ’基へのアセチル基の移動を触媒する酵素である。Ｎ”−アセチルトランスフ ェラーゼは既に、大腸菌［プロットら（Ｂｒｏｔ、　、Ｎ、　）　Ａｒｃｈ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　１５５：４７５−４７７（１９７３）］ 、ラット肝臓［ペスターナら（Ｐｅｓｔａｎａ、Ａ、）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ　１４：１３９７−１４０３（１９７５）　、ペスターナら（Ｐｅｓｔａｎ ａ、Ａ、）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１４：１４０４（４１２（１９７５） ；ヤマタら（Ｙａｍａｄａ、　Ｒ，）　１ｓｔ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｒ　ｔ ｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　（１９８７）；８２５：３４］　１　 ラット脳［オドノヒュ−（０’　Ｄｏｎｏｈｕｅ、　Ｔ、　Ｌ、　）。 Ｊ、Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、２５８：２１６３−２１６７（１９８３）］　、ラッ ト脳下垂体［ウッドホードら（Ｗｏｏｄｆｏｒｄ、　Ｔ、　Ａ、　）　Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ　Ｃｈｅｍ、　２５４：４９９３−４９９９（１９７９）　：　ペアーゼ ら（Ｐｅａｓｅ、　Ｋ、　Ａ、　）　Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｔｎ、　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ、　２１２　：　１７７−１８５（１９８１j　； ゲモツキ（Ｇｅｍｂｏｔｓｋｉ、　Ｃ，Ｃ，）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２５７　：　１０５０１−１０５０９（１９８２）　：チャペルら（Ｃｈａｐ ｐｅｌｌ、Ｍ、Ｃ，）　、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１：１０ｇｇ−１０ ９１（１９８６）］、ウラン下垂体［Ｇｅｍｂｏｔｓｋｉ、Ｃ，Ｃ，Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、２５７：１０５０１−１０５０９（１９８２月、つ７レンズ［グ ランガーら（Ｇｒａｎｇｅｒ、　Ｍ、　）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｌ、Ａｃａｄ、 ｓｃｉ、ＵｓＡ　７３：３０１０−３１４　（１９７６）］　：　雌鶏卵管［ツ ナサヮら（Ｔｓｕｎａｓａｗａ、　Ｓ、　）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８ ７　：６４５−６５０（１９８０）］および小麦胚［キトら（Ｋｉｄｏ、　Ｉｌ 、　）八ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２０８：９５−１０ ０（１９８１）］で示された。 しかしながら、これら供給源からのＮ”〜アセチルトランスフェラーセ酵素が４ ０倍以上に精製されたことはない。 発明の要約 Ｎ“−アセチル化は真核性タンパク質のα−アミ７基のｉも一般的な化学修飾で あり、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼによって触媒される。サツカロミセス ・セレビンエから均質なＮ’−アセチルトランスフェラーゼを精製しその基質特 異性を決定した［リー（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）、スミス（Ｓｗｉｔｈ、 　Ｊ、　Ａ、　）、リン（Ｌｉｎ　Ｌ−１１，）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　 ２６３F１ ４９４ｇ−１４９５５（１９８ｇ）］　コとにより、酵母Ｎ’　Ｔセｆ　／Ｌ７ 　トランスフェラーゼをコードする完全長さのｃＤＮＡを単離することが可能と なった。このｃＤＮＡクローンを突然変異させ、ヌル変異体（ａａａｌと呼称） を得た。突然変異は致命的ではないが、細胞の増殖を遅らせ、ヘテロジーニアス であった。ａａａｌ／ＡＡＡＩジブロイドは最初に４つの生存可能な胞子を形成 するが、子嚢ねばり（コンシステンン−）内の２個のａａａ　ｌ胞子は小さいコ ロニーを与えた。さらに、ａａａｌ／ａａａ１　２倍体は芽胞形成欠損であった 。ａａａ１突然変異体は熱ショックに過敏であり定常期に達し得ない。ａａａｌ 突然変異はまた、ｒａＪ交配型細胞における交配機能を特異的に低下する。これ らの結果は、Ｎ“−アセチル化が真核性タンパク質の重要な化学修飾であること を示している。′この突然変異体を得ることができたことから他の突然変異体を 得ることができ、遺伝子発現への適用およびタンパク質配列決定が可能となる。 詳しくは、本発明は改変されたＮ′″−アセチルトランスフェラーゼを発現する 細胞に関する。１つの実施態様では、本発明は改変されたＮ’−アセチルトラン スフェラーゼを発現する酵母細胞、とりわけ、ＡＡＡ　ｌ遺伝子に突然変異を有 する酵母細胞に関する。本発明は特に、細胞のＮ’−アセチルトランスフェラー ゼ活性の実質的な欠如をもたらすＡΔＡ１遺伝子の突然変異に関する。 本発明はまた改変されたＡＡＡ　１遺伝子を含有する組換え分子に関する。 本発明はまたＮ’−アセチル化アミノ末端を持たないペプチドまたはタンパク質 の製造方法であって、ＡＡＡＩ遺伝子内に突然変異を有し、その突然変異の結果 、実質上ＡＡＡ　！遺伝子産物の活性を失い、ペプチドまたはタンパク質のＮ” −アセチル化を触媒することが不可能となった酵母細胞内でペプチドまたはタン パク質を発現させることからなる方法に関する。 本発明はまたペプチドのアミノ酸配列の決定法であって、ａ）ＡＡＡＩ遺伝子を 有する酵母であって、該遺伝子に突然変異を有し、その突然変異の結果、実質上 ＡＡＡ　１遺伝子産物の活性失い、ペプチドＮ°−アセチル化を触媒することか 不可能となった酵母細胞内でペプチドを発現させ。 ｂ）ペプチドを回収し。 Ｃ）ペプチドのアミノ酸配列を決定することからなる方法に関する。 図面の簡単な説明 図１はサツカロミセス・セレビシェＮ”−アセチルトランスフェラーゼＡＡＡ　 ｌのアミノ酸配列およびそのＤＮＡ配列を示す。 図２はＡＡＡ　ｌ遺伝子の制限地図である。図中、（ａ）は完全長さのＡＡＡ　 １クローン（ｐＢＮ９）（黒線はｃＤＮＡ、破線はＢｌｕｓｃｒｉｐｔ）、（ｂ ）ｐＢＮ９からの３°Ｈｉｎｄｌｌｌ断片の欠失（ｐＢＮＨ９）、（ｃ）ｐＢＮ Ｈ９のＥｃｏＲＶ部位への３　、８　ｋｂ　ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ　断 片の挿入（ｐＢＮＨｕ９）。 図３はａａａ　１株の熱シヨツク感受性を示す図である。細胞をＹＰＤ培地で後 期対数期まで増殖させ、ＳＤ培地で希釈し、５４℃でインキュベーションする。 生存率（％）を各時間毎に調べた。株の遺伝子型は表２に示されている。 す、カロミセスセレビシエのＮ”−アセチルトランスフェラーゼを見掛は上、均 質（４６００倍）に精製し、サブユニットの分子量か９５，０００であって、様 々な合成ペプチド基質［ＡＣＴＨ（１−２４）　、ヒトスーパーオキシドジムタ ーゼ（１−２４）および酵母アルコールデヒドロゲナーゼ（１−２４）を含む］ にアセチル基を転移させる、２量体タンパク質として特性化した［リーら（Ｌｅ ｅ。 Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３°１４９４８−１ ４９５５（１９８ｇ）、米国特許出願Ｎ００７／２８４，３４４および０７／１ ５３．３６１コ。 さらに、この酵素は様々なペプチド基質およびヒストンのワ／ル残基のε−アミ ７基のアセチル基を転移しないことか示された。Ｎ０〜アチセチルトランスフエ ラーセ酵素はサツカロミセス・セレビシェの染色体ＩＶに位置する、単一の遺伝 子（ＡＡＡＩ、アミノ末端、α−アミノ、アチセチルトランスフエラーゼ）にコ ードされている。 Ｎ’−アセチルトランスフェラーセ酵素が精製されたことにより、そのアミノ酸 配列の解明が可能となった。この解明によって酵母内で該酵素をコードするｃＤ ＮＡ配列のクローニングが可能となった。酵母ｃＤＮＡのクローニングによって 真核性タンパク質の合成と分解におけるＮ“−アセチル化の生物学的機能の研究 が可能となった。 さらに詳しくは、このｃＤＮＡ分子を得ることによってサツカロミセス・セレビ シェＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異体アレルを構築し、改 変されたＮ′−アセチルトランスフェラーゼを発現する細胞を得るために、改変 されたアレルを酵母および植物細胞に導入することかできる。そのような突然変 異体の構築および使用は本明細書に引用する文献に記載されているしり−（Ｌｅ 　ｅ＋Ｆ、　Ｊ）、スミス（Ｓｍｉｔｈ、　Ｊ、　Ａ、　）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ ｉｏｌ、１７１　（１１）（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１９８９）」。 したがって本発明は１つの目的として、改変されたＮ１−アセチルトランスフェ ラーゼ活性を有するサツカロミセス・セレビシェ株および植物株に関する。本明 細書中、「改変された」という語句は本発明のＮ”−アチセチルトランスフエラ ーゼと通常（正常）のそれ（即ち、非−突然変異または「野生型」）の活性との 対比を意図して用いられる。通常のＮ”−アセチルトランスフェラーゼの単離、 精製および分析法、並びに該酵素の特性（即ち、基質特異性、比活性、安定性等 ）は本明細書に引用する米国特許出願Ｎ００７／２８４，３４４および０７／１ ５３，３６１に記載されている。 本発明の改変されたＮ”−アチセチルトランスフエラーゼ活性は、例えば、正常 な細胞に見られるよりも低い比活性（重量あたりの活性単位）を示す。例えば、 「ヌル」突然変異（以下に述へるａａａ１突然変異）を生産し、実質上、正常な タンパク質にはあるＮ“−アセチルトランスフェラーセ活性のすべてを喪失した Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼを含有する細胞を構築するのに用いることか できる。そのようなアレルか酵母細胞に導入されると、高温に対する感受性、定 常期への移行、および交配機能等の基本的な細胞特性か影響を受ける。この結果 は、Ｎ“−アチセチル化か真核性細胞における重要な化学修飾であり、真核細胞 における幾つかの非関連の生物学的機能に影響することを示している。 本発明はまた、Ｎ”−アセチルトランスフェラーセ濃度が高められた（即ち正常 値より高い）サツカロミセス・セレビシェ株に関する。さらに、本発明は改変さ れた（即ち、非正常）特異性、安定性または特性の、Ｎ”−アチセチルトランス フエラーゼ活性を有するサツカロミセス・セレピノエ株を包含スる。 本発明は、また、「実質上純粋な」または「実質上純化された」Ｎ’−アセチル トランスフェラーゼまたはその変異体に関する。本明細書中、「実質上純粋な」 または「実質上純化された」という語句は同等に用いられ、実質上天然の酵素に 付随する不純物、即ち、タンパク質、炭水化物、脂質等、を伴わないＮ“〜アセ チルトランスフェラーゼを指す。また、この語句はさらに、当該技術者が用いる ｌまたはそれ以上の純度または均一性に関する分析法で均質であるＮｏ−アセチ ルトランスフェラーゼをも指す。例えば、実質上純粋なＮ”−アセチルトランス フェラーゼは、例えば分子量、クロマトグラフ法等のパラメーターについて標準 実験偏差の範囲内で一定の、再現性ある特性を示すであろう。しかしなから、［ 実質上純粋な」という語句は酵素と他の化合物との人工的または合成混合物を排 除することを意味しない。この語句はまた、酵素の生物学的活性を干渉しない不 純物であって、例えば、不完全な精製によって存在し得る不純物の存在をも排除 する意味でない。 Ｉ　Ｎａ−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子操作Ａ、Ｎ’−アセチルトラン スフェラーゼの配列決定本発明者らは、真核性Ｎ”−アセチルトランスフェラー ゼ遺伝子を分子クローニングし、完全なｃＤＮＡ配列決定を行った［リーら（Ｌ ｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋＋＋、　２６３：　 １４９４８−１４９５５（１９８ｇ）、米国特許出願Ｎｏ、０７／２８４，３４ ４および０７／１５３．．３６１］　。酵ＩＮ“−アセチルトランスフエラーセ タンバク質は２５６２塩基のオーブンリーディングフレームにコードされており 、８５４アミノ酸からなる。このアミノ酸組成から計算した分子量は９８，５７ ５ダルトンであり、これは見積られたサブユニ、ト分子量９５．　０００±２， ０００と一致する。天然タンパク質のタンパク質配列決定で、Ｎ−末端が保護さ れている、即ちＮ−末端Ｍｅｔ残基の開裂後、２番目のセリル残基がアシル化（ おそらくアセチル化）されているらしいことか明らかになった。酵素が糖タンパ クであることは不明であるが、これは残基１２０−１２２．１６１７．１６３， ６４３−６４５．７０２−７０ｊ、７６１−７６３および７９２−７９３に、６ 個の推定のＮ−グリコリル化部位（即ち、Ａｓｎ　−Ｘ−３ｅ　ｒ　（Ｔｈｒ） 配列）を有している。残基５０８から７２０までの長い親水性領域が酵素の制御 または位置決定に機能的な役割を果しているか否かは明らかでないが、これは該 分子の通常でない構造特徴である。 このＮ”−アセチルトランスフェラーゼのタンパク質配列と他のＮ’−アセチル トランスフェラーゼとの比較では、幾つかの短い配列間に５０％以上の類似性が あったが、感知できる程の割合（％）の類似性は認められなかった。これらの部 位は、早期の試みとして、触媒作用に関与する残基の同定のための部位特異的突 然変異誘発を導入すべき部位であろう。サツカロミセス・セレビシェのＮ＃−ア セチルトランスフェラーゼおよびそのｃＤＮＡの配列を図１に示す。 Ｂ、、　Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子ノーザンおよびサダンハイブ リソド形成でこのＮ”−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子が１個 存在することが示された。しかしながら、酵母がタンパク質のα−ＮＨ，をアセ チル化することができる他のアセチルトランスフェラーゼを念有しているか否か は明らかでなかった。さらに、酵母のＮ’−アセチルトランスフェラーゼの基質 特異性に関する以前の研究で、酵母内に、ヒストン−特異的アセチルトランスフ ェラーゼの存在が示された［トラビスら（Ｔｒａｖｉｓ、Ｇ、Ｈ，）Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｍ、　２５９：１４４０６−１４４１２　（１９８４）コが、この酵 素はペプチド基質およびヒストンのε−アミン基のアセチル基を転移しないこと か明らかであった。 ＡＡＡ　１遺伝子は第１Ｖ染色体上にあり、５ＩＲ２遺伝子の５゛フランキング 配に直接、隣接している。５ＩＲ２および他の３つの連結していないＳＩＲ遺伝 子はＨＭＲおよびＨＭＬ遺伝子（これらは２倍体酵母の交配型の決定に関与する ）の転写のトランス制御（ｔｒａｎｓ　ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）に影響を及ぼす ものであり、これら遺伝子とＡＡＡ　１との機能上の関連性を明瞭にするものは ない。 酵母ＡＡＡ　１遺伝子のクローニングによって、決定すべき真核性タンパク質の 分類および分解におけるＮ“−アセチル化の役割を分子的に詳細にすることが可 能となった。 Ｃ，Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列の突然変異体および改変され たアレルの形成 Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列変異体はクローン化Ｎｏ−ア セチルトランスフェラーゼｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　配列に突然変ｘを導入することで得 られる。そのような変異には、例えばＮｏ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子 にコードされているアミノ酸配列内における欠失、挿入または置換を含む。欠失 、挿入および置換の任意の組み合わせを構成することができる。明らかに、ヌル 突然変異体が望ましい場合には変異体をコードするＤＮＡ内で作られる突然変異 は配列をリーディングフレームの外におくものであってはならず、第２のｍＲＮ Ａ構造を作成する相補性領域を創製するものでないことが好ましい（英国特許出 願公開Ｎｏ、　７５．４４４）。 遺伝的レベルでは、これらの変異体は通常、Ｎｏ−アセチフレトランスフェラー ゼをフードするＤＮＡのヌクレオチドに部位特異的突然変異を誘発することによ り変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後ＤＮＡを組換え細胞培養内で発現 させることにより得られた。 アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定していてもよいか突然変異そのもの は必ずしも先に決定しておかなくてよい。例えば、特定の部位での突然変異の成 果を最適化するために、標的コドンまたは標的領域でランダム突然変異誘発を行 い、発現したＮ・−アセチルトランスフェラーゼ変異体を所望の活性の最適な組 み合わせに関してスクリーニングする。配列が既知のＤＮＡの予め定めた部位で 置換突然変異を起こす方法は、例えば、部位特異的突然変異誘発として、周知で ある。 本発明のＮｏ−アセチルトランスフェラーゼ変異体の調製はタンパク質の早期に 調製された変異体または非変異体をコードするＤＮＡに部位特異的突然変異を誘 発することによって、都合よく行うことができる。部位特異的突然変異誘発に、 トラバースされる欠失連結部分の両側に安定な２本鎖を形成するに十分なサイズ と、配列の複雑さとを有するプライマー配列を得る上で十分な数の隣接ヌクレオ チド、並ひに所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特異的なオリゴヌヌクレ オチド配列、を用いることで、Ｎ１−アセチルトランスフェラーゼ変異体を製造 することができる。一般に、変換すべき配列の連結部分の両側に約５−１０残基 を有する配列長さ２０−２５ヌクレオチドのプライマーが好ましい。通常、部位 特異的突然変異誘発の方法は既知であり、例えば本明細書に引用するアデルマン ら［（Ａｄｅｌｍａｎ）、ＤＮＡ　２：１８３（１９８３）］の著書がある。 理解されるように、部位特異的突然変異誘発には、一般に、１本鎖および２本鎖 形て存在するファージヘクターを用いる。部位特異的突然変異誘発に有用なベク ターは、例えば本明細書に引用するメツ７ングら［（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、）　 ３ｒｄ　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐ、　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　Ｒ ｅｃｏｍｐｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、　Ｅｄｉｔｏｒ　Ａ、Ｗａｌｔｏｎ、　Ｅｌ ｓｅｖｉｅｓ、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ　（１９８１）］の開示したＭ１３ファー ジである。これらのファージは市販品を容易に入手でき、その使用は当業者に周 知である。あるいは、１本鎖ファージ複製起点を有するプラスミドベクター［ベ イラら（Ｖｅｉｒａ）ｔｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍ、　１５３：３　（１９８７）］ を用いて１本鎖ＤＮＡを得ることもできる。 一般に、本発明における部位特異的突然変異では、まずその配列内に関連タンパ ク質をコードするＤＮＡ配列を含有する１本鎖ベクターを得る。通常、合成、例 えばフレアらの方法［Ｃｒｅａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、 　ＵＳ＾７５：５７５６　（＋９７１１１）］により、所望の突然変異配列を含 むオリコヌクレオチドプライマーを製造する。次いて、このプライマーとタンパ ク質配列を含有する１本鎖ベクターとをアニーリングさせ、例えば大腸菌のポリ メラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗ断片のようなりＮＡポリメラーゼ酵素に委ねて突然変 異を含む鎖の合成を完成する。 かくして突然変異した配列と第２の鎖か所望の突然変異を含む。次いてこのへテ ロ２本鎖ヘクターを用いてＪＭＩＯｌのような適当な細胞を形質転換し突然変異 配列アレンジメントを有する組換えベクターを含むクローンを選択する。 そのようなりローンを選択した後、突然変異したタンパク質領域を得、タンパク 質合成のための適当なベクター、通常適当な宿主の形質転換に用いられる型の発 現ベクターに挿入する。 アミノ酸配列欠失は一般に約１−３０残基の範囲であり、より好ましくは１−１ Ｏ残基であって、通常、（必然的ではないが）隣接している。 アミノ酸配列の挿入にはアミノおよび／またはカルボキシ末端での１個の残基ま たは基本的には無制限の長さのボッペプチドの融合、並ひに単一またはＦｌ数ア ミノ酸残基の配列内挿入を含む。配列内挿入（即ち、完全なＮ’−アセチルトラ ンスフエラーセをコードする配列内への挿入）は通常、約１−１０残基、好まし くは約１−５残基の挿入である。末端挿入の例には、成熟Ｎ°−アセチルトラン スフェラーゼの組換え宿主からの分泌を容易にするため、宿主にとって異質また は同質のシグナル配列をＮ”−アセチルトランスフエラーセのＮ−末端に融合す ることも含む。 第３は、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ内の少なくとも１個のアミノ酸残基 、好ましくは唯一の残基を除去し、異なる残基をその場所に挿入する変異である 。そのような置換は、Ｎ’−アセチルトランスフェラーセの特性をうまく変化さ せることが望まれる場合には以下の表１にしたがって行うことか好ましい。 表１ 元の残基　置換例 Ａｓｎ　Ｇｌｎ；Ｈｉｓ Ｈｉｓ　Ａｓｎ；Ｇ１ｎ １１ｅ　Ｌｅｕ；Ｖａｌ Ｌｅｕ　’　Ｉｌｅ；Ｖａｔ Ｌｙｓ　Ａｒｇ　；Ｇｌｎ　；Ｇｌｕ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ；Ｔｙｒ；ｌ１ｅ Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　；Ｌｅｕ；Ｔｙｒ Ｖａ　］　Ｉ　ｌｅ　；Ｌｅｕ 機能または免疫学的同一性の実質的な変化は、表１よりも保存性ポリペプチドバ ックボーン、例えばシートまたはへリノクスフンホメーンヨン、（ｂ）標的部位 での電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ、等を維持する上でのそれらの 作用をより大きく変化させる残基を選択する。一般に、置換は、以下のいずれか が予測される。（ａ）グリノンおよび／またはプロリンを他のアミノ酸で置換す る、欠失するまたは挿入する。（ｂ）親水性残基（例えばセリルまたはスレオニ ル）で（を）疎水性残基（例えばロインル、イソロイノル、フェニルアラニル、 バリル、アラニル）を（で）置換する：（Ｃ）／スティン残基で（を）他の残基 を（て）置換する。（ｄ）電気陽性側鎖（例えばり／ル、アルキニル、ヒスチジ ル）で（ヲ）電気陰性側鎖（例えば、グルタミル、アスパルチル）を（て）置換 する。または（ｅ）かさ高い側鎖を有する残基（例えばフェニルアラニン）で（ を）そのような側鎖を有する残基（例えばグリシン）を（て）置換する。 大多数の欠失および挿入、および特に置換で分子の特徴が根本的に変化するとは 期待できない。しかしながら、置換、欠失または挿入を行う前にその正確な効果 を予測することが困難である場合、常套的なスクリーニングアッセイによって効 果を評価できることは当業者ならば理解するであろう。例えば、一般に変異体は 、固有のＮ“−アセチルトランスフェラーゼをコードする核酸に部位特異的突然 変異を誘発し、変異体核酸を組換え細胞培養で発現させ、そして所望により細胞 培養から、例えばポリクローナル抗Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼカラム（ 少なくとも１個の残存エビトーフカそれに結合することで、変異体を吸着させる ために）への免疫親和性吸着（イムノアフィニティーアトソープション）によっ て、精製する。 次いで細胞ライゼートまたは精製Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ変異体の活 性を、所望の特性に関する適当なスクリーニングアッセイで分析する。例えば改 変Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの免疫学的特性における変化、例えば特定 の抗体との親和性、は競合型イムノア、セイで分析される。そのようなタンパク 質の酸化還元や熱安定性、疎水性、タンパク加水分解による分解され易さ、担体 との凝集傾向、またはマルチマーの形成傾向は当業者周知の方法で分析できる。 実質上Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠く変異体を同定するには、正 常な（すなわち活性な）Ｎａ−アセチルトランスフェラーゼのクローンを突然変 異させ、ヌル突然変異体に導入する。そノ後は、形質転換体の大部分はＮ’−ア セチルトランスフェラーゼ活性を示すので、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ 活性を欠くクローンの発見は容易である。 同様にして、強化された、または変化したＮ“−アセチルトランスフェラーゼ活 性を有するクローンを同定することかできる。ヌルアレルのクローン（１−１０ アミノ酸の置換または欠失を有する）を突然変異誘発しＮ・−アセチルトランス フェラーゼ活性を欠く細胞（例えばヌル突然変異体）に導入する。突然変異の結 果、「訂正」または「補償」突然変異を受けたＮ“−アセチルトランスフェラー ゼ活性を欠くクローンは細胞に導入されると、Ｎ“−アセチルトランスフェラー ゼ活性を発現する。この活性を（上記の方法）で分析し、所望の改変変異体を得 ることができる。 Ｄ、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング本発明のサツカロ ミセス・セレビシェのＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニング は様々な方法のいずれを用いて行ってもよい。そのような方法の１つはｃＤＮＡ 挿人体のシャトルベクターＤＮＡライブラリー（Ｎ”−アセチルトランスフェラ ーゼを発現する細胞から調製）をＮ“−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の存 在に関して分析することを要する。そのような分析は細胞をベクターでトランス フェクノコンし、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの発現に関して分析する。 この遺伝子のクローニングの好ましい方法にはＮ’−アセチルトランスフェラー ゼ酵素のアミノ酸配列の決定およびこれらの配列を用いてＮ”−アセチルトラン スフェラーゼをコードするｃＤＮＡとハイブリダイズするプローブを設計する必 要かある。この作業を達成するには純化（精製）Ｎａ−アセチルトランスフェラ ーゼタンパク質または該タンパク質のフラグメント（例えば臭化ンアン、または パパイン、キモトリプシンまたはトリブノン等の酵素により得られる）の配列を 決定する［オイケら（Ｏｉｋｅ、　Ｙ、　）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　 ２５７　：９７５＋−９７５８（１９８２）　：　リューら（Ｌｉｕ、Ｃ，）、 １ｎＬ１．Ｐｅｐｔ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、　２１：２０９−２１５（１９ ８３）］　、好ましくはそのような配列決定は自動配列決定装置を用いて行う。 １０アミノ酸以上のペプチドが配列決定されれば、配列情報は一般に、Ｎ”−ア セチルトランスフェラーゼ遺伝子等の１個の遺伝子をクローニングするに十分で ある。 完全な分子または該分子の１またはそれ以上の適当なペプチドフラグメントの配 列か決定されれば、それらをコードし得るＤＮＡ配列を調べる。遺伝コードの縮 重のために特定のアミノ酸をコードするのに、１以上のコドンか用いられる［ワ トソノ（ＷａＬｓｏｎ、Ｊ、Ｄ、）　ｉｎ：ｈｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅ、　３ｒｄ　ｅｄ、Ｗ、Ａ、Ｂｅｎｊａｍｉｎ、 Ｉｎｃ、　Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ、’　ＣＡ　（１９７７）ｐｐ、　３５６−３ ５７１　。テ７工不うノ−（退縮）度か最も低いオリゴヌクレオチドによってコ ードされている可能性のあるアミノ酸配列を同定するためにペプチドフラグメン トを分析する。 好ましくは、唯１個のコドンてコードされているアミノ酸を含有する配列を同定 することによって行う。時には、そのようなアミノ酸配列は単一のオリゴヌクレ オチドでコードされているか、多くの場合、アミノ酸配列は幾つかの類似したオ リゴヌクレオチドの０ずれかでコードされている。重要なことは、セットに含ま れる全メンノＸＩ−か潜在的にペプチドフラグメントをコードし得るオリゴヌク レオチドを含有している、即ち、ペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同 じヌクレオチド配列を含有する可能性があるが、該セントの１個のメンバーのみ がこの遺伝子のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含有することである 。このメンノー−がセット（こ含まれているので、そしてこれかセットの他のメ ン、＜−の存在下でもＤＮＡとハイブリクイズし得るので、ペプチドをコードす る遺伝子のクローニングのための単一のオリゴヌクレオチドを用いる方法と同様 に、分画されていないオリゴヌクレオチドセットを用ｔＸること力（できるので ある。 上記と全く同様の方法でペプチドフラグメントをコードすることかできるオリゴ ヌクレオチド配列または配列セットに相補的な第１ノゴヌクレオチド（またはオ リゴヌクレオチドセット）を用いることができる。 Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子の断片をフードすることができる適当 なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセット（またはそのようなオリ ゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドセットの相補鎖）を同定しく上記の方 法を用い）、合成し、当業者既知の方法で、Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ 遺伝子配列を発現し得る酵母細胞から誘導したＤＮＡ、より好ましくはｃ　ＤＮ Ａ製品とハイブリクイズさせた。核酸ハイブリダイゼーションの方法はマニアテ イスら［Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ｉｎ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ 、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ、　Ｎｙ　（１９８２）コおよびノ＼ムス（Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、　Ｄ 、　）およびヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｓ、　Ｊ、）［Ｉｎ：　Ｎｕｃｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｚａｔｉｏｎ、　ａＰｒａｃｔｉｃａｌ＾ｐｐｒｏａ ｃｈ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１Ｉａｓｈｉ’ｎｇＬｏｎ、　ＤＣ（１９８５） ］に記載されている。用いるＤ　Ｎ　ＡまたはｃＤＮＡの供給源はＮ“−アセチ ルトランスフェラーゼ遺伝子をエンリッチ（豊富化）シておくことか好ましい。 そのような豊富化はＮ”−アセチルトランスフェラーセ発現によって特徴付けら れる条件下で培養した細胞から抽出したＲＮＡから得られるｃＤＮＡから最も容 易に得ることができる。 上記の、またはそれらに類似の方法はヒトアルデヒドデヒドロゲナーゼ［（Ｈｓ ｕ、　Ｌ、　Ｃ，）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ ８２：３７７１−３７７５　（１９８５）］　：フィフ゛口不クチり［スズキら （Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｓ、　）　Ｅｕｒ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｏｒｇａｎ、 　Ｊ、　４：２５１９−２５２４　（１９８５）コ、ヒトエストロゲン受容体遺 伝子［ウオルターら（Ｗａｉｔｅｒ、　Ｐ、　）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃ ａｄ、ｓｃｉ、　ＬＩＳ＾ｇ２ニアｇ８９−７ｇ９３（１９８５）］　；組織型 プラスミ／ゲン活性化因子［ペニカら（Ｐｅｎｎｉｃａ、　Ｄ、　）Ｎａｔｕｒ ｅ　３０１：２＋４−２２１　（１９８３）］　；およびヒトターム胎盤アルカ リホスファターゼ相補ＤＮＡ［カムら（Ｋａｍ、’Ｉｆ、）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。 ＵＳＡ　８２：８７１５−８７１９　（１９８５）］の遺伝子のクローニングに 成功を収めている。 Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のクローニングの好ましい別法ではＮ ”−アセチルトランスフェラーゼを発現し得る細胞からのＤＮＡまたは好ましく はｃＤＮＡを発現ベクタ一にクローニングすることにより発現ヘクターのライブ ラリーを調製する。次（Ｘでライブラリーを抗−Ｎ＃−アセチルトランスフェラ ーゼ抗体と結合することができ、かつＮ′−アセチルトランスフェラーゼまたは Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼのフラグメントと同一のアミノ酸配列を有す るポリペプチドをコードし得るヌクレオチド配列を有するタンパク質を発現し得 ることに関してスクリーニングする。 上記の方法で得られたクローン化Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を発 現ベクターに操作可能に結合し、細菌または真核性細胞に導入しＮ′−アセチル トランスフエラーセタンバク質を生産することかできる。そのような操作の技術 はマニアティスら（前掲）によって開示され、当業者に周知である。 Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ配列は様々な供給源から 得られる。例えば、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼをコードするｍ　ＲＮ　 Ａは酵素を産生ずる任意の種の組織から７−ザンブロ、ト法［アービンら（Ａｌ ｗｉｎｅ）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ１６８：２２０〜２４２　（１９７ ９）］で単離し、オリコヌクレオチドプローブで標識することかできる。次いて ｍＲＮＡを当業者既知の方法てｃＤＮＡに変換する。 ＤＮＡプローブは検出可能な基で標識してもよい。そのような検出可能な基は検 出可能な物理的または化学的性質を有する任意の物質である。そのような物質は イムノアッセイの分野で広範に開発されており、そのような方法に有用な標識の 大多数が、一般に本発明に適用可能である。特に有用なのは酵素［Ｃｌ１ｎ、Ｃ ｈｅ、２２：１２４３　（１９７６）］、酵素基質（英国特許１，５４８，７４ １）　、補酵素（米国特許Ｎｏ、　４．２３４０．７９７および４．２３８．５ ６５）　、酵素阻害物質（米国特許Ｎｏ４．１３４．７９２）等の酵素的に活性 な基；発蛍光物質（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅ、２５：３５３　（１９７９）］　：発色 団：化学発光または生物発光等の発光物質（ＣＩｉｎ、Ｃｈｅ、２５：５１２　 （１９７９）］、特異的に結合可能なリガンド；近位で相互作用する一対、およ び３Ｈ１３５３，３ｔｐ、１１５１．　１４ｃ等の放射性同位元素である。その ような標識または標識対はそれら自身の物性（例えば蛍光物質、発色団および放 射性同位元素）またはそれらの反応性または結合性（例えば、酵素、基質、補酵 素および阻害物質）に基ついて検出される。例えば補酵素で標識したプローブは その標識が補酵素である酵素とその酵素の基質とを加えることで検出できる。例 えば、基質に作用して検出可能な物性を有する生成物を生成する酵素を用いるこ とができる。後者の例には、ベータガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ 、ベルオ牛シダーセが含まれるがこれに限定されない。 Ｅ、Ｎ′−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列の発現本発明のＮ’−アセチ ルトランスフェラーゼ酵素をコードするＤＮＡまたはｃＤＮＡを発現ベクターに 操作可能に連結し、宿主細胞に導入し、その細胞にＮ’−アセチルトランスフェ ラーゼ活性を発現させることができる。２個のＤＮＡ配列（プロモーター領域配 列と所望の酵素をコードする配列）間の結合の性質か、１）フレームシフト突然 変異を起こす、２）所望の酵素をフードする遺伝子配列の転写を指令するプロモ ーター領域配列の作用を阻害する、または３）プロモーター領域配列による所望 の酵素をコードする遺伝子配列が転写される能力を阻害する、ことがなければ、 ２個のＤＮＡ配列は操作可能に結合していると言われる。 Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼをフードするＤＮＡ配列を、結合（ｌｉｇａ ｔｉｏｎ）のための平滑端または付着端、制限酵素による適当な末端の作成、適 当な付着端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処 理、および適当なりガントとの結合、を含む常法に従いベクターＤＮＡと再結合 させることができる。 本発明は所望の酵素の、任意の原核性細胞での発現を包含する。 １つの態様では宿主細胞の染色体に所望の遺伝子配列を導入し得るベクターを用 いる。導入されたＤＮＡが染色体に安定に組み込まれた細胞は発現ベクターを含 有する宿主細胞の選択を可能にするｌまたはそれ以上のマーカーをも導入するこ とで選択することができる。マーカーは宿主細胞内の栄養要求性を補うもの（通 常の酵母の栄養要求性マーカーである１ｅｕ２．　ｕｒａ３等）、殺生物剤抵抗 性、例えば抗生物質または銅等の重金属、などであってよい。選択マーカー遺伝 子は発現されるへきＤＮＡ遺伝子配列に直接結合させるか、同じ細胞に同時形質 転換によって導入してもよい。 好ましい態様では導入される配列は受容宿主内で自律的に複製可能なプラスミド またはウィルス性ベクターに挿入される。広範な種々のベクターをこの目的のた めに用いることができる。特定のプラスミドまたはウィルスベクターを選択する に際して重要な因子は以下の点である。ベクターを含有する受容細胞を容易に認 識し、ベクターを含有しない受容細胞から選択することかできる：特定の宿主内 でのベクターの望ましいコピー数、および宿主細胞と異なる種とノ間−Ｃ’　ｒ 　／ヤトル」可能であることか望ましいか否か。 本発明のＮ’−アセチルトランスフェラーセは従来の条件下、例えば、抽出、沈 澱、クロマトグラフィー　アフィニティータロマトグラフイー、電気体動等によ って単離、精製するここかできる。 Ｉ　原核生物細胞における発現 好ましい原核生物宿主は、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）、バ／ルス（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）、ストレプトマイセス（ＳｔｒｅｐＬｏｍｙｃｅｓ）、／ニートモナス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモ不う（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア（Ｓ ｅｒｒａｔ　ｉａ）なとの細菌である。 最も好ましい原核生物宿主はＥ　、　ｃｏｌ　ｉである。特に関心のある細菌宿 主は、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２株２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）、Ｅ　、　ｃ ａｌ　１Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０（Ｆ　 −＋　λ−１原栄養菌（ＡＴＣＣ２７３２５））、及びサルモ不う・チフィムリ ウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又はセラチア・マルセ スセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）なとの他の腸内細菌類、 及び種々の７ユ一トモナス種である。原核生物宿主は発現プラスミドのレプリコ ン及び制御配列に適合しなければならない。 原核生物細胞（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ、Ｂ、ズブチリス、シュードモナス、スト レプトマイセスなと）において所望の酵素を発現させるためには、その所望の酵 素をコードしている配列を機能的な原核生物プロモーターと作動可能に連結する 必要がある。このようなプロモーターは構成又は調節（即ち、誘導性もしくは抑 制性）のいずれでもよいが、後者が好ましい。構成プロモーターとしては、例え ばバクテリオファージλのｉｎｔプロモーター、及びｐＢＲ３２２のβ−ラクタ マーセ遺伝子のｂｌａプロモーターなどがある。誘導原核生物プロモーターとし ては、例えばバクテリオファージλの主要布及び左プロモーター（Ｐ、及びＰＲ ）、Ｅ、ｃｏｌｉのｔｒｐ、　ｒｅｃＡ、１ａｃＺ、１ａｃｌ、ｇａｌ及びｔａ ｃプロモーター、Ｂ、ズブチリスのα−アミラーセ［Ｕｌｍａｎｅｎ、Ｉ　らの Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６２：１７６−１８２（１９８５）］及び］δ −２８−特異的プロモーターＧ　ｉ　１ｍａｎ、　Ｍ、　Ｚ　らのＧｅｎｅ　３ ２：１ｌ−２０（１９８４）］、バシルスのバクテリオファー／のプロモーター ［Ｇｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、　ＪのＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ。 １ｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プレス、Ｉｎｃニュ ーヨーク（１９８２）］、ならひにストレプトマイセスプロモーター［Ｗａｒｄ 、　Ｊ、　Ｍ、らのＭｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　２０３：４６８−４７８（ １９８６）］か挙げられる。原核生物プロモーターについては、Ｇ１１ｃｋ、　 Ｂ、　ＲのＪ、　Ｉｎｄ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１：２７７−２８２（１９ ８７）、Ｃｅｎａｔ　ｉｅｍｐｏ、　Ｙ、のＢｉｏｃｈｉｍｉｅ　６８：５０５ −５１６（１９８６）、及びＧｏＬｔｅｓｍａｎ、　ＳのＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　 Ｇｅｎｅｔ、　１８：４１５−４４２（１９８４）に概説されている。 原核生物細胞における適切な発現には、遺伝子コード化配列の上流にリポソーム 結合部位か存在することも必要である。このようなリポソーム結合部位は例えば 、Ｇｏｌｄ、ＬらのＡｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　３５＋３６５ −４０４（１９８１）に記載されている。 所望の酵素をコードしている配列及び作動可能に連結したプロモーターは、線状 分子又はより好ましくは閉鎖共有環状分子のいずれかであることのできる非複製 型ＤＮＡ（又はＲＮＡ）分子として、受容原核生物又は真核生物細胞に導入する ことかできる。このような分子は自律的に複製することかできないので、所望の 酵素の発現は導入配列の一時的な発現によって起こり得る。あるいは、宿主の染 色体に導入配列を組み込めば、永久発現を起こすことができる。 好ましい原核生物ベクターには、Ｅ　、ｃｏｌ　ｉ内で複製することのできるプ ラスミド、例えばｐＢＲ３２２、Ｃｏ１Ｅ１、ｐｓｃｌｏｌ、ｐＡｃＹｃ１８４ 、π■Ｘなどがある。このようなプラスミドは例えば、マニアチス［Ｍａｎｉａ ｔｉｓ、　Ｔ、らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・プレス、コールド ・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（１９８２）］に記載されている。 バンルスのプラスミドにはｐｃ、１９４、ｐｃ２２１、ｐＴｌ　２７などがある 。このようなプラスミドは、ｃｒｙｃｚａｎ、　Ｔ、のＴｈｅ　Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒＢｉｏｌｏｇｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｉ、アカデミツク・プレス、 ニューヨーク（１９８２）、　３０７−３２９頁が開示されている。適当なスト レプトマイセスのプラスミドにはｐ　Ｉ　Ｊ　１０１　［Ｋｅｎｄａｊｌ、に、 　Ｊ、らのＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６９：４１７７−４１８３（１９８ ７）］、及ヒφＣ３１などのストレプトマイセスバクテリオファージ［Ｃｈａｔ ｅｒ、　Ｋ、　Ｆ、らの５ｉｘｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏ ｓｉｕｍ　ｏｎ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミ アイ・カイト、ブタベスト、）＼ンガリー（１９８６）、　４５−５４頁］があ る。ンユードモナスブラスミドは、Ｊｏｈｎ、　Ｊ、　ＦらのＲｅｖ、　Ｉｎｆ ｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　８：６９３−７０４（１９８６）、反引ｚａｋｉ、に、の Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　３３ニア２９−７４２（１９７８）に 概説されている。 構築物を含有するベクター又はＤＮＡ配列を発現のために調製したなら、得られ たＤＮＡ構築物を適当な宿主に導入すればよい。これには、プロトプラスト融合 、リン酸カル／ウム沈殿、電気穿孔法（エレクトロボレー／コノ）又は池の通常 の方法などの種々の手法を使用することかできる。融合したなら、得られた細胞 を培地中で発育させ、適当な活性についてスクリーニングする。配列の発現によ り、基質特異的なアミ／ペブチターセか産生される。 ２　真核生物細胞における発現 好ましい真核生物宿主はインビボ又は組織培養物のいずれかの酵母、真菌（特に アスペルキルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、哺乳動物細胞（例えば、ヒト又 は霊長類細胞）及び植物細胞などである。 所望の酵素を真核生物宿主において発現させるには、真核生物の調節領域を使用 することが必要である。このような領域は一般に、ＲＮＡ合成を開始させるに十 分なプロモーター領域などである。好ましい真核生物プロモーターには、マウス メタロチオネインＩ遺伝３６５（１９８２）］、５Ｖ４Ｑ初期プロモーター［Ｂ ｅｎｏｉｓｔ、　ＣらのＮａｔｕｒｅ　（Ｌ周知のように真核生物ｍＲＮＡの翻 訳は、最初のメチオニンをフードしているコドンから開始される。そのため、真 核生物プロモーターと所望の酵素（又は機能的なその誘導体）をコードするＤＮ Ａ配列との連結部がメチオニンをコードてきる介在コドン（即ち、ＡＵＧ）を含 有しないようにするのが好ましい。このようなコドンが存在すると（そのＡＵＧ フドコド所望の酵素コード化ＤＮＡ配列と同じ解読フレーム内にある場合）融合 タンパク質が生成されるか、又は（そのＡＵＧコドンか所望の酵素コード化ＤＮ Ａ配列と同し解読フレーム内にない場合）フレームーンフト突然変異が招来され る。 ａ、酵母における発現 酵母は本発明の好ましい宿主である。酵母を使用することは、酵母がグリコリル 化などの翻訳後ペプチド修飾をも行うことができることから実質的に有利である 。所望のタンパク質を酵母で生産するために利用できる高いコピー数のプラスミ ド及び強いプロモーター配列を利用する多くの組換えＤＮＡ計画が存在する。酵 母はクローン化された哺乳動物遺伝子産物に存在するリーダー配列を認識し、リ ーダー配列を担うペプチド（即ち、プレーペプチド）を分泌する。 一連のあらゆる酵母遺伝子発現系を利用できる。このような発現ベクターには例 えば、酵母２−ミクロンサークル、発現プラスミドＹＥＰ１３、ＹＣＰ及びＹＲ Ｐなど、又はそれらの誘導体がある。 このようなプラスミドは当業界周知である［Ｂｏｔｓｔｅｉｎ、　Ｄ、らのＭｉ ａｍｉＷｎｔｒ、　Ｓｙｍｐ、　１９：２６５−２７４（１９８２）、Ｂｒｏａ ｃｈ、　Ｊ、　Ｒ，のＴｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌ。 ｇｙ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　 Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ、Ｃ。 ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂａｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コールド春 スプリングＱハーバ−。 ニューヨーク、　４４５−４７０頁（１９８１）、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、　Ｒ， のＣｅ１ｌ　２８：２０３−２０４（１９ｇ２）　］。ＹＥＰ１３は本発明の好 ましいベクターである。 ｂ　哺乳動物細胞での発現 哺乳動物細胞は、正しい折りたたみ又は正しい部位てのグリコ／ル化なとの翻訳 後修飾をタンパク質分子に施すことかできる。宿主として有用であり得る哺乳動 物細胞には、ＶＥＲＯ又はＣＨＯ−に１などの線維芽細胞（フィブロブラスト） 起源の細胞、及びそれらの誘導体がある。哺乳動物宿主に関連して、所望の酵素 を発現させるために幾つかのあり得るベクター系を利用することができる。宿主 の性質に応じて、広範な種々の転写及び翻訳調節配列を使用できる。 転写及び翻訳調節シグナルは、調節／グナルが高い発現レベルを有する個々の遺 伝子と関連しているアテノウイルス、ウンパビローマウィルス、サルウィルスな どのウィルス起源から誘導することができる。あるいは、アクチン、コラーゲン 、ミオノンなどの哺乳動物発現産物由来のプロモーターも使用できる。抑制又は 活性化することができ、その結果遺伝子の発現を調整可能にする転写開始調節シ グナルを選択てきる。興味深い調節シグナルは、温度の変動によって発現を抑制 又は活性化できる温度感受性の調節ノブナル、又は例えば代謝産物なとの化学的 調節を受ける調節／グナルである。 哺乳動物宿主に関する発現のためには幾つかのベクター系を利用できる。１つの クラスのベクターは、つ／パピローマウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウ ィルス、又は５Ｖ４Ｑウイルスなとの動物ウィルスから誘導される、自律的に慢 製する染色体外プラスミドを提供するＤＮＡ要素を利用するものである。第２の クラスのベクターは、所望の遺伝子配列の宿主染色体への組込みに依存するもの である。導入されたＤＮＡか細胞の染色体に安定に組み込まれた細胞は、発現ベ クターを含有する宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーも導 入することによって選択することかてキル。この７−カーは栄養要求変異宿主に プロトトロピーを、例えば抗生物質又は銅なとの重金属の生物致死側耐性を提供 できるものである。選択マーカー遺伝子は発現させるＤＮＡ配列に直接に連結す ることができ、あるいは同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる 。ｍＲＮＡ合成を最適にするには、さらなる要素が必要となる場合かある。これ らの要素には、スプライス・シグナル、及び転写プロモーター、エンハンサ−１ 及び終止シグナルがある。 このような要素を包含するｃＤＮＡ発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ、　ＨのＨ ｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ、３：２８０（１９８３）なとに記載されている。 Ｃ植物細胞での発現 本発明のＮ”−アセチルトランスフェラーゼは遺伝子操作法によって植物に導入 することができ、それによりアセチル化の速度が増大される。ある種の除草剤は アセチル化によって不活化されることが知られている。従って、除草剤耐性かよ り強い植物を生産することか可能である。本発明の他の態様は、Ｎ”−アセチル トランスフェラーゼ遺伝子を使用して植物を形質転換し、植物の除草剤耐性を増 大させることである。 本発明に使用できるＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードしている コート化領域は植物細胞又は形質転換される植物にとって同種（ホモローガス） であっても異種（ヘテロローガス）であってもよい。しかし、Ｎ”−アセチルト ランスフェラーゼをコートする遺伝子配列は得られた植物細胞内で発現され、機 能的なタンパク質又はボソペプチトとして産生される必要かある。このように、 本発明は酵素を発現するホモローがスなＮ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝 子又はヘテロローカスなＮ“−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のいずれかを 含有する植物をも包含している。 本発明の池の態様では、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼは形質転換する植物 とホモローカスな植物Ｎ’−アセチルトランスフ二ラーうを包含している。本発 明の別の態様では、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼは形質転換する植物にヘ テロローガスな酵素を包含している。さらに、本発明ではＮ′〜アセチルトラン スフェラーゼ遺伝子をフードしているゲノムＤＮＡ及びｃＤＮＡの両者由来のＤ ＮＡを使用できる。また、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子はその一部 をｃＤＮＡクローンから、一部をケノムクローンから構築することかできる。ま た、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子をコードするＤＮＡは種々の種由 来の一部分を含有することができる。 本発明の広い思想に包含される態様は種々存在する。その１つの態様として、本 発明はキメラ遺伝子配列を提供する・（ａ）　特定の植物細胞内て遺伝子が発現 されるとＮ’−アセチルトランスフェラーゼについて機能的であるＮ’−アセチ ルトランスフェラーゼをコードする第１の遺伝子配列、（ｂ）　Ｎ’−アセチル トランスフェラーゼコード化領域のいずれかの側に作動可能に連結された１つ又 はそれ以上の付加的な遺伝子配列。この付加的な遺伝子配列にはプロモーター（ 群）又はターミネータ−（群）の配列が含有される。植物調節配列は宿主細胞に とってヘテロローガスであってもホモローガスであってもよい。 好ましい態様では、Ｎ′−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターを 使用し、キメラ遺伝子配列を発現させる。この遺伝子配列に使用できる他のプロ モーターはｎｏｓ、ｏｃｓ、及びＣａＭＶプロモーターなどである。使用できる 効率的な植物プロモーターは過剰産生性の植物プロモーターである。このプロモ ーターをＮ＃−アセチルトランスフェラーゼの遺伝子配列と作動可能に連結すれ ば、該Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼの発現がプロモートされ、それにより 形質転換植物が除草剤に対して増大された耐性を有することになろう。本発明に 使用できる過剰産生性の植物プロモーターは大豆由来のりブロース−１，５−二 リン酸カルボキシラーゼの小さなサブユニット（ｓｓ）　［Ｂｅｒｒｙ−Ｌｏｖ ｅらのＪ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ａｐｐ、Ｇｎｅ、、ト４８３−４９８ （１９８２）］、及びクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーターである 。 これら２つのプロモーターは、真核性の植物細胞において光り誘導されることが 知られている［例えば、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｌ ａｎｔｓ、　ａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、　Ａ 、Ｃａｓｈｍｏｒｅ、Ｐｌｅ＋＋ａｍ、ニューヨーク、　１９８３．２９−３８ 頁、Ｃｏｒｒｕｚｉ、　Ｇ、らのＪ、　ｏｆ　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２ ５８：１３９９（１９８３）、及びＤｕｎｓｍｕｉｒ、　ＰらのＪ、　ｏｆ　Ｍ ｏ１．　ａｎｄ　Ａｐｐｌ　ｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、　、　２：２８５（１９８３ ）を参照のこと］。 さらに、他の好ましい態様では、Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含 有するキメラ遺伝子配列の発現を正しい解読フレーム内で植物プロモーターと、 そして遺伝子分泌シグナル配列と作動可能に連結する。 植物プロモーターと作動可能に連結されたＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺 伝子を含有するキメラ遺伝子配列、及び好ましい態様として分泌シグナル配列を も含有するものを、適当なりローニングベクターに連結すればよい。一般には、 宿主細胞と適合する複製及び制御配列を含有するプラスミド又はウィルス（バク テリオファージ）ベクターを使用する。クローニングベクターは通常、復製起点 を含有すると共に、形質転換宿主細胞に表現型選択マーカーを、通常は抗生物質 に対する耐性を付与することのできる特定の遺伝子をも有している。形質転換ベ クターは、宿主細胞に形質転換した後にこれら表現型マーカーによって選択する ことかできる。 本発明に使用できる宿主細胞はＥ　、　ｃｏｌ　ｉ、Ｓ、チフイムリウム、及び セラチア・マルセスセンスなどの細菌宿主などの原核生物である。酵母又は糸状 菌なとの真核生物宿主も本発明に使用することができる。 クローニングベクター及びそのベクターによって形質転換された宿主細胞を本発 明に使用すると、通常ベクターのコピー数か増大する。増大したコピー数にある Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有するベクターは単離することが でき、例えばそれはキメラ遺伝子配列を植物細胞に導入するために使用できる。 ベクター中に含有される遺伝子物質は組換えＤＮＡを機械的に移すことのできる マイクロピペットを使用し、植物細胞に直接マイクロ注入できる。 遺伝子物質はさらに、細胞に取り込まれた遺伝子物質と沈殿複合体を形成するポ リエチレングリコールを使用することにより植物細胞に移すこともてきる［Ｐａ ｓｚｋｏｗｓｋｉらのＥＭＢＯＪ、　３：２７１７−２２（１９８４）コ。 本発明の他の態様ては、Ｎ　”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子は、エレク トロポレーションによって植物細胞に導入することができるＵＦｒＯＩＩＩＩＩ ｌらのＥｘｐｒｅｓｓＩｏｎ　ｏｒ　Ｇｅｎｅｓ　Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　１ ｎＬｏｊｏｎｏｃｏＬａｎｄ　ＤｉｃｏＬ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌｓ　ｂｙ　Ｅ ｌｅｃｔｒｏｐｏｒａＬｉｏｎ″、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｅａｄ、　 Ｓメ@ｉ、　。 Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　８２・５８２４（１９８５）］。この手法では、植物プロト プラストを、Ｎｏ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子構築物を含有するプラス ミドの存在下にエレクトロボレートする。高電場強度の電気インパルスは生体膜 を可逆的に貫通し、プラスミドの導入を行わしめる。エレクトロボレートされた 植物プロトプラストは細胞壁を再構成し、分裂し、植物カルスを生成する。Ｎ” −アセチルトランスフェラーゼを発現する形質転換植物細胞は、上述の表現型マ ーカーを使用して選択される。 Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を植物細胞に導入する他の方法は、Ｎ ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子で形質転換したアグロバクテリウム・ツ メファシェンスで植物細胞を感染させることである。当業者に既知の適当な条件 下では、トランスフオームした植物細胞は発育して苗条、根を形成し、さらに発 育して植物となる。Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列は、例えばア グロバクテリウム・ツメファシェンスのＴｉプラスミドによって適当な植物細胞 に導入することができる。このＴｉプラスミドはアグロバクテリウム・ツメファ ／エンスにより感染の際に植物細胞に移行し、植物のゲノムに安定に組み込まれ る［Ｈｏｒｓｃｈらの”Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ　ｏｆ　ＦＴ１プラスミドはト ランスフオーム細胞を産生ずるための２つの必須領域を含有する。トランスファ ーＤＮＡ（Ｔ　ＤＮＡ）と命名されているその１つは、腫瘍形成を誘発するもの である。ビルレント領域と命名される他方のものは、腫瘍の生成に必須であるか 、その維持には必要でないものである。植物のゲノムに移行するトランスファー ＤＮＡ領域は酵素の遺伝子配列を挿入するごとによりその大きさを増大させるこ とかできるか、それにより移行能に影響を与えることはない。腫瘍誘因遺伝子を 除去し、もはや妨害しなくすることによって、得られた修飾Ｔｉプラスミドは、 本発明の遺伝子構築物を適当な植物細胞に移行させるためのヘクターとして使用 することかできる。 アグロバクテリウムによって形質転換できるすべての植物細胞、及び形質転換細 胞から再生された全植物を本発明によってトランスフオームすることによっても 、移行したＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含有しているトランスフ オームされた全植物を得ることができる。 現在、アグロバクテリウムによって植物細胞を形質転換するための異なる２つの 方法かある （１）　培養した単離プロトプラストと共にアグロバクテリウムを同時培養する 、又は （２）細胞もしくは組織をアグロバクテリウムで形質転換する。 方法（１）では、プロトプラストを培養でき、そして培養プロトプラストから植 物を再生することのできる確立された培養系が必要である。 方法（２）では、（ａ）　植物細胞又は組織をアグロバクテリウムによって形質 転換できること、及び（ｂ）　形質転換細胞又は組織を誘発して全植物に再生で きることか必要である。この２段階の系では、感染するために２つのプラスミド か必要である　Ｔ−ＤＮＡ含有プラスミド及びｖｉｒプラスミド。 植物細胞又は植物を形質転換した後、Ｔｉプラスミドによってトランスフオーム されて酵素を発現している得られた細胞又は植物は、適当な表現型マーカーによ り選択することかできる。これらの表現型マーカーには抗生物質耐性があるが、 これに限定されない。池の表現型マーカーは当業者に既知であり、本発明に使用 することかできる。 プロトプラストを単離し、培養して全再生植物とすることのできるすへての植物 を本発明によって形質転換すれば、移入されたＮ″−アセチルトランスフェラー ゼ遺伝子を含有する全植物を回収することかできる。適当な植物は例えば、Ｆ　 ｒａｇａｒｉａ（オランダイチコ）、Ｌｏｔｕｓ、　Ｍｅｄｉｃａｇｏ（ウマコ ヤ７）、ＯｎｏｂｒｙｃｈｉｓＳＴ　ｒｉｆｏｌ　ｉｕｍ（シロツメフサ・ンヤ ／クソウ）、ＴｒｉｇｏｎｅｌｌａＳＶｉｇｎａ、　Ｃ１ｔｒｕｓ（レモン・ミ カン）、Ｌ　ｉｎｕｍ（アマ）、Ｇｅｒａｎｉｕｍ（ケンノショウコ・）＼クサ ンフウロ）、Ｍａｎｉｃｏｔ、　Ｄａｕｃｕｓにンジン）、Ａ　ｒａｂｉｄｏｐ ｓｉｓ、　Ｂ　ｒａｓｓｉｃａ（アブラナ・ハクサイ・カブラ・キャベツ）、Ｒ ａｐｈａｎｕｓ（タイコン）、５ｉｎａｐｉｓ（カラ／）、ＡｔｒｏｐａＳＣａ ｐｓｉｃｕｍ（）ウガラ／）、Ｄ　ａｔｕｒａ（チョウセンアサガオ）、Ｈｙｏ ｓｃｙａｍｕｓＳＬ　ｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ（ｈマド）、Ｎ１ｃｏｔｊａｎａ（ タバコ）、Ｓ　ｏｌａｎｕｍ（ナス・ンヤガイモ）、Ｐ　ｅｔｕｎｉａ（ツクバ ネアサガオ）、Ｄ　１ｇ１ｔａｌ　ｉｓ（シギタリス）、Ｍａｊｏｒａｎａ、　 Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ（チコリ−）、Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ（ヒマワリ）、Ｌａｃ ｔｕｃａＳＢｒｏｍｕｓ、Ａｓｐａｒａｇｕｓ。 Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ、　Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ、　Ｎｅｍｅｓｉａ、Ｐ ｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ、Ｐａｎｉｃｕｍ、ＰｅｎｎｉｓｅｔｕｍＳＲａｎｕｎｃ ｕｌｕｓＳＳｅｎｅｃｉｏ、　Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ、　ＣｕｃｕｍｉｓＸ Ｂｒｏｗａｌｌｉａ、　Ｇｌｙｃｉｎｅ、　Ｌｏｌｉｕｍ、　Ｚｅａ、　Ｔｒｉ ｔｉｃｕｍ、　Ｓｏｒｇｈｕｍ。 及びＤａｔｕｒａ属由来の種などである。 例えば、すべての主要な禾穀類、サトウキビ、テンサイ、綿花、果実及び他の木 、豆果及び野菜など（これらに限定されない）の培養された細胞又は組織から実 際上すべての植物が再生され得ることを示す証拠が多くなっている。これらすべ ての植物がアグロバクテリウムによって形質転換できるか否かについて、限定的 な意見が現在存在する。アグロバクテリウムのための天然の植物宿主である種は インビトロにおいて形質転換できる。単子葉植物、特に穀類及び草はアグロバク テリウムの天然の宿主でない。アグロバクテリウムを使用してこれらを形質転換 しようとする試みは最近まで成功していなかった［Ｈｏｏｙｋａｓ−Ｖａｎ　Ｓ ｌｏｇｔｅｒｅｎらの１ｌａｂ＋ｒｅ　３１１ニア６３−７６４（１９８４月。 現在は、特定の単子葉植物はアグロバクテリウムによって形質転換することがで きるという証拠が集まって来ている。ここに利用できる新規な実験手法により、 穀物及び草などの種か形質転換できる。 アグロバクテリウムによって形質転換できるさらなる植物属は、Ｉｐｏｍｏｅａ 、　Ｐａ５ｓｉＮｏｒａ、　ＣｙｃｌａｍｅｎＳＭａｌｕｓＳＰｒｕｎｕｓＳＲ ｏｓａＳＲｕｂｕｓ、　ＰｏｐｕｌｕｓＳＳａｎｔａｌｕｍ、　ＡＡｌｌｌｕ、 　Ｌｉｌｉｕｍ、　Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ、　Ａｎａｎａｓ、　Ａ　ｒａｃｈｉｓ 、　Ｐ　ｈａｓｅｏｌｕｓ、及びＰ　１ｓｕｎ＋である。 培養プロトプラストからの植物再生は、Ｅｖａｎｓらの”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ 　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”　ｉｎ　１ｌａｎｄｂｏｏｋ 　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　１：１２４−１７６（マクミ ラン出版社、ニューヨーク、１９８３）、Ｍ、　Ｒ，Ｄａｖｅｙ、　”Ｒｅｃｅ ｎｔ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒ ｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒ。 ｔｏｐｌａｓｔｓ”、　Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ、　１９８３−Ｌｅｃｔｕｒｅ 　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、　１９−２９頁（パークハウサー、バーセル、１９ ８３）、Ｐ、　Ｊ、　Ｄａｌｅの”Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌｓ　ａｎ ｄ　０ｔｈｅｒ　Ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔ　Ｃｒｏｐｓ″ｉｎ　Ｐｒｏｔｏｐ ｌａｓｔｓ　１９８３−Ｌｅｃｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、３１−４１ 頁（バークハウザー、バーセル、１９１３３）、及びＨ，ＢＩｎｄｉｎｇ、　” Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ″ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔ ｏｐｌａｓｔｓ、２１−３７頁（ＣＲＣブレス、ホカ・ラドン、１９８５）に記 載されている。 再生法は植物の種から種に応じて種々変動するが、一般にはまず始めにＮａ−ア セチルトランスフェラーゼ遺伝子の多重コピーを含有する形質転換プロトプラス トの懸濁液を調製する。次いで、そのプロトプラストＦＡ濁液から、天然の胚の ように熟成し、発芽する段階にまで胚形成を誘発すればよい。この培養培地には 一般に種々のアミノ酸、及びオー牛ンン及びサイトカイニン類などのホルモンを 含有させる。特にトウモロコシ及びアルファルファのような種にとっては、グル タミン酸及びプロリンをこの培地に加えると有益である。 苗条及び根は通常同時に発育する。再生の効率性は、培地、遺伝子型、及び培養 の経緯に左右される。これら３つの変数を制御すれば、再生は完全な再現性をも って、繰り返すことができる。 形質転換植物細胞から発育した成熟植物は自家受粉して同系交配植物を産する。 この同系交配植物は、増大したＮ“−アセチルトランスフェラーゼをコードして いる遺伝子を含有する種子を産する。これらの種子を発育させれば、アセチル化 の速度か増大した植物を得ることができる。 本発明の同系交配を使用すれば、除草剤耐性の雑種（）−イブリット）を発現さ せることかできる。この方法では、除草剤耐性の同系交配ラインを池の同系交配 ラインと交雑させれば、ノーイブリッドか得られる。 再生植物から得られた、花部、種子、葉部、茎部、果実部なとの部分は、これら の部分か除草剤耐性細胞を含有する限り、本発明の範囲内である。その再生植物 の子孫及び変異体ならびに突然変異体も本発明の範囲内に包含される。 二倍体植物では通常、片方の親をＮ“−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子配列 で形質転換すればよく、他方の親は野生型である。これらの親を交雑させた後の 第１世代のノーイブリッド（Ｆｌ）は、１／２　Ｎａ−アセチルトランスフェラ ーゼ／野生型、　］／２　Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼ／野生型の分配を 示す。この第１世代のハイブリッド（Ｆｌ）を自家受粉させると第２世代のハイ ブリット（Ｆ２）か得られる。このＦ２ハイブリットの遺伝子分配は１／４　Ｎ ”−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼ、１／２ 　Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ／野生型：ｌ／４野生型／野生型である。 Ｎ′−アセチルトランスフェラーゼ／Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの遺伝 子構成物を有するＦ２ノ＼イブリッドを除草剤耐性植物として選択する。 本明細書に使用している変異体は、植物の子孫に有性的に伝達する遺伝性の変動 なとの、安定であり、遺伝性である表現型の変化を表す。但し、その変異体はア セチル化の速度増大により依然として除草剤耐性植物である。また、本明細書に 記載している突然変異体は、放射線などの環境条件の成果として、又は十分に確 立された遺伝の法則に従って特性が減数分裂的に伝達する遺伝子変化の成果とし て変化を表す。しかし、突然変異植物は本発明のアセチル化の速度増大により依 然として除草剤耐性を示さなければならない。 Ｉｌ、本発明の株及びそのＮ＃−アセチルトランスフェラーゼの使用上記のよう に、本発明は改変されたＮ”−アセチルトランスフェラーゼ酵素を生産するため の手段、及びこの酵素をコードする遺伝子配列を種々の宿主に導入するための手 段を提供するものである。 Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼ活性を欠いている（即ち、Ｎ”−アセチルト ランスフェラーゼ活性を実質的に欠いている改変Ｎ”−アセチルトランスフェラ ーゼを示す）細胞は、タンパク質のアミノ酸配列を決定するうえで非常に望まし い。既述のように、Ｎ“−アセチル基がタンパク質のアミノ酸に存在すると、こ のような分子のアミノ酸配列の決定が妨害される。Ｎ”−アセチルトランスフェ ラーゼ活性を欠く細胞はタンパク質のアミノ末端へのアセチル基の移行を触媒し ないので、このような細胞から産生されるタンパク質は容易に配列決定できるで あろう。従って、例えばそのＮ’−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子のゼロ突 然変異（ｎｕｌｌ　ｍｕｔａｔｉｏｎ）を有する細胞を使用すれば、Ｎ’−アセ チル化を欠いた内生の酵母タンパク質が得られるであろう。例えば、このような 細胞を使用すれば、タンパク質（又はペプチド）のα−アミン基にアセチル基を 欠いている組換えタンパク質又はペプチドを発現させることができる。このよう なタンパク質は既知の方法により容易に配列決定することができよう。 同様に、このようなゼロ突然変異細胞はヘテロローガスなタンパク質（即ち、こ のような細胞からは天然又は通常は産生されないタンパク質）の生産のための宿 主として使用でき、それによりこのようなタンパク質のアミノ酸配列の解明を行 うことができる。 Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼが正常のＮ”−アセチルトランスフェラーゼ よりも活性であるか、又はそれよりも高いレベルで産生される突然変異細胞を生 産できることは、Ｎ”−アセチル化が増大しているタンパク質を生産したい場合 には望ましい。既述のように、このようなタンパク質は非−アセチル化タンパク 質よりも安定である点で望ましいものである。 所望の活性（例えば、増大又は減少した基質特異性、温度安定性なと）に適合さ せるためにＮ’−アセチルトランスフェラーゼ活性を改変できることは、Ｎ’− アセチル化の特性が改変しているタンパク質を産生じ得る宿主細胞を、発育させ ることができる点て有用である。 改変したＮ’−アセチルトランスフェラーゼ酵素は、突然変異宿主細胞について 既述した方法と同じ方法により精製でき、又はインビトロで使用することができ る。 ここまで本発明を一般的に説明してきたが、本明細書に記載の特定の実施例を参 照すれば、同等のものが容易に理解されようが、これらの実施例は単に本発明の 例示を目的とするものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。 実施例１ 酵母の培地をＳｈｅｒｍａｎらの報告（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、ら、Ｍｅｔｈｏ ｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ。 ｒ、ニュー　ヨーク、１９８６年）に記載されているようにして作製した。 すなわちＹＰＤ培地には１％のバクト酵母エキス（Ｂａｃｔｏ−ｙｅａＳｔ　ｅ ｘｔｒａｃｔ）　、２％のバタトペブトンおよび２％のグルコースを含有させ、 ＹＰＧ培地には１％のバクト酵母エキス、２％のバクトペプトンおよび３％のグ リセリンを含有させ、ＳＤ培地には０．７％のアミノ酸なしのディフコ（Ｄｉｒ ｃｏ）酵母窒素ヘースおよび２％のグルコースを含有させた。また栄養要求株に 対して、必須の栄養素を指定のｔａ度で供給した（Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、ら、 Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８６年）。 本発明の正常の、および改変されたＮ・−アセチルトランスフェラーゼ類の好ま しい精製方法は、Ｌｅｅ、　Ｆ、　−Ｊ、　Ｓら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 ２６３巻、１４９４８〜１４９５５頁、１９８８年の方法であり、この文献は本 願に援用するものとする。要約すると、酵母細胞を溶菌酵素で処理し、得られた スフェロプラストを低張緩衝液にホモジナイズする方法である。酵母Ｎ”−アセ チルトランスフェラーゼは、ゆるやかに振盪することによって細胞溶解物から放 出される。得られたＮ”−アセチルトランスフェラーゼは、Ｐト３０膜で限外濾 過し、次いて例えば０２Ｍ　ＫＣＩを含有するＨＤＧ緩衝液（２０ｍＭ　ＨＥＰ ＥＳ−に’、ｐｌ＋７．４．０．５ｍＭ　ＤＴＴ、　１０％（Ｖ／　Ｖ）のグリ セリンおよび００２％ＮａＮ＊）を用いて一夜透析することによって濃縮できる 。酵母Ｎ′−アセチルトランスフエラーセ製剤の半減期は、１０％のグリセリン を添加することによって安定化させることができる。 得られたＮ’−アセチルトランスフェラーゼ調製物は、任意に、上澄み液中の残 留細胞生体物質を除去することによってさらに精製してもよい。この処理にはイ オン交換法を用いることかできる。一定の塩の溶離液（０，２Ｍ　ＫＣＩ）を用 いるＤＥＡＥ−セファロースのクロマトグラフィか好ましい方法である。 所望により、Ｎ”−アセチルトランスフェラーゼはさらにイオン交換クロマトグ ラフィで得たピーク画分をプールし、適切な緩衝液（例えば０．０５Ｍ　ＫＣＩ を含有するＨＤＧ緩衝液）に対して透析し、イオン交換樹脂（例えばＤＥＡＴ− セファロース）のカラムに注入し、連続塩勾配液（例えば００５〜０．５Ｍ　Ｋ ＣＩ）で溶離することによって精製してもよい。このカラムで得たアセチルトラ ンスフェラーゼのプールを濃縮し、透析して、アセチルトランスフェラーゼの活 性を分析する。 イオン交換カラムで得たピーク画分はさらに、ヒドロキシルアパタイトを用いる 吸着カラムを使って精製してもよい。従来技術で知られているように、ヒドロキ シルアバタイトカラムは、水酸化リン酸カル／ウム充填物中のカル／ラムイオン にタンパク質を選択的に吸着する。ヒドロキシルアバタイトのカラムは塩の直線 勾配液で溶離することか好ましく、活性画分を同定してプールすることがてき所 望により、上記ヒトロキフルアバタイト力ラムから得たピーク画分は、プールし 、濃縮し、適切な緩衝液（例えば０．０５Ｍ　ＫＣＩを含有するＨＤＧ緩衝液） に対して透析し、イオン交換カラム（好ましくはＤＥ５２−セルロースのカラム ）に注入して塩の連続勾配液で溶離してもよい。 ＤＥ５２−セルロースカラムから得たピーク画分は、所望により、活性画分をプ ールし、Ｎ″−アセチルトランスフェラーゼ活性体を濃縮し、適切な緩衝液（例 えば０．０５Ｍ　ＫＣＩを含有するＨＤＧ緩衝液）に対して透析し、次いでアフ イニテイカラム（例えばＡｆｆｉ−Ｂｌｕｅゲル）に吸着させて、塩の連続勾配 液（例えば０．０５〜１．０Ｍ　ＫＣＩ）で溶離することによってさらに精製し てもよい。０．６Ｍ　ＫＣＩの位置を中心にして、単一の活性ピークが生成する 。 上記の一連のクロマトグラフィの工程を用いると、酵母アセチルトランスフェラ ーゼは、２７％の収率で細胞エキスに対して約４６００倍に精製することができ る。Ｎ’−アセチルトランスフェラーゼの活性は、次にようにして測定すること かできる。すなわち、粗酵母溶解物を作り、Ｎ“−アセチルトランスフェラーゼ 活性を先に記載したようにして測定する（Ｌｅｅ、　Ｆ、　−Ｊ、　Ｓら、Ｊ、 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６３巻、■４９４８〜１４９５５頁、１９８９年） 。上記溶解物の一部を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　ｐＨ７，４，１５０ｍＭ　ＫＣ Ｉ、］　ｍＭ　ＤＴＴ、　２５μＭ［３旧アセチル補酵素Ａ　（０，５μＣｉ） および５０μＭ　ＡＣＴＨ（＋−２４）からなり、最終容積を１００μｍに調節 した反応混合物が入っている１、５ｍｌのエノペンドルフ管に添加した。得られ た検定混合物を３０６Ｃで３０分間インキュベートした。反応を、０．５Ｍ酢酸 を添加して停止させ、水浴内で冷却した。得られた反応試料をｓｐ膜ディスク（ Ｃｕｎｏ）で濾過し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　１２２５サンプリングマニフオール ドで、０．５Ｍ酢酸を用いて洗浄した。上記の膜を軽度に乾燥して／ンチレーン ヨンカクテル内に入れ、ベックマンＬＳ　３８０１シンチレー／ヨンカウンター で計数した。内性化合物のアセチル化度を示す対照物の放射能は、各試料の測定 値から差し引く。活性の１単位は、標準の検定条件下でＡＣＴＨ（１−２４）に ｌ　ｐｍｏｌのアセチル残基を組み込む活性と定義する。 本明細書で用いる「実質的に純品の」または「実質的に精製された」という用語 は、天然状態では酵素に通常結合している化合物を実質的に含有せず、すなわち タンパク質および炭水化物の成分を実質的に含有していないＮ”−アセチルトラ ンスフェラーゼを、を味している。この用語は、さらに当該技術分野の熟練者か 用いる１つ以上の純度、もしくは均質性の特性によって均質であるＮ’−アセチ ルトランスフェラーゼを意味する。例えば、実質的に純品のＮ″−アセチルトラ ンスフェラーゼは、分子量、クロマトグラフ法などのパラメータについて、標準 実験偏差の範囲内で一定で再現性のある特性を示す。しかし、この用語は酵素と 化合物の人工、もしくは合成の混合物を除外するものでない。また、この用語は 、例えば精製が不完全なために存在し得る、生物活性を阻害しない小量の不純物 の存在を除外することを意味しない。 ａａａ　ｌ変異体か、今まで予想もしなかった第２のＮ“−アセチルトランスフ ェラーゼを持っていることが見出された。この第２のＮ’−アセチルトランスフ ェラーゼは、メチオンＮ’−アセチルトランスフェラーゼ活性体であり、ｒＭ− Ｎ”−ＡＴＪと命名する。この第２のＮ’−アセチルトランスフェラーゼは、Ｊ ｏｈｎ　Ａ、　Ｓｍ１ｔｈおよびＦａｎｇ−Ｊｅｎ　Ｓ、　Ｌｅｅが１９８９年 ｌＯ月２５日に出願した米国特許出願ｒｌＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＯＦ　 ＭＥＴＨＩＯＮＩＮＥ　Ｎ”−ＡＣＥＴＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥＪの課題で あり、この文献は本願に援用するものとする。本発明のＡＡＡＩＮ’−アセチル トランスフェラーゼ（ｒＮ・−ＡＴＪ）の相対特異性と活性をＪｏｈｎ　Ａ、　 Ｓｍ１ｔｈとＦａｎｇ−Ｊｅｎ　Ｓ、　Ｌｅｅが１９８９年ＩＯ月２５日に出願 した米国特許出願ｒｌＤＥＮＴＩＦＩｃＡＴＩＯＮ　ＯＦ　ＭＥＴ）ＩＩＯＮＩ ＮＥ　Ｎ”−ＡＣＥＴＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥｊのメチオニンＮ’−アセチ ルトランスフェラーゼ活性体（Ｍ−Ｎ’−ＡＴ）と比較するために、合成ペプチ ドを作った。これらのペプチドは、上記の２つの酵素に対する基質として働く性 能について測定された。これらの試験の結果を表２と３に示す。表２には、活性 に対するアミン末端アミノ酸の影響を試験した結果を示し、表３には活性に対す 名アミノ末端から２番目のアミノ酸の影響を試験した結束を示、Ｌ、。 基質　活性（％） ＡＣＴＨ（ヒート　）　１００土５　０Ｓ−Ｙ−５−Ｍ−Ｅ−Ｈ−Ｆ−Ｒ−Ｗ− Ｇ−に−Ｐ−Ｖ−［、−に−に−Ｒ−Ｒ−Ｐ−Ｖ・Ｋ−Ｖ−Ｙ−Ｐ（平均活性± Ｓ、　Ｄ、　） Ｎα−ＡＴ　Ｍ−Ｎα−ＡＴ ＩＱ２］　アルコールデヒドロゲナーゼ５−Ｑ−Ｐ−Ｅ−□−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ− １−ＦイーＥ−５−’Ｈ：れ島藩髪、−，１３４°７　。

【Ｅ２】　アルコールデヒドロゲナ−１（１−２４）　（ｉｌｆｆｌ）　１２１ ｉ６　０Ｓ−Ｅ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ−Ｖ−Ｉ−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｈ−Ｇ− に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ［Ｌ　］　］アル：＋−ルデｌ：Ｖｏ’ｆｔ− ゼＩ（１−２４）（酵母）　１２６２５　０Ｓ−Ｌ−Ｐ−Ｅ−Ｔ−Ｑ−に−Ｇ− Ｖ−１−Ｆ−Ｙ−Ｅ−Ｓ−Ｈ−Ｇ−に−Ｌ−Ｅ−Ｙ−に−Ｄ−１−Ｐ実施例４ ＡＡＡ　ｌ遺伝子の３”末端からＨｉｎｄｌｌｌ断片を除去してこの遺伝子の約 ４５％を削除し、３．８ｋｂのｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈ’ｉｓＧ遺伝子断片をＥ ｃｏＲＶ部位に挿入したく図２Ａ）　、　ａａａ　１−１　：　：ｈｉｓＧ−Ｕ Ｒ＾３−ｈｉｓＧ配列を含有するＤＮＡ断片でｕｒａ３／ｕｒａ３、二倍体酵母 （ＭＧＤ５０２株）（表４）（ＩｔＯら、Ｊ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、、Ｆ５３ 巻、１６３〜１６８頁、１９８３年）を形質転換した。この工程は以下のように して行った。 ＡＡＡ　ｌ挿入断片の旧ｎｄＩ［１部位からブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ、　Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の旧ｎｄＩ１１部位までのＡＡＡ　１の３′ 末端を削除してプラスミドｐＢＮＨ９を構築し、次いで自己連結さ゛せた。酵母 ＵＲＡ３遺伝子と２つのｈｉｓＧ繰り返し配列を含有する３、　８ｋｂのＤＮＡ 断片をＢｇｌ■とＢａｍ旧で消化することによって、プラスミドＰｐＮＫＹ５１ 　（Ａｌａｎｉ、　Ｅ。 ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１１６巻、５４１〜５４５頁、１９８７年）がら切り 取り、その粘着末端をクレノー断片で満たした。プラスミドｐＢＮ）＋９をＥｃ ｏＲＶで切断して開き、３．８ｋｂのｈｉ’ｓＧ−υＲＡ３−ｈｉｓＧを含有す る断片をｐＢＮｌ１９に連結して平滑断片にしてｐＢＮＨＩＩ９を得た。 タンパク質のＮ”−アセチル化反応の生物学的意義を研究するために、分解削除 変異を一段階遺伝子トランスプレイスメント法（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ）　（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｒ１，Ｍｅｔ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、、１０１巻、　２ ０２〜２１１頁、１９８３年；この文献は本願に援用するものとする）で行った 。 基本的には、Ｘｈｏ　Ｉで消化することによって、４．９ｋｂのＤＮＡ断片をｐ ＢＮＨＵ９から取り出し、この断片は種々菌株を形質転換するのに用いた。ウラ フルの原栄養体を選択した。 ｔｌＲＡ３遺伝子と１−）のｈｉｓＧ繰り返し単位の除去をＵｒａ’、ａａａ− 株（八８１ｇ−ａ）を５−ＦＯＡ（５−フルオロ−オロチン酸）プレート上にパ ッチングすることによって行った。このプレートは先に記載したように（８ｏｅ ｋｅ、　Ｊ、　Ｄ、ら、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、、１９７巻、３４５ 〜３４８頁、１９８４年）　ｕｒａ３菌株（ウラシル＋５−ＦＯＡ）に対して選 択性である。このようにして、ＡＢ１８−ａｐ　（ａ　ａ　ａ　１　：　：　ｈ ｊｓＧ、　ｕｒａ３）　、すなわち５−ＦＯ＾抵抗性菌株がＡＢ１８−ａから誘 導された。 ｕｒａ”形質転換体を単離し胞子形成を行わせ、４分子分析（ｔｅｔｒａｄａｎ ａｌｙｓｉｓ）を行うために、得られた子嚢を解剖して個々の胞子にした。はと んどの二倍体は、柔毛を有する生胞子を生成した。しがし、完全な４分子（２０ の４分子）は、各々２つの野生型の大きさのコロニーと２つの小さなコロニーで 構成されていた。完全な４分子の特性決定を行ったところ、大きなコロニーはｕ ｒａ−＠胞で構成され、小さなコロニーはｕｒａ”細胞で形成されていることを 示した。 ４分子はＤＮＡプロット法で分析した。これらの方法を行うための制限酵素はす へて、Ｎｅｖ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社がら購入した。ＤＮＡｆｊｐ 識はＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入 手した。ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜はＮＥＮ社から入手した。酵母のゲ ノムＤＮＡを単離しくＳｈｅｒｍａｎ、　Ｆ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅ ａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙＸＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニュー　ヨーク、１ ９８６年）、制限酵ｔｒ？ｔＭ化シ、トリス−ホウ酸緩衝液中０．８％アガロー スを用いて電気泳動に付し、ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ　Ｐｌｕｓ膜に転移させ、Ａ ＡＡ　ｌ　のランダムプライムを行った［”Ｐ］−Ｘｈｏｌ／Ｂａｇ旧断片（ｐ ＢＮ９由来）と２４時間雑種形成を行い、洗浄し、次いでオートラ／オグラフィ に付した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　９８巻、５ ０３〜５１７頁、１９７５年）。 ４分子のこのＤＮＡプロット分析によって、ｕｒａ−胞子がＡＡＡ　１の野生型 変形に対応する１、１ｋｂのＸｈｏｌ／Ｂａ−旧または２．５ｋｂ　Ｘｈｏｌ／ ５ｐｈｌの断片を含有し、一方ｕｒａ”胞子が追加の３．８ｋｂＯＵＲＡ３遺伝 子の断片（図２Ｂ）を含有することが証明された。−培体と二倍体の株は、ａａ ａ　１−１　：　：ＵＲＡ３分解体（ｄｉｓｒｕｐｔ　１ｏｎ）だけを含有して いるときに生育できたので、ＡＡＡ　ｌは必須遺伝子でないことは明らかである 。さらにＮ６−アセチルトランスフェラーゼ酵素検定法（Ｌｅｅ、Ｆ−Ｊ、　Ｓ ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、、２６３巻、１４９４８〜１４９５５頁 、１９８８年）によって、ＵＲ＾３標識かａａａ　ｌ遺伝子を明示することが証 明された。 細胞から得たタンパク質抽出物の酵素検定によって、ｕｒａ”胞子は、検出でき るＮ″−アセチルトランスフェラーセ活性をもっておらず、一方、未形質転換の 二倍体（＋／＋）であるペテロ接合二培体（＋／ａａａｌ　１）とｕｒａ−胞子 は、正常な酵素活性を有することか確認された。また、ａａａ　ｌ・・ＵＲＡ３ 配列を有するＤＮＡ断片で１ｒａ３−培体酵母株（ＡＢＩ８．　Ｔ３Ａ）　（、 表４）を形質転換した。これら−培体株のｕｒａ’ｌＦ；質転換体を単離した。 ＤＮＡプロット分析法と酵素検定法によってＡＡＡｌ遺伝子か分解されているこ とが証明された。 入Ａ 酵母株 ＭＧＤＳＯ２，４ｃ　ＭＡＴｅ　起重＋　ｄ’＋　丘＋　ｋハｒ　カｔ　ＡＭＩ ＭＧＤＳＯ２，４ｄ　ＭＡＴα起ｌ、　！’＋　’Ｊｍ＋　ｋ吐、　ＭｎＬ　Ｂ 藍ｄへ８１ＢＭＡＴａ雇程」＋　皿、　ＬＹｊＺ＋　江ハ、　肛ｕ、　ｕｕユＡ Ｂ１Ｂ−ａｐ　ＭＡＴａ　観Ｃ旦ｔ　ｈｉｓｓ、　ｍｌ　ｋハ、　肛ｕ、　…… 」Ｔ３Ａ　ＭＡＴａ皿、屓９区Ｉ、凹 Ｆ６７６　ＭＡＴａ　ｙｊｄ、旦Ｊｓ＋　肥ｕ＋　Ｂ且Ｊ、　ＬＬｎＬ　匹ｍ１ ３２６８−１−讐怖し副１皿、揮、■包、匣。 ’ａａａｌ−１は、ａ　ａ　ａ　ｌ　：　：　ｈｉｓＧ−ＵＲＡ−ｈｉｓＧを示 す。 ａａａｌ−２はａａａｌ：：ｈｉｓＧを示す（材料と方法の項に記載したのと同 じ）。 ５＾８１８とＴ３＾の交雑由来の二倍体。 ＣＡＢ１８−ａとＴ３＾の交雑由来の二倍体。 ’ＡＢ１８−ａとＴ３＾−ａの交雑由来の二倍体。 ＡＡＡ　１株の表現型を次の方法により試験した。試験株をＹＰＤ培地中３０° Ｃにて３日間増殖させ、次にその細胞をＹＰＤプレートにプレートすることによ ってコロニーの形態を試験した。コロニーの大きさと形態を５日間増殖させた後 、評価した。 被験株の比増殖速度をＹＰＤ培地中３０°ＣＣ１２００ｒｐで細胞を増殖させて 測定し、０Ｄｌｌｏｏ値は特定の時間間隔をおいて測定した。 定常期に入ったことは次の３つの方法で決定した。（ｉ）ＹＰＤ培地中で３日間 増殖させた培養物の一部を同容積の１０％ホルムアルデヒドと混合し、短時間、 超音波処理を行い、次いで血球計数器て百分率を測定する方法（ｌ測定当たり約 ｔｏｏｏの細胞）　：　（ｉｉ）定常期における生存率を測定する方法（細胞を ＳＤ培地中３０℃にて５日間保持し、希釈した後細胞をＹＰＤプレート上にプレ ートし、次いで２日後コロニーの数を計数する）、および（ｉｉｉ）　５日間培 養した培養プレートを密封状態で３〜５分間ヨウ素の結晶で転化させて、グリコ ーゲンを含有する暗褐色の出現に注目することによってグリコーゲンの蓄積を決 定する方法である。 先に記載したようにして（Ｓｈｅｒｉａｎ、　Ｆ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｙｅａ＆ｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク 、１９８６年）、胞子形成を行った。予備胞子形成プレートには０．５％のハク トー酵母、０．５％のバクトペブトン、１％のグルコースおよび２％バクト寒天 を含有させた。細胞をこれらのプレート上で１日間増殖させた後、１％酢酸カル シウム、０．１％バクト酵母エキス、２％バクト寒天および適切な栄養素要求株 向は栄養素（ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）を含有する胞子形 成プレートに移した。細胞は、特に指示がない限り３０℃で増殖させた。酵母の 形質転換は酢酸リチウム法（Ｉｔｏ、Ｈら、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１５３巻 、１６３〜！６８頁、１９８３年）で行った。二倍体の構築と４分子の解剖は、 標準法（Ｓ１１６ｒｍａｎＦら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓＳＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＳＣ ｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク、１９８６年）を用いて行 った。プラスミドはＭａｎｉａｔｉｓらが報告した標準の方法（Ｍａｎｉａｔｉ ｓ、　Ｔ。 ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａ ｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ。 ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニュー ヨーク、１９８２年）で構築した。 胞子形成効率は次にようにして試験した。すなわち細胞をＹＰＤプレート上で増 殖させ、適切な栄養素要求株向は栄養素を加えた胞子形成培地（１％酢酸カリウ ム、０，１％の）・クト酵母エキス、０．０５％テキストロース）に移し、２５ ℃２５Ｏｒｐｍで１日間インキコヘートした。細胞を遠心分離（１２００Ｘｇ、 ５分間、２０°Ｃ）で収穫し、適切な栄養素要求株向は栄養素を添加した最小胞 子形成培地（１％酢酸カリウム水溶液）中に再懸濁させ、２日間インキュベート した。５００以上の細胞を計数することによって、胞子を形成した細胞の百分率 を測定した。 熱感受性を次のようにして試験した。すなわち、細胞をＹＰＤ培地内で３０°Ｃ にて後期対数増殖期まで増殖させ、ＳＤ培地て約ｌＸＩＯ３／ｍ１まで希釈し、 次いで５４°Ｃでヒート／ヨノクを与えて測定した。 一部分を指定の時間に取り出し、水浴で冷却し、希釈した後、細胞をＹＰＤプレ ート上にプレートした。３日後、コロニーを計数し、生存百分率を測定した。 ４分子分析で得たｕｒａ”細胞で形成された小さなコロニーにより、ゆっくり増 殖する細胞はａａａｌ−１か分解されたという遺伝的証拠か得られた。各−培体 細胞（野生型およびａａａ　］変異体）の比増殖速度を測定した。得られたデー タは、ａａａ　ｌ変異体は、比増殖速度か４０〜６０％減少することを明確に示 した（表５）。 細胞か定常期に入ることに対してａａａｌの変異が影響するのか否かを決定する ために、出芽した細胞の比率、定常生存率およびグリコーゲンの蓄積を試験した 。８種類の６株（表５）の培養物を細胞数の増大かもはや検出されなくなるまで 、ＹＰＤ培地中で３〜５日間３０°Ｃで増殖させた。いずれかの接合型のａａａ 　ｌ細胞の培養物は、指数増殖中の培養物に特徴的な出芽細胞／未出芽細胞比を 示すか、一方野生型の株は、定常期の培養物に特徴的な出芽比を有することを表 ５は示している。その上に、変異細胞には多重部位と異常出芽がしばしば観察さ れた。定常期における生存百分率は、８種の６株をＳＤ培培地中日日間３０°Ｃ で増殖させることによって測定した。 この試験は、ａａａ　１株の非増殖性培養物か野生型株より急速に生存性を失う ことを示した（表５）。グリコーゲンの蓄積は、８種の６株をＹＰＤプレートに ５日間プレートした後測定した。これらの非増殖性プレート培養物は、ヨウ素蒸 気に短時間曝露した。細胞が定常期に入るとき、貯蔵グリコーゲンの蓄積によっ て野生型株のみが暗褐色になる。上記の結果は、Ｎ”−アセチルトランスフェラ ーゼは細胞が定常期に入るのに必要であることを示している。 ３日間培養した培養物をＹＰＤプレートにプレートしたところ、＋　：＋　ｒＩ ｌコロニーは人きさか変１ヒして会しになり、約８０％か野生型＋１１１　！Ｉ Ｉより大きさか小さくなるこ、とか９出された。多ｆｆｉ［異体のコロニーを取 り出しＹＰＤ中で３０間増殖させ、ＹＰＤプレートにプレートシた。これらのａ ａａ　ｌ変異体コロニーも、大きさが変化し奇６細胞はＹＰＤ培地中３０°ＣＣ １２０Ｏｒｐで増殖させ、ＯＤ＠。。は各種の時間間隔で測定した。 ５細胞はＹＰＤ培地中３０℃で３日間増殖させた。短時間超音波処理を行った後 、出芽細胞と未出芽細胞を血球計数器で計数した。各測定について１０００以上 の細胞を計数した。 ０株をＳＤ培地中３０°Ｃで５日間保持した。細胞をＹＰＤプレート上にプレー トし、２日後にコロニーを計数した。 実施例７ ＡＡＡ　ｌ遺伝子は胞子形成に必要である酵母の胞子形成は、ＭＡＴａ／ＭＡＴ α二倍体細胞の飢餓によって開始され、分化の制御されたプログラムを示す（丁 ｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏ「ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃ ｈａｒｏｍｙｃｅｓ：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄ　Ｉｎｈｅｒｉｔｅｎｃ ｅ　（Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｎ　ら編集）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｏ ｂｏｒ、ニューヨーク、１９８１年中のＥｓｐｏｓ　ｉｔｏ、　Ｒ，Ｅ、らの論 文）。 Ｎ’−アセチル化反応か胞子形成に役割を演するのか否かを評価するために、野 生型（＋／＋）、異型分解形（＋／ａ　ａ　ａ　１−１）　、同形分解形（ａａ ａ　ｌ−１／ａａａ　１−１）の二倍体を示す、遺伝子型二倍体酵母株（ＭＧＤ ５０２とＭＳ）の２セツト（表４参照）を使用した。表５に示すように、両方の 同形（ａａａ　１−１／ａａａ　１−１）の二倍体株（ＭＳ−２ａとＭＧＤ５０ ２−２ａ）は効率的に胞子を形成しなかった。 実施例８ ＡＡＡ　１遺伝子は特異的な接合型の機能に必要である接合の試験は次にように して行った。接合についての試験を行う株をＹＰＤ培地内で一夜増殖させた。各 接合型からの同数の細胞（約５　Ｘ　１０８）を混合し、ＹＰＤ培地中３０°Ｃ で６時間インキュベートし、凝集について試験した。さらに、栄養素要求性選択 に対して必須の栄養素を含有するＳＤプレートに細胞をプレートした。このプレ ートには接合によって生成した二倍体のみが増殖するはずである。個々の接合型 細胞は単独でＳＤプレートにプレートされ、栄養素要求性の標識の復帰について 検定されたが、原栄養体はまったく観察されなかった。 α因子を検定するために、テスター株３２６８−１３　（α５ｓ２−１）の約１ ０′の細胞をＹ　Ｐ　Ｄ　（＋））＋４．　ｓ）プレートの上に広げ、試験され るａ型３日間インキュベートした後、明確にみえるようになった。 ａａａ　ｌ変異体（ＭＤＧ５０２．４ａおよび八Ｂ１８−ａ　；ともにａ−接合 型）とα因子応答について試験した。細胞ＹＰＤ中で一夜増殖させ、洗浄し、ｌ Ｘｌ０＠細胞／ｍｌの細胞密度でα因子（１８Ｍ）を含有するＹＰＤの５ｍｌ中 に再懸濁させ、３０°Ｃてインキュベートした。試料（０，１ｍ１）を種々の時 間間隔で取り出し、同容積の１０％ホルムアルデヒドと混合し、Ｇｉ柑で捕捉さ れた細胞を出芽細胞／未出芽細胞比で測定しノこ。 一倍体のニス・セレビンエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、２つの接合型の ａとαて生し、ＭＡＴ配座て決定した（Ｎａｓｙｍｔｈ、　Ｋ、ら、５ｃｉｅｎ ｃｅ、２３７巻、１１６２〜１１７０頁、１９８７年）。逆の接合型の細胞も、 細胞か融合し二倍体細胞か生成することになる接合反応に参加することがてきる （　Ｂｅｎｄｅｒ、＾ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１２１巻、４６３〜４７６頁、 １９８９年：　ＳｐｒａｇｕｅＧ、　Ｆ、ら、Ａｎｒ＋ｕ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌ、、３７巻、６２３〜６６０頁、１９８３年；　Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　：　Ｌｉｆｅ　Ｃｙｃｌｅ　ａｎｄＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅＳＳｔｒ ａｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　ｆ　ら編集、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨー ク、１４３〜１８（１頁、１９８１年におけるＴｈｏｒｎｅｒ　Ｊの論文）。い くつものタンパク質が接合のプロセスに関与しているか、これらのいずれのＮ゛ −アセチル化か起こっているかは不明である。 したかって、接合はａａａ　１株［ＭＤＧ５０２．４ｄ（ａ　＞、ＭＤＧ５０２ ．４ａ（ａ）、Ｔ３Ａ−ａ　（α）もしくはＡＢｌｇ−１（ａ）］と逆の接合型 の株とをゆっくり混合することによって実施した。驚くべきことには、ａ型のａ ａａ　１変異株（ＡＢｌｇ−ａとＭＤＧ　５０２．４ａ）は、野生型のα型細胞 と混合したとき、野生型α型細胞と同様には凝集しなかった。接合の定量試験の 結果、ＭＡＴａａ　ａ　ａ　ｌ細胞の接合効率は有意に減少したが、停止されな いということか分かった（表７）。２つのα型ａａａ　ｌ変異体（Ｔ３Ａ−ａと ＭＧＤ５０２．４ｄ）は、野生型株（Ｔ３＾とＭＧＤ５０２．４ｃ）と同レベル でα因子を産生じた。しかし２つのａ型ａ　ａ　ａ　１　変Ｒ体（ＡＢｌｇ−ａ とＭＧＤ　５０２．４ａ）は、野生型株（ＡＢｌｇとＭＧＤ５０２．４ｂ）より もα因子の産生が少なかった。ａ型ａａａ　ｌ変異体（ＭＧＤ５０２．４ａ）は 、α因子の産生か野生型（ＭＧＤ　５０２．４ｂ）よりも少なくとも３０倍少な かった。 同様な結果が、八ＢＩ８−ａをＡＢ−１８と比へた場合にも認められた。 ａ型細胞は、ＢＡ旧遺伝子産物、いわゆるバリヤー活性体を分泌することが知ら れており、そしてその活性体はα因子を劣化させ、その結果接合の応答をトリガ ーする（ｆｌｉｃｋｓ、　Ｊ、　Ｂ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２６０巻、２４６〜 ２４８頁、１９７６年；　Ｋｒｏｎｓｔａｄ、　Ｊ、　Ｗ、　、　Ｃｅ１ｌ、　 ５０巻、３６９〜３７７頁、１９８７年：　Ｍａｎｎｅｙ、Ｔ、Ｒ，、Ｊ、’Ｂ ａｃｔｅｒｉｏ１．１５５巻、２９１〜３０１頁、１９８３年：　Ｓｐｒａｇｕ ｅ、　Ｇ、　Ｆ、　Ｊｒ、ら、Ａｎｎｕ、Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　 ３７巻、６２３〜６６０頁、１９８３年）。 バリヤー活性体は、ａ接合型細胞の画線によるα因子産生領域の干渉で検出した 。この検出はＳｐｒａｇｕｅとＩｉｅｒｓｋｏｗｉｔｚの文献に記載の方法で（ Ｓｐｒａ’ｇｕｅ、　Ｇ、　Ｆ、　、　Ｊｒら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、 １５３巻、３０５〜３２１頁、１９８１年）、旧ｃｋｓとｌｌｅｒｓｋｏｗｉｔ ｚの文献に記載のＦ６７８（ｓｓｔｌ）をテスター株として用いて（ｆｌｉｃｋ ｓ、　Ａ、　Ｈら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ口、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ 、８１巻、７０２１〜７０２５頁、１９８４年）行った。合成のα因子をＢａｃ ｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ社から購入し、９０％メタノールに溶解 した（　２　ｍｇ／ｍ１）。 この試験によって、ａ型ａａａ　ｌ変異株（ＡＢＩｇ−ａとＭＤＧ５０２．４ａ ）が野生型で超高感受性の細胞に比べてバリヤー活性がごくわずかに減少したた けであることかわかった。その上に、その細胞を１μ麓のα因子を含有するＹＰ Ｄ培地に再懸濁させた場合、ａ型ａａａ１変異体（ＡＢＩｇ−ａとＭＤＧ５０２ ．４ａ）はＧｌ相に捕捉できない。 フェロモン産生の定量測定を以下のようにして実施した。細胞をＹＰＤ培地中３ ０度で２０Ｏｒｐｍにて後期体数増殖期まで増殖させた。細胞は１．３Ｘ　ｌＯ ’ｇで５分間行う遠心分離を２回実施してペレット化し、フェロモン活性につい て上澄み液を検定した。フェロモンを含有する上澄み液をクエン酸緩衝液（ｐｔ １４．５）で連続的に希釈した液（２〜４倍希釈液）をフェロモンに超高感度の 細胞のローン上にスポットし、２３°Ｃで３６〜４８時間インキュベートした。 ＹＰＧ培地中での中期対数増殖期とＹＰＤ培地中での増殖の異なる段階で、５０ ０ｍ１の培養物から細胞を収穫した。熱／ヨノクを次のようにして行った。　Ｙ ＰＤ培養物のＡ６００が約２．０に達したとき、７５ｍ１ずつ２つの試料を取り 出し、一方を３７°Ｃて２時間加熱し、他方は３０°Ｃでインキュベートした。 全ＲＮＡを各試料から抽出した（　Ｓｈｅｒｍａｎ、　Ｆ、ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＳＣｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂ。 ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｏｂｏｒ、ニューヨーク、１ ９８６年）。酵母ＲＮＡ（１０μｇ）を１．２％アガロース／ホルムアルデヒド ゲルを用いる電気泳動に付した（Ｌｅｈｒ’ａｃｈ、　）Ｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ、　１６巻、４７４３〜４７５１頁、１９７７年）。ＲＮＡＩ識を含 有するレーンを切り取り、臭化エチジウムで染色することによって視覚化し、Ｒ ＮＡの分子の大きさを測定するのに用いた。そのＲＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎ 　Ｐｌｕｓ膜に転移させ、次にランダムプライムを行った［３”Ｐ］−Ａ　Ａ　 Ａ　１　（ｐＢＨ９由来のもの、図２Ａ）およびβ−チューブリン（Ｎｅｆｆ、 　Ｎ、　Ｆ、ら、Ｃｅ１ｌ、　３３巻、２１１〜２１９頁、１９８３年）ＤＮＡ と２４時間雑種形成させ、洗浄し、オートラジオグラフにかけた（Ｔｈｏｍａｓ 、　Ｐ、　Ｓ、、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ。 ＾、７７巻、５２０１〜５２０５頁、１９８０年）。ＡＡＡ　１とβ−チューブ リンに対するｍＲＮＡのレベルをｆｆ１ｌｌ定した。 全ＲＮＡは、ＹＰＧ培地中で増殖させた中期対数増殖期の細胞；ならびにＹ　Ｐ 、Ｄ培地中で増殖させた早期対数増殖期の細胞、中期対数増殖期の細胞、定常期 の細胞および３７°Ｃで２時間熱シヨツクを与えた細胞から作製した。ＲＮＡプ ロット分析は、ランダムプライムを行った［”Ｐ］−放射標識付きＡＡＡ　Ｉと 酵母β−チュープリンのプローブで行った。ＡＡＡＩは、β−チューブリンの遺 伝子（Ｎｅｆｆ。 Ｎ、　Ｆ、ら、Ｃｅ１ｌ、３３巻、２１１〜２１９頁、１９８３年）に比べて、 転写のレベルに対してグルコース抑制、増殖期または熱ショックの影響はまつＮ “−アセチル化反応は、各種のタンパク質が細胞内で分解して劣化しないように 保護する働きがあるということは、すでに示唆されている（Ｊｃ＋ｒｎｖａｌｌ 、　Ｈ，、Ｊ、　Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、、５５巻、１−１２頁、１９７５年 ；　Ｒｕ　ｂｅｎｓＬｅｉｎ、　Ｐ、ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、２５４ 巻、１１１４２〜１１１４７頁、１９７９年）。ユビキチン依存分解系によって 仲介されるタンパク質代謝回転速度は、モデルタンパク質のＮ末端における遊離 α−ＮＨ，基の存在に依存すると報告されており、（Ｂａｃｈｍａ　ｉ　ｒ、＾ 、ら、３ｃｉｅｎｃｅ、２３４巻、１７９〜１８６亘、１９８６年）、および酵 母細胞中、ポリュビキチンが熱ノヨノクタンパク質であることが証明されている （Ｆｉｎｌｅｙ、　Ｄ、ら、Ｃｅ１１．４８巻、１０３５〜１０４６頁、■９８ ７年；　Ｔａｎａｋａ、　Ｋ、ら、ＥＭＢＯＪ、、７巻、４９５〜５０２頁、１ ９８８年）。しかし、タンパク質のＮ＃−アセチル化反応か熱７ヨノクに対する 抵抗について何らかの働きがあるのか否かについては分かっていない。それ故に ８種の二倍体株（４種のａａａ　］変異体と４種の野生型）中の指数関数的に増 殖中の細胞に５４℃で熱／ヨ、りを与え、生存率を種々の時点て測定した。図３ に示すように、ａａａ　１株（ＭＧＤ５０２．４ａとＭＧＤ５０２．４ｄ）は、 野生型株（ＭＧＤ５０２．４ｃおよびＭＧＤ５０２．４ｂ）より熱ショックに対 して感受性である。他のａａａ　１株（八Ｂ１８−ａとＴ３＾−ａ）も野生型株 （八Ｂ１８とＴ３Ａ）より感受性かあった。 実施例１２ ＡＡＡ　ｌ遺伝子の発現はＡＡＡ　ｌの変異を相補することができるＡＡＡ　１ 遺伝子の発現ブ５スＥ、トは、ｐＶＴ−Ｌ１００発現ベクター（ＬＥＵ２標識含 有）もしくはｐＶＴ−Ｖ１００発現ベクター（ＵＲＡ３標識含有）のＡＤ旧プロ モーター（Ｖｅｒｎｅｔ、　Ｔら、Ｇｅｎｅ、５２巻、２２５〜２３３頁、１９ ８７年）にすぐ続いて位置するＸｂａ　１部位に、ＡＡＡ　１コーデイング領域 を挿入することによって構築した。これらのプラスミドはそれぞれｐｔ。 ＾ｌもしくはｐＵＡｌと呼称する。 種々のａａａ　ｌ変異体をＡＡＡ　ｌ遺伝子を含有するプラスミドのｐＬＡｌも しくはｐＵＡ　ｌで形質転換した。ＭＤＧ５０２−２ａ／Ｔ形質転換体（ｐＬＡ ｌを含有する）は、ＭＤＧ５０２−２ｇに見られた胞子形成の不全を回復した（ 表６）。その上に、ｐＬＡ　ＩのＭＤＧ５０２．４ａへの導入（ＭＡＴａ、　ａ 　ａ　ａ　Ｉ　）およびｐＬＩＡｌの＾Ｂ１８−ａｐへの導入（ＭＡＴａ％ａ　 ａ　ａ　ｌ　−２）によって接合効率が回復した（表７）。これらの形質転換体 は野生型と同様に、豊富なａ接合因子を発現した。さらに、これらの形質転換体 の比増荻旦 ＭＧＤ５０２　紡ル屑肚　２７ ＭＧＤ３０２−ａ　鉦吐山屑駄２３ ＭＧＤＳＯ２−２ａ　ｄ　＜０．１ ＭＧＤＳＯ２−２ａ／Ｔｂ用り油坦２１　＋ＭＳ　紡孔ツ旦　１６ Ｍ５−ａ　３３３Ｊ−山ｇ　１２ Ｍ５−２ａ　１３１１０１１１１点１ユ１　＜０．１６６株の胞子形成効率は、 材料と方法の項に記載したのと同様に、胞子形成および最小胞子形成培地で３日 間２５°Ｃでインキュベートした後、測定した。 ｈＭＧＤ５０２−２ａ／Ｔは、ＡＡＡＩ遺伝子を発現するｐＬＡ　ｌプラスミド で形質転換した東Ｄ５０２−２ａである。 ＭＧＤＳＯ２，４ｃ　ａ　ＭＡＬ　ＭＧＤＳＯ２，４ｂ　ａ　ＡＡＡＩ　２．１ 　ｘ　１０５ＮＧＯ５０２，４ｃ　ｅ　ＮｖＪ　ＭＧＯ５０２，４ａ　ａ　ユｖ ｄユ１　＜１００ＭＧＤＳＯ２，４ｄ　ｅｎｔＬＩ　ＭＧＤＳＯ２，４ｂ　ａＡ ＡＡｌ　Ｂ、２ｘｌＯ’ＭＧＤＳＯ２，４ｄ　αｊｊｊ１．１　ＭＧＤＳＯ２， ４ａ　ａ　ｌもｏユニ　＜１００Ｔ３Ａ　（ＩＭＡＩ　ＡＢｌＢ　ａＡＭｌｌ、 ４ｘ１０５Ｔ３Ａ　ａ　ＡＡＡＩ　ＡＢｌＢ−ａ　ａ　ａ旧すュユ　＜１００Ｔ ３Ａ−ａ　ａ　ｎ虹ユＡＢ１８　ａ　ＡＭＩ　７．５　ｘ　１０’１接合効率は 、材料と方法の項に記載したように３０℃で測定した。 ｂＭＧＤ５０２．４ａ／Ｔは、Ａ　Ａ　Ａ　ｌ遺伝子を有するＰＬＡＩで形質転 換されたＭＧＤ５０２．４ａであった。 ’ＡＢ１８−ａｐ／Ｔは、ＡＡＡ　ｌ遺伝子を有するｐじ＾Ｉで形質転換された ＡＢ［８−ａｐてあった。 実施例１３ Ｎ”−アセチルトランスフェラーセ遺伝子のＡＡＡ　Ｉを欠いた酵母株は、野生 型の酵母株と比べて小さく、種々の大きさで変形したコロニーとして増殖し、こ れらの株からの細胞は多重に異常に出芽した。その上に、ＡＡＡ　ｌは定常期に 入り、胞子を形成し、熱／ヨ。 りに抵抗し１、ａ型の特異的接合機能を有するために必要であることが証明され たが、これらのプロセスにおけるＮ”−アセチル化反応の役割は不明確なままで ある。 １１ｅｒｓｈｋｏら（ｌｌｅｒｓｈｋｏ、＾。ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　 Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、　Ｓ＾５．８１巻、７０２１〜７０２５頁、１９ ８４年）は、Ｎ“−アセチル化タンパク質の＾ＴＰ依存ユビ牛チン系による分解 か、遊離Ｎ末端を有するタンパク質より遅いことを示し、かつ　Ｎ’−アセチル 化反応か、タンパク質分解に対する保護に関与しているということを示唆した。 その上に、熱／ヨノクによるＵＢ１４遺伝子（ユビキチンをフードする）の誘発 は、ユビキチンか熱ショック応答に役割を演じ、その生理的役割は環境のストレ スによって生成した改変タンパク質もしくは毒性タンパク質を分解することであ ろうと示唆した（Ｆｉｎｌｅｙ、　Ｄ、ら、Ｃｅ１ｌ、４８巻、　１０３５〜１ ０４６頁、１９８７年；　Ｔａｎａｋａ、　Ｋ　ら、ＥＭＢＯＪ、、　７巻、４ ９５〜５０２頁、１９８８年）。本発明者らはＮ’−アセチル化反応か熱ショッ クに対する抵抗に役割を演するということを間接的に立証した。しかし、どのく らいの数のＮ”−アセチル化タンパク質か熱／ヨノクに対する保護に関与してい るのか、および１つ以上のこれらタンパク質における曝露されたα−ＮＨ，基か ユビキチン抱合とユビキチン依存分解に対する認識シグナルを形成するのか否か は、現在明らかでない。 ａａａ　ｌ変異体の同定された表現型の最も注目すべきことは、ａ型であってα 型でないａａａ　１変異体の方か低い効率で接合するということである。このこ とは、すでに観察されている。すなわち、５ＴＥ２（α因子レセプター）　（Ｈ ａｒｔｉｎｇ、Ａ、ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、６巻、２１０６〜２１ １４頁、１９８６年；　Ｊｅｎｎｅｓｓ、　Ｄ、　Ｄ、ら、Ｃｅ１１．．３５巻 、５２１〜５２９頁、１９８３年）　、５ＴＥ６と５ＴＥ１６（ａ因子の成熟に 必要な遺伝子）　（Ｐｏｔｅｒｓ、　Ｓら、Ｃｅ１ｌ、４７巻、４１３〜４２２ 頁、１９８６年；　Ｙｉ　１ｓｏｎ、　Ｋ、　Ｌら、Ｍ。 １、ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ、、４巻、２４２０〜２１１２７頁、１９８４年）　、 ＭＦａｌとＭＦａ２（ａ因子）　（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ、Ｓら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ ｌ　Ｂｉｏｌ、８巻、１３０９〜１３１８頁、１９８８年）の変異によって、接 合型の効率が１００万倍も減少する。これに対して、ａａａｌ変異によって接合 型の効率の減少は１０００倍であった。したかって、すてにａｒｄｌ変異につい て観察されているように（Ｔｈｉｔｅｗａｙ、　Ｍら、Ｃｅ１１．．４３巻、４ ８３〜４９２頁、１９８５年）、ａａａＩの変異によっである種のａ−特異的遺 伝子産物の発現は減少したが、停止しなかったようである。ＡＲＤＩ遺伝子産物 は、ＨＭＬ部位で直接的もしくは間接的に作用し、その発現を抑制することが示 唆されている（Ｔｈｉｔｅｗａｙ、　Ｍら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、 ７巻、３７１３〜３７２２頁、１９８７年）。 異なるレベルのアセチル化が、いくつかの真核タンパク質に観察されている（Ｇ ａｒｌｉｃｋ、　Ｒ，Ｌら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５６巻、１７２ ７〜１７３１頁、１９８１年；　Ｊｏｒｎｖａｌｌ、　Ｈ，、Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７２巻、４４３〜４５２頁、１９７７年；　ＭａｃＬｅｏｄ 、＾、Ｒ１ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　７８巻、２８１〜２９ １頁、１９７７年；　Ｍａｈｏｎｅｒｙ、　Ｗ、　Ｃ，ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ、　１９巻、４４３６〜４４４２頁、■９８０年：　Ｓｍｙｔｈ、　Ｄ、 　Ｇら、Ｎａｔｕｒｅ、　２８８巻、６１３〜６１５頁、１９８０年；　Ｓｔｅ ｇｉｎｋ、　Ｌ、　Ｄ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２４６巻、３００ １〜３００７頁、１９７１年；　Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｋ、ら、ＦＦＭＳ　Ｌ ｅｔｔ、、１４０巻、６３〜６６頁、１９８２年）。さらにイソ酵素（ＡＤＨＩ およびＡＤＨ…）もアセチル化のレベルか異なることが報告されている（Ｊｏｒ ｎｖａｌｌ、　Ｈ，ら、ＦＦＢ５　Ｌｅｔｔ、、１１１巻、２１４〜２１８頁、 １９８０年）。このようにアセチル化レベルが異なるのは、イン酵素間の主要構 造の差、利用できるアセチル−ＣｏＡがないこと、または酵素活性のレベルの差 が原因かもしれない。しかし、両方のＡＤＨイソ酵素の残基ｌ〜２４に似せて合 成したペプチドは、酵母Ｎ“−アセチルトランスフエラーセによって等しくアセ チル化されたが、このことはアセチルＣｏＡが過剰に存在している条件下では、 両方のイソ酵素の有効なアセチル化が進行するはずであるということを示唆して いる（Ｌｅｅ、　Ｆ−Ｊ、　Ｓ、ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ４．２６３巻 、１４９４８〜＋４９５５頁、１９８８年）。さらにＲＮＡプロット分析を行っ た結果、グルコース抑制、異なる増殖相または熱ショックはＡＡＡ　ｌ遺伝子の 転写調節に対して大きな影響はまったく与えなかったことが分かった。しかし、 これらの結果はＮ”−アセチル化反応が、Ｎ１−アセチルトランスフェラーゼの 翻訳後の修飾（リン酸化もしくはグリコリル化）または調節（抑制もしくは活性 化）によって調節されないということを否定しない。 これらのａａａ　ｌ変異体とＡＡＡ　１遺伝子の上記の広範囲の用途は、酵母の Ｎ“−アセチル化反応の生物学的機能と調節を解明する基盤を構成している。 実施例１４ ａ　ａ　ａ　ｌ　対立遺伝子はサツカロミセス・セレビンエのタンパク質合成を 改変する Ｎ’−アセチル化反応は、どのようにして真核細胞の躬訳とプロセノ／ング（ｆ ｏｌｄ、　Ｆ、、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、９巻、２５６〜２５ ７頁、１９８４年）に影響を与え、かつタンパク質分解に対して保護するか（Ｊ ｏｒｎｖａｌｌ、Ｈ，、Ｊ、Ｔｈｅｏｒ、　Ｂｉｏｌ、５５巻、１〜１２頁、１ ９７５年；　Ｒｕｎｂｅｎｓｔｅｉｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５ ４巻、１１１４２〜＋１１４７頁、１９７９年）は明らかでない。さらに、ユビ キチン依存分解系によって行われるタンパク質の代謝回転の速度は、モデルタン パク質のＮＨ，末端における遊離α〜ＮＨ，基に依存していることは明らかであ り（Ｈｅｒｓｈｋｏら、ＰｒｏｃＮａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、 　Ｓ、＾１．８１巻、７０２１〜７０２５頁、１９８４年；　３ＢＣｈａａｉｒ ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４巻、１７９〜！８６頁、１９８６年）、この依存 性はＮ”−アセチル化反応がタンパク質の代謝回転を妨害する重要な役割を演す ることを示している。 セリンとアラニンは、アセチル化されたタンパク質中に最もよくみられるＮ末端 残基てあり、これらの残基はメチニオン、グリシン、トレオニン、バリンおよび アスパラギン酸とともに、はとんどすべてのＮａ−アセチル化残基を占めている （Ｔｓｕｎａｓａｗａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＥｎｚｙｍｏｌＳ１０６巻、１６５ 〜１７０頁、　１９８４年；　Ｄｒｉｅｓｓｅｎら、ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１８巻、２８１〜３２５頁、１９８５年ＨＰｅｒｓｓｏｎ ら、Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１５２巻、５２３〜５２７頁、１９ ８５年ＨＡｕｇｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃｉ、。 １１巻、４９４〜４９７頁、１９８６年；　Ｔｓｕｎａｓａｗａら、Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６０巻、５３８２〜５３９１頁、１９８５年）。しかし 、これらの残基をＮ末端に持つてる種のタンパク質がアセチル化されるようにな る根拠は不明のままである。 酵母におけるタンパク質合成に対するＮａ−アセチルトランスフエラーゼ不全の 影響を試験するために、野生型とａａａ１変異体から単離し、次に二次元ゲル電 気泳動法で分離した可溶性タン／　ＮＴり質問の比較を二次元タンパク質ゲルの コンピュータによる分析で行った。 この目的のために、酵母株のＴ３Ａ　（ＭＡＴα、ｈｉｓ３．１ｅｕ２、ｕｒａ ３、ＡＡＡ　ｌ）およびＴ３＾−ａ　（ＭＡＴα、ｈｉｓ３．１ｅｕ２、ｕｒａ ３、ａａａｌ−１）を使用した。酵母培地はＳｈｅｒｍａｎらが記載しているの と同様にして調製した［ＭｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ 　（Ｃｏ！ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。 ｒａＬｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｏｂｏｒ、ニューヨーク）１ ９８６年］。すなわち、１％のバクト酵母エキス、２％ノ１クト−ペブトンおよ び２％グルコースを含有するＹＰＤ培地、ならびに１０．０ｇ／ｌのコノ１り酸 塩、６０ｇ／ｌのＮａ０１１．５．０ｇ／Ｉの（ＮＩ＋、）、ＳＯ，，１，７ｇ ／ｌの酵母窒素ヘース（アミノ酸類および（ＮＨ，）、Ｓｏ、なし）、メチオニ ンと７ステイン以外の１８の各アミノ酸の１２．５ｍｇ／ｌ、各々ｔｏｍｇ／ｌ のアデニンとウランル、および２０ｇ／ｌのグルコースを含有するＹＮＢ培地で ある。 酵母は、回転振盪器を用い、２５°ＣＣ１２００ｒｐにてＹＮＢ培地内でＡ６６ ｏ・０７５になるまて一夜増殖させた。１０ｍ１の酵母培養物に、ｌＯμＣｉ／ ｍｌの濃度で（３５Ｓ）−メチオニン（約１２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を添加する ことによって酵母タンパク質に標識をつけて、さらに２０分間２５°Ｃで振盪し た。氷を加えて培養物を冷却した後、細胞を１５ｍ１　Ｃｏｒｅｘ管中で４℃に て５分間遠心分離して（７０００ｘｇ）単離し、冷蒸留水で一度洗浄して遠心分 離した。得られた細胞のペレットに３００μｌの冷蒸留水を添加し、次いてメニ スカス線まで０４５１のガラスピーズを加えた。 得られた細胞を３０秒間つつ４回激しく旋回させて破壊したが、各３０秒間の破 壊の間、１分間づつ水で冷却した。生成したホモジネートをエノペンドルフビペ ノトでガラスピーズがら取り出し、１．５ｍｌのマイクロフユーズ管に入れた。 ガラスピーズを１００μｌの蒸留水で２回洗浄し、洗浄水を上記ホモジネートに 添加した。０．３％ＳＤＳ、　１．０％β−メルカプトエタノール、５００１Ｍ のトルスーＨＣＩ　ｐｔｔｇ、ｏを含有する溶液４０μｌ　（１／１０容積）を 添加した。得られた溶液を沸騰水溶中で２分間加熱し、次いで水上で冷却した。 Ｉ　ｍｇ／ｍｌのＤＮアーゼＩ、５００μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ、および５０ ｍＭ　ＭｇＣ１−を含有する５０ｍ％！　トゾスーＨＣＩ　ｐＨ７，０の溶液５ ０μｌを溶菌ｉ（＊に添加し、得られた溶液を水上で１０分間インキュベートし た。得られた溶菌液をマイクロフユーズ管中で８分間遠心分離し、上澄み液を新 しい管に移し、液体窒素中で凍結させた。 複数対の二次元ゲルに２種の試料調製物を展開し、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａｂ ａｓｅｓｌｎｃＪｆ　（米国、ニューヨーク州、ハノチントン・ステー／ジン） でフッピユータ分析を行った。ケルはＧａｒｒｅｌｓの方法（Ｇａｒｒｅｔｓ。 Ｊ、　ｌ、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６４巻、５２６９〜５２８２頁、１ ９８９年）で作製した。 約４００．　ＯＯＯｃｐｍを含有する溶菌液を各ゲルに負荷した。等電点電気泳 動のアノホリルンン（第一次元）は、ｐＨ４〜７てあった。トアンル硫酸ナトリ ウムのポリアクリルアミド濃度（第二次元）は、１２．５％であった。得られた ケルをフルオログラフィーで処理した。各試料について２回の実験で３セツトの 露出（３，６および１２日目）を行った。得られたフィルムは、ＦＤＰ−Ｉ＋／ ６０コンピュータにインターフェイスされた０ｐｔｒｏｎｉｃｓ　Ｐ−１０００ スキヤナーで走査した。得られたデータは、ＰＤＱｕｅｓ、ｔワークステーショ ンに移した。得られたタンパク質のスポットを同定し、定量しＰＤＱｕ６ｓｊ　 ／ステムで比較した。この／ステムは、ＧａｒｒｅｌｓとＦｒａｎｚａのシステ ム（Ｇａｒｒｅｌｓら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２６４巻、５２８３〜 ５２９８頁、１９８９年）に基ついたものである。 タンパク質合成に対するＮ’−アセチルトランスフェラーゼ不全の影響を、野生 型およびａａａ　ｌ変異体の酵母細胞由来の可溶性タンパク質の二次元ケル電気 泳動パターンを比較することによって試験した。８５５の分離したタンパク質の スポットがゲルのコンピュータ分析によって検出された。野生型細胞中に同定さ れた４８のタンパク質は、分子質量（ｍ、ｏｌｅｃ、ｕｌａｒ　ｍａｓｓ）が変 化することなく、ａａａ　１変異体細胞中により高いｐＩ値をもっていることが 観察された。このような高いｐＩ値へのシフトは、タンパク質中のα−ＮＨ，基 のプロント化とアセチル基を欠いていることかおそら（原因である。その上にａ ａａ　ｌ変異体細胞は、野生型細胞より１４４個少ないタンパク質を含有してい た。 Ｈｅｒｓｈｋｏ　（ｈｅｒｓｈｋｏら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｉ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃ　ｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、、８１巻、７０２１〜７０２５頁、１９８４年 ）らは　Ｎ　ａ−アセチル化タンパク質のユビキチン／ＡＴＰ依存系による分解 が遊離のＮ末端を有するタンパク質よ・りも遅いことを示し、Ｎ“−アセチル化 がこの系による分解を防止できることを示唆した。ａａａ　ｌ変異体内には、も はや検出されない１４４のタンパク質は、この経路で分解された可能性がある。 しかし、「シフトされた」タンパク質のほとんどは、それほど不安定てはなかっ た。従って、Ｎ’−アセチル化はタンパク質の分解の防止に関与する唯一の因子 ではない。 ２７の新しいタンパク質かａａａ　ｌ変異体に出現した。これらのタンパク質の 合成は、もはやアセチル化されない調節タンパク質で調節された遺伝子の抑制解 除、もしくは活性化によってもたらされる。 このような仮定は、１つのタンパク質がａａａ　ｌ変異体中のａ−特異的接合型 遺伝子を調節しているということを示唆している（Ｍｕｌｌｅｎら、ＥＭＢＯＪ 、、８巻、２０６７〜２０７５頁、１９８９年）。 さらに、野生型とａａａ　ｌ変異体のタンパク質の比較をした結果、ａａａｌ変 異体の７１のタンパク質か５０％以上減少し、３４のタンパク質か２００％以上 増加していた。かような縮小合成もしくは増大合成は、Ｎ”−アセチル化を欠い ている調節タンパク質て調節されているのかもしれない。 試験の結果、可溶性タンパク質のわずかに２０％がａａａ　ｌ変異体中でシフト するか、もしくは消える（すなわち、これらのタンパク質はおそら＜Ｎ’−アセ チル基を欠いていたことを示す）ことが分かったか、酵母中の可溶性タンパク質 の５０％かＮ’−アセチル化されていることか示唆されている（Ｂｒｏｗｎ、　 Ｊ、　Ｌ、　、　Ｉｎｔ、　Ｃｏｎｇｒ、　ＢｉｏｃｈｅｍＡｂｓｔｒ、、　１ １巻、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｕｎｉｏｎ　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ、　Ｃａｎａｄａ、　９０頁、　１９７９年）。追加のＮ”−アセチルトラン スフェラーゼの存在かこの明らかな差の原因かもしれない。 Ｎａ−アセチル化法は、Ｎａ−アセチルトランスフェラーゼ遺伝子を削除するこ とによって、その合成が改変される多数のタンパク質で示されるように、真核タ ンパク質の重要な化学的修飾法である。 本発明はその特定の実施態様について記載したが、本発明はさらに改変すること ができ、またこの応用は本発明の変形、用途もしくは適用を含むものであること は理解されるであろう。そして、これらの応用は一般に本発明の原理にしたがい 、かつ本発明が関連する技術分野内で知られているか、もしくは通例の慣行の範 囲内にあり、先に述へた必須の特徴に相当し、かつ請求の範囲内にあって、本明 細書での開示事項よりはずれた事項も含むものである。 国際調査報告 −訂峙一−＾−ＣＩ−４＋〜・Ｐｅｒ／ＬＩＳ９０１０５８８３

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. １．改変されたＮα−アセチルトランスフェラーゼを発現する細胞。
2. ２．酵母細胞である請求項１に記載の細胞。
3. ３．ＡＡＡｌ遺伝子に変異を有する請求項２に記載の酵母細胞。
4. ４．Ｎα−アセチルトランスフェラーゼ活性を実質的に欠いている請求項３に記 載の酵母細胞。
5. ５．ＡＡＡｌ遺伝子のａａａｌ−１対立遺伝子もしくはａａａｌ−２対立遺伝子 を有する請求項４に記載の酵母細胞。
6. ６．改変されたＡＡＡｌ遺伝子を有する組み換え分子。
7. ７．Ｎα−アセチル化アミノ末端を欠いているペプチドをＡＡＡｌ遺伝子を有す る酵母細胞中で発現させることを特徴とする該ペプチドの生産方法であって、前 記遺伝子は、ＡＡＡｌ遺伝子産物の活性を実質的に失わせる変異を有し、かつ該 細胞が前記ペプチドの前記Ｎα−アセチル化反応を触媒できなくしている製造方 法。
8. ８．ａ．ＡＡＡｌ遺伝子産物の活性を実質的に失わせる変異を有し、かつ含有さ れる酵母細胞がペプチドもしくはタンパク質のＮα−アセチル化反応を触媒でき なくするＡＡＡｌ遺伝子、を有する酵母細胞中にペプチドもしくはタンパク質を 発現させ、；ｂ．前記のペプチドもしくはタンパク質を回収し；そして、ｃ．前 記のペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列を決定すること を特徴とする、ペプチドもしくはタンパク質のアミノ酸配列の決定方法。