JPH05502580A

JPH05502580A - 細菌での触媒ｒｎａの製造法

Info

Publication number: JPH05502580A
Application number: JP2515050A
Authority: JP
Inventors: ロッシー，ジョン・ジェイ; テーラー，ネリダ
Original assignee: City of Hope
Current assignee: City of Hope
Priority date: 1989-08-31
Filing date: 1990-10-19
Publication date: 1993-05-13
Also published as: EP0506666B1; AU6616090A; EP0506666A1; EP0506666A4; DE4091533T; WO1992006988A1; AU649975B2; DE69031080D1; CA2071854A1; DE69031080T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】５、大腸菌４．５Ｓ　ＲＮＡ遺伝子に融合させたりポザイムとＴａｃフ冶モーターを持つベクター。

６、前記リポザイムが抗ＨＩＶ−Ｉ　ｇａｇリボザイムである、請求項５記戴のベクター。

７、抗ＨｆＶ−１ｇａｇリボザイムが、５’　ＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣｔＣＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣ３’の配列を持つ、請求項６記載のベクター。

８、大腸菌４．５５　ＲＮＡに融合させたＴａｃプロモーターとりポザイムを持つベクターを用いて形質転換させた細胞の発現産物。

９、前記細胞が細菌細胞である、請求項８記載の発現産物。

１０、前記細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項９記載の発現産物。

＋１．前記リポザイムが抗ＨＩＶ−１ｇａｇリボザイムである、請求項９または請求項１０記赦の発現産物。

１２、前記リボザイムが５’　ＧＧＡＵＣＣＧＣＵＵＡＡＵＡＣＵＣＵＧＡＵＣ；ＡＧＵＣＣＧＵＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＵＣＵＣＧＣＡＣＣＧＧＡＵＣＣＧＣＣＡノＧＵＧＣＣ３ “の配列を含む、請求項９または請求項１０記載の発現産物。

１３、請求項９または請求項■０記載の発現産物を用いる反応により）ＩＪＩ− Ｉ　ＲＮＡを切断することからなる方法。

明細書［ス！磯μρυソ（左製造法本出願は、１９８９年６月２１日に提出されたロッジ−（Ｒｏｓｓｉ）、キャンティン（ＣａｎＬｉｎ）、ザイア（Ｚａｉａ）、ｉよびチャン（Ｃｈａｎｇ）の米国特許出願第０７／３６９．４８９号、および第０７／３６９．４８９号の一部継続出願として１９８９年８月３１日に提出されたロンシー、キャンティン、ザイア、およびチャンの米国特許出願第０７／４０１．６１３号の一部継続出願である。米国特許出願第０７／３６９．４８９号および第０７／４０１．６１３号は、本書の参照文献に収められている。

本発明は、哺乳動物細胞および細菌細胞を含めた細胞での触媒ＲＮＡ（リボザイムンの製造法に関するものである。より詳細には、本発明は、リポザイムをコードする合成遺伝子、そのような遺伝子を移入して形質転換させた哺乳動物細胞および細菌細胞、およびそのような細菌の発現産物を含むリボザイムに関する。

また、本発明は、そのような発現産物のｉｎ　ｖｉｔｒ（ｌ＋および治療での使用も包含する。

＠盟曵背景ＲＮＡ−ＲＮＡ二重らせん形成による形質発現障害の１形態は、「アンチセンス」阻害と命名されている。アンチセンス遺伝子調節の利用は、有効な抗ウイルス療法を可能にすると期待される。アンチセンスアプローチの重大な制約は、特に、抗ウィルス活性に応用するとき、このアプローチが化学を論的であり、そして効果を得るためには著しく標的ＲＮＡに対して過剰のモルのアンチセンスウィルスを必要とするかもしれないことである。

近年、酵素活性を持つＲＮＡのようなりボザイムの発見により、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを形成するだけでなく、ホスホジエステル共存結合の切断を触媒し、多数の基質分子を代謝するアンチセンス分子の開発がもたらされた。リボザイムは現在はとんど全てのＲＮＡ転写物を標的とすることが可能であり、効率的な切断がｉｎ　ｖｌｔｒｏで容易に達成できる。　Ｓ、Ｈ，キム（Ｋｉｍ）ら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬＩ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　：８７８Ｂ〜８７９２（１９８７）；Ｊ、ヘイズロン（Ｈａｓｅｌｏｆｆ）ら、ＮａＬｕｒｅ　２３４：５８５〜５９１　（１９８８）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ／８９１０５８５２　；　Ｔ。

Ｒ，セック（Ｃｅｃｈ）ＪＡＭＡ　２６０：３０３０〜３０３４　（１９８８）；ＰＣＴ国際公開ＷＯ／８８１０４３００　；Ａ、ｃ、シェフリーズ（Ｊｅｆｆｒｉｅｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ７：１３７Ｌ〜１３７７　（１９８９）を参照のこと。

米国特許出願第３６９．４８９および第４０２．６１３号は、なかでも）（ＴＶ −１ＲＮＡまたは他のあらゆるウィルスＲＮＡまたは細胞内在ＲＮＡを１ｎｖｉＬｒｏとｉｎ　ｖｉｖｏで切断するのに有用な、安定した、触媒として効率的なりボザイム、そのようなりボザイムにより形質転換された哺乳動物細胞、そのような形質転換を達成するのに有用なベクター、およびリボザイムが合成により製造したものか、そのような形質転換細胞により発現されたものであるカーにかかわらず、そのようなりポザイムの人の治療への使用を記載している。本書の参照文献に収めたチャンら、Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２：２３〜３１（１，９９０）を参照のこと。

発■の要約治療用の特異的標的を持つリポザイムの大量生産は困難である。本発明は、触媒ＲＮＡを挿入した安定なＲＮＡ分子の発現による、あらゆるリボザイムの大規模生産のための新規方法を提供する。どのような安定なＲＮＡも使用できる。本発明の好ましい実施では、触媒ＲＮＡ配列を挿入した、Ｔａｃプロモーターに指令される４、５Ｓ　ＲＮＡにより、大腸菌を形質転換する。そのような融合ＲＮＡの高レベルの発現は、増殖温度を変動させること、ＲＮアーゼＩＩＩのようなある種の酵素活性が欠損する大腸菌または他の細菌の突然変異株を使用するこ七、適切な宿主においてイソプロピルチオβガラクトピラノシド（Ｉ　ＰＴＧ）を用いて発現を誘導すること、望ましくない立体構造を除去するために４．５３または同様の遺伝子内に１組のいれこ式削除（ｎｅｓｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を行うこと、石よびその他の標準的分子生物学的手法により得ることができる。

本発明は、触媒ＲＮＡをコードする合成遺伝子、そのような遺伝子により形質転換した微生物、そのような遺伝子の発現産物を含む触媒ＲＮＡ、およびそのような発現産物のｉｎ　ｖｉｔｒｏ＃よび治療における使用も包含する。

凹面の説明図１は、大腸菌の４．５３　ＲＮＡＪｔ伝子に融合させたりポザイムとＴａｃプロモーターを含むベクターを示す。

図２は、図１に示したりポザイムを含む転写単位を持つ、図１に示したベクターを示す。

図３は、４．５３　ＲＮＡと融合した抗−ＨＩＶ−１ｇａｇリポザイム（ａ列とｂ列）と４．５５　ＲＮＡ単独（０列）の発現を示すノザン法分析である。

図４は、本発明によって大腸菌形質転換体により過剰産生された小ＲＮＡの酸性フェノール抽出物のエチジウムプロミド染色ゲルを示す。

図５は、図４に示したエチジウム染色ＲＮＡを含む調製用ゲルを示す。矢印の頭は融合リボザイムを示す。

図６は、４．５３転写物に組み込まれたＲＮＡ折り畳み構造の構成を示す図である。

図７は、４．５３融合リボザイムにより作成した大腸菌形質転換体を用いた、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ切断反応を表すゲル電気泳動性分析を示す。

発労の拝担久説明従来、ｉｎ　ｖｉＬｒｏ研究のためまたは培養細胞への配送のためのりポザイムを作る好ましい方法は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応の大規模化であった０本発明はｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写の必要性を無くし、従ってリボザイムの大量生産の原価を大幅に低減する。

より包括的な実施態様では、本発明は、リポザイム配列を挿入した細菌の安定なＲＮＡ分子の発現による、あらゆるリポザイムの大規模生産のための新規方法を捉供する。

安定なＲＮＡはどのようなＲＮＡでもよく、挿入物もどのようなりボザイムでもよい。より詳細には、遺伝子が人手できるどのような細菌の低分子の安定なＲＮＡも使用できる。ＲＮＡ分子は低分子であること、すなわち約５０から２００個のヌクレオナトを含むことが好ましく、そして大腸菌ＲＮＡであることが好ましい。現在、本発明の実施のための最良の態様と思われる方法には大腸菌４，５Ｓ　ＲＮＡが使用される。

数ある中で、米国特許出願第３６９．４８９号または第４０１．６１３号に記載されるリボザイムのうち何れを使用してもよい、ＲＮＡ−リポザイム融合産物の過剰産生を容易にするために、強力な原核生物プロモーター系を選ぶ。安定なＲＮＡ、リボザイムおよびプロモーターを含むベクターを移入して、そのような融合産物を大量に生産するために選んだ細菌に形質転換を起こさせる。

一般に、コンセンサス配列プロモーターは、本発明の実施に任用である。、ＴａＣプロモーター系が好ましい。熱により誘導できるλρＬプロモーター系を使用してもよい。

安定なＲＮＡ、挿入したりボザイム、および適切なプロモーターと転写ターミネータ−の組み合わせを含むベクターは、本発明の重要な成分である。そのようなベクターを造成し、既知の方法により細菌に移入して形質転換を起こす。

尖施倒１大腸菌Ｌ　５３　ＲＮＡ遺伝子は先行技術に記載されている。Ｊ、プロジュース（Ｂｒｏｓｉｕｓ）ら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＣｈｅｒｎＩｓｔｒｙ　２６０：３５３９〜３５４１　（１９８５）を参照のこと、この遺伝子はＭ　！　ｕ　［制限部位を持つ６図１の構造を得るために、４，５３　ＲＮＡ分子のＭｌｕ１部位に、５“ＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＧＣＴＣＴＣＧＣＡＣＣＧＣ，ＡＴＣＣ３”の配列を持つ抗−）（ＩＶ−１ｇａｇリボザイムを挿入する。その方法は下記の通りである。

プラスミドｐ　ＫＫ２４３−１を、４．５５遺伝子配列中のただ１個のＭｌｕｌ制限部位で切断した。この切断（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）により生じた付着端を、フレノウ（Ｋｌ　ｅｎｏｗ）ＤＮＡポリメラーゼにより満たし、子ウソ腸ホスファターゼにより脱リン酸化した。３°末端に相補的配列の１０個の塩基を持つ２個の合成りＮＡオリゴマー、ＧＡＧＨＡＭ＋　（ＧＧＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＣＧＴＧＡＧＧＡＣ）および２　ＣＣＣＧＧＡＴＣＣＣ，ＣＧＡＧＡＧＣＧＴＴＴＣＧＴＣＣＴＣＡＣＧＧ）を、次のようにして、Ｔａｃポリメラーゼにより二本鎖断片に重合した。すなわち、これらの等モ／１４を、約０．５マイクログラムの各オリゴ、１２５μモルの各ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（ソータスーパーキン・エルマー（Ｃｅｔｕｓ−Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ））石よび２，５単位のＴａｑポリメラーゼを含有する５０マイクロリツトルの反応液中で混合した。

１０回の増幅サイクルを、下記を用いて実施した：９４Ｃ−１分、３７Ｃ−１分、および７２Ｃ〜２分。重合した断片をリン酸化し、ρＫＫ２４３−１ヘクターに結合し、そして標準塩化カルシウム法により大腸菌株ＭＣ１０６１に移入して形質転換を起こさせた。形質転換体をリポザイム挿入物についてスクリーニングし、ノザン法ゲル分析を用いて、挿入物を持つクローンを発現について調べた（図３参照）、低分子ＲＮＡを下記の方法により陽性クローンから収集した。細胞を低温の５０ｍ！ｌ−リスｐＨ７，５，５ｍＭ　ＭｇＣ１，に懸濁させ、酸性フェノールで２回抽出し、０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　ｐＨ５，５にし、３．５容のエタノールで沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、滅菌水に再懸濁させた。このＲＮＡのアリコートを、ＴＢＥｌｌｋ衝液と６％アクリルアミド（２０：ｌ　アクリルアミド：ビス）ゲルを用いて４０ミリアンペアで泳動させ、９０ミリアンペアで１＠エレクトロブａ７テイング法をｊテうことにより、ゼータ７Ｃ７−ブ（Ｚｅｔａ　Ｐｒｏｂｅ）ナイロンフィルターに移し、そして放射能でラベルしたｇａｇリボザイム特異プローブＧＡＧＲＡＭ２とハイプリントを形成させた。このようなノザン法分析により、前駆体（図３．０列）と最終産物（ａ列、ｂ列）が検出された。以後の研究のために発現が最も高いクローンを選択した。

前駆体と処理産物の両方を３７°Ｃでｒ　Ｌ　Ｊブロスにより培養し、そして０．３Ｍ　Ｎａ０Ａｃ　ｐＨ５，５，０，１％ドデシル硫酸ナトリウム中のアクリルアミドゲルから１晩拡散溶出することにより精製したのち、リボザイム活性を調べた。溶出後、ＲＮＡをフェノールで２回、ジクロロメタンで１回抽出し、エタノールで沈澱させ、遠心器にかけてベレット化し、そして７０％エタノールで洗浄した。ＲＮＡは使用前に水に溶解した。チャン（Ｃｈａｎｇ）ら（前記）が記載した方法によりＲＮＡ断片をｉｎ　ｖｉｔｒｏ切断活性に一ついて試験した。

図４は、小ＲＮＡの酸性フェノール抽出物のエチジウムプロミド染色ゲルを示す０図中、このような形質転換により過剰産生された４、５８は左列に、同しくＭｌｕ１部位に８ｂｐ　挿入断片を持つ４，５Ｓは右列に示されている。矢印は、１ｍｌ以下の細胞培養物に由来するエチジウムプロミド染色産物（４，５５）（４，５Ｓと８ｂｐ　挿入物断片）を示す。

図５は、約２５０ｍ１の細胞からのＲＮＡの調製的酸性フェノール抽出物を示す。矢印は４．５Ｓ　ｇａｇリボザイム融合転写物を示す。この転写物をゲルから切り取り、それが触媒機能を持つことを明らかにした（図７参照）。

ｖｕ　１１４．５Ｓ　コード配列Ｉ　＠Ｉ＠　龜　−−− マＡＢＦＩＧ、　４ＦＩＧ　６国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．触媒ＲＮＡをコードする合成遺伝子。２．図１に示したベクター。３．請求項１記載の合成遺伝子または請求項２記載のベクターを用いて形質転換した哺乳動物細胞または細菌細胞。４．請求項１記載の合成遺伝子または請求項２記載のベクターを用いて形質転換した細菌細胞。５．大腸菌４．５Ｓ　ＲＮＡ遺伝子に融合させたリボザイムとＴａｃプロモーターを持つベクター。６．前記リボザイムが抗ＨＩＶ−１ｇａｇリボザイムである、請求項５記載のベクター。７、抗ＨＩＶ−１ｇａｇリボザイムが、【配列があります】の配列を持つ、請求項６記載のベクター。８，大腸菌４．５Ｓ　ＲＮＡに融合させたＴａｃプロモーターとリボザイムを持つベクターを用いて形質転換させた細胞の発現産物。９．前記細胞が細菌細胞である、請求項８記載の発現産物。１０．前記細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項９記載の発現産物。１１．前記リボザイムが抗ＨＩＶ−１ｇａｇリボザイムである、請求項９または請求項１０記載の発現産物。１２．前記リボザイムが【配列があります】の配列を含む、請求項９または請求項１０記載の発現産物。１３．請求項９または請求項１０記載の発現産物を用いる反応によりＨＩＶ−１ＲＮＡを切断することからなる方法。