JPH05502368A - アミロイド沈着物の測定法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミロイド　の油　および試　。

免豆旦立互 本発明は、アルツハイマー病におけるアミロイド症の化学的介入に有用な測定法 および試薬に関する。

１豆ユ！見 アルツハイマー病（ＡＤ）は、年齢に相関して脳が退化する疾病であり、人生後 半における知的障害を起こす最も一般的な病因である。神経斑、あるいは老人性 斑、および神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）は、アルツハイマーの脳の病理組織学的 特徴を顕著に示すものである。これらの斑（プラーク）と線維濃縮体とは、ＡＤ に特異的なアミロイドクラスのタンパク質の性質に関与する、二つの異なるタン パク質の沈着物から生じると考えられている。

アミロイドの主要なタンパク質成分は、約４キロダルトン（ｋｄ）のタンパク質 であり、部分的なβひだ状構造、あるいはその分子量のために、それぞれβタン パク質、あるいはＡ４タンパク質と呼ばれる。Ａ４のアミノ酸配列は決定されて いる（Ｗａｎｇら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ ＳＡ　８２：８７２９−８７３２）。

６９５残基の一次翻訳産物をコードする全長のｃＤＮＡはクローン化されており （Ｋａｎｇら、（１９８７）　Ｎａｔｕｒｅ　３２５４３３−７３５）　、７５ １残基、あるいは７７０残基の前駆体をコードする池のｃＤＮＡは同定されてい る（Ｐｏｎｔｅら、（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３１：５２５−５２７；　 Ｔａｎｚｉら、（１９８８）　Ｎａｔｕｒｅ　３３１＋５２８−５３０；　およ びＫｉｔａｇｕｃｈｉら、（１９８ｇ）　ＮａｔｕｒｅＬ■：５３０−５３２） 。

Ａ４９７パク質は、一般的には、アミロイド斑として、細胞外で、脳実質および 血管壁に蓄積する。このアミロイド斑は、凝集した原線維構造を形成し、５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル上で不溶性である。この原線維は、一般的に″は、コ ンゴレッド染色後の複屈折による緑色によって、および直径４０オングストロー ムから９０オングストロームのアミロイドとして同定されている。

前述の箪二のタンパク質は、細胞内で、アルツノ−ゴマ−症の脳の神経細胞に沈 着しくＣａ５ｔａｎｏおよびＰｒａｎｇｉｏｎｅ、（１９８８）Ｌａｂ　Ｉｎｖ ｅｓｔ　５８：１２２−１３２）　、そして一対のらせんフィラメントに類似の 構造を有する線維濃縮体（ＰＨＦｓ）を形成する。β−アミロイドタンパク質と は対照的に、ＰＨＦｓを含有するタンパク質の一次構造および数は不明である。

ＰＦＩＦを含む神経細胞突起は斑の周囲に見いだされφが、β−アミロイドタン パク質の沈着物は、退化した神経細胞突起および神経膠細胞で囲まれた、成熟斑 の中心のコアを形成する。

ＡＤの病因は不明であるが、ＡＤ患者の皮質に見いだされる神経斑の数は、痴呆 の程度と相関することが証明されている（Ｒｏｔｈら、（１９６６）　Ｎａｔｕ ｒｅ　２０９：１０９−１１０：　ＷｉｌｃｏｃｋおよびＥｓ１ｒｉ、（１９８ ２）　Ｊ　Ｎｅｕｒａｌ　Ｓｃｉ　５６＋３４３−３５６）。アミロイド症の治 療目標は、アミロイド物質の更なる沈着を防ぎ、およびその再吸収を促進あるい は加速することである。今までのところ、ＡＤの発病を治療する手段はなく、Ａ Ｄにおけるアミロイド形成のメカニズムに関する知識の不足が、この過程におい て介入し得る治療薬剤の開発および設計に対する大きな障害となっている。更に は、β−アミロイドタンパク質の沈着物あるいはＰＨＦＳが存在する脳のアミロ イド症の動物モデルがないことは、開発中の治療薬剤を試験するうえで、もう一 つの障害を作り出している。

しかしながら、今ではＡＤに関連する特定のアミロイド症を治療する論理的な治 療方法が明かになっている。この方法は、部分的には、他の型のアミロイド症を 治療しようとして得られた成功と失敗からのものであり、例えば、インビトロで ベンズ・ジョーンズタンパク質からのアミロイドの形成をブロックするジメチル スルホキシドの使用（Ｃｏｒ　ｉａら、（１９８Ｂ）　ＬａｂＩｎｖｅｓｔ　５ ８：４５４−４５８）　、および家族性地中海熱、およびアミロイド腎臓病のい くつかのケースで、腎臓のアミロイド沈着物の大きさを減少し、臨床上緩解をも たらすコルヒチンの使用（Ｒａｖｉｄら、（１９７７）　Ａｎｎ　Ｉｎｔｅｒｎ 　Ｍｅｄ　８７：５５８−５７０）がある。

Ａ４由来の合成ペプチドによる、年齢に相関した大脳のアミロイド発生のインビ トロモデルが、努力の結果、Ｃａ５ｔａｎｏう、（１９８６）　Ｂｉｏｃｈｅｍ 　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍ　１４１ニア８２−７８９、およびＫｆｒ ｓｃｈｎｅｒら、（１９８７）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳ Ａ　８４：６９５３−６９５７によって開示された。Ｃａ５ｔａｎｏらは、アミ ロイドコアタンパク質のアミ／末端２８残基に相当する合成ペプチドを用いると 、アミロイド原線維がインビトロで形成し得ることを証明した。この２８残基の ペプチド、および２８アミノ酸の中に含まれる１７残基の配列は、両方とも原線 維を形成し、アルツハイマーの脳から単離される物質と同様に染色された；しか しながら、合成アミロイド原線維は可溶性であり、アルツハイマーの脳から単離 される天然の不溶性のアミロイドとは異なっていた。

Ｋ　１ｒｓｃｈｎｅｒらは、これと同じ２８残基のペプチドを不溶性の凝集体と して産生じ得ることを証明したが、しかしながら、このような特定のインビトロ モデルは、アミロイド沈着物が生じる細胞環境と十分相関しないと考えられる。

Ｄｙｒｋｓら、（１９１１１１）　ＥＭＢＯＪ　７：９４９−９５７は、６９５ 残基の前駆体のアミロイドＡ４２部分と細胞質ドメインを含有する、短い無細胞 翻訳産物が、多量体を形成し得ることを示した。凝集は、インビ）・口の無細胞 系を用いて観察されたが、この系では、この翻訳産物の凝集が、本来インビボに 従うかどうかは解明できない。更に、インビトロの無細胞系では、タンパク質の 安定な供給、すなわち、タンパク質の適当なレベルを発現し得るかどうか、タン パク質分解があるかどうか、およびインビボでの組み換えタンパク質の発現と関 係するかどうかはいえない。

従って、アミロイド沈着の過程で化学的に介入し得る薬剤を測定し得る、決定的 な細胞沈着物モデルが必要になってくる。そのような方法は、比較的単純に実行 することができ、およびＡＤ斑を他の障害に関連する斑とは区別できるように、 高度に特異的でなくてはならない。更に、この方法は標準法になり得ることが望 ましい。本発明はそのような必要性を充足しており、更なる利点を提供する。

１五恋！１ 本発明は、細胞環境内で、アルツハイマー病に関連するアミロイドの沈着過程に おいて、介入可能な治療薬剤の効果の測定方法を提供する。この方法は、組み換 え産物であるアミロイド基質を利用する、スクリーニングアッセイである。さら に本発明は、本発明によって提供される細胞株の中に、プレアミロイドタンパク 質凝渠体の形成を検出する免疫試薬の開発および使用に関する。

本明細書において、実施態様として広く記載しているが、本発明の目的を達成し 、および本発明の目的に従って、アルツハイマー病のアミロイド症に介入し得る 薬剤のスクリーニング方法は、以下の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）の工程を包含 する；ａ）不溶性プレアミロイド凝集体として、β−アミロイドタンパク質を産 生ずるのに適した条件下で、β−アミロイドタンパク質をコードする遺伝子を発 現し得る細胞株を培養する工程； ｂ）被験薬剤の既知量を細胞培養物に添加して組み合わせる工程； Ｃ）プレアミロイド凝集体の形成が減少するかどうかを測定するために、この組 み合わせをモニターする工程。

本発明のもう一つの実施態様では、プレアミロイドの形成は、β−アミロイドタ ンパク質を不溶性プレアミロイド＃集体として発現し得る組み換えウィルスに、 細胞株を感染させることにより誘導し得る。このような組み換えウィルスは、β −アミロイドタンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを含有する 。

アミロイドに介入可能な薬剤をスクリーニングするのに有用な試薬を用いるイム ノアッセイキットもまた、本発明によって提供される。

の　な号　日 図１は、ワタシニアｐＵＶｌ挿入ベクターを用いる二つのアミロイド発現構築物 の概略図である。

図２は、ＡＰＣＰ抗体による３５Ｓ−メチオニンでラベルされた、ＶＶ：Ａ９９ 感染ＣＶ−１細胞溶解物の免疫沈降の結果を示す。矢印は、Ａ９９タンパク質を 示す。

図３は、ＡＰＣＰ抗体で染色されたＣＶ−［染細胞の蛍光顕微鏡写真である。図 ３Ａは、Ｍｏｃｋコントロールであ’）；図３Ｂｉｔ、ＶＶ：Ｃ０ＮＴコントロ ール細胞であり；図３０は、Ｖ’／：９９構築物であり；図３Ｄは、ＶＶ：４２ 構築物である。各写真はそれぞれ、倍率は２００倍であり、露光時間は０４秒で ある。

図４は、改変β−アクチン発現の選択ベクターであるｐＡＸ−ｎｅｏの概略図で ある。これは哺乳類細胞でβ−アミロイドコア構築物を発現するのに用いられる 。

ましい　態　の−　な：Ｂ 上述したように、本発明は、アルツハイマー病のアミロイド症に介入し得る薬剤 をスクリーニングする方法を包含する。

本明細書で用いている用語「β−アミロイドコアタンパク質」、あるいは、ｒＡ ４タンパク質」は、ＧｌｅｎｎｅｒおよびＷｏｎｇ、（１９８４）肛姐肚し紅姐 肚ｓ　Ｒｅｓ≧■ユ皿８８５皿上８５、最初に決定された、約４　ｋｄのタンパ ク質をさしている。これは、わずかに異なるアミノ末端を有する４つのペプチド の混合物、すなわち、３つの小さなペプチドのアミノ末端が、最も大きいペプチ ドのアミノ末端によって完全にコードされている混合物を配列分析して、アミノ 末端を決定している。

用語「β−アミｏイド前駆体タンパク質」は、６９５アミノ酸のアミロイド前駆 体タンパク質（Ｋａｎｇら、　（１９８７）上記）、あるいは７５１アミノ酸タ ンパク質（Ｐｏｎｔｅら、　（１９８＋１）上記）のいずれかをさしており、こ れらはその配列の中に、上述で決定されたβ−アミロイドコアタンパク質配列を 含んでいる。Ａ４コアタンパク質は、６９５アミノ酸のタンパク質のアミノ酸５ ９７位、および７５１アミノ酸の配列のアミノ酸６５３位から始まる。

用語「プレアミロイド凝集体」、「プレアミロイド形成」、あるいは、「プレア ミロイド沈澱物」は、アルツハイマー病患者の脳に高頻度に見いだされるプレプ ラーク、およびプラークよりもかなり小さな、球形の顆粒様沈着物を、形態学的 に記述したものであり、Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉら、（１９８８）　Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ　Ｌｅｔｔ　９３：１９１−１９６によって初めて発見された。

本明細書で用いている用語「挿入ベクター」は、ウィルスゲノムへの同植組み換 えを媒介し得る、プラスミド、コスミド、あるいはファージを包含しており、β −アミロイドタンパク質をコードするＤＮＡは、その結果得られる組み換えウィ ルスによって安定に保持される。本発明の一つの実施態様では、ワクシニアウィ ルスＤＮＡから構築されるプラスミドを用いる。

用語「発現ベクター」は、該ベクターが有する、それぞれの組み換え遺伝子によ ってコードされるタンパク質を合成し得る、プラスミド、コスミド、あるいはフ ァージを包含する。

このようなベクターは、アミロイドタンパク質発現に適当な宿主細胞の染色体に 、個別に複製されるか、あるいは組み込まれ得る。

外来性の、あるいは異種性のＤＮＡが細胞の内に導入されると、細胞は「形質転 換」される。形質転換をするＤＮＡは、細胞のゲノムを産生ずる染色体ＤＮＡの 中に組み込まれ得るかぐ共有結合されて）、あるいは組み込まれ得ない。例えば 、原核生物、酵母、および哺乳類細胞では、形質転換をするＤＮＡは、プラスミ ドのようなエピゾーム要素に維持され得る。形質転換をするＤＮＡを含む娘細胞 群を含有する細胞株あるいはクローンを確立し得ると、その細胞は安定に形質転 換される。「クローン」とは、有糸分裂による一個の細胞あるいは共通の祖先由 来の細胞群のことである。「細胞株」とは、代々、インビトロで安定に培養し得 る細胞のクローンのことである。

Ａ、−アミロイドのコード　ダ［ β−アミロイド遺伝子は、合成物か、天然物か、あるいはそれらの組ろ合わせで ある。天然の７５１アミノ酸の前駆体タンパク質をコードする遺伝子は、１９８ ８年６月２日に公開されたＰＣＴＷ０８８１０３９５１に記載されており、本出 願と同じ譲渡人に譲渡されている。哺乳類細胞でのタンパク質の発現は、本明細 書の実施例４に提供されている。公開された部分と相関する部分は、特に参考と して本明細書中に記載されている。

この遺伝子は、Ａ４２フアタンパク質、あるいはＡ４２コアタンパク質および細 胞質ドメインを含有するアミロイドタンパク質であるＡ９９をコードする。後者 のタンパク質は、７５１前駆体タンパク質の、４２残基のコアタンパク質および 細胞質ドメインの５７アミノ酸を含有する。Ａ９９の配列は、次のとおりである ＡＳＰ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　ＧｉｎＬｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｐ ｈｅ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＧＬｙ　！９ｅｒ　Ａｔｎ　 Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ１Ｌｅ　ＩＩｓ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ％！ａｌ　Ｇ ｌｙ　Ｇｌｙ　ＶａＬ　Ｖａｌ　ｒｌｅ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＩｌｅＶａ ｌ　ＩＩｓ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＩｌｅＨｉｓ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ 　Ｇｌｕ　ＧｌｕＡｒｑ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　 Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＴｙｒ　Ｌ ｙｓ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ。

これらの遺伝子は、組み換えＤＮＡ発現ベクターにより、所望のタンパク質の発 現に提供される。

上述したように、これらの遺伝子は天然物か、合成物か、あるいはそれらの組み 合わせである。合成ヌクレオチド配列を調製するときは、天然のアミロイド核酸 配列を改変することが望ましい。例えば、所望の宿主に選択的に２職されるコド ンの使用がしばしば好まれる。ある場合に″は、合成、あるいは天然のヌクレオ チド配列を更に換えることが望ましい。

例えば、都合のよい発現ベクターの中に遺伝子配列の挿入を促進するような、あ るいは、得られるポリペプチドの１個あるいはそれ以上のアミノ酸を、安定性を 増すためにに置換するような、制限部位を作るか、あるいは除去するなどして変 える。部位特異的な変異を生成する一般的な方法は、Ｎｏｒｅｎら、（１９８９ ）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４：１８２−１８８に記載されている。

この前駆体タンパク質のペプチド、例えば、Ａ４コアタンパク質由来のペプチド はまた、本明細書中では、特異的免疫試薬の産生に提供されており、合成物、あ るいは天然物である。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｅｄｇｅら、（１９８１）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２ ニア５６、およびＤｕｃｋｗｏｒｔｈら、（１９８１）　Ｎｕｃ　Ａｃｊｄｓ　 Ｒｅｓ　９：１６９１に記載されているホスホトリエステル法か、あるいはＢｅ ａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、（１９８１）　Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔ　２ ２：１８５９、およびＭａｔｔｅｕｃｃｔおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、（１９８ １）　Ｊ　Ａｍ　ＣｈｅｌＩＳａｃ　１０３：３１８５に記載されているホスホ ロアミダイト法によって調製される。そして、市販の自動オリゴヌクレオチド合 成装置を用いて、調製され得る。

Ｂ、’７クンニアウイルスのベクター アミロイドタンパク質のコード配列は、Ｍｏ５ｓら、　（１９ｇ３）しｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅ　Ａｌｌｌ１ｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｖｏｌ、３．　Ｅｌｓｅ ｖｉｅｒ−Ｎｏｒｔｈ　Ｈ。

１１ａｎｄ、　ｐ、　２０２−２１３：　およびＭｏ５ｓら、（１９８４）　Ｊ 　Ｖｉｒｏｌ　４９：８５７−８６４に記載されている方法を用いて、組み換え ワクシニアウィルスを産生ずる目的で、ワクシニアウィルスのプラスミド挿入ベ クターの中に挿入し得る。次に、このアミロイド−ワクシニア組み換え体を、（ １）各アミロイド抗体ノ＜り質の発現、およびブレアミＯイド形成の分析、およ び（２）アミロイド抗体の産生に用い得る。

二つのワクシニアウィルスの挿入ベクターであるｐＳＣｌｌ　（Ｃｈａｋｒａｂ ａｒｔｉら、（１９８５）　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　５：３４０３−３４ ０９、およびｐＵ■１（Ｆａｌｋｎｅｒら、（１９８７）　ｉｕｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ　１５ニア１９２）を、アミロイドタンパク質の発現、およびアミロイ ド−ワクシニア組み換え体の産生に用いた。両方のベクターは、共通挿入性を有 し、それぞれ、二個のワクシニアウィルスプロモーターを含んでいる。−個のプ ロモーター（Ｐｌ）は、選択マーカー遺伝子の発現を誘導するのに用い（この場 合、β−ガラクトシダーゼ）、もう−個のプロモーター（Ｐ２）は、異種アミロ イドＤＮＡ挿入物の発現を誘導するのに用いる。両方とも、ワクシニアウィルス ＤＮＡが両側に隣接している（中断チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子）が、この ことは、野生型のワクシニアウィルスゲノムの同種組み換えを促進し、選択メカ ニズム（ｔｋ−（マイナス）ウィルスの産生）を提供する。ｐｓｃ１１ベクター は、ワクンニア初期−後期プロモーター（Ｐ７．５）を用いて、異種遺伝子の発 現を誘導し、そして１個のＳｍａｌクローニング部位を有スル。ｐＵＶ１ベクタ ーは、ワクシニア後期プロモーター（Ｐｌ、ｌ）を用いて、異種遺伝子発現を誘 導し、そしてｐＨ後期遺伝子のＡＴＧの後に、融合タンパク質が発現するように 設計されている。

全ての場合において、アミロイド−ｐＵ’／１構築物は、本来のアミロイドタン パク質配列の中にさらにアミノ末端アミノ酸が導入されることを防ぐために、大 部分５’　（ＡＴＧの後ろ）側のクローニング部位（ＥｃｏＲＩ）を用いて作ら れた。

Ｃ２組み　え発　ベクターおよび　主 原核細胞および真核細胞の系が両方とも、本明細書中に記載しているアミロイド 遺伝子を発現するのに用いられることは、当業者に理解される。原核細胞は、し ばしば、種々のＬ」立■の菌株で示されている；しかしながら、他の微生物の菌 株もまた用い得る。宿主と適合する種由来の、複製部位、選択マーカー、および 制御配列を含有するプラスミドベクターを用いる；例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉは典 型的に、Ｂｏｌｉｖａｒら、　（１９７７）Ｇｅｎｅ　２：９５によるＥ、　ｃ ｏｌｉ種由来のプラスミドｐＢＲ３２２の誘導体により形質転換される。ｐＢＲ ３２２は、アンピシリンおよびテトラサイタリン耐性遺伝子を含んでいるため、 所望のベクターを構築する際に、保持、あるいは破壊し得る多数の選択マーカー を提供する。リボゾーム結合部位の配列に加えて、必要に応してオペレーターと ともに、転写開始プロモーターを含有することが本明細書に明記されている、通 常用いられる原核細胞の制御配列には、β−ラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）お よびラクト−７、（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、（１９７７）Ｎａ ｔｕｒｅ　１９８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇ ｏｅｄｄｅ　ｌら、（１９８０）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　８： ４０５７）　、λ−由来ＰＬプロモーター（５１１ｉｚａｔａｋｅら、（１９８ １）　Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１２８）　、およびＮ遺伝子リボゾーム結合部位 、およびｔｒｐ−１ａｃ　（ｔｒｃ）プロモーター系（ＡｍａｎｎおよびＢｒｏ ｓｉｕｓ、（１９８５）　Ｇｅｎｅ　４０：１８３）のような、通常用いられる プロモーターが含まれる。

バクテリアに加えて、酵母のような真撲微生物もまた、宿主として用い得る。多 くの他の菌株、あるいは種が通常入手されるが、Ｓａｃｅｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、パン酵母の実験菌株が、最もよく用いられる。用いるベ クターとしては、例えば、Ｂｒｏａｃｈ、　（１９８３）　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　 １０１：３０７の２ミクロン複製間点、あるいは他の酵母の適合複製起点（Ｓｔ ｉｎｃｈｃｏｍｂら、（１９７９）　Ｎａｔｕｒｅ　２８２：３９；　Ｔｓｅｈ ｕｍｐｅｒら、（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１０：１５７　ａｎｄ　Ｃ１ａｒｋｅ ら、（１９８３）　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　ｌｏｔ：３００参照）が用いられ得る。

酵母ベクターの制御配列には、糖分解酵素の合成に対するプロモーターを含有す る（ｔ（ｅｓｓら、（１９６８）　Ｊ　Ａｄｖ　Ｅｎｚ　ｍｅ　Ｒｅ　７：１４ ９ＨＨｏｌ　１ａｎｄら、（１９７ｇ）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　１７：４９ ００）　ｏ　当該分野では周知の、イ也のプロモーターには、３−ホスホグソセ レート牛ナーゼに対するプロモーターが含まれる（Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎら、（１ ９８０）　Ｊ背景により、転写が制御されるという利点を更に有する他のプロモ ーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ５酸ホスフア ターゼ、窒素代謝に関連した変性酵素、α因子系、マルトースおよびガラクトー スを利用する酵素に対するプロモーター領域がある。さらにターミネータ−配列 は、コード配列の３°末端にあるのが望ましいと考えらる。このようなターミネ ータ−は、酵母由来の″遺伝子中では、コード配列の後の３゛非翻訳領域で見い だされた。

もちろん、多細胞生物由来の真核宿主細胞培養において、ポリペプチドをコード する遺伝子を発現することも可能である。例えば、Ａｘｅｌら、米国特許第４． ３９９．２１６号を参照のこと。

これらの系では、イントロンを切り出し得るという更なる利点を有しており、従 って、直接ゲノムフラグメントを発現するのに用い得る。有用な宿主細胞株には ｌ／ＥＲＯＳＨｅＬａ、仔ノ＼ムスターの腎臓＜ＢＨＫ）　、ＣＶ−Ｌ　ＣＯＳ ＳＣ０５Ｓ、　ＮＩＨ３Ｔ３、Ｌ、オヨびチャイニーズハムスター卵巣（Ｃ１（ Ｏ）細胞が含まれる。このような細胞の発現ベクターは通常、哺乳類細胞と適合 するプロモーターおよび制御配列を含有している。例えば、シミアンウィルス４ ０　（ＳＶ４０）由来の、通常用いられる、初期および後期プロモーター（Ｆｉ ｅｒｓら、＜１９７８）　Ｎａｔｕｒｅ　２７３：１１３）　、あるいは、ポリ オーマ、ヘルペスウィルス、アデノウィルス２、ラン乳頭腫ウィルス、あるいは 鳥類肉腫ウィルスのような、他のウィルスプロモーターである。制御プロモータ ーである、ｈＭＴｌｌ　（Ｋａｒｉｎら、（１９Ｂ？）　Ｎａｔｕｒｅ　２９９ ニア９７−８０２）もまた用い得る。哺乳類細胞宿主系の概要は、Ａｘｅｌ、上 記に記載されている。

昆虫の発現系もまた、アミロイド遺伝子を発現するのに用い得る。たとえば、バ キュロウィルスポリヘトリン遺伝子は、高レベルの異種タンパク質の発現に用い られる（Ｓｍｉｔｈら、（１９８３）　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ旧ｏ１３（１２）＋２ １５６−２１６５＋　Ｓｕｍｍｅｒｓら、−ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　狂孟肛且ｎＣａ１ｉｆｏｒ ｎｉｃａ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ”、　Ｂａ ｎｂｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ＋　Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ａｌｔｅｒｅｄ　Ｖｉ ｒｕｓｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、　２２：３１９−３３９ ゜Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８５ ）　。

Ｄ、な　伝　太細　の　生 ワクシニアで発現されるアミロイドＤＮＡクローンはまた、アミロイドタンパク 質を発現する安定な遺伝子導入細胞株を産生ずるのに用い得る。一般に、これら の細胞株は、二個の発現プラスミドのうちの一個を最初に構築することにより産 生される。発現プラスミドは両方とも、その選択マーカーは、Ｓ’／４０初期プ ロモーター、それ自身のプロモーターも含む細菌のカナマイシン耐性遺伝子、Ｓ Ｖ４０介入配列、および初期領域からのＳＶ４０ポリアデニル化部位からなるＧ ４１８ネオマイシン発現カセット（ｎｅｏ）によって提供される。篤−の発現プ ラスミドでは、アミＯイドＤＮＡクローニング部位は、５°末端側に、ＳＶ４０ エンハンサ−で改変されたヒトメタロチオネイン遺伝子プロモーターであるｐＭ ｔ　Ｉ　ｌａに隣接し、および３°末端側に、初期領域からのＳＶ４０ポリアデ ニル化部位に隣接している。第二の発現構築では、アミロイドＤＮＡクローニン グ部位は、５°末端側に、β−アクチンプロモーターに隣接し、および３°末端 側に、ＳＶ４０の初期領域あるいはβ−アクチン遺伝子のような、有用なポリア デニル化部位をコードする配列に隣接している。

上述した各ベクターは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法、あるいはエレクトロ ポレーションによって、限定されないが、次の実施例で記載しているような、哺 乳類細胞株の中に形質転換し得る。１日後、細胞はｌｏｇ／ｍｌのＧ４１８を受 けて、Ｇ４１８１Ｔｒｌ性コロニ一群を提供する。成功した形質転換体はまた、 発現構築物の中に安定なりＮＡの遺伝を有しており、次に、低密度でプレートシ 、クローン単離物を精製する。次に、アミロイドタンパク質を最大に産生ずるク ローン単離物を分析し、高産生クローンを増殖して、ストック用に供給する。

Ｅ、プレアミロイドニ　の　法 アミロイド症の診断は、コンゴレッド染色による組繊標本の複屈折による特徴的 なエメラルドーグリーン発色を示すことで確立されており、偏光副微鏡検査で検 査される。コンゴレッド染色は、一般的に市販の診断キットにより行われる。

Ａ４タンパク質の単離および特徴付けによって、アルツハイマー病における大脳 アミロイドを認識する特異抗体の増加が認められた（Ａｌｌｓｏｐら、（１９８ ６）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔｔ　６８：２５２−２５５）。

更に、Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉら、　（１９８Ｂ＞上記は、アルツハイマーの患者 および、少数ではあるが正常なヒトの両方で、プレアミロイド沈着物を検出する 抗体が産生され得ることを証明した。この沈着物は、アミロイドの染色性および 光学的性質を欠いており、そのため、主としてコンゴレッドを用いる通常の染色 法でも、またチオフラビンＳあるいは銀塩を用いる染色方法でも検出されない。

標準のプロトコールは、本発明のアミロイドタンパク質に特異的な抗体を調製す るのに用い得る。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を調製す る技術は、当該分野では周知のものである。要するに、ポリクローナル抗体ヲ、 ウサギあるいはマウスのような動物に、アミロイドタンパク質、あるいは合成ア ミロイドペプチドを、アジュバントと一緒に注入して調製する。このアミロイド タンパク質は、カルボジイミド、ゲルタールアルデヒド、あるいは他の架橋剤を 用いる化学的方法により、ウシ血清アルブミン、あるいはキーホールリンベット ヘモシアニンのようなキャリアータンパク質に結合させる必要がある。あるいは 、キャリアータンパク質に結合されないタンパク質も投与し得る。アミロイドタ ンパク質を発現するワクシニアウィルス組み換え体もまた、抗体を調製するのに 用い得る。このワクシニアウィルス組み換え体を動物に注入し、最初の免疫後、 数週間動物に追加免疫する。１０日から２週間後、動物を死亡させ、抗面清を採 取して、力価を測定する。

モノクローナル抗体を、通常、適当な条件下で、ポリクローナル抗体を作る動物 の８９７８球を、永久増殖能をもつミエローマ細胞株と融合させて調製する。こ の８９７８球は、肺臓細胞、あるいは末檎血液リンパ球であり得る。融合技術も また、当該分野では周知であり、一般に、ポリエチレングリコールのような融合 剤とともに細胞を混合する。成功したハイブリドーマの形成を、例えば、ＨＡＴ 培地のような標準方法で評価し、選択する。成功したハイブリドーマの中から、 所望の抗体を分泌するハイブリドーマを、それが存在する培養培地を測定するこ とにより、スクリーニングする。

当該分野では周知である、ＥＬＩＳＡ　（酵素結合免疫測定法）、Ｒ［Ａ（放射 性免疫測定法）、ＩＦＡ（蛍光免疫測定法）およびウェスタンプロット分析のよ うな、標準的な免疫技術が、アミロイド発現をスクリーニングする診断に用い得 る。現在、基本測定原理を種々改変した、多（の文献が存在する。これは、標的 の分析物と抗体との間の特異的な結合を単純化したもので、この結合は、定性的 および／あるいは定量的に検出し得る。一般的に、蛍光ラベル、酵素ラベル、あ るいは放射性ラベルが用いられる。

典型的な一つの例としては、ラベルされた抗原（たとえば、アミロイドタンパク 質）と分析物との間の抗体に対する競合を利用して、結合フラクションと非結合 フラクションを物理的に分離させる。分析物はラベル抗原の結合と競合するため 、大量の分析物が存在すると、より多くのラベルが非結合のフラクションに残る 。この競合−結合型のアッセイでは、サンプルを、既知の力価をもつラベルした アミロイドタンパク質とアミロイドタンパク質抗体とを一緒にインキュベートす る。

次に、抗体−タンパク質複合体を、周知の技術により、結合されていない試薬か ら分離する。複合体のラベルの量を、例えば、放射性免疫測定法ではγ線を測定 することにより、あるいは酵素免疫測定法では吸光度計により測定する。もしあ るなら、サンプル中のアミロイドタンパク質の量を、測定されるラベルの量を標 準曲線と比較して測定する。

この基本原理の他の実施態様には、ラベル抗体それ自身の使用、分析物、抗分析 物抗体、および抗抗体の間の３つの複合体くこのうちの一つがラベルを含んでい る）を含冑するサンドイッチアッセイおよび免疫吸着剤による結合アラクシ３ン と非結合フラクションの分離が含まれる。巨に見える沈澱物を生じる凝集アッセ イもまた用いられる（　Ｌｉｍｅｔら、　（１９８２）本測定法は、プレアミロ イドの皮質沈着物が生物の痴呆を誘導するかどうかという疑問に答える、最初の 工程の一つを提供する。プレアミロイド沈着物と老人性斑が、続いて出現するこ とから、プレアミロイド沈着物が老人性斑へ発展し得ることを示唆している。

ダウン症候群はＡＤの病因と密接に関係している、周知の疾病の一つである。２ ０世紀以降、ダウン症候群の患者には、ＮＦＴｓ、コンゴ親和性（ｃｏｎｇｏｐ ｈｉｌｉｃ）脈管障害、および老人性斑などの、アルツハイマーと同じ範囲の変 化が見られる。Ｇｉａｃｔｏｎｅら、（１９８９）　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ　Ｌｅｔ ｔｓ　９７：２３２−２３８が報告しているように、プレアミロイド沈着物と老 人性斑の分布の、時間との相関性を調べた分析では、ダウン症候群患者の細胞外 プレアミロイド沈着物と老人性斑との間には、年齢依存性の、逆の相関関係があ ることがわかった。アルツハイマー病患者ニよる、同様の、時間依存性の研究は 実施し得ないが、対応するパターン（プレアミロイドが老人性速比着物になる） が見いだされることが予想される。この過程を妨げる治療薬剤は、アルツハイマ ー病に対する有効な療法の発展を約束するものである。

本発明の方法の実施では、アミロイドタンパク質の発現は、細胞培養およびアミ ロイドタンパク質の発現に適する条件下で、形質転換された細胞株を培養するこ とから始まる。この方法では、高レベルのタンパク質の発現が好まれる。本発明 の一つの実施態様では、Ａ４２あるいはＡ９９アミロイドタンパクｉ１［コード するＤＮＡを含有するβ−アクチンベクターテ形質転換されるＣＨＯ細胞株を、 例えば、３７°Ｃで５−７２時間、１０％仔ウシ血清を添加した、Ｆ１２培地と ＤＭＥ培地の１．１混合物のような哺乳類培養培地で培養する。遺伝子導入され たウィルスの単層を、選択し、斑を精製し、アミロイド−ワクシニア組み換えウ ィルス群を調製する。

プレアミロイド凝集体の形成は、例えば、二次的にラベルした抗抗体により検出 されるβ−アミロイド−次抗体のような、標準の免疫細胞化学的方法によりモニ ターし得る。もしも、対象化合物が、プレアミロイドの形成を阻害し得るかどう か試験することに関心がある場合は、プレアミロイド凝集体をモニターする前に 、その化合物を培養培地に導入する。あるいは、プレアミロイドの形成が確立さ れた後、培養培地にその化合物を導入し、この反応混合物をモニターして、その 化合物がプレアミロイド吸収を誘導するかどうか調べる。

本発明で用いられる、開発中の治療化合物としては、例えば、ジメチルスルホキ サイドのようなアミロイド−原線維変性剤、およびコルヒチンやクロラムブシル のような細胞毒性薬剤が含まれる。これらの薬剤の効力を、アミロイド沈着物に 結合する抗体の減少を観察することによりモニターし得る。

このような結合の減少は、プレアミロイド沈着物の減少を示唆するものである。

あるいは、宿主細胞におけるプレアミロイドの形成は、他の細胞現象を誘発し得 、アルツハイマー病の病因とは無関係であるが、プレアミロイド沈着物の出現と は相関性のあるマーカーとして用い得る。例えば、特異的なプロテアーゼのよう な、ある種の酵素レベルの上昇は、プレアミロイド沈着物の代わりに測定し得る 。これらの酵素濃度レベルは、培養細胞がストレスを受けると、典型的に増、加 する。

本発明はまた、上述した診断あるいはスクリーニング方法に適するキットを包含 する。これらのキットは適当な試薬を含んでおり、池の試薬（例えば、洗浄液、 酵素基質、抗アミロイド抗体）と−緒に、適当な容器の中にラベル抗体のついた 固相支持体で固定されたプレアミロイドタンパク質凝集体を含有する適当な材料 、あるいは本４り定の実施に必要な他の材料か包装されている。通常、簡便化の ために、試薬を前もって測定する。キットのオプション成分としては、有効な免 疫測定方法を記載している使用説明書がある。直接測定法用キットには、例えば 、固相免疫測定支持体で固定されたプレアミロイドタンパク質凝集体、およびア ミロイドタンパク質に対するラベル抗体を含有する容器、および上述した池の試 薬が含有され得る。

次の実施例は、本発明の教示を解明するように設計されており、本発明の範囲を 制限するものではない。細胞の形質転換、ベクターの構築、イムノア、セイの実 施、などに用いられる多（の技術は、広く当該分野で行われており、はとんどの 開業医には、特定の条件および操作を記載している標準的な供給材料には馴染み がある。本実施例は、そのような知識の所見を記載しており、当該分野で周知の 方法は、参考として記載されている。

実施例１ アミロイド　コアＤＮＡ　に凭　るｇ　ホ以下の実施例は、４２アミノ酸斑コア 領域（Ａ４Ｚ）　、およびβ−アミコイド前駆体タンパク質（Ａ９９）の５７ア ミノ酸に隣接したカルホキ／末端領域を含有している４２アミノ酸斑コア領域（ Ａ４２）を含む発現ベクターを記述したものである。Ａ４２およびＡ９９構築物 の別の構築物が調製され、これには、１７アミノ酸アミロイドシグナル配列が含 有されている。これらの構築物はアミロイドタンパク質を十分発現しなかったの で、これらのベクターを用いた更なる実験は実施しなかった。

二つのアミロイド構築物（ＶＶ：Ａ４２およびＶＶ：Ａ９９）をそれぞれコード するアミロイドＤＮＡを蕾する組み換えワク／ニアウィルスは、Ｍａｃｋｅｔｔ およびＳｍ１ｔｈの（１９８６）　Ｊ　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ　６７：２０６７− ２０８２、本明細書では参考として援用する、で総説されている標準方法で作成 した。図１は、種々のアミロイド発現構築物を示している。これらは全て、ｐＵ Ｖｌベクター中にワクシニアｐＨプロモーターをクローニング条件を満足させる ために、５°末端を改変した。それぞれの構築物の特性は次のとおりである； Ａ、ＶＶ：Ａ４２： Ａ４２−コード配列（ヌクレオチド２０８０から２２０５．７５１アミロイド前 駆体の配列に従い番号を付けた）は、次に示す１４５塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲ ｌ−一旧オリゴマーとして合成された適当なＴＧＡストップコドン、およびアミ ノ末端にＡｓｎ−５ｅｒアダプタ一配列を含有する： （以下余白） ５　′ＡＡＴ　ＴＣＣＧＡＴ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＴＴＣＣＧＡ　ＣＡＴ　ＧＡＣ ＴＣＡＧＧＡ　ＴＡＴ　ＧＡＡ　ＧＴＴ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　ＣＡＡ　ＡＡＡ　Ｔ ＴＧ　ＧＴＧＴＴＣＴＴＴ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＧ　ＧＧＴ　ＴＣＡ 　ＡＡＣＡＡＡＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＴＣＡＴＴ　ＧＧＡ　ＣＴＣＡＴＣＧＴＧ　 ＧＧＣＧＧＴＧＴＴ　ＧＴＣＡＴＡ　ＧＣＧ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＧＡ 　Ｇ　３’この合成フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したｐ Ｇｅｍｌ　（Ｐｒｏｍｅｇａ−Ｂｉｏｔｅｃ）に結合し、ｐＧｅｍＡ４２を得た 。続いて、ｐＧｅｍＡ４２のＥｃｏＲｌ−Ｂａｎ旧フラグメントを単離し、ｐｕ ｖｌの陰旦ＲＩ−担旧部位に結合し、ｐＵＶｌ：Ａ４２を得た。

ｐＵＶｌ：Ａ４２　（２８７ｂｐ）のムＩ−工１フラグメントを更に、配列の確 認、のために、ｍｐ１８の中にサブクローニングした。

Ｂ、ＶＶ：Ａ９９ り（ＩＶＩ−Ａ９９構築物用のアミロイドタンパク質をコードするＤＮＡは、７ ５１アミノ酸前駆体タンパク質をフードするプラスミド４７４Ｂに由来する。プ ラスミド４Ｔ４Ｂの構築は、同じ譲渡人が所有しているＰＣＴ／ＵＳ８７１０２ ９５３の実施例３に記載されている。この公表（公報）の関連する部分を、本明 細書中に、参考として組み入れる。プラスミド４Ｔ４Ｂの５９０　ｂｐのＤｄｅ ｌ−Ｐｖｕｌｌフラグメントを、４Ｔ４Ｂのカルボキン末端の１キロヘース（ｋ ｂ）のＥｃｏＲＩフラグメントから単離し、２７　ｂｐのＥｃｏＲｌ　−Ｄｄｅ 　ｌアミノ酸配列に結合し、ＥｃｏＲｌおよび社旦１消化したｐＵ’／１にクロ ーニングし、ｐｌＪＶｌ：Ａ９９を得た。

ｐＵＶｌ：Ａ９９の７６１　ｂｐの迦１−錘ユＩフラグメントを更に、ｍｐ１８ およびｐＧｅｍ２のＸｂａｌ−Ｓａｉｌベクターフラグメントにサブクローニン グした。配列データにより、予想配列が確認できた。

実施例２ アミロイドタンパク　の発現 実施例１に記載したワクンニア挿入ベクターを、次に示すように、アミロイドー ワクソニア組み換えウィルスを作成するのに用いた； Ａ、アミロイドーワクンニアウイルス組み　え　の−１６０ｍｍディツシュ中の コンフルーエンッに達したＣ１／−１細胞のモルイヤーに細胞当り、０．０５ｐ ｆｕの感染倍率（ｍｏｉ）で、ワクシニアウィルス（Ｗｙｅｔｈ株）を感染させ た。感染後０．５時間に、細胞を１０　ｕｇの挿入プラスミドＤＮＡ、および０ ．５ｕｇの野生型ワク／ニアウィルスＤＮＡをリン酸カルシウムで沈澱させたも のに感染させた。細胞を、完全培地で培養し、３７°Ｃで２日間インキュベート した。モルイヤーを集めて、ＴＫ−ワクシニアウィルスを、２５αｇ／ｍ　１の ５−ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）　（ＢｕｄＲ）存在下、ＴＫ−１４３ 細胞上で選択した。感染後４８時間に、モルイヤーを、３００　ｕｇ／ｌｌ１ｌ の５−ブロモ−４−りｏｏ−３−インドイル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ ｇａｌ）を含む１％アガａ−スに重層した。４−６時間後に、青い斑を取り出し 、ＢｒｄＵおよびＸｇａｌの存在下で、さらに二回の斑精製で、更に精製した。

アミロイド−ワクシニア組み換えウィルスのストックを、ＴＫ−１４２あるいは ＣＶ−１細胞中で調製した。組み換えウィルスＤＮＡを、各ストックから調製し た。これらは、サザンブロノト分析により、適切なアミロイドＤＮＡ挿入を含む こと、および野生型あるいは自然発生型ＴＫ−ワク７ニアの雑菌混入がないこと が示された。

Ｂ、ワク／ニアウィルス組み　え体によって　生されたアミロイド　“的ポリペ プチドの己 ＣＶ−１で発現されたＶＶ：Ａ４２およびＶ’／：Ａ９９アミロイドタンパク質 の特徴付けは、アミロイド前駆体のカルボキシ末端領域に対する抗体を用いて、 ３５Ｓ−メチオニンでラベルした感染細胞タンパク賃を免疫沈降、およびポリア クリルアミドゲル分析により実施した。

β−アミロイド抗体を、合成ペプチドから産生じた。この合成ペプチドは、標準 のプロトコールに従って、固相合成法を用い調製した。粗ペプチドの精製は、ゲ ル濾過で脱塩し、次にイオン交換クロマトグラフィー、および調製用逆相液体ク ロマトグラフィーを行った。各ペプチドは、アミノ酸組成、および配列分析によ り、完全に特性付けた。Ｃ００Ｈ−ＣＯＲＥは、アミノ酸５５３−６８０　（Ｄ ＡＥＦｌ？）ＩＤｓＧＹＥＶＨ）ＩＱＫＬ’／ＦＦＡＥＤＶＧＳＳＡ）　ｉ：対 応する（カルボキン末端の二個のアミノ酸は、Ｍａｓｔｅｒｓら、（１，９８５ ）　旦ｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　３２：４２４５−４２４９のアミ ノ酸配列からとっているが、Ｐｏｎｔｅら、上記のＡ４　ｃＤＮＡからの推定翻 訳物とは異なる）。Ｃ００）［−８２、およびＣ００Ｈ−Ｃ３はアミノ酸７３６ −７５１　（ＮＧＹＥＮＰＴＹＫＦＦＥＱＭＱＮ）に、Ｃ００Ｈ−８３およびＣ ００Ｈ−Ｃ３はアミノ酸７０５〜７１９　（ＫＫＫＱＹＴＳＩＩ（）ｆＧｖｖＥ ｖ）　ニ対応し、そし７：　Ｃ００Ｈ−Ｃ５は７ミ／酸７２９−７４２　（）Ｉ ＬＳＫＭＱＱＮＧＹＥＮＰＴ）に対応する。Ａ４前駆体のペプチドの番号付およ びトボロノーは、ＰＯｎｔｅら、上記の参考文献を参照している。ニューシーラ ント自互ウサギを、キーホールリンベ、／トヘモンアニンに結合したペプチド５ ００　ｕｇで、皮内経路により、免疫した。このウサギを、４週間目に最初の採 血を行い、その１週間後に、２５０　ｕｇの結合ペプチドで追加免疫した。引き 続く採血は、３週間の間隔で、１週間後の追加免疫と共に行った。

全ての動物は所定のガイドラインに従って処置した。特定のペプチドに対する抗 体の力価を、西洋ワサビパーオキシダーゼを結合した酵素結合免疫吸着アッセイ で測定し、Ｃｏｏｌ（−ＣＯＲＥ、　Ｃｏｏｌ−Ｂ２、Ｃｏｏｌ（−Ｃ２、Ｃｏ ｏｌ（−Ｂ３、Ｃｏｏｌ（−Ｃ３、およびＣ００Ｈ−Ｃ５に対してそれぞれ、７ ．４　ｘ　１０’、２．７　Ｘ　１０”、ｌ　Ｘ　１０’、９，１ｘｌＯ８，８ ，２ｘ　１０５、および２．５　Ｘ　１０’であることがわかった。

９５２３１ｉ１一対スル抗体は、アミノ酸６７３−６８５　（ＡＥＤＶＧＳＫＮ ＧＡＩＩＧ）に対応し、９５２４１１１ｍ対する抗体は、アミノ酸７０１−７１ ２　（ＬＶＭＬＫＫＫＱＹＴＳＩ）に対応する。これら二つのペプチドに対する 抗体は、ニューシーラント白色ウサギ各々に、２００　ｕｇのメチル化シタウン 血清アルブミン（ＰＢＳ）、およびＰＢＳ中の２００　ｕｇの相当する合成ペプ チドを同時に注射して、産生させた。ウサギを一次接種後の１．２および３週間 目に同量のペプチドで追加免疫した。血清サンプルを、６週間目に採取し、ＡＰ ＣＰ合成ペプチドに対する力価を測定した。得られた力価は、９５２３では１． ５　Ｘ　１０４、および９５２４テｉｔ４　ｘ　１０５テあった。

Ｃ’／−１細胞を、１の感染割合でＶｌ／：９９に感染させた。感染後２０時間 に、３５Ｓ−メチオニン（２５０ｕｃｉ／＋ｒｌ）を、４時間、加えた。

細胞溶解物を調製し、１０７ｃｐＩ！ｌを含む部分を、アミロイド特異的抗血ｉ ｆｆ　（Ｃ００Ｈ−Ｂ３、Ｃ００Ｈ−Ｃ５およびＣ００Ｈ−ＣＯＲＥ）　、あル イハ正常ウサギ血清およびプロティンＡで免疫沈降させた。

３５Ｓ−メチオニン細胞溶解物の免疫沈降物を、変性２ｏ％５ＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲルで分析した。図２に示すように、ｖｖ：Ａ９９で産生されたＡ９９ タンパク質の高レベルの発現および安定性が証明された。コントロール血清（正 常な非免疫ウサギ血清）は、ＶＶ：Ａ９９タンパク質産物には反応性を示さなか った。

ＶＶ：Ａ９９アミロイドコアタンパク質は、約１１．５−１７　ｋｄの分子量に およぶ広いバンドとして移動した。更に、より高分子量型のＡ９９タンパク質が 、明かに観察された。

１／Ｖ：Ａ９９の発現産物は、９９アミノ酸コアタンパク質の高レベルでの発現 を示し、そして、Ａ９９の多量体は必ずしも１１．５−１７ｋｄの整数倍ではな いので、自己凝集、および他のタンパク質との凝集、あるいはタンパク分解と組 合された自己凝集の証拠を示した。

実施例３ Ａ４２およびＡ９９発　の染 二人のヒト、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ＃　ＨＴＢＩＯ）およびＩＭＲ−３２（ ＡＴＣＣ＃　ＣＣＬ１２７）　、および−匹のラット、ＰＣ−１２（Ｇｒｅｅｎ およびＴ１５ｃｈｌｅｒ、（１９７６）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅ ｔ　ＵＳＡ　７３：２４２４−２４２８）の神経細胞株を、ＶＶ：Ａ４２および ＶＶ：Ａ９９組み換えウィルスに対する有効な感染能力に関して調べた。全ての 細胞株は、既知力価のワクンニアウィルスの一定量（ｍｏｉ＝２）で細胞を感染 することにより、ワタソニアウィルスの複製を行う宿主であると記載されている 。この感染細胞を、感染後２０時間で回収し、凍結−融解により破壊し、そして 、力価を測定した。収率は投入したウィルス単位と比較し、その収率が２０−１ ００倍に増加すれば、宿主細胞はワクンニアの複製を行うとした。

これらの神経細胞株、およびＣ’／−１細胞株を、アミロイド染色実験に用いた 。各宿主用の培養培地は次のとおりである：ＣＶ−ｔ　：　培地は、１０％ＦＢ Ｓ、ベニ／リン、ストレプトマイシン、およびＬ−Ｇｉｎを補ったイーグルのＭ ＥＭである。

ＳＫ−Ｎ−ＭＣ：　１０％ＦＢＳ、非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマ イシン、およびＬ−Ｇｂ＋を補ったイーグルのＭＥＭｏ ＰＣ−１２：　ＤＭＥＭ２１．５％ＤＨ３，５％ＤＦＢＳ、およびＬ−Ｇｌｎ、 および ＩＭＲ−３２・　イーグルのＭＥＭ　（ハングのＢ５５）　、および１０％のδ ＦＢＳ、プラス非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシン、お よびＬ−Ｇｌｎ。

各細胞株は、４つの独立したチャンバーに分けられた顕微鏡スライド（Ｌａｂ　 Ｔｅｃｈ）でフンフルーエンノーまで培養シた。

第一のチャンバーはｍｏｃｋ感染させ、第二のチャンバーはＡ４配列を欠くコン トロールの組み換えウィルス（ＶＶ：Ｃ０ＮＴ）で感染させ、第三のチャンバー はＶ’／：Ａ９９で感染させ、第四のチャンバーはＶＶ：Ａ４２で感染させた。

各スライドは、単一単位として操作されるため、これは内部標準法である。

ウィルス感染は、細胞当り、５から２０のウィルス斑形成単位（ｐｆｕンのｍｏ ｉで行い、感染の約２０時間後に、染色のために回収した。免疫細胞化学染色用 に調製したスライドを、４％バラホルムアルデヒドで固定し、−次抗体、および ローダミン結合二次抗体（Ｃａｐｅｌ　Ｉ　Ｌａｂｓ）で処理する前に、０．２ ％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００で膜透過性とした。要するに、膜透過性とした後、 細胞を０，２％のゼラチンを含むＰＢＳで洗浄した。１ｏｏｕｌの一次アミロイ ド抗体（ＰＢＳプラス０．２％ゼラチンでｌ／２００に希釈する）を細胞と、３ ７℃で３０分間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳと０２％ゼラチン中で１ ０分間洗浄し、次にローダミンで標識した二次抗体（ヤギ抗ウサギ）の１／２０ ０希釈液（、ＰＢＳおよびゼラチンで）と共に、３７℃で２０分間インキュベー トした。細胞を、ＰＢＳとゼラチン中で１０分間洗浄し、可視化するために蛍光 顕微鏡にのせた。用いて成功した抗体には、９５２３．９５２４、Ｂ３、および Ｃ５が含まれる。コア抗体は評価しなかった。あるいは、スライドを４％バラホ ルムアルデヒドで固定し、次にチオフラビンＳ１　あるいはフンゴレノドで染色 し、市販キット（Ｓｉｇｍａ）の指示に従い、ヘマトキンシンで対比染色しした 。

ＩＭＲ−３２およびＰＣ−１２細胞には、い（つかの技術的困難があるため、こ れらの細胞株を用いた更なる研究は止めた。ＩＭＲ−３２細胞は、顕微鏡用スラ イドに十分付着しなかったが、これは、ラミニンによる前処理によって解決し得 た。更に、このＩＭＲ−３２細胞は、感染中の無血清条件に対する耐性がなかっ た。ＰＣ−１２細胞は、バックグラウンドが高い免疫染色を示し、実験サンプル とコントロールサンプルの差異が、大きくなかった。

図３は、コア領域抗体９５２３抗体のｌ／２ＱＯ希釈液で染色されたＣＶ−１細 胞の蛍光顕微鏡写真を示す。特異的で、はっきりした染色は、Ｖｌ／：Ａ９９お よびＶ’／：４２感染細胞のみに見られた。予想したように、ＶＶ：４２染色は せず、ｖｖ・９９特異的染色が、Ｂ３抗体で見られたが、これは、この領域が、 ＶＶ：Ａ４２構築物には含まれていないためである（結果は示していない）。お そらく、内因性のＡ４前駆体発現のために、かすかな斑点状の染色が、全細胞で 両方の抗体に対して観察された。ｌ／Ｖ：Ａ９９およびＶＶ：Ａ４２感染細胞は 、細胞に結合した大きな沈着様構造の形で、強い反応性を示した。この沈着様構 造物は、おそらく、ウィルスによる細胞変性による細胞残骸物ではない。なぜな らば、これはＶＶ：Ｃ０ＮＴ細胞では見られず、そして、これらの免疫反応性は 、この血清を作成するのに用いられる合成ペプチドで抗血清を予め吸着すると除 去し得るからである。

沈着物生成に対するアルミニウムの増強効果の可能性を、細胞を５０　ｍＭのＡ ｌＣｌ３と前処理して調べた。アルミニウムは、斑に存在するので、アミロイド 生成においては、病理学上、「コファクター」と考え得る。しかしながら、アル ミニウム処置培養物と未処置培養物の間で、沈着物生成の程度には、明かな質的 差異は見られなかった。

アルツハイマー病患者の脳中のＡ４コア領域の免疫学的反応性を研究している焼 入かの研究者たちが、図３に示されたのと類似の構造を記述していることは重要 と考えられる。各グループは、有意な量の、特異的に染色される球形の顆粒様沈 着物を見いだしたことを報告しており、これらは、プレプラーク、およびプラー クよりもかなり小さい（Ｄａｙ　ｉｅｓら、　（１９８８〉ム且匹上甚」シ：１ ５８８−１６９３：　１ｋｅｄａら、（１９８９）　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ　６ ０：１１３−１２２：　Ｔａｇｌｉａｖｉｎｉら、　＜１９８８）上記：　Ｔａ ｔｅ−Ｏｓｔｒｏｆｆら、　（１９８９）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓ ｃｉ　８６：７４５−７４９）　、研究グループはすべて、観察される小さな顆 粒様沈着物は、アミロイド斑の発展過程の非常に初期の段階のものであると、独 立して提唱している。われわれの細胞培養系で観察された構造は、アルツハイマ ー病の脳で見られたものと類似のものである。研究者たちは、この顆粒様沈着物 は、銀染色で、時として検出し得るが、コンゴレッドでは染色されないことを報 告した。アルツハイマーの顆粒様沈着物は、Ａ４抗血清との反応性は大きいが、 アミロイドの染色性を認識し得る染料とは容易に反応しないので、この構造物は 、「プレアミロイド」沈着物と命名された。

実施例４ な　の確１ β−アミロイドコアタンパク質を発現する多くの構築物を、ｐＨβＡＰｒ−１− ｎｅｏと呼ばれるβ〜ルアクチ発現／選択ベクターの誘導体を用いて構築した。

このベクターは、図４に示され、次のエレメントの組合わせである： ａ　）　ｂｐ　１−４３００は、ヒトβ−アクチン遺伝子単離物ｐ１４Ｔβ−１ ７からの４．３　ｋｂの鈷ユＲ１−酊ユＩフラグメントである（Ｌｅａｖｉｔｔ ら、（１９８４）　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｔ　４：１９６１−１９６９）。

プロモーターの配列決定の詳細は、ＮＥら、（１９８５）　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　 Ｂｉｏｌ　５：２７２０−２７３２を参照。ｃａｐ部位、５°非翻訳領域および ＩＶＳ　１位を、図４に示す。

Ｓ’ＵＴにも、あるいは、３′スプライシング部位からＢａｍ旧部位へのポリリ ンカー領域にも、ＡＴＧコドンは存在しない；ｂ）　ｂｐ　４３００−４３２０ は、部分的にｐｓＰ６４ポリリンカー（Ｍｅｍ。

ｎら、（１９８４）　Ｎｕｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ　１２＋７０３５−７０５６ ）由来である；ｃ　）　ｂｐ　４３２０−６６００　は、ｐｃＤＩ／１　（Ｏｋ ａｙａｍａおよびＢｅｒｇ、（１９８３）Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　３：２ ｉ１０−２８９）由来である；およびｄ　）　ｂｐ　６６００−１００００は、 ＳＶ４０の開始点プラス初期のプロモーターに結合した細菌ネオマイシン遺伝子 を含むｐｓｖ−ｎｅｏからの、Ｐｖｕｌ　Ｉ−ＥｃｏＲ１フラグメント（５ｏｕ ｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、　＜１９８２）Ｊ　Ｍｏｌ　Ａ　Ｇｅｎｅｔ　１： ３２７−３４１）である。転写の方向は、図４に示したとおりである。このベク ターは、ＥｃｏＲ１部位を削除し、新しいＥｃｏＲ１部位を、ポリリンカーのＳ ａｌ　１部位の３゛側、およびポリリンカーのＨｉｎｄｌ１１部位の５゛側に追 加して、変化させた。

この改変されたベクターを、ｐＡＸ−ｎｅｏと呼ぶ。β−アクチンＡ４２は、Ｉ ）ＧＥＭ−Ａ４２からヒュＲ１−Ｂａユ旧の１４５　ｂｐフラグメントを除去し 、虱Ｉ咀匹Ｒ１アダプター配列（５°−ＴＣＧ　ＡＣＡ　ＴＧＣＡＴＯＣＡＣＡ ＡＴ　ＴＡ−３’　）を追加し、そして１１および抛旧部位でｐＡＸ−ｎｅ。

発現ベクターにクローニングして構築した。β−アクチンＡ９９プラスミドは、 ｐＧＥＭ２−Ａ９９の６７０　ｂｐの鈷コＲ１−匡Ｉ１１フラグメントを除去し 、上述したＳａｌ　Ｉ−ＥｃｏＲ１アダプター配列を加え、そして５ａｉｌおよ びＨｉｎｄｌ１１部位でｐＡＸ−ｎｅｏベクターにクローニングして構築した。

１０６細胞につき、それぞれＤＮＡを７　ｕｇ用いるリン酸カルシウム沈澱法に よって、各構築物をＣＨＯ細胞の中に導入し、耐性群をＧ４１８−不才マイシン で選択した。Ａ９９およびＡ４２構築物に対する感染効率は、１０６細胞に対し て１０３以上であり、β−７クチンＡ９９あるいはβ−アクチンＡ４２のいづれ かで感染したプール細胞を、Ｇ４１８−ネオマイシン耐性（５００ｕｇ／ｍｌ） を用いて選択した。

これらのプールからの細胞溶解物を調製し、Ａ４タンパク質の免疫沈降、および ウェスタンプロットにより分析した。次に、高度発現クローンを選択し、実施例 ３に記載した免疫細胞染色法を用いて「プレアミロイド」沈着物を分析した。

実施例５ プレアミロイド沈着　の湧 アミロイド沈着物を生成し得る、■ｖ・９９あるいはＶＶ：４２感染細胞を、９ ６−ウェルマイクロタイタープレートに蒔いた。適切な希釈および添加を行うた め、自動ピペッタ−を用いて、被験薬剤を細胞に導入する。種々の濃度の薬剤を 、組織培養インキュベータ中の、定められた時間、あるいは３ないし７２時間、 細胞と共に３７℃で、インキュベートする（あるいは、プレインキユイベートす る）。

インキュベーション後、培養培地を除去し、プレアミロイド測定用に、次のよう に細胞を調製する。細胞を、アミロイド抗体を用いた免疫細胞化学染色用に固定 する。−次抗体を導入し、引き続いて、ラベルした二次抗抗体と共にインキュベ ートし、そして−次抗体と二次抗体との結合レベルを、ＥＬＩｓＡプレートリー ダーを用いて測定し、ラベル化抗体の吸光度を記録する。被験薬剤なしの状態で 培養されたコントロールサンプルの細胞と比較して、小さい吸光度は、その薬剤 がアミロイド沈着物を阻害する能力をもつことを示している。この方法は、相関 するマーカー酵素を用い、プレアミロイドの溶解を検出できるように改変し得る 。

本発明の領域、あるいは精神からはずれることなく、様々な改変および変化を本 発明の方法になし得ることは、当業者には明白である。このため、請求項は本発 明の改変および変化を包含すべ（意図されている。

ＦＩＧ、２ ＦＩＧ、３Ａ　ＦＩＧ、３Ｂ ’５’宕 国際調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．アルツハイマー病のアミロイド症に介入し得る薬剤をスクリーニングする方 法であって； ａ）不溶性のプレアミロイ凝集体として、β−アミロイドタンパク質を産生する のに適した条件下で、β−アミロイドタンパク質をコードする遺伝子を発現し得 る細胞株を培養する工程； ｂ）該被験薬剤の既知量を該細胞培養物に添加して組み合わせる工程；および ｃ）プレアミロイド凝集体の形成が減少するかどうか測定するために、該組み合 わせをモニターする工程；を包含する、方法。
2. ２．前記β−アミロイド遺伝子が、アミロイド斑コアドメインを含有するタンパ ク質をコードする、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記β−アミロイド遺伝子が、アミロイド斑コアドメイン、およびカルボキ シ末端ドメインを含有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記β−アミロイド遺伝子が、以下のポリペプチド【配列があります】 をコードする、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記プレアミロイドが、前記β−アミロイド遺伝子を含有する組み換えワク シニアウイルスに感染した、安定な細胞株に由来する、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記細胞株が、哺乳類宿主細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記被験薬剤がプレアミロイド斑の形成を阻害するかどうかを測定するため に、該被験薬剤を細胞培養の発育相に導入する、請求項１に記載の方法。
8. ８．プレアミロイド斑の形成を溶解するかどうかを測定するために、前記被験薬 剤を前記アミロイド凝集体に添加する、請求項１に記載の方法。
9. ９．プレアミロイド凝集体の形成を検出し得る、免疫試薬。
10. １０．モノクローナル抗体である、請求項９に記載の免疫試薬。
11. １１．ポリクローナル抗体である、請求項９に記載の免疫試薬。
12. １２．アルツハイマー病のアミロイド症において化学的に介入し得る化合物をス クリーニングするイムノアッセイキットであって； アルツハイマー病に特異的なプレアミロイド凝集体の予定量；および 該プレアミロイド凝集体に対するラベル化された抗体の予定量；を含有する、キ ット。
13. １３．請求項１２に記載のキットであって、前記ラベルが酵素反応の成分である 、キット。
14. １４．請求項１２に記載のキットであって、前記プレアミロイド凝集体が、固相 イムノアッセイ支持体に固定されている、キット。