JPH05502376A - セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １４、＠乳類細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。

１５、連続したヌクレオチドを一緒に連結および／またはオリゴ−および／また はポリ−ヌクレオチドを連結することからなる方法である請求項６．７または８ に記載のＤＮＡの調製方法。

１６、薬に使用するための請求項１から４のいずれかに記載のタンパク貫禄分子 。

１７．気腫、関節炎または敗血症性ショックの治療または予防のための薬の製造 における請求項１がら４のいずれかに記載のタン・バク質様化合物の使用。

１８、効果的で通常毒性のない量の請求項１から４のいずれかに記載のタンパク 質様化合物を患者に投与することからなる方法である気腫、関節炎または敗血症 性ショックの治療または予防方法。

１９、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様化合物およびこれに対し て薬学上使用できる担体からなる薬学上の処方箋。

２０、請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様化合物を特異的に結合す ることができる抗体。

明細書 セリンプロテアーゼ阻害活性を有するポリペプチドおよびこれをコードするＤＮ Ａ 本発明は、ポリペプチド、特にセリンプロテアーゼ阻害型の活性を有するポリペ プチド、これをコードしているＤＮＡおよびこの阻害剤を含む薬学上の調製物に 関するものである。

炎症過程中に特に好中球によって放出されるタンパク質分解酵素は、肺気腫や気 管支拡張症等の慢性の肺病に関する組織損傷において中心的な役割を果たしてい ると考えられている（ヤノフ　−１−−（ｊａｎｏｆｆ　Ａ）、（１９８５年） 、エム　レヴ　レスプ　ディス（Ａｍ　Ｒｅｖ　Ｒｅ５ｐ　Ｄｉｓ）　、１３２ 巻、ページ４１７）。はとんどの人々は、血液や肺組織にプロテアーゼの効果を 阻止する様々な阻害剤が含まれているので、炎症反応による組織の損傷を最小限 にしてかなり健康に過ごせる（ストックレイ　アール（Ｓｔａｃｋｌｅｙ　Ｒ） 、（１９８３年）、グリユ　サイ（Ｃ１ｉｎ　５ｃｉ）、６４巻、ページ１１９ ）。

Ｃ１−抗トリプシン（ＡＡＴ）は、血液中及び肺分泌物中に存在するセリンプロ テアーゼの主要な阻害剤である。

この主な物理的機能は、好中球のエラスターゼ、つまり慢性の肺病で起こる肺結 合組織の損傷部中に含まれる酵素から末端の気道を保護することである（カレル 　アールダブル（Ｃａｒｅｌｌ　ＲＷ）　、ジエプソン　ジエーオー（Ｊｅｐｐ ｓｓｏｎ　ＪＯ）、ラウレル　シービー化ａｕｒｅｌｌ　ＣＢ）ら、（１９８２ 年）、ネイチ’ｒ　（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８巻、ページ３２９）。

遺伝的にＡＡＴが欠損している人々は、喫煙している場合は特に、進行した初期 の成人肺気腫にかかりやすい（ラウレル　シービー化ａｕｒｅｌｌ　ＣＢ）、エ リクソン　ニス（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ　Ｓ）、（１９６３年）、スカンド　ジエー 　グリユ　ラボ　インベスト（Ｓｃａｎｄ　Ｊ　Ｃｌ１ｎ　Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓ ｔ）　、１５巻、ページ１３２）。他のセリンプロテアーゼ−阻害剤も多分タン パク質分解から肺を守る役割を果たしているにもかかわらず、これらは特徴に乏 しく、またはこれらの阻害剤の遺伝的異状が慢性の肺病に関してまだ公表されて いない。他の遺伝的因子は慢性の肺病の原因となっているらしい。潜在的に関連 して異常は関連タンパク質中にある。過去の報告によると、Ｃ１−抗トリプシン に対する抗体によって発見された免疫学的交差反応物質があり（グリユー　アー ルエッチ（にｌｅｗ　ＲＨ）　、ジディアン　ジェーエル（Ｚｉｄｉａｎ　ＪＬ ）、チャオ　ジエービー（Ｃｈｉａｏ　ＪＰ）ら、（１９８１年）、「エレクト ロフオレイシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　Ｊにおける、ウォルター 　デ　グルイタ−（Ｗａｌｔｅｒ　ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ）　、ページ５１１５ 、ミツトマン　シー（Ｍｉｔｔｍａｎ　Ｃ）　、ティーヴイービ−（Ｔｅｅｖｅ ｅ　Ｂ）、リーベルマン　ジエー（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ　Ｊ）、（１９７３年） 、ジエー　オック　メディ（Ｊ　Ｏｃｃ　Ｍｅｄ）、１５巻、ページ３３）、ま た３つの関連遺伝子がラットの肝臓ｃＤＮＡライブラリー中で発見された（クラ ウターケーエス（Ｋｒａｕｔｅｒ　ＫＳ）、シトロン　ビーニー（Ｃｔｔｒｏｎ 　ＢＡ）、フス　エムティ（Ｈｓｕ　ＭＴ）、（１９８６年）、ＤＮＡ、５巻、 ページ２９）ことから、他のセリンプロテアーゼ−阻害剤と推定されたものに特 徴が維持されていることが示された。

肺気腫か進行したすべての患者のうち５％未満が明らかにＡＡＴタンパク質の同 一と見なされる異状があり（ミツトマン　シー（Ｍｉｔｔｍａｎ　Ｃ）　、ティ ーヴイー　ビー（ＴｅｅｖｅｅＢ）、リーベルマン　ジエ−（Ｌｉｅｂｅｒｍａ ｎ　Ｊ）、（１９７３年）、ジェー　オック　メディ（ｊ　Ｏｃｃ　Ｍｅｄ）　 、１５巻、ページ３３）、喫煙者の約１０から２０％だけが特に肺気腫にかかり やすい（ニーフナ−ディイー（Ｎｉｅｗｈｏｎｅｒ　ＤＥ）、（１９８３年）、 「テキストブック　オブ　パルモナリー　デイジーゼス（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏ ｆ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ）Ｊにおいて、ページ９１５）。約 ２０％の肺気腫の患者に起こるＡＡＴ遺伝子の多形性が最近公表された（カルシ ェカー　エヌエ（Ｋａｌｓｈｅｋｅｒ　ＮＡ）、ホッジソン　アイジｓ−−（Ｈ ｏｄｇｓｏｎ　ＩＪ）、ワトキンス　ジーエル（Ｗａｔｋｉｎｓ　ＧＬ）ら、（ １９８６年）、エム　レヴ　レスプ　ディス（Ａｍ　Ｒｅｖ　Ｒｅ５ｐ　Ｄｉｓ ）　、１３３巻、ページＡ２１９）。この多形性は慢性の肺病の原因に含まれる 他の遺伝子候補に関連がある。ヒトにおいて２つの他の潜在的に重要な遺伝子が 染色体１４上のＡＡＴまでの１００キロ塩基対（Ｋｂ）以内にあることが現在知 られている。これらは、Ｃ１−抗キモトリプシン（Ａ　ＣＴ）（ラビン　エム（ Ｒａｂｉｎ　Ｍ）　、ワトソン　エム（Ｗａｔｓｏｎ　Ｍ）、キッド　ブイ（Ｋ ｉｄｄ　Ｖ）ら、（１９８６年）、ソマト　セルモル　ジエネト（Ｓｏｍａｔ　 Ｃｅｌ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ）　、１２巻、ベージ２０９）、および抗エラスタ ーゼ活性を持つセリンプロテアーゼ阻害剤をコードしている（プロフェッサー　 エスウー（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｓ、　Ｗｏｏ）、ベイラー　メディカル　スク ール、ヒユーストン、テキサス（Ｂａｙｌｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　５ｃｈｏｏｌ 。

Ｈｏｕｓｔｏｎ、　Ｔｅｘａｓ）による）ＡＡＴ遺伝子関連配列（ＡＳＲＧ）（ ライ　イー（Ｌａｉ　Ｅ）　、カオ　エフ（Ｋａｏ　Ｐ）　、ｏ　−エム（Ｌａ ｖ　Ｍ）ら、（１９８３年）、エム　ジエー　ヒニーム　ジエネット（Ａｍ　Ｊ 　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ）、３５巻、ベージ３８５）である。

ヒト肝臓ｃ　ＤＮＡ　ライブラリーからの様々なＡＡＴｃＤＮＡクローンの単離 はすでに報告されている（カルシェカー　エフ（Ｋａｌｓｈｅｋｅｒ　Ｎ）　、 チスウエル　デ（（Ｃｈｉｓｗｅｌｌ　Ｄ）、マークハム　ｘ　−（Ｍａｒｋｈ ａＩＥＩＡ）ら、（１９８５年）、アン　グリニ　バイケム（Ａｎｎ　Ｃ１１ｎ 　Ｂｉｏｃｈｅｍ）、２２巻、ベージ２５）。

構造及びＡＡＴの役割の理解が肺気腫の診断及び潜在的な管理において明らかに 主に重要であるにもかかわらす、ＡＡＴが完全な解答を提供していないことは明 らかである。

当業者が直面している問題は、さらにセリンプロテアーゼ阻害剤を同定すること であり、これによって当業者らが肺気腫等の症状への理解をさらに深められるよ うに研究することができる。

ＡＡＴおよびＡＣＴをコードしているＤＮＡと異なる重要なヌクレオチド配列を 有する核酸を単離し、クローニングした。この配列に相当するタンパク質を、適 当な宿主／ベクター機構を用いることによって作製し、セリンプロテアーゼ阻害 活性を測定した。したがって、新たなヒトセリンプロテアーゼ阻害剤を発見し、 調製した。

本発明の第一の概念によると、配糖化されていない分子量が３２ＫＤａ±Ｉ　Ｋ 　Ｄ　ａであるヒトセリンプロテアーゼ阻害剤を提供することである。

この分子量は、１つまたはそれ以上の以下のマーカータンパク質が以下に示す分 子量を有する条件下で、（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ ）によって）測定できる； α−ラクトアルブミン　１４．４ＫＤａダイズトリプシンインヒビター　２０． ＩＫＤａカルボニックアンヒドラーゼ　３０　ＫＤａオボアルブミン　４３　Ｋ Ｄａ ウシ　血清アルブミン　６７　ＫＤａ 以下に示すように、本発明の概念のセリンプロテアーゼ阻害剤の熱安定特性およ びｐＨ安定特性は、さらにＡＡＴとは区別される。

本発明は、第二の概念において、以下より選択されるタンパク貫禄分子を提供す ることである；（ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１に示されるアミノ酸配列または これとは実質的に異ならない配列を有する分子； ｂ）ａ）と実質的に同等な構造および生物学的活性を有するポリペプチド； Ｃ）実質的にこれらの生物学的活性を何するａ）またはｂ）の断片、誘導体およ び変異体。

３８番目のロイシン（Ｌ　ｅ　ｕ　ｓｓ）からの配列はＡＡＴの末端配列と一致 することから、この配列は活性にとって重要であることが分かる。一方、１〜３ ７残基はＡＡＴと本発明のタンパク質を区別する役割を果たす。

本発明の概念における断片のうち、これらの開始部位は分子内メチオニン残基部 位である。このようなポリペプチドは、Ｎ末端部位で異なる構造物のより短い配 列を持つという点でＡＡＴとは異なり、このことはアルファーヘリカル構造（ａ ｌρｈａ−ｈｅｌ　１ｃａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ）の欠損による三次構造より 信じられている。

したがって、本発明は、第三の概念において、以下より選択されるタンパク貫禄 分子を提供することである；（ａ）セリンプロテアーゼ阻害活性を有し、アミノ 末端がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の１から３７番目のアミノ酸配列またはこれとは 実質的に異ならない配列を有するポリペプチド： ｂ）ａ）と実質的に同等な構造および生物学的活性を有するポリペプチド； Ｃ）実質的にこれらの生物学的活性を有するａ）またはｂ）の断片、誘導体およ び変異体。

構造における幾つかの変化はもとの生物学的に活性化しているポリペプチドにお いて起こっていることは当業者によって理解されているが、このような構造上の 変化によって例えばセリンプロテアーゼ阻害のような生物学的な活性の利益が失 われる際には、本発明はこのような変化を本概念に含む。変化の一形態としては ５．１つまたはそれ以上のＮ末端アミノ酸残基の付加が挙げられる。

当業者によって理解されるように、幾つかの領域および幾つかの残基は他よりも 重要であるため、許容できるアミノ酸残基の変化を正確に制限することは難１− い。生物学的活性において重要な役割を果たす保存領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　 ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）は変化に対しより寛容でな（、本発明の他の概念は、１つ またはそれ以上の保護配列を有するまたはこの配列から構成されるポリペプチド を提供することである。

「保存（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）　Ｊとは、有益な他のタンパク質と実質的に相同 な配列を持つという意味である。相同度において正確な数の制限をつけることは できないが、２５％は重要であり、例えば、８０％またはそれ以上が多くの実施 態様において他の因子の中で、相同関係があるところによっては、かなり重要で あると考えられる。

本発明のポリペプチドの誘導体は、例えば、機能基では、アミノ基、ヒドロキシ ル基、メルカプト基またはカルボキシル基であり、例えば、それぞれ配糖化、ア シル化、アミダイト化、エステル化等で誘導されている。配糖化誘導体において 、オリゴ糖は、通常、アスパラギン、セリン、トレオニンおよび／またはリンノ に連結されている。アシル化誘導体は、特にもとの有機または無機酸、例えば、 酢酸、リン酸または硫酸によってアシル化され、アシル化は、たいてい、特にチ ロシンまたはセリンのそれぞれのＮ末端アミノ基またはヒドロキシ基で行われる 。エステルは、もとのアルコール、例えば、メタノールまたはエタノールのエス テルであることが好ましい。

配糖化は適当な残基上で行われる；アスパラギン残基は、特に三次構造の表層部 位にあるときには、特に配糖化に適している。ＡＡＴのもとの配糖化部位に相当 する部位での配糖化が好ましが、少なくとも配列の共通部位での配糖化である。

配糖化は生物学的活性に不可欠ではないと考えられる。

さらなる誘導体としては、塩、特に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カ ルシウムまたは亜鉛塩等のアルカリ金属及びアルカリ土類金属塩、またはアンモ ニアと形成されるアンモニウム塩またはトリエチルアミン等の低級アルカリアミ ン、２−ヒドロキシエチルアミン等のヒドロキシ−低級アルカリアミン等の適当 な有機アミンなどの、薬学上使用可能な塩である。

本発明のポリペプチドの変異体は、１つまたはそれ以上の他のアミノ酸に対して そのアミノ酸の−か所（黒変異体）または約１０か所までのそれ以上の変換に特 徴される。これは、異なるコドンに導入するＤＮＡレベルでの相当変異（ｃｏｒ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の結果である。天然のおよび合成 の変異体は、本発明の概念に含まれる。

さらに、使用できる変化としては、もとの構造物の形態、構造または活性に不適 当なくらい影響を及ぼさない限り、例えば、融合タンパク質、保存変異体（ｃｏ ｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ　ｍｕｔａｎｔｓ）、対立遺伝子変化、多形性、オリゴマ ーの形態等が挙げられる。

本発明によるタンパク貫禄分子は、調製若しくは天然であれば適当な方法で単離 することができる。半合成的調製はある条件下ではより適当ではあるが、合成は 通常天然の分子にとっても好ましい。さらに本発明の概念によると、上記のタン パク貫禄分子の調製方法、つまり連続したアミノ酸残基を一緒に連結および／ま たはオリゴ−および／またはポリペプチドを連結することからなる方法を提供す ることである。配糖化または他の修飾も必要であれば適当な段階で行うことがで きる。

本発明によるタンパク貫禄分子は、アミノ酸残基の数が大きすぎなければ、化学 合成によって調製することができるが、ＲＮＡの翻訳によって調製することが望 ましい。ｉｎ　ｖｉｔｒｏのＲＮＡの翻訳機構はある条件下では適当であるが、 ＤＮＡの発現が通常選択される方法である。

したがって、さらに本発明の概念によると、上記のタンパク貫禄分子をコードし ている組換えまたは単離ＤＮＡを提供することである。

本発明によるＤＮＡは、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示されるアミノ酸またはセリ ンプロテアーゼ阻害活性を持ち、アミノ末端がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１の１、か ら３７番目のアミノ酸配列またはこれと実質的に相違しない配列を含むポリペプ チドをコードしていることが好ましい。５ＥＱＩＤ　ＮＯ：１に示されるヌクレ オチド配列はそれ自身発現するのに好ましいが、遺伝コードの同義性によって、 多くのヌクレオチド配列が目的とするアミノ酸配列をコードすることができる。

本発明によるＤＮＡは、実質的に上記のＤＮＡからなることができまたはさらに 他の配列を有していてもよい。

本発明のタンパク貫禄分子の断片、誘導体および変異体は、少なくともＳＥＱ　 １．Ｄ　ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列の一部をコードしているＤＮＡと同等 のＤＮＡによってコードされている。この同等性はハイブリダイゼーション実験 によって評価できる。例えば厳重な条件下で、少なくともＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： １に示されるＤＮＡ配列の一部または少なくともＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示さ れるアミノ酸配列の一部をコードしている他のＤＮＡ配列にハイブリッド形成す るＤＮＡは、本発明の一部を形成している。厳重な条件とは、例えば、塩濃度が 約０．９モルで３５〜６５℃をいう。

本発明による組換えＤＮＡは、ベクターの形態をとることかできる。このベクタ ーは、例えば、プラスミド、ニスミドまたはファージまたは他のウィルスである 。ベクターは、ベクターを感染（または形質転換：この言葉は本明細書中で入れ 代わり用いられる）した細胞を選択できるように及び好ましくは異種のＤＮＱを 導入したベクターを持つ細胞を選択できるように、１つまたはそれ以上の選択マ ーカーを有することが多い。適当な開始または終了シグナルは通常存在する。さ らに、ベクターが発現する際には、発現を促すのに十分な調節配列が存在する。

調節配列を持たないベクターはクローニングベクターとして有用である。

適当なベクターとしては、プラスミドｐＫＫ２３３−セルピン（ｐｌａｓｍｉｄ 　ｐＫＫ　２３３−ｓｅｒｐｉｎ）が挙げられる。

このクローニングベクターを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）またはこの操作を容易に する他の適当な宿主に導入することができる。適用な宿主としては、大腸菌（Ｅ 、　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０５のに１２株が挙げられる。配糖化は生物学的活 性に必要と考えられないので、発現は原核生物または真核生物で行うことができ る。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）はしばしば選択される原核生物体である。真核生 物については、サツ力ロマイセスセルビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　 ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　等の酵母が適当であるが、酵母の異なる配糖化のノく ターンは、他の真核生物の発現宿主も好ましいことを意味している。ノくキュロ ウィルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）で感染された昆虫細胞等の昆虫細胞も使用 でき、例えばＳＶ４０で感染されたＣＯ８細胞等の哺乳類細胞も使用できる。し たがって、本発明の他の概念によると、上記のＤＮＡで感染若しくは形質転換さ れた宿主細胞を提供することである。

本発明によるＤＮＡは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏのプロセスを含む、連続したヌクレオ チドを一緒に連結および／またはオリゴ−および／またはポリーヌクＩノオチド を連結することを含む便利な方法によって調製することができるが、組換えＤＮ Ａ技術が選択された方法を形成する。

本発明のＤＮＡは当該分野において既知の方法によってｃＤＮＡライブラリーよ り回復でき、ヌクレオチド配列が分かれば、直接増幅（ｄｉｒｅｃｔ　ａｍｐｌ ｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が例えばポリメラーゼ連鎖反応によって可能であることが 分かっている。

（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、（１９８５年）、 ２３０巻、ページ１３５０〜ユ３５４）。本発明による組換えＤＮＡ配列は、市 販の材料を用いて完全に調製できる。例えば、デレク　ウッド　ライブラリー（ Ｄｅｒｅｋ　Ｗｏｏｄｓ　Ｌｉｂｒａｒｙ）　（チャイルドｌ、／ンズ　ホスピ タル（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ、３００　ロングウッド　アヴ エニュー、ボストン、エム−７−−０２１１５（３００Ｌｏｎｇｖｏｏｄ　Ａｖ ｅ、　Ｂｏｓｔ。

ｎ、　ＨＡ　０２１１５）、米国）等のヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーが使用で きる。また、ｃＤＮＡを逆転写酵素を用いたトータル　ヒトＲＮＡより調製でき る。

ＣＧテイル（ＣＧ　ｔａｉｌｓ）をホモポリマー　テーリング（ｈｏｗｏｐｏｌ ｙｍｅｒｉｃ　ｔａｉｌｉｎｇ）技術によって付加することができる。

このようにして末端に付加された（ｔａｉｌｅｄ）　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、α１− 抗トリプシンプローブ（合成またはすべての元の配列の断片またはすべての元の 配列である）を用いてスクリーニングでき、これによってポジティブクローンと 推定されるものを同定できる。次に、Ｐｓｔｌ断片をＣＧテーリング（ＣＧ；　 ｔａｉｌｉｎｇ）によって単離できる。

本発明のＤＮＡは、また、診断、スクリーニングまたは他の目的に有用である。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のｃＤＮＡ配列から、目的とするアミノ酸配列の領域に 相当する目的とするＤＮＡ配列の領域があることが立証された。５アミノ酸残基 配列が、タンパク質の重要性であると思われる部分の９０％以上を十分担ってい ると考えられる。１つまたはそれ以上の短い目的とする範囲を化学的に目的とす るペプチドを合成するのに用いｍ：のことは一般的に利用されているー、特異的 な抗体を産生ずる。特異的な多クローン性抗体のヒト血清および肝臓のホモジネ ートへの反応性を測定し、このタンパク質がＡＡＴまたはＡＣＴと反応しない抗 体を用いた両方の組織に存在するかを調べる。

本発明のタンパク貫禄分子は、例えば、セリンプロテアーゼ阻害剤の欠損に関連 した症状の処置において有用である。このように、本発明のタンパク貫禄分子は 、白血球のエラスターゼ阻害、カテブンンＧ阻害、トリプシン阻害および／また は膵臓のエラスターゼ阻害活性を表わし、このことがら気腫、関節炎または敗血 症性ショック等の症状の治療の有用であることか示される。

したかって、さらなる概念において、本発明は、薬に使用するための上記のタン パク貫禄分子を提供するものである。

また、本発明は、上記のタンパク質様化合物を気腫、関節炎または敗血症性ショ ックの治療または予防のための薬の製造に使用することを提供するものである。

また、本発明は、気腫、関節炎または敗血症性ショックの治療または予防方法、 つまりの効果的で通常毒性のない童の上記のタンパク質様化合物を虫者に投与す ることからなる方法を提供するものである。

さらに、本発明は、１つまたはそれ以上の」二記のタンパク質様化合物を活性成 分として含む薬学的調製物を提供するものである。このような調製物は、例えば 吸入剤としてまたは非経口で投与するのに適当に使用できる担体と共に処方され る。非経口投与用として用いられる調製物は大抵滅菌されている。

熱安定性試験によると、本発明のポリペプチドは、ヒト血清および／またはＡ、 　Ａ、　Ｔに比べて熱処理（例えば６０℃、３０分間）により安定である。しか しながら、ｐＨ安定性はＡ、　Ａ　Ｔに比べて悪いようである（例えば、ｐＨが ４．５未満では本発明のタンパク質は少なくともある条件下では非活性であるが 、ある（約３０％のような）活性はＡＡＴに残っており、また、ｐＨが９より高 いときには本発明のタンパク質は非活性である）。

また、本発明は、本発明のタンパク貫禄分子に対する抗体を提供するものである 。これらは当該分野において既知の技術によって作製され（例えば［アンチボデ イズ、アラボラトリイ　マニュアル（Ａｎｔ、１ｂｏｄｉｅｓ、　Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔ、ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　Ｊ　、イー　バーロウ（Ｅ、　Ｈａｒｌｏｗ ）およびディ　レイン（’、Ｄ、　Ｌａｎｅ）　、コールド　スプリング　ハー バ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ）、１９８８年を参照）、例え ば欠損症の診断等の、なかんずく診断の目的に有用な多クローンおよび単クロー ン抗体を含む。病気の素質に関する異状が同定され、このような情報によって潜 在的な危険が査定できる。

本発明の実施態様を、実施例のみによっておよび本発明の好ましいポリペプチド のアミノ酸残基配列およびこれをコードしているＤＮＡ配列（ＢａｍＨＩ／Ｈｉ ｎｄｕ　ＩＩ断片として）を示しているＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示される配列 を参照しながら記載する。

実施例１−単離および配列分析 ｃＤＮＡライブラリーをヒト肝臓ポリＡ＋メツセンジャーＲＮＡより調製し、Ｂ ａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉリンカ−が（つついているプラスミドベクタ ーｐＡＴ１５３のＰｖｕ１１部位にクローニングした。このライブラリーは１０ ０，０００個の組換え体からなる。５．０００個のコロニーをＡＡＴ遺伝子のコ ード配列に相当する放射能でラベルされた１、３５０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡプ ローブを用いてスクリーニングした。繰り返しスクリーニングした後、予想した ものと違う制限酵素断片を有するクローンを単離した。これは、ＢａｍＨＩおよ びＨｉｎｄｌＩＩの制限酵素で消化した際にかなり大きなりａｍＨＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片を有する。ＡＡＴのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の正確な大きさ は約１３０ｂｐであるはずであるが、実際の断片の大きさは約３５０ｂｐであっ た。クローニングされた細胞系のサンプルは、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　 １２株、ＨＢＩ○１−クローン　Ａ５（プラスミド　ｐＡ７１５３）と記載され ているが、エフシーアイエムビ−（ＮＣＩＭＢ）、）レイ　チサーチ　ステイン ョン、ビーオーボックス　３Ｌ１３５　アベイ　ロード、アベルディーン（Ｔｏ ｒｒｅｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ、ＰＯＢＯＸ　３１．１３５　Ａ ｂｂｅｙ　Ｒ。

ａｄ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ）　、英国、ニービー９８デイジー（ＡＢ９８ＤＧ） に１９８９年１２月１５日に受託番号４０２３７で寄託された。

ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片を配列用Ｍ１３（ｒｒｒｐ１８およびｍｐ １９）にクローニングしたら、ＡＡＴのものとは異なる配列を有していた。この 配列は、ｃＤＮＡクローンの３′末端の非翻訳領域に相当していた。

ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１のＤＮＡ配列はまた、１から６および９９１から９９６ 番目のヌクレオチド部位に２つの中間ＢａｍＨＩ制限酵素部位がある。１０００ ｂ　ＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩ断片の配列分析をしたところ、これもまた、５′末 端でかなり異なる配列を有している。ロング（Ｌｏｎｇ）ら、バイオケミストリ ー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８４年、２３巻、ページ４８２８の用語 を用いると、ＡＡＴでは、１２６から１５への塩基が転化しており、１２７〜４ ８６塩基がな（なっており、残りの配列が活性化部位を含むＡＡＴと同一であっ た。

ヌクレオチドおよび相当するアミノ酸残基配列を５ＥＱＩＤ　ＮＯ：１に示す； コード領域は３番目（初めのイソロイシン）から９２９番目（ストップコドン） までである。ＢａｍＨ１部位はそれぞれ１から６番目および９９１から９９６番 目の位置にある。

実施例２−ｐＫＫ２３Ｂ−２の発現 逆配置（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）中のＡＡＴの第一のエクソ ンを有するＢａｍＨＩ断片およびＡＡＴと同じ配向中の４８７から１３８０まで の配列（ロング（Ｌｏｎｇ）らの番号性はシステムを使用）をＡＡＴに相当する 読み枠中のプラスミド発現ベクターｐＫＫ２３３−２にクローニングした。

ＢａｍＨＩ断片の末端を埋め、制限酵素ＮｃｏＩ　（ＣＣＡＴＧＧ）の認識部位 を有する８塩基のリンカ−（ＧＣＣＡＴＧＧＣ）を連結し、Ｎｃｏｌて切断し、 この断片をベクターｐＫＫ２３Ｂ−２のＮｃｏ１部位にクローニングすることに よって、クローニングを行った。目的とする配向中にあればこの断片によって、 ＡＡＴと同じ配向の大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中の融合していないタンパク質が 発現する。

大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ　１０５のに１２株を宿主細胞として用い、 形質転換される細胞系のサンプルは、大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｌ）　Ｋ　１２株、ＪＭ１０５−クローン　ｐＫＫ２３３−ｓｅｒｐ（プ ラスミド　ｐＫＫ−２）と記載されているが、エフシーアイエムビー（ＮＣＩＭ Ｂ）、トレイ　チサーチステインョン、ビーオー　ボックス　３１．１３５　ア ベイ　ロード、アベルディーン（Ｔｏｒｒｅｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉ ｏｎ、ＰＯＢｏｘ　３１．１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒｄｅｅｎ ）　、英国、ニービー９８デイジー（ＡＢ９　ｇＤＣ）に１９８９年１２月２１ 日に受託番号４０２４４で寄託された。

形質転換された細胞を０．３の最適密度になるまで生育させ、さらにクローニン グされた遺伝子断片の前におくβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の誘導剤である１０ ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を加え、細胞を３７℃、５時 間生育させることによって形質転換された細胞を発現させた。

発現した外タンパク質は、１つまたはそれ以上の以下のマーカータンパク質が以 下に示される分子量を持つような条件下で、ＰＡＧＥで３２ＫＤａ±ＩＫＤａの 分子量を有していた； α−ラクトアルブミン　１４．４ＫＤａダイズトリブシンインヒビター　２０． ＩＫＤａカルボニックアンヒドラーゼ　３０　ＫＤａオボアルブミン　４３　Ｋ Ｄａ ウシ　血清アルブミン　６７　ＫＤａ 実施例３　１）ＮＨ１８ａの発現 ヌクレオチド１から９９６番目の部位までのＢａｍＨＩ断片（実施例１）を発現 ベクターｐＮＨ１８ａのＢａｍＨ１部位にクローニングした。クローニングされ た細胞系のサンプルは、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）　Ｋ　１２株、Ｄ１２１０Ｈ Ｐ（プラスミド　ｐＮＨ１８ａ）と記載されているが、エフシーアイエムビー（ ＮＣＩＭＢ）　、トレイ　チサーチ　ステインョン、ビーオー　ボックス　３Ｌ １３５　アベイロード、アベルディーン（Ｔｏｒｒｅｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ ｔａｔｉｏｎ、ＰＯＢｏｘ　３１．１３５　Ａｂｂｅｙ　Ｒｏａｄ、　Ａｂｅｒ ｄｅｅｎ）　、英国、ニービー９８デイジー（ＡＢ９８ＤＧ）に１９９０年１２ 月５日に受託番号ＮＣＩＭＢ　４０３４１で寄託された。ｐＮＨは、縦に並んだ ２つの逆向きのプロモーターを有するベクターである。挿入部の発現は、原核生 物のプロモーターの熱誘導変化によって調節されている。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌ ｉ）宿主Ｄ１２１ＯＨＰ株のファージＩｎｔ生成物（ｐｈａｇｅ　ｌｏｔ　ｐｒ ｏｄｕｃｔ）およびプラスミドのａａｔＢとａａｔＰの認識配列によって介在さ れている特定部位の組換えによって、逆位が行われる。熱−パルスはプロモータ ーを「オフ」から「オン」の位置に切り替え、Ｉｎｔ−介在変化は、９５％の効 果である。

誘導および発現について以下に詳細に記載する。バクテリア（Ｄ１２１０ＨＰ） を２５０ｍ１のＬＢ−プロステ最適密度が０．３　（６００ｎｍで測定）になる まで生育させた。細胞を４２℃、２分間、熱−パルスさせ、Ｉ　ＰＴＧを最終濃 度が１ｍＭになるまで加えた。この細胞を３７℃で一晩生育させ、さらに４℃で ５００ｇ、１５分間遠心した。

この細胞を、１ｇ細胞当たり３ｍ、１のリシスバッファ−（５０ｍＭトリス塩酸 、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

１００ｍＭ塩化すトリウム）で再懸ｉｔ、た。フェニルメチルスルホニルフルオ リド（ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｐｈｏｎｙｌｆ　ｌｕｏｒｉｄｅ）（Ｐ ＭＳＦ）（８μｍ／ｇ）　、リゾチーム（１０ｍｇ／ｍｌ）およびデオキシコー ル酸（４ｍｇ／ｇ）を加えた。

この混合物を３７°Ｃで水浴ｊ１、攪拌し、さらに混合物の粘性がなくなるまで ＩｇＭＨ胞当たり２０μｍのデオキシリボヌクレアーゼＩ　（ＤＮＡａｓｅｌ） （１ｍｇ／ｍｌ）と共に培養（−だ。この細胞溶解産物を４℃で１２，０００ｇ 。

１５分間遠心した。ぺ１．／　ッＩ・を０．１ｍ、Ｍ　ＰＭＳＦおよび８Ｍ尿素 に再懸濁し、室温で１時間放置］−た。この溶液を９容量の５０ｍ、Ｍリン酸二 水素カリウム（ｐ　Ｈ１０，７）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、（ｐＨ８，０）および５ ０ｍＭ塩化ナトリウムで３０分間処理した。次に、ｐＨを塩酸で８．０に調整し た。この混合物を室温で１２，０００ｇ５１５分間遠心し、ベレットをさらに分 析するために再懸濁した。

実施例４−ｐＫＫ２３３−２から発現したタンパク質の活性 実施例２の細胞をべ１ノット化し、生理食塩水で洗浄し、２回浸透圧シヨ’７り による融解（Ｏ３ｍＯｔｉｃＩＪ’５ｉＳ）　、凍結溶解した後、上清の生物学 的免疫学的活性を分析した。５ｍｌ培養物から約４００μｍの上清を集め、ヒト 　α１−抗トリプシンに対する抗体を用いた免疫化学測定によって、約１．４μ ｇのタンパク質を得た。エラスターゼの阻害アッセイを用いて、この調製物１５ μｍ　（約５０ｎｇ）は、約０．１ｍｌのヒト血清と同等の活性を有していた。

この活性はタンパク質量に換算した際にほぼ一致する。熱安定性の研究によって 、同様の処理をｊ５たヒト［ｆ［１清では活性が失われるのに対して、発現タン パク質は熱処理（６５℃、２０分間）に対Ｉ−で安定であることが示された。

実施例５−ｐＮＨ１８ａから発現したタンパク質の活性ｐＮＨ１８ａ　（実施例 ３−ＮＣＩＭＢ　４０３４１）の発現タンパク質の熱安定性およびｐＨ変化に対 する安定性を調べた。上記実施例４と同様にして活性を測定した。６０℃で３０ 分間加熱した際、このタンパク質は、α１−抗トリプシン（、Ａ　Ａ　Ｔ　）と 比較した際、機能的な活性が残っていた。この活性は処理をしていないサンプル の約３０％であったか、Ａ、　Ａ　Ｔでは実質的には活性が検出されなかった。

このことから、発現タンパク質はかなりより熱安定であることが示された。酸性 のｐＨでは、発現タンパク質はｐＨ４，５未満で不活性化されるが、Ａ、　Ａ　 Ｔは約３０％の活性が残った。ｐＨが９．０より高いと、発現タンパク質は不活 性化された。ＡＡＴでは配糖化された残基が存在し、これにより安定化されるが 、発現タンパク質ではそのようなものが存在しない。

監ムニニ立− ９９１から９９８ｂｐ　＋ＢａｍＨＩＷ位特性、ヒト　セリノブロチアーゼ阻害 剤ＴＧＣＣＴＧ　入ＡＧ　ＣＴＡ　ＧＴＣＣＡＴ　入入に　ｆｆｒ　ＴＴＣＧＡ Ｇ　Ｇ入ＴＧＴＴ　１４５Ｃｙｓ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　入ｓｐ　 Ｌｙｓ　Ｐｈ＠　ｌｘｕ　、Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａ工４Ｃ４５、 ＴＴＣＧＧＧ　ＧＡＣＡＣＣＧＡＡ　ＧＡＧ　ＧＣＣ入ＡＧ　入入ＡＣ入Ｇ　入 ＴＣ入ＡＣ２１８Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　ＧＬｕ　Ａｌａ　Ｌ ｙｓ　Ｌｙｓ　ＧＬｎ　工１−ａ　Ａｓｎ要約 ポリペプチドおよびこれをコードしているＤＮＡ幾つかの点ではα１−抗トリプ シン（ＡＡＴ）と同様であるが配糖化されていない分子量がＰＡＧＥで３２±Ｉ ＫＤａであるセリンプロテアーゼ阻害剤を発見した。この活性化タンパク質をコ ードしているｃＤＮＡをクローニングし、配列分析を行ったため、このタンパク 質の配列が明らかになった。組換えＤＮＡ技術によって、例えば大腸菌（Ｅ、　 ｃｏｌｔ）で発現させることによって、天然のポリペプチド配列及び関連タンパ ク質の調製が可能である。この阻害剤は、気腫、関節炎または敗血症性ショック の治療に有用であることが分かった。

補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　４年　６月１９日

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．配糖化されていない分子量が３２ＫＤａ±１ＫＤａであるヒトセリンプロテ アーゼ阻害剤。
2. ２．以下から選択されるタンパク質様分子：ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示される アミノ酸配列またはこれとは実質的には異ならない配列を有する分子；ｂ）ａ） と実質的に同等の構造および生物学的活性を有するポリペプチド；および ｃ）実質的にこれらの生物学的活性を有するａ）またはｂ）の断片、誘導体およ び変異体。
3. ３．以下から選択されるタンパク質様分子：ａ）セリンプロテアーゼ阻害活性を 有し、アミノ末端がＳＥＱＩＤＮＯ：１の１から３７番目のアミノ酸配列または 実質的にこれとは異ならない配列を有するポリペプチド； ｂ）ａ）と実質的に同等の構造および生物学的活性を有するポリペプチド； ｃ）実質的にこれらの生物学的活性を有するａ）またはｂ）の断片、誘導体およ び変異体。
4. ４．誘導体が配糖化された誘導体である請求項２または３に記載のタンパク質様 分子。
5. ５．連続したアミノ酸残基を一緒に連結および／またはオリゴーおよび／または ポリペプチドを連結することからなる方法である請求項２または３に記載のタン パク質様分子の調製方法。
6. ６．請求項１、２または３に記載のタンパク質様分子をコードする組換えまたは 単離ＤＮＡ。
7. ７．ＳＥＱＩＤＮＯ；１に示されたアミノ酸配列をコードする請求項６に記載の ＤＮＡ。
8. ８．ＳＥＱＩＤＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列を有する請求項６に記載の ＤＮＡ。
9. ９．請求項６、７宏たは８に記載のＤＮＡとハイブリッド形成する組換えまたは 単離ＤＮＡ。
10. １０．ベクターの形態をとる請求項６、７または８に記載のＤＮＡ。
11. １１．効力のある連結プロモーターを有する発現ベクターである請求項１０に記 載のベクター。
12. １２．請求項１０または１１に記載のベクターを感染または形質転換された宿主 細胞。
13. １３．大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）である請求項１２に記載の宿 主細胞。
14. １４．哺乳類細胞である請求項１２に記載の宿主細胞。
15. １５．連続したヌクレオチドを一緒に連結および／またはオリゴーおよび／また はポリーヌクレオチドを連結することからなる方法である請求項６、７または８ に記載のＤＮＡの調製方法。
16. １６．薬に使用するための請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様分子 。
17. １７．気腫、関節炎または敗血症性ショックの治療または予防のための薬の製造 における請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様化合物の使用。
18. １８．効果的で通常毒性のない量の請求項１から４のいずれかに記載のタンパク 質様化合物を患者に投与することからなる方法である気腫、関節炎または敗血症 性ショックの治療または予防方法。
19. １９．請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様化合物およびこれに対し て薬学上使用できる担体からなる薬学上の処方箋。
20. ２０．請求項１から４のいずれかに記載のタンパク質様化合物を特異的に結合す ることができる抗体。