JPH05503222A - 特にグラム陽性バクテリアのグリコペプタイドに対する抵抗力の発現に係るポリペプタイド、ポリペプタイドをコードするヌクレオチドシーケンスおよび診断への使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特にグラム陽性バクテリアのグリコベブタイドに対する抵抗力の発現に係るポリ ペブタイド、ポリペブタイドをコードするヌクレオチドシーケンスおよび診断へ の使用本発明は、特にグラム陽性バクテリアについての、殊にダラム陽性球菌群 についてのグリコペグタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に係るポリペブ タイドに関するものである。本発明は同様にそのポリペブタイドをコードするヌ クレオチドシーケンスに関するものである。更に９本発明はグリコベプタイドに 対する抵抗力を菌体外で検出することによってポリペブタイドとそのヌクレオチ ドシーケンス（配列）を使用することに関する。グラム陽性球菌のうち９本発明 はとりわけ腸内球菌。

連＃ｉ１球菌ならびにブドウ球菌を対象とし、これらの球菌は本発明の成果を利 用するために特別に関心があるものである。

グリコベプタイド、そのうちで特にバンコマイシンとティコプラニンは、バクテ リアの細胞壁の合成を阻害する抗生物質である。それらの抗生物質は、特にペニ シリンに対するアレルギーならびに抵抗を有するグラム陽性球菌（腸内球菌、連 鎖球菌ならびにブドウ球菌）による感染症の治療に利用することができる。バン コマイシンは長い間使用されたにも拘らず、その抗生物質は、抵抗力を有する最 初の菌種が始めて単離された１９８６年まではほとんど全ての菌種に対して活性 を保持してきた。

それ以来、グリコペプタイドに対する抵抗力はヨーロッパやアメリカの数多くの 微生物学者によって検出され、特に免疫抑制による患者から単離された菌種につ いては、院内感染による病原微生物の感受性について体系づけられた評価が必要 である。

グリコベプタイドの活性は、抗生物質内での複合体ならびにペプチドグリカンの 前駆物質の形成と、細胞壁の代謝に係る酵素との直接的な相互作用に基づいてい る。特に、ペプチドグリカンの前駆物質の末端残基であるＤ−アラニン−Ｄ−ア ラニン（Ｄ−Ａｌ　ａ　−Ｄ−Ａｌ　ａ）にグリコベブタイドが直接固定するこ とが確認されている。

特に腸内球菌についてのグリコペプタイドに対する抵抗力が最近発現したことに より、あるいくつかの結果が得られると同時にその抵抗力を付与した要因につい ての検索が行われた。

例えば、ある特定の腸内細菌であるエンテロコツカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅ ｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＢＭ４１４７において、グリコペプタイド に対する抵抗力の決定因子は３４ｋｂのプラスミドであるプラスミドｐＩＰ８１ ６に位置していることが確認されている。この決定因子はＥ、ｃｏｌｉにクロー ンされている（Ｂｒｉｓｓｏｎ　Ｎｏｅｌ　ｅｌ　ａｌ：　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏ ｂ。

Ａｇｅｎｔｓ　ＣｂｅｍｏＩｂｅｒ、：　３４．９２４−９２７．１９９０）。

今日までに得られた結果によれば、グリコベプタイドに対する抵抗力は約４０　 ｋ　Ｄ　ａの分子量を持つタンパク質の生成に関連していて、そのタンパク質の 合成はバンコマイシンのようなあるいくつかのグリコベブタイドの阻止濃度に影 響を及ぼしている。

グラム陽性球菌のあるいくつかの菌種に対する抵抗力ならびにグリコペプタイド 、特にバンコマイシンとティコプラニンについての検討並びに究明の結果２本発 明者は抵抗菌種についてのプラスミドによって一般的に保持されているシーケン スによってコードされているいくつものタンパク質またはポリペブタイドの発現 が関連していることを確認した。本発明者によって得られた新規な結果によって 、更には、抵抗の２つの表現型をコードする遺伝子を識別し、一方ではグリコペ プタイドに対する高いレベルの抵抗力を有する菌種を、他方ではその低いレベル の抵抗菌種を識別することが可能になった。

高いレベルの抵抗力を有する菌種によって、バクテリアの菌種、特にグラム陽性 バクテリアの菌種については、バンコマイシン並びにティコプラニンのそれらの 菌種に対する最小阻止濃度がそれぞれ３２並びに８マイクログラム／ｍ１より高 いことが理解されている。バンコマイシン並びにティコプラニンの低いレベルの 抵抗力を持つ菌種に対する最小阻止濃度は１６と３２マイクログラム／ｍｌの間 である。これらの菌種は明らかにティコプラニンに対して感受性を有している。

本発明者は、グリコペブタイドに対する抵抗力を発現するのに必要な成分のうち リガーゼＤ−Ａｌａ　Ｄ−Ａｌａとある同族性を有するＶＡＮＡまたはＶａｎＡ と名ずけられた特定のタンパク質を単離し、精製した。Ｖ　ａ　ｎ　Ａはそれに もかかわらずリガーゼとは機能的に区別される。

原則的には、遺伝子についてはｒｖａ　ｎＪを接頭語として付け、アミノ酸の配 列についてはｒＶａｎＪを接頭語として付けて命名されている。

本発明はグリコベグタイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはテ ィコプラニンに対する抵抗力の発現に係るポリペブタイドやタンパク質に関する と同時に、そのような複合物をコードするヌクレオチドシーケンスに関するもの である。

同様に９本発明は、グリコベブタイドに対する抵抗力の検出のために、特に連鎖 ポリメライゼーション（ＰＣＲ）のためにまたは抗体の作用を調べる試験のため に利用できるヌクレオチドのプライマー（旗印、探索子）を巨的としている。

また本発明はポリペブタイドの組成物に関するものであり。

そのポリペブタイドの組成物は少なくとも、シーケンスリストにてＳＥＱ　ＩＤ Ｎｏ１　（ＶａｎＨ）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ２　（ＶａｎＡ）　、　ＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ３　（Ｖ　ａ　ｎ　Ｘ）またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｌ　９　（Ｖａ　 ｎＣ）によって同定されるアミノ酸シーケンスから選ばれたタンパク質またはタ ンパク質部分、またはＶａｎＨ，ＶａｎＡ、Ｖａ　ｎＸもしくはＶａｎＣに対す る抗体によって認識される全タンパク質もしくはタンパク質部分、または、厳重 なまたは余り厳重でない条件下で、シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ８．　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ９．　ＳＥＱ　１０　Ｎｏｌ　ＯまたはＳＥＱ　１０ 　Ｎｏ２１によって同定されるヌクレオチド連鎖の１つとハイブリッドもしくは 下記に示す部分シーケンスＶ１またはｖ２の１つとハイブリッドされたシーケン スによってコードされている全タンパク質もしくはタンパク質部分によって特徴 付けられている。

Ｖｌ：　ＧＧＸ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＸ　ＴＣＸ　ＴＴＸＧＣＡＧＣ ＣＡＡ　ＧＧＸ Ｖ２：　ＡＡＴ　ＡＣＸ　ＡＴＸ　ＣＣＸ　ＧＧＸＣＴ ＴＴＴ　ＡＣ 本発明において、グリコベプタイドベに対する抵抗力の発現に係るある特定の第 １の組成物は、それにはグラム陽性バクテリアに対してグリコベグタイド群の抗 生物質、特にバンコマイシンおよび／またはティコプラニンに対する抵抗力を付 与するのに必要な、もしくはダラム陽性球菌群の菌種に対してかかる抵抗力を助 長するタンパク質の１つもしくはそれ以上の少なくとも３つのタンパク質もしく はその全タンパク質部分であって。

そのタンパク質またはタンパク質部分が。

ａ）シーケンスリストにてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１　、　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　 ２　またはＳＥｏ　１０　Ｎｏ３によって同定されるシーケンスの１つに対する 抗体によって認識されるか、または。

ｂ）シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９ またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１０によって同定されたシーケンス、または厳重な または余り厳重でない条件下で該シーケンスもしくは相補性シーケンスの１つと ハイブリツドされているシーケンスもしくはシーケンスｖ１またはｖ２の１つと ノへイブリッドされているシーケンスを含む遺伝子によってコードされているこ とによって特徴付けられる。

そのうえ、それらのシーケンスは、それぞれ０ＲＦ３．遺伝子ｖａｎＨ，ｖａｎ Ａ　（または０ＲＦ２）を含む０ＲＦ１によって示され、それらは菌種エンテロ コツカス・ファエシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ）ＢＭ４ １４７から得られるような抵抗タンパク質を特徴付けている（ＬｅｃｌｅｒＱ　 ｅｌ　ａｌ：　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、；　３１９．１５７−１６１ ）。

リガーゼＤ−Ａ　１　ａ　−Ｄ−Ａ　１　ａに結びつくが異なる特異性を有する 別のタンパク質であるＶａｎＣはエンテロコツカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏ ｃｃｕｓ　ｇａｌｌ　ｉｎａｒｕｍ）ＢＭ４１７３によって特徴付けられ、その 遺伝子ｖａｎＣは。

その検出に関わるｖａｎＡを決定する領域に対応するため（こ遺伝子ｖａｎＡと 十分な相同性を有するドメインを提供する。

エンテロコツカス・ガリナルム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｇａｌｌｉｎａｒｕ ｍ）は、バンコマイシンの弱いレベルの抵抗型分離株である（Ｄｕｌｋａ−Ｍａ ｌｅｎ　ｅｌ　ａｌ：　Ａｎｌｉｍｉｃｒｏｂ、　ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏ＋ｈ ｅｒ、；　３４（１９９０ｂ）、　１８７５−１８７９）。

本明細書中で使用する用語「ポリペブタイド」には、タンパク質を含むアミノ酸 のすべての連鎖、またはタンノ（り質のそれよりも小さい部分が含まれる。

上記で問題となる厳重な条件は、ヌクレオチドシーケンスのハイブリダイゼーシ ョンに関する常法に従って決定される。たとえば、遺伝子ｖ　ａ　ｎ　Ａ　（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８）のシーケンスと／’％イブリッドされるシーケンスに関し ては、以下の条件が適用できる。つまり。

−厳重な条件下でのハイブリダイゼーションのためには：反応温度６５度で１夜 、０．１％ＳＤＳ、０．７％脱脂粉ミルク、６ｘＳＳＣ（１ｘＳＳＣ＝０．１５ Ｍ　ＮａＣ１，０，０１５Ｍナトリウムくえん酸、ｐＨ＝７．０）２ｘＳＳＣ− ０，１％ＳＤＳ中で６５度で洗浄−余り厳重でない条件下でのノ飄イブリダイゼ ーションのためには： ハイブリダイゼーションの温度は６０度で１夜おいて。

４５度の温度で洗浄 グリコベブタイドに対する抵抗力の発現は、グリコペプタイドに対して感受性の ある通常の病原微生物による感染の持続性によって表される。

１つのポリペブタイドまたはタンパク質がグリコペブタイドに対する抵抗力の発 現には必要であり、従ってそれがなければそのポリペブタイドもしくはそのタン パク質を含む菌種を、かかるポリペブタイドもしくはタンパク質が存在しない感 受性菌種よりも、グリコベブタイドに対してより感受性を高（する。

グリコベブタイドに対する抵抗力のレベルは、特にグラム陽性球菌の菌種により 異なっている。

本発明の好ましい態様によれば、ポリペブタイドは上記に定めた組成物に含まれ 、　ＳＥＱ　１０　Ｎｏｌ　（Ｖａ　ｎＨ）　、　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２（Ｖａ ｎＡ）およびＳＥＱ　１０　Ｎｏ　３　（Ｖ　ａ　ｎ　Ｘ）としてシーケンスリ ストにて同定されたタンパク質の結合に対応している。

従って１本発明者によって、グラム陽性バクテリアについてのグリコペブタイド に対する抵抗力の発現には、少なくとも３つのタンパク質もしくはそのタンパク 質に由来したポリペブタイドが発現することが必要であることが確認された。

本発明を実施する第１の態様によれば９組成物のポリペブタイドはそのうえ、グ リコベグタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に必要なアミノ酸シーケンス が、ｖ１節要素、特に、シーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ４または ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　５として同定されたシーケンスに対応するタンパク質、つ まりそれぞれが調節シーケンスＲと感知（センサー）シーケンスＳに対応してい るタンパク質の制御下にあることにより特徴付けられている。

タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　ＳとＶａｎＲとは２つの構成要素に対する調節系を構成 しており、ＶａｎＲは転写を活性化し、ＶａｎＳはＶ　ａ　ｎ　Ｒに依存してい る転写を増進している。ＶａｎＳは。

外部培地に示されたバンコマイシンに応答してＶ　ａ　ｎ　Ｒのホスホリレーシ ョンのレベルを変化させることができ、従ってバンコマイシンに対する抵抗力を 有する遺伝子の転写の制御に干渉する。

それらの調節シーケンスは９本発明のポリペブタイドに含まれた抵抗タンパク質 の発現を助長する範囲内で、特に、抵抗のレベルを増大することができる。

本発明の有利な実施をするための別の態様では、上記組成物のポリペブタイドは 、前述した５つのタンパク質をコードするシーケンスを表すところの、シーケン スリストにおいてＳＥＱ　ＩＤＮｏ６として示すシーケンスによってコードされ ている。

本発明の別のシーケンスは、トランスボ七−ス（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）　（ シーケンスのｂｒｉｎ（＞にてコードされている）をコードするＳＥＱ　（Ｄ　 Ｎｏ６の下流の連鎖のように、　５ＥＱＩＤＮｏ６を含むＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　 １１として示され、そしてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ。

６の下流の連鎖は３８ｔｌの繰り返し逆転シーケンスの遺伝子ｖａｎＹ及び遺伝 子ｖａｎＺならびにそれぞれの末端に対応している。ＳＥＱ　［ＯＮｏ　１１は 、遺伝子がグリコベブタイドに対する抵抗力を確立するのに異なるレベルで干渉 するトランスポゾンを構成している。

同様に１本発明は、前述した組成物ならびにポリペブタイドに属する精製タンパ ク質を目的としている。特に１本発明は。

シーケンスリストにＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２として示したアミノ酸シーケンスに対 応することを特徴とする精製タンパク質ＶａｎＡまたは遺伝子ｖａｎＡとハイブ リダイゼーションできる遺伝子によってコードされているタンパク質Ｖ　ａ　ｎ 　Ｃを対象にしている。

タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ａは３４３個のアミノ酸からなり、理論分子量は３７４ ００Ｄａである。タンパク質ＶａｎＣは３４３個のアミノ酸からなり、理論分子 量は３７４０４Ｄａである。

本発明の構成において関係のある別のタンパク質はシーケンスリストにＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏｌ　（Ｖａ　ｎＨ）、　ＳＥＱ　ｆＤ　Ｎｏ３　（Ｖａ　ｎＸ）。

ＳＥＱ　ｆＤ　Ｎｏ４　（Ｖ　ａ　ｎ　Ｒ）およびＳＥＱ　１０　Ｎａ５　（Ｖ 　ａ　ｎ　Ｓ）として示されたシーケンスに対応している。

ＳεＱＩＤＮｏｌによって同定されたシーケンスは、遺伝子ＶａｎＨによってコ ードされたタンパク質ＶａｎＨを含んでいて。

そのタンパク質は３２２個のアミノ酸からなっていて、メチオニンから始まって いる。そのタンパク質はペプチドグリカンの合成に関わる酵素であって、３５７ ５４ｋＤａの分子量を有している。タンパク質ＶａｎＨは、２−ケトカルボン酸 を形成するための対応する２−ヒドロキシカルボン酸のＮＡＤ十に従属する酸化 反応を触媒するデヒドロゲネースに類似するあるいくつかのものを提供する。実 際は、タンパク質ＶａｎＨはＮＡＤ十よりもむしろＮＡＤＰ十を使用している。

同様に、タンパク質ＶａｎＨは、恐らく直接に基質の結合に関係していて、触媒 の作用をしている。タンパク質ＶａｎＨはリガーゼＶａｎＡの基質の合成に関与 している。タンパク質ＶａｎＡの基質はＤ−α−ヒドロキシカルボン酸であって 、これは、バンコマイシンとＮ−アセチル−Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニンと間に 形成された水素結合がＤ−アラニン末端のＮＨ基と結合することによって水素結 合が無くなって、ペプチドグリカンの前駆物質とバンコマイシンとの結合に作用 するアミノ酸りの場所にタンパク質Ｖ　ａ　ｎ　ＡによってＤ−アラニンと縮合 している。ｒＡｌａＪは「アラニン」の略語である。

本発明者はタンパク質ＶａｎＡとＶａｎＨにおける相互作用を明らかにし、特に 次のように述べている。つまり、タンパク質ＶａｎＡ（その基質のために変更さ れた特異性を持つリガーゼＤ−Ａ　ｌ　ａ　：　Ｄ−Ａ　Ｉ　ａ）の性質はタン パク質Ｖ　ａ　ｎ　ＡによるＤ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｄ−Ａ　１　ａの異なる新規な 構成物の生合成に関与するグリコベプタイドに対する抵抗を可能にし、そのベブ タイドはペプチドグリカンに導入されているがバンコマイシンによっては認識さ れない。特に、遺伝子ｖａｎＨの生成物における特異的なα−セト酸レしクテー スＤとの類似性を観察すると。

その構成物がアミノ酸りは有していないが、ヒドロキシ酸りを有していることが 決定されている。このヒドロキシ酸りはしたがってペプチドグリカンの新規なデ ブシベプタイド前駆体を生成するタンパク質ＶａｎＨによってＤ−アラニンと関 連してい本発明は、上記タンパク質の１つもしくはそれ以上を含むハイブリッド タンパク質や、決定されたアミノ酸シーケンスに関連するそのタンパク質と同様 に、抵抗複合体のその異なるタンパク質のすべての組み合わせを対象としている 。

さらにまた７本発明の枠組みにおいて、ヌクレオチドシーケンスは前述したアミ ノ酸シーケンスの１つをコードしている。

ある特定のシーケンスは、前出の刊行物（レクレルクら＝１９８８年）に記載さ れたプラスミドｐＩＰ８１６から得られるところの制限フラグメントＨｉｎｄＩ 　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩに対応する約７．３ｋｂのヌクレオチドシーケンスである 。

その７．３ｋｂのシーケンスは３つの抵抗のタンパク質と。

上記において問題とされる２つの調節タンパク質とをコードするヌクレオチド連 鎖を含んでいる。コードされたそれらのシーケンスは内部フラグメントＢｇ　Ｉ 　Ｉ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉに含まれている。同様にそれらはトランスポセースおよび レゾルベースのコードされたシーケンスの部分を含んでいる。

本発明は、制限フラグメントＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩのすべての部分、 特に、抵抗タンパク質３つをコードする約３゜４ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＩ −ＸｂａＩもしくはタンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ａをコードする約１．７ｋｂのフラ グメントＥｃｏＲＶ−３ａｃＩＩまたは２つの調節タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｒと ＶａｎＳをコードする制限フラグメントＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩと同様 に、上記制限フラグメントを含むヌクレオチドフラグメントを対象にしている。

本発明のヌクレオチドシーケンスの別の定義は、前述したｐＩＰ８１６から得ら れた下記制限部位の順番に含まれるヌクレオチドフラグメントに相当している。

つまり、ＨｉｎｄＩＩＩ。

ＢｇｌＩ　Ｉ、ＢｇｌＩ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａ　Ｉ。

ＥｃｏＲＩ０ 本発明による別のヌクレオチドシーケンスは、　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ７゜ＳＥＱ 　ＩＤ　Ｎｏ６．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｌ　１またはＳＥＱ　１０　Ｎｏ　２２ によって同定されたシーケンスの中から選ばれた連鎖に対応するシーケンスまた はその連鎖もしくはその連鎖のすべての部分、さらには全ての連鎖もしくは相補 ＤＮＡ連鎖もしくはそのＤＮＡの１つに対応するＲＮＡの連鎖によって特徴付け られる。そのシーケンスは、特にダラム陽性球菌群の菌種において、グリコベグ タイド群の抗生物質、特にバンコマイシンおよび／またはティコプラニンに対す る抵抗を検出するためのハイブリダイゼーションのプライマーを構成しているか 、それとも特にダラム陽性球菌群の菌種において、グリコペグタイド群の抗生物 質、特にバンコマイシンおよび／またはティコプラニンに対する抵抗を発現する ために必要なまたは関連しているシーケンスをコードしているかのいずれかであ る。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ７のシーケンスは、３つの抵抗タンパク質ＶａｎＨ，Ｖａｎ ＡおよびＶａｎＸをコードしている。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２２とＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１１のシーケンスは９図７ａに 示すトランポゾンを含んでいて、このトランボゾンは、たとえば、抵抗の表現型 を得るために必要な遺伝子の発現の調節に関与する抵抗か、または得られた抵抗 ポリペブタイドの量に関与する抵抗に関連する遺伝子のように、グリコベブタイ ドに対する抵抗力の発現に必要な遺伝子を含んでいる。

上記定義に対応する特定のシーケンスは下記シーケンスのうちの１つである。つ まり。

Ｖｌ：　ＧＧＸ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＸ　ＴＣＸ　ＴＴＸＧＣＡＧＣ ＣＡＡ　ＧＧＸ または Ｖ２：　ＡＡＴ　ＡＣＸ　ＡＴＸ　ＣＣＸ　ＧＧＸＣＴ ＴＴＴ　ＡＣ シーケンスＶ１とｖ２とは、遺伝子ｖａｎＡとｖａｎＣを検出するために調べら れた特異性の程度にしたがって、その他のヌクレオチドに関連した場合にはプラ イマーを構成することが可能であり、まるで連鎖ポリメライゼーション反応の開 始端のように使用される。

ヌクレオチドの好ましい別の連鎖は、　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８．　ＳＥＱ　ＩＤ Ｎｏ９．　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ１Ｏ，ＳＥＱ　ＩＤＮｏ２１．　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ １２　（）ランスボセース）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ１３　（レゾルベース）　 、　ＳＥＱ　１０　Ｎ。

１４　（ｖａｎＹ）、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ１５　（ｖａｎＺ）、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ ２３　（ｖａｎＲ）、またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２４　（ｖ　ａ　ｎ　Ｓ）の連 鎖。

またはＳＥＱ　ＩＤＮｏ８　（ｖａｎＡ）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ９　（ｖａｎ Ｈ）　。

ＳＥＱ　１０　ＮｏＩ　Ｏ（ｖ　ａ　ｎＸ）またはＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ２１　（ ｖ　ａ　ｎＣ）　。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｌ　２　（トランスボセース）、　５ＥＱＩＤＮｏ１３　（ レゾルベース）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ１４　（ｖａｎＹ）　、　ＳＥＱ　ＩＤ Ｎｏ１５　（ｖａｎＺ）、ＳＥＱ　ＩＤＮｏ２３　（ｖａｎＲ）、ＳＥＱ　ＩＤ Ｎｏ２４　（ｖａｎＳ）にて示される連鎖にてコードされたタンパク質のそれに 類似している免疫学的および／または機能的な性質を有するタンパク質をコード しているその連鎖の１つの変異種もしくはグリコベグタイド群の抗生物質に対す る抵抗力を有する菌種を検出することが可能であるところの連鎖である。

変異種には下記性質を有するシーケンスのフラグメントの全てを含んでいる。こ のシーケンスは、抵抗タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｈ＊ＶａｎＡ及びＶａｎＸをコー ドしている。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ８で命名されたヌクレオチドシーケンスは、プラスミドｐＡ Ｔ２１４（図６）上の位置３７７のコドンＡＴＧと位置１４０６のコドンＴＧＡ との間に位置する１０２９ｐｂのＤＮＡフラグメントに相応している。

本発明は同様に、５つのタンパク質（２つの調節タンパク質と３つの抵抗タンパ ク質Ｖ）をコードしたシーケンスに対応し。

かつ、同じようにコードされたシーケンスに関連する並列シーケンスを含むまた はその連鎖を含むＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６で同定された連鎖に相当するヌクレオチ ドシーケンスを対象としている。

本発明の枠組みの中には同様に、並列シーケンスが欠落することによって特徴付 けられるＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６について修飾されたシーケンスが含まれる。この 並列シーケンスは後記の様に表されかつ次のように定められる連鎖である。つま り。

−図５のシーケンスの塩基１と塩基１４７６の間のＲをコードするシーフェンス の上流の連鎖 一図５のシーケンスの塩基３３４７と塩基３５００の間の感知タンパク質Ｓおよ び０ＲＦＩをコードするシーケンスの間の連鎖、または 一図５のシーケンスの塩基６１６８と塩基７２２７の間の０ＲＦ３をコードする シーケンスの下流の連鎖。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６と名付けられたシーケンスはまた次の順序の部位を含むフ ラグメントによって特徴付けられている。つまり。

Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ０調節タンパ調節タ ンパ抗質ンパク質の位置は図３に示している。

本発明者は、定められたレベルのグリコベブタイドに対する抵抗力の発現に必要 なまたは関連する遺伝子ｖａｎＲ，ｖａｎＳ、ｖａｎＨ，ｖａｎＡおよびｖａｎ Ｘの上流並びに下流に、トランスボセース及びレゾルベース（上記グループの上 流に）及び遺伝子ｖａｎＹとｖａｎＺ　（そのグループの下流に）をコードする 遺伝子を同定した。トランスボセースならびにレゾルベースの遺伝子は形質転換 に関与していて、Ｄ、Ｄ−カルボキシベブチデースをコードする遺伝子ｖａｎＹ は、ペプチドグリカンの代謝に関与し、かつ、たとえ複製の数を増やしたプラス ミドに含まれる遺伝子ｖａｎＲ，ｖａｎｓ、ｖａｎＨ，ｖａｎＡおよびｖａｎＸ が琳独で高いレベルの抵抗を付与したとして。

Ｅ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７についてのグリコペプタイドに対する抵抗力に 寄与している。

トランスボヤースをコードするシーケンスは、遺伝子ｖａｎＲ，ｖａｎｓ、ｖａ ｎＨ，ｖａｎＡ、ｖａｎＸ、ｖａｎＹ、ｖａｎＺならびにレゾルベースをコード すルＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２２　テ示されるシーケンスのｂｒｉｎ（）上に位置 していることには注目に値する。

本発明は下記シーケンスリストにて同定したＤＮＡシーケンスばかりでなく相補 ＤＮＡシーケンスや対応するＲＮＡシーケンスをも対象としている。本発明はそ の上、前述したタンパク質、ポリペブタイドもしくはそれらのフラグメントの発 現の点でまたは１例えば連鎖ポリメライゼーション反応による。バンコマイシン やティコプラニンのようなグリコベグタイド群の抗生物質に対する抵抗力を有す るグラム陽性バクテリアの菌種を検出する能力の点で均等な前記シーケンスにも 関している。

同様に本発明には、上記ヌクレオチドシーケンスの１つを含む組換えシーケンス によって特徴付けられる。

本発明はまた。上記ヌクレオチドシーケンスの１つを含むこと、特定された宿主 についての特にバンコマイシンやティコプラニンのような抗生物質に対する抵抗 力の発現を干渉することができる調節要素の制御下において複製にとっては必須 ではない部位に上記ヌクレオチドシーケンスの１つが含まれていることを特徴と する組換えベクターに関する。

本発明を実施するに当たって特に有利な組換えベクターは次のベクターである。

つまり、タンパク質ＶａｎＡをコードするヌクレオチドシーケンスを含む１７６ １ｂｐのフラグメントＥｃｏＲＩ−３ａｃ　Ｉ　Ｉを含むｐＡＴ２１４であり１ 本発明のシーケンスはプロモーター１ａｃのようなプロモーターの制御下にある ベクター内に配置するのが有利である。

本発明は更に、バンコマイシンおよび／またはティコプラニンのようなグリコペ グタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現に関わる条件下で、前記したような ヌクレオチドシーケンスまたは前述したベクターを含む組換え細胞宿主を対象と していて、その宿主は例えば特にグラム陽性球菌のようなバクテリアから選ばれ る。

本発明はまた酵母、菌類、昆虫細胞またはは乳動物にも適用できる。

同様に本発明は、前出のシーケンスとハイブリダイゼーションができることを特 徴とするヌクレオチドブライマーを対象とし、そのプライマーは必要により標識 が付けられる。そのプライマーはグリコベプタイドに対する抵抗を有するタンパ ク質を特定している場合もあり、また特定していない場合もある。

本発明に使用される標識物質には１周知の放射性標識物質と同様に酵素標識物質 や化学蛍光標識物質のようなその他の標識物質も含まれる。

そのように標識されたプライマーはグラム陽性バクテリアについてのグリコペブ タイドに対する抵抗力を検出するためのハイブリダイゼーションによる試験に利 用できる。その場合には。

厳しくない条件を使用できる。

本発明に係るヌクレオチドブライマーは、特にバンコマイシンおよび／またはテ ィコプラニンのようなグリコペブタイドに対する抵抗力を持つタンパク質をコー ドするシーケンスをグラム陽性バクテリアについて特定することを特徴とし、そ のプライマーはその上そのシーケンスの中で包括的である。

本発明においては、感受性菌種全体について示されたシーケンスと交差ハイブリ ダイゼーション反応も増殖（ＰＣＲ）反応も示さないような１本発明の前記タン パク質の１つをコードするヌクレオチドシーケンスと、特定されたそのプライマ ーによってハイブリッドされた全てのオリゴヌクレオチドが含まれる。

連鎖ポリメライゼーション反応（ＰＣＲ）に使用できるオリゴヌクレオチドに包 括的な特長はグリコベグタイド群の抗生物質に対する抵抗力を持つグラム陽性バ クテリアのどれか１つの菌種についての抵抗に関わるヌクレオチドシーケンスの 増殖を特異的に促進する能力によって決定される。

本発明に係るヌクレオチドプライマーの部分は調べた利用の機能が異なっていて もよい。ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドはその技術において通常の長さ のフラグメントに左右される。そのプライマーを作製するためには９例えば２０ ０個のヌクレオチドのプライマーフラグメントのような本発明のシーケンスの全 ての部分を用いる。

本発明を実現する特定の実現態様によれば、ヌクレオチドブライマーは特にバン コマイシンやティコプラニンのようなグリコペグタイド群の抗生物質に対する抵 抗力を高いレベルで持つグラム陽性バクテリアについての発現に必要なタンパク 質をコードするヌクレオチドシーケンスの特異性またはそのヌクレオチドシーケ ンスに基づいて選択される。

関係のあるプライマーの例としては、遺伝子ｖａｎＡの遺伝子間部分中から選択 することができる。

本発明の実現のために有利な別のプライマーは、前記定義によって包括的である が、抵抗遺伝子にとっては特異的ではない性質によって特徴付けられる。それら はＰＣＲの開始端としても同様に使用され、それらは次のように示される。つま り。

Ｖｌ：　ＧＧＸ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＸ　ＴＣＸ　ＴＴＸＧＣＡＧＣ ＣＡＡ　ＧＧＸ Ｖ２：　ＡＡＴ　ＡＣＸ　ＡＴＸ　ＣＣＸ　ＧＧＸＣＴ ＴＴＴ　ＡＣ ｖｌとｖ２とは遺伝子ｖａｎＡとｖａｎＣとハイブリダイゼーションされ、グリ コペブタイドに対する抵抗力に関連するタンパク質を別の微生物について検出す ることができる。

本発明の特有の別のプライマーは、特にグラム陽性バクテリアについて特にバン コマイシンのようなグリコペグタイド群の抗生物質に対し低いレベルの抵抗の発 現に必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケンスの特異的な性質を有 している。

同様に、タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ａをコードする遺伝子ｖ　ａ　ｎ　Ａのシーケ ンスに由来するオリゴヌクレオチドのプライマーは高いレベルまたは低いレベル の抵抗を一様に調べるために使用することができる。

本発明においては、特に好ましい型のプライマーは、特にバンコマイシンおよび ／またはティコプラニンのようなグリコベブタイドに対する抵抗力を持つダラム 陽性の菌種の染色体もしくは非染色体のヌクレオチドシーケンスとのハイブリッ ド、特にダラム陽性の球菌２例えば腸内球菌、好ましくはＥ、ｆａｅｃ　ｉ　ｕ ｍＢＭ４１４７もしくはＥ、ｇａ　］　ｌ　ｉｎａ　ｒｕｍの染色体もしくは非 染色体のヌクレオチドシーケンスとのハイブリッドによって特徴付けられる。

高いレベルの抵抗を持つ菌種を低いレベルの抵抗を持つ菌種から識別するために は、厳しい条件を使用したハイブリダイゼーションによる試験を行う。

本！！明のオリゴヌクレオチドは制限酵素で切断したり、または古典的な方法に よる化学合成によって得られる本発明のシーケンスから得ることができる。

さらに１本発明は、上記ポリペブタイドまたは前記アミノ酸シーケンスを認識す るポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を対象にしている。

それらの抗体は抗体製造の古典的な方法に従って製造することができる。特にモ ノクローナル抗体は、コーラ−・ミルシュタインの方法に従って製造される。こ の方法は、古典的な方法によって事前に本発明のポリペブタイドまたはその組成 物で免疫したマウスの肺臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることによってモ ノクローナル抗体を製造する方法である。

本発明のモノクローナル抗体は、特にバンコマイシンならびにティコプラニンに 対する抵抗力によって特徴付けられるタンパク質の存在を検出するために有利に 使用できる。

特に関係のある抗体はタンパク質ＶａｎＡまたはタンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｃに対 するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体である。これらの抗体は、グ リコペグタイド群の抗生物質に対して高いレベルの抵抗力を持つ特にグラム陽性 球菌のようなバクテリアの菌種を有利に検出できる。その場合、検出のためにマ ウスの試料細胞を事前に溶解する段階では、その試料を抗体と前もって接触させ ることができる。

その検出を可能にするためには、たとえば放射性物質もしくはその他で１１！識 した抗体を使用するのが有利である。

したがって１本発明の枠組みによれば、グリコベブタイドに対する抵抗力をグラ ム陽性バクテリアについて検出するための試験にはＥＬＩＳＡ法が使用される。

たとえばＥ、ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ、ｇａ　Ｉ　］　ｉｎａｒｕｍなどのた とえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／ま たはティコプラニンなどのグリコベブタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌 種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断するためのキットは、下記を含むものとして 特徴付けられるニ ー　標識された場合には上記定義に応答する抗体−抗体−抗原免疫反応の検出の ための試薬−必要に応じて、試験試料の細胞を溶解するための試薬。

その他１本発明者によって完成された手段は、連鎖ポリメライゼーション反応（ ＰＣＲ）によるグリコベブタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌種の検出す るための迅速がり信頼性のある試験またはキットを実現するために適合されるま ったく興味のある利点を提供する。そのような試験は、あまり信頼性が高くなく かつある場合にはグラム陽性バクテリアについてのグリコペプタイドに対する抵 抗力を持つタンパク質をコードする遺伝子群の代表的な全てを検出できる現行の 試験の感度を改良することができる。

そのタンパク質の遺伝子を増殖する方法による試験はＰＣＲ法によってまたはＩ ＰＣＲ（逆連鎖ポリメライゼーション反応の略語）法によって行うことができる 。

ＩＰＣＲ法は、検出が望まれている遺伝子の末端ＮＨ２およびＣ０ＯＨ領域を増 幅する二とができる。

ある特定の開始端は弱いレベルの抵抗菌種の遺伝子を増幅することが可能である 。その開始端はたとえば抵抗タンパク質ＶａｎＡをコードするシーケンスから遺 択される。

たとえば、後述するシーケンスの例はＰＣＲ法またはＩＰＣＲ法による増幅をを 検出するためのプライマーを製造するための開始端として使用することができる 。つまり。

Ｖｌ：　ＧＧＸ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＸ　ＴＣＸ　ＴＴＸＧＣＡＧＣ ＣＡＡ　ＧＧＸ Ｖ２：　ＡＡＴ　ＡＣＸ　ＡＴＸ　ＣＣＸ　ＧＧＸＣＴ ＴＴＴ　ＡＣ （式中、Ｘは塩基Ａ、Ｔ、ＣおよびＧのうちの１つを表すかまたはイノシンの場 合にはその全てに対応するン 本発明は、当然のことながら、場合によっては、それが対応するＲＮＡプライマ ーと同様な前述したオリゴペプタイドの相補性プライマーを対象としている。

たとえばＥ、ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ、ｇａ　ｌ　ｌ　ｉｎａｒｕｍなどのた とえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／ま たはティコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性菌 種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断するためのキットは、下記を含むものとして 特徴付けられるニ ー　上記定義に応答するヌクレオチドのプライマー及び場合によリ −ｍべるシーケンスの増幅をするために必要な量のオリゴヌクレオサイドトリホ スフェート −ハイブリダイゼーションのバッファー−ＤＮＡのポリメライゼーション剤 同様に、たとえばＥ、ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ、ｇａｌｌｉｎａｒｕｍなどの たとえば腸内球菌などの特に球菌に属するところの特にバンコマイシンおよび／ またはティコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つグラム陽性 菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出する方法は、下記のステップを含むものと して特徴付けられる： ａ）抵抗菌種を含む余地がある生物試料を、グリコペプタイドに対する抵抗力を 発現するために必要な対象ヌクレオチドシーケンスとハイブリダイゼーションが できるところの、上記ヌクレオチドシーケンスから構成されている開始端と、ま たは前記シーケンスの部分全と接触させる手段からなり、それらのシーケンスを マトリックスとして、その開始端とハイブリダイゼーションされるそれぞれのヌ クレオチドシーケンスに対して、マトリックスに相補するそれぞれの開始端から の延長生成物が合成されるようなハイブリダイゼーションの条件下で、４つの異 なるオリゴヌクレオサイドトリホスフェートとポリメライゼーション剤の存在下 にて使用するステップ ｂ）そのマトリックスおよび得られた延長生成物の分離ステップであって、その ときに後者をマトリックスのように作用させるステップ Ｃ）対象ヌクレオチドシーケンスを検出できる量を得るための上記ステップａ） を繰り返すステップｄ）該ヌクレオチドシーケンスの増幅生成物を検出するステ ップ。

対象シーケンスの延長生成物の検出は、ＰＣＲ法またはＩＰＣＲ法を実施するた めに使用される開始端と同一のプライマーまたはプライマーが標識されている場 合には該開始端とは異なる該プライマーによって可能である。

ＰＣＲ法を使用する手段に関する詳細は特許公報ＥＰＯ２２９７０１およびＥＰ Ｏ２００３６２に記載されている。

本発明のその他の利点並びに特徴は下記例並びに図から明らかである。

図面の説明 図１＝メンブレン分画のタンパク質をポリアクリルアミドＳＤＳ　（ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）ゲルで電気泳動した図で、ラインｌと４とは分子量がＮ！ｓのものを示 し、ライン２はバンコマイシンの不存在下で培養したＥ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４ １４７を示し、ライン３はバンコマイシン１０マイクログラム／ｍｌを含む培地 で培養したＥ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７を示している。矢印の先端はは抵抗 タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ａの位置を示す。

図２ＡニブラスミドｐＡＴ２１３とｐＡＴ２１４の挿入体の制限地図。ベクター とＤＮＡの挿入体とは明るい色の断片と暗い色の断片とからそれぞれ識別されて いる。矢印の後方は遺伝子ｖａｎＡを示している。

図２Ｂ゛プラスミドｐＡＴ２１４中の１７６１ｂｐの挿入体に対するヌクレオチ ドシーケンスのためのストラテジー。

矢印はジデオキシ法によるシーケンス反応の方向と範囲を示している。オリゴヌ クレオチドの合成開始端（５″ＡＴＧＣＴＣＣＴＧＴＣＴＣＣＴＴＴＣ３’　Ｏ Ｈ）は位置３６１と位置３７８との間のシーケンスと相補的である。関係する制 限位置をただ１つ示している。

図３＝シーケンスＲ，Ｓ、０ＲＦＩ、○ＲＦ２，０ＲＦ３の位置。

図４：ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ６を示す。

図５：ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ６と対応するタンパク質を示す。

図６：遺伝子ｖａｎＡと対応するタンパク質のシーケンス。

図７ａ二遺伝子ｖａｎＲ，ｖａｎｓ、ｖａｎＨ，ｖａｎＡ。

ｖａｎＸ、ｖａｎＹ、ｖａｎＺ、トランスポセースの遺伝子、レゾルベースの遺 伝子、並びにトランスポゾンの末端には３８ｂｐの繰り返し逆転末端シーケンス の局在場所を示している。

（ｂ）ニブラスミド地図作成法。（Ａ）プラスミドｐＡＴ２９のポリリンカーと その研究中に組み立てられた誘導体。

矢印Ｐ２はａｐｈＡ３のプロモータＰ２の位置及びオリエンテーションを示して いる（Ｃａｉｌｌａｕｄ　ｅｊ　ａｌ：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ。

Ｇｅｎｅｌ、：　２０７．５０９−５１３．１９８７）。　（Ｂ）プラスミドｐ ＡＴ８０の挿入体。白抜き長方形印はプラスミドＴＩＡＴ２９のＤＮＡを示すが 、その寸法を示しているのではない。矢印で終わる長方形はコードされたシーケ ンスを示している。

上下方向並びに水平方向の直線の矢印はそれぞれプラスミドｐＡＴ８０の誘導体 中の遺伝子ａ　ｐ　ｈ　ａ−１の位置とオリエンテーションを示している。制限 位置は次の通りである。つまり、Ａｃ、ＡｃｃＩ　：ＢａｍＨＩ　；Ｂｇ、Ｂｇ ｌＩ　Ｉ　：Ｂｓ、Ｂｓ　ｓＨＩ　Ｉ　；Ｅ、ＥｃｏＲｉ　：Ｈ，Ｈｉｎｄｌ　 Ｉ　Ｉ　：Ｈｃ、Ｈｉｎｃ　Ｉ　Ｉ　；に、ＫｐｎＩ　；Ｐ、Ｐｓｔ　Ｉ　：Ｓ 、Ｓｍａ　Ｉ　；ＳＩ、５ａｃＩ、ＳＩ　Ｉ、５ａｃＩＩ　；Ｓａ、Ｓａ　Ｉ　 Ｉ　；ｓｐ、５ｐｈｒ　；ｘｂ、Ｘｂａ　Ｉ。

（Ｃ）プラスミドｐＡＴ８６．ｐＡＴ８７．ｐＡＴ８８およびｐＡＴ８９への挿 入体。その挿入体は直線で示し、対応するベクターは０印で示している。

図８＝図７で示したトランスポゾンのヌクレオチドシーケンスと対応するタンパ ク質のアミノ酸シーケンス。ヌクレオチドシーケンスは、その上にトランスポセ ースのコードシーケンスが局在するｂｒｉｎ（十）とｂｒｉｎ（−）（位置１か ら位置３１８９までに局在しているｂｒｉｎ（＋）と相補的であるシーケンスに 対応している）。

図９　遺伝子ｖａｎＣ含むプラスミドｐＡＴ２１６の１３４７ｂｐの５ａｃＩ− Ｐｓｔｌのフラグメントのヌクレオチドシーケンス。番号は制限部位５ａｃＩの 最初の塩基Ｇから付けられている。位置２１５の翻訳開始コドンＡＴＧの上流の 潜在的なシーケンスＲＢＳには下線を付けている。

５ＴＯＰ　（ＴＧＡ）コドンには＊印を付けている。遺伝子ｖａｎＣのコード領 域ならびにそのアミノ酸シーケンスは太く肉付けした文字で示している。重なっ たシーケンスのクローンはバクテリオファージＭ１３ｍＰ　１０　（英国アマジ ャム社）中でのプラスミドｐＡＴ２１６のサブクローンの制限フラグメントによ って作製される。包括的な開始端（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　 Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）は組換えファージの挿入体をシーケンスするために使用 される。このシーケンスはＤＮＡポリメレースＴ　７　（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ； 　ＵＳ　Ｂ　ＣｏＲＰ社製：アメリカ国オハイオ州）と［α−３５３］　ｄＡＴ Ｐ　（英国アアマシャム社製）を使用してヌクレオチドジデオキシ法（サンガー らＰＮＡＳ；　７４．５４６３−５４６７、１９７７）によって行われる。

反応生成物は６％変性ポリアクリルアミドのゲル上に注入された。

図１０　タンパク質ＶａｎＣ，ＶａｎＡ、ＤｄｌＡ及びＤｄＩＢのアミノ酸シー ケンスの配列。　（Ｉ）で示したアミン酸と４つのシーケンス中の保存代替（Ｃ ）は配列中に示している。保存代替を分類するために、アミノ酸を次のようにグ ループ分けした。つまり、ＲＫ、ＬＦＰＭＶＩ、５ＴＱＮＣ，ＡＧＷ、Ｈ，ＥＤ およびＹｏ　ドメイン１．　２．３及び４の同族（ホモローブ）部分の領域には 下線を付けている。ベブタイド１および２に相当するシーケンス早印で示してい る。

図１１：オリゴヌクレオチドｖ１およびＶ２の説明。

（Ａ）：タンパク質ＶａｎＡとリガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａ１ａのペプチド１お よび２のアミノ酸シーケンス。Ｎ末端基とペプチド１との間、ペプチド１と２と の間およびペプチド２とＣ末端基との間のアミノ酸の番号が付けれている。

３つのシーケンスのうち少なくとも２つのシーケンスの間の同定されたアミノ酸 を太く肉付けした文字で表している。

（Ｂ）：目標ペプチドとそのヌクレオチドシーケンス。ＸｌまＤＮＡの何らかの 塩基を示す。ＤｄｌＢのペプチド２は２つの位置（＊印を付けた）で目標ペプチ ドとはそのレベルが異なっている。

（Ｃ）：ＶｌとＶ２とのヌクレオチドシーケンス。交互ヌクレオチドとＤＮＡの 全塩基に相当するデオキシイノシン（１）は変異した目標ペプチドをコードする ヌクレオチドシーケンスのための位置に利用される。矢印はＤＮＡ合成の方向を 示している。オリゴヌクレオチドはバイオシステムＤＮＡ３８０Ｂ装置（米国ア プライドバイオシステム社製）を使用してメトキシホスアラミド法によって合成 された。ＤＮＡは、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムプロミド（米国１ｎｓ ｉ　ＢＩａｌｅｃｂｎｏＩｏｇＩｅｓ社製）で抽出することによってバクテリア 溶菌物から単離され（Ｌｅ　Ｂｏｕｇｕｅｎｅｃ　ｅｔａｌ：　Ｊ、　Ｂａｃｌ ｅｒｉｏｌ、：　１７２．７２７−７３４．１９９０）　、そしてマビラート等 の記載にしたがって（Ｐｌａｓｍｉｄ：　２３．２７−３４．１９９０）。

温度制御システム（インテリゼント・ヒイーテイング・ブロック：　ＩＢＨＩＯ Ｉ　；英国ハイパジッド社製）を用いてＰＣＲによる増幅のためのマトリックス として使用した。

増幅生成物は、エチジウムプロミドで着色した後、０．８％ゲルで電気泳動して 明らかにした。

図１２：遺伝子ｖａｎＣの挿入による不活性化。遺伝子ｖａｎＣは白抜きの矢印 で示していて、６９０ｂｐのＥｃｏＲｌ−ＨｉｎＣＩＩの内部フラグメントは斜 線を入れて示している。最後の線はプラスミドｐＡＴ１１４のＤＮＡを示してい て、太線はＰＭ４１７４のクロモシームＤＮＡを示し、矢印は抗生物質に対する 抵抗力のある遺伝子を示していて、ａｐｈＡ−３は３”−アミノグルコシドホス ホトランスフェレースをコードする遺伝子であり、ｅｒｍはＥＲＲメチルトラン スフェレースをコードする遺伝子である。

（Ａ）ニブラスミドｐＡＴ２１７はプラスミドｐＡＴ２−１６のフラグメントＥ ｃｏＲＩ−ＨｉｎＣＩ　ＩをＥｃｏＲＩとＳｍａＩで消化した自滅ベクターｐ　 ＡＴ　１１４　（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｌ　ｅＩａｌ：　Ｇｅｎｅ：　１０６．２ １−２７；１９９１）で連結して構成されている。

（Ｂ）：８Ｍ４１７４のクロモシームＤＮＡのｖａｎＣの領域。

（Ｃ）：ＰＡＴ２１７の融合後のｖａｎＣの領域。

図１３：８Ｍ４１７４の遺伝子ｖａｎｃ中へのｐＡＴ２１７の融合についてのサ ザンプロットによる分析。

（左側の部分）：ＥｃｏＲＩで消化され１％アガロースゲルで電気泳動されて分 解されたＢＭ４１７５（ライン２）と８Ｍ４１７４（ライン３）の全ＤＮＡ０Ｐ ｓ　ｔ　Ｉで消化したバクテリオファージラムダのＤＮＡは分子量の標準として 使用した（ライン１）。ＤＮＡは真空装置（Ｔｔａｎｓ−Ｖａｃ　ＴＥ８０；米 国Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｓ＋ｔｕｍｅｎｌｓ社製）を使用 してメンブレン（Ｎｙｌｒａａ；米国５ｃｈｌｅｉｃｂｅｒ　＆　５ｃｂｕｅｌ １社製）上を真空で移動させ、モしてＵＶ照射によってメンブレンに結合させた 。ハイブリダイゼーションはプライマーＣ（中央）またはｐＡＴ１１４に特異的 であるプライマーａｐｈＡ−３に対して行った（Ｌａｍｂｅｒｊ　ｅｔａｌ：　 Ａｎｎａｌｅｓ　ｄｅ　ｌ’Ｉｎ５ｊｉｔｕ４ｅ　Ｐａ５ｔｅｕｒ／Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏ１．；　１３６（ｂ）、　１３５−１５０．１９８５）。

（右側の部分）ニプライマーは切断断片を翻訳することによって３２Ｐ標識を付 けた。分子量（ｋｂ）を示している。

図１４：Ｅ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７からのタンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｓおよ びＥ、ｃｏｌｉのＰｈｏＲとＥｎｖＺからのアミノ酸シーケンスの配列。左側の 番号は配列中の最初のアミノ酸の位置を示している。右側の番号は対応する列の 最後のアミノ酸の位置を示している。同定されたアミノ酸は枠で囲んでいる。点 線は類似物を最適化するために入れた欠落部分を示している。線は外部ＨＰＫ中 のアミノ酸を保存しているモチーフの位置を示している。太い字で示したモチー フ■中のヒスチジン残基はオートホスホリレニージョンの潜在位置である。

図１５：Ｅ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７のＶａｎＲとＥ。

ｃｏｌｉのＯｍｐＲとＰｈｏＢならびにＳａ１ｍｏｎｅ１１３　ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｉｕｍのＣｈｅＹのアミノ酸シーケンスの配列。右側の番号は対応する列の最 後のアミノ酸の位置を示している。同定されたアミノ酸は枠で囲んで示している 。点線は類似物を最適化するために入れた欠落部分を示している。太い字で示し た残基は外部のＲＲの効果ドメイン中に強く保持されているアミノ酸に対応して いる。

ＣｈｅＹのアスパラギン酸残基５７はＣｈｅＡに関連したＨＰＫによってりん酸 化される。

遺伝子ｖａｎＶの同定法 遺伝子ＶａｎＶの同定と特徴化のための材料と方法バクテリア菌種とプラスミド 菌種またはプラスミド　源または参照 エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｂｓｒｉｃｂｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ８３　メッシン グ（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　（１９７９）ＡＲ１０６２ランバッハとホグネス （Ｒａｍｂａｃｈ　＆　Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７７）ＪＭ１０３　／’ンシャ ン（Ｈａｎｎｓｈａｎ）　（１９８３）ＳＴ６４０　ルクテンベルクとファン・ シャンデル・ファン−ダム （Ｌｕｇｊｅｎｂｅｒｇ　＆　ｖａｎ　Ｓｃｈｉｉｎｄｅｌｖａｎ−Ｄａｍ）　 （１９７３） エンテロコツカス中ファセシウム（Ｅｎｔｅｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｉｕｍ ）８Ｍ４１４７　レクレルク等 プラスミドｐｕｃ１ｇ　ノランダー等 ｐＡＴ２１３　ブリッソンーノエル等 ｐＡＴ２１４　明細書中に記載 エンテロコツカス細胞膜の製造 エンテロコツカス・ファセシウム８Ｍ４１４７をハートプレインブイヨン（培地 ブロスＢＨＩ）５００ｍｌ中で光学密度（Ｄ０６００）が０．７になるまで培養 した。誘発はバンコマイシン（米国イーライリリー社製）１０マイクログラム／ ｍ１で実施した。

最終ステージは４度で実施した。細胞は６０００Ｇで１０分間遠心分１１１１テ 分離し、バフ７７−ＴＥ　（０，０１Ｍ　ＴＲｌ５−）１ｃＩ、　０．００２Ｍ 　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，０）で洗浄し、ガラスピーズ（直径１００マイクロメー タ）に２分間ブラウン装置を用いて溶菌した。細胞残査は６０００Ｇで１０分間 遠心分離をして分離した。細胞膜は６５０００Ｇで遠心分離して回収し、バッフ ァーＴＥ０．５ｍｌ中に懸濁させた。

ミニセルの製造 プラスミドを、形質転換によって、バクテリアのサック状に調整したイー・コリ （Ｅ、　ｃｏｌｉ）ＡＲ１０６２中に導入した。バクテリアサックはしよ糖傾斜 にて回収し、タンパク質はランバッハとホグネスの方法（Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　Ｕ Ｓ；　７４．５０４１−５０４５．１９７７）に従って［３５５］Ｌ−メチオニ ン（英国アマジャム社製）５０マイクロＣ４で標識した。

イー・コリの細胞膜フラクションと細胞質フラクションの製造イー・コリＪＭ８ ３とその誘導種を光学密度［０Ｄ６００）が０゜７になるまでＢＨＩ培地にて培 養し、バッファーＴＥで洗浄し。

懸濁した。細胞懸濁液はブランソンＢ７型超音波発生装置を用いた細胞フラグメ ンテーション装置にて５０Ｗの用量で超音波で２０秒間処理し、全細胞を６００ ０Ｇで遠心分離して除去した。。上清液を１００ＯＯＯＧで１時間遠心分離して 細胞膜フラクションと細胞質フラクションとに分画した。

ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）バクテリアフラク ションのタンパク質はポリアクリルアミド　゛（７４５％−１５％）　（ラエム リ（ＬａｅｍＬＩｌｌｉ）、　Ｎａｔｕｒｅ：　２２７．６８０−６８５．１９ ７０）の直線傾斜ゲルを用いた５ＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。電気泳動は２００ ｖで１時間、３５０Ｖで３時間行った。

ゲルはクラシー色素で染色した。抽出液のタンパク質は１０％ポリアクリルアミ ドゲルで分離し、オートラジオグラフィーで発色させた。

タンパク質バンドの精製とＮ末端シーケンスの決定エンテロコツカス・ファセシ ウムＢＭ４１４７の培養液の細胞膜フラクションのタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで分離した。得られたゲルは、泳動装置（電気泳動装置ＬＫＢ２１１７マルチ フオーＩＩ）を用いて装置製造者のマニュアルに従ってポリビニリデンジフルオ ライド膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で ２００ｍＡで１時間電気泳動をした。泳動したタンパク質はボンンー赤色素で染 色し、所望のタンパク質を有する膜部分を切り出し、テフロンフィルターに装着 し、シーケンス対（アプライドバイオシステム４７０Ａ型シークエンサー）のセ ル中に装着した。タンパク質はエドマンの自動分解法によりシーケンスされた（ Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ：　１．８０−８１．１９６７）。

プラスミドの構造 プラスミドｐＡＴ２１３（プリンソンーノエル等：Ａｎ）ｉｍｉｃｒｏｂ、　Ａ ｇｅｎｔｓ　ＣｂｅｒｎｏＩｈｅｒ：　３４．９２４−９２７．１９９０）は、 ダラム陽性とグラム陰性の両性のベクターのＥｃｏＲ１部位でのエンテロコツカ スクローンのプラスミドｐＩＰ８１６の４．０ｋｂのＤＮＡフラグメントＥｃｏ ＲＩからなっている（Ｔ＋１ｅｕ−Ｃｕｏｌ　ｅｔａｌ、：ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ ｏｂｉｏｌ、　ｔ、ｅｕ；　４８．２８９−２９４．１９８７）。ｐＡＴ２１４ の構造を決めるために、ｐＡＴ２１３の１７６１ｂｐのＥｃ。

ＲＶＳａｃＩＩのＤＮＡフラグメントを精製し、イー・コリのポリメラーゼＤＮ ＡのＫ　］　ｅ　ｎ　ｏ　ｗフラグメントで処理し。

前もってＳｍａＩで消化し脱リン酸化したｐＵｃ１８のＤＮＡではり合わせた（ 図２）。クローン化は、制限酵素（ベーリンガーマンハイム・ファルマシア社製 ）、リガー−ｔ’ＤＮＡ　Ｔ４（ファルマシア社製）およびフォスファターゼア ルカリン（ファルマシア社製）を、製造者のマニュアルに従って用いて行った（ Ｍａｎｉａ＋ｉｓ　ｅｌ　ａｔ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ。

１９８２）。

Ｍ１３でのサブクローン化とヌクレオチドシーケンス制限ＤＮＡでのフラグメン トを、ファルマシアＰ−Ｌバイオケミカルス社製のバクテリオファージＭｌ　３ 　（Ｎｏ＋ｔａｎｄｅｒ　ｅｌａｌ：　Ｇｅｎｅ：　２６．１０１−１０６．１ ９８３）から誘導したｍｐ１８とｍｐ１９の複製であるポリリンカーでサブコロ ーンした。イー・コリＪＭ１０３は組換えファージでトランスフェクションされ 、そして単純なりｒ　ｉｎのＤＮＡを得た。ヌクレオチドシーケンスはＴ７ボリ メラーゼＤＮＡ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｌａｔｅｓ　Ｂｉｏ ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ　０ｂｉｏ） と　［α３５ｓコ　ｄＡＴＰ（英国アマジャム社製）を用いたジデオキシヌクレ オチドの酵素法Ｃ５ａｎｇｅｒ　ｅｌ　ａｌ：　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　ＵＳ Ａ：　７４．５４６３−５４６７）で実施した。反応生成物は６％に調整したバ ッファーを含むポリアクシーケンスの情報解析とデータベース 完全なりＮＡのシーケンスはコンピュタ−プログラムＤＢＣ○ＭＰとＤＢＵＴＩ 　Ｌを用いて組み合わせて決定した（Ｓｊａｄｅｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ；　８．３６７３−３６９４．１９８０）。タンパク質データベース であるパスツール研究所のＰＳＥＱＩＰはクラベリー（Ｃｌａｖｅｒｉｅ：　Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ；　１２．３９７−４０７．１９８４）によ って開発されたアルゴリズムを用いてスクリーニングした。アミノ酸のシーケン ス対の間の配置はウィルバー等のアルゴリズムを用いて行った（Ｗｉｌｂｕｒ　 ｅｌ　ａｌ：　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　ＵＳＡ；　８０．７２６−７３０゜１９８３ ）。ホモローブの統計学上の有意差はりツブマン・ピアソン（Ｌｉｐｍａｎ　＆ 　Ｐｅａｒｓｏｎ：　５ｃｉｅｎｃｅ；　２２７．１４３５−１４４０．１９８ ５）のアルゴリズムを用いて評価した。

それぞれの比較のために、アミノ酸２０個のシーケンスを使用して危険結果の平 均標準偏差を計算した。

遺伝相補試験 プラスミドを形質転換によって、非修飾Ｄ−ａｌａ−Ｄａ１ａリガーゼで処理し た温度過敏性変異株であるイー・コリ５Ｔ６４０に導入した（Ｌｕｇｊｅｎｂｅ ｒｇ　ｅ（ａｌ、：　Ｊ、　Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ、；　１１０、２６−３４．１ ９７３）。形質転換株は１００マイクログラム／　ｍ　１のアンピシリンを含有 したプレート上で３０度で遺択し、調べた切断部分のプラスミドＤＮＡの存在と 制限カードが確認された。アンピシリン含有ＢＨＩブロス培地中に３０度で生育 させた特有の二ロニーを１００マイクログラム／ｍｌのアンピシリンと５０マイ クロモル以内のイソプロピル−１−チオーβ−Ｄ−ガラクトピラソサイド（Ｉ　 ＰＴＧ）を含む寒天ＢＨＩ培地培地一度に加え、そのプレートを３０度の許容温 度から４２度の非許容温度までの温度で培養した。相補性の試験は４２度で１８ 時間培養した後コロニーが現れれば陽性であると考えられる。

結果 タンパク質ＶａｎＡとＮ末端シーケンスの同定１部誘導条件下でその他は非誘導 条件下で培養したエンテロコツカス・ファセシウムＢＭ４１４７の細胞膜フラク ションを５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。バンコマイシンの阻止濃度に関連して見 いだされた一つの相違は推定分子量が約４０ｋＤａであるタンパク質に対応する バンドの標識強度である。誘導細胞中にも非誘導細胞中においても、タンパク質 のバンドは、プラスミドｐＩＰ８１６を欠落したエンテロコツカス・ファセシウ ムＢＭ４１４７の誘導体の細胞膜が存在しないこれらの細胞と同じタンパク質を 表している。ＶａｎＡと命名された誘導タンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで精製 された後、５０ｐｍｏ＋のサンプルについてエドマン自動分解法で分析した。Ｖ ａｎＡのＮ末端のシーケンスの新規なアミノ酸は次の通りであった。つまり、Ｍ ｅｔＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　ｒｌｅＬｅｕである。

遺伝子ｖａｎＶのサブクローニング ４．０ｋｂのプラスミドｐＡＴ２１３の挿入体はエンテロコツカス・ファセシウ ムＢＭ４１４７のグリコベブタイドに対する抵抗力についての決定因子を有して いる。その挿入体の数個の制限フラグメントはＩ）ＵＣｌ３中にサブクローニン グした。またイー・コリのタンパク質ＶａｎＶ特異性の組換えプラスミドは細胞 質と細胞膜のフラクションのタンパク質またはバクテリアサックの抽出物を５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥで分析して同定された。この手法はイー・コリがグリコペブタイド に対して強い抵抗力を示すので使用された。プラスミドｐＡＴ２１４のＥｃｏＲ Ｖ−３ａｃＩＩ挿入体はエンテロコツカス・ファセシウムＢＭ４１４７の細胞膜 生成物から由来したタンパク質ＶａｎＶと共に移動する４０ｋＤａの特有のポリ ペブタイドをコードしている。

プラスミドｐＡＴ２１４の挿入体のヌクレオチドシーケンスと遺伝子ｖａｎＶを コードするシーケンスの同定プラスミドｐＡＴへの１７６１ｂｐのＥｃ　ｏＲＶ −５ａ　ｃ　ＩＩ挿入体のヌクレオチドシーケンスは第２図に記載した手法によ りＤＮＡの２つのｂｒｉｎについて決定した。ＤＮＡの各ｂｒｉｎ上の３つの解 読カード内の末端コドン（ＴＧＡ、ＴＡＡ。

ＴＡＧ）の位置は、タンパク質ＶａｎＡをコードするのに十分な大きさを有する 解読開始特有のカード（ＯＲＦ）の存在を示している。この解読開始カードＯＲ Ｆは２８１番目の位置にあるコドンＴＡＡおよび１４０６４０６位置にあるコド ンＴＡＧとの間に位置している。ＯＲＦから結論されるアミノ酸のシーケンスす ることによって、タンパク質ＶａｎＡのＮ末端のそれと対比される。タンパク質 をシーケンスとして同定された新規なアミノ酸は３７７位置のコドンＡＴＧ　（ メチオニン）　（図３）から始まるヌクレオチドシーケンスによってコードされ ている。

翻訳開始コドンはシーケンス（ＴＧＡＡＡＧＧＡＧＡ）　が先にあり、このシー ケンスは、その部分（３’　ＯＨＵＣＵＵＵＣＣＵＣＣ５’）中のバチルス・ズ ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の自己結合部位１６３のＡ　 ＲＮ　ｒの８個の塩基に対して相補的であるところのグラム陽性バクテリアのり ボゾーム（ＲＢＳ）に対する連結部位を特徴付けている（Ｍｏｒｉｎ　ｅｌ　ａ ｌ：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｊ、：　１８６．３３９−３４６．１９８ ２）。解読開始ＯＲＦカード中には、２８１位置と３７７位置との間には別の開 始コドンＡＴＧまたはＧＴＧは存在していない。３７７位置のコドンＡＴＧから １４０６４０６位置ンＴＧＡに延長している１０２９ｂｐのシーケンスは３４３ 個のアミノ酸残基を含むタンパク質をコードしている。そのタンパク質の測定分 子量は３７４００Ｄａであり、この値は、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析によって 得られた推定値４０ｋＤａと一致している。

タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ａのアミノ酸シーケンスと酵素Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａ リガーゼのホモローブ タンパク質データバンクＲ３ＥＱＩＰのスクリーニングによると、タンパク質Ｖ 　ａ　ｎ　Ａとイー・コリのリガーゼＤ−ａｌａ−Ｄ−ａ　ｌ　ａ　（ＥＣＯＡ ＬＡ、　Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ：　Ｊ、　Ｂａｃｊｅｒｉｏｌ：１６７ 、８０９−８＋７．１９８６）との間とＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈ　ｉ　 ｍｕ　ｒ　ｉ　ｕｍ　（ＤＡＬ　Ｉ　Ｇ　Ｄａｕｂ　ｅ（！ｌ：　Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ：２７、３７０１−３７０８．１９８６）のホモローブ（同族体） が示されている。

タンパク質対について計算した類似率は同定したアミノ酸の２８％と３６％との 間であり、アミノ酸同族体を構成するもののうちの４８％から５５％までである 。ＶａｎＡとＤＡＬＩＧとは密接に結合している。この類似の統計学的有意差は 、ＶＡＮＡの形式で評価され、シーケンスはＤＡＬＩＧまたはＥＣ０ＡＬＡと同 じアミノ酸組成を含んでいるＣＬＩｐｒｎａｎ　＆　Ｐｅｘｒｓｏｎ：　５ｃｉ ｅｎｃｅ；　２２７．１４３５−１４４０．１９８５）。

リガーゼＤ−ａ　ｌ　ａ−Ｄ−ａ　ｌ　ａの活性に対する遺伝相補性試験 菌種イー・コリ５Ｔ６４０はリガーゼＤ−ａ　１　ａ　−Ｄ−ａ　１ａに対する 活性が欠如している温度感受性変異株である（Ｌｕｇ＋ｅｎｂｅｒｇ　ｅｌ　ａ ｌ：　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、；　１１３．９６−１（１４，１９７３）。

プラスミドｐＵｃ１８とプラスミドｐＡＴ２１４は形質転換によって菌種イー・ コリ５Ｔ６４０中に導入された。イー・コリ５Ｔ６４０とイー・コリ５Ｔ６４０ 　（１）ＵＣｌ３）は３０度の許容温度でしか通常は生育しないのに対して、イ ー・コリ５Ｔ６４０（ｐＡＴ２１４）は３０度の許容温度でも４２度の非許容温 度でも生育した。

本試験では、ＶＡＮＡがイー・コリ中のりガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａと機能 的に結合し、ＤＡＬＩＧと同じ連結反応（リゲーション）を恐らく触媒すること ができる。

ＩＩ　ペプチドグリカンの前駆物質であるデブシペブタイドの合成を制御する二 重成分ＶａｎＳ　ＶａｎＲの調節系菌種、プラスミドおよび培養条件 プラスミドｐｌＰ８１６の制限フラグメント（Ｔｒａ−、Ｍｏ　ｂ”、Ｖｍｒ） ダラム陽性とグラム陰性の両性のベクターを構成するベクターｐＡＴ２９の誘導 体（ｏｒｉＲｐＡＭβ１゜ｏｒｉＲｐＵＣ＋　ｏｒｉＴ　ＲＫ２．ｓｐａ、１ａ ｃＺα）（Ｔｒｉｅｕ−Ｃｕｏｌ　ｅＩａｔ：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ、；　１８．４２９６．１９９０）中にクローン化した。このベクターは 本発明者によって調整され、イー・コリＪＭ１０３の形質転換のために使用され た（△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、５ｕｐＥ、ｔｈｉ、ｓ　ｔｒＡ、５ｂｃＢ１５ ．ｅｎｄＡ、ｈｓｐＲ４，Ｆ　ｔｒａＤ３６．ｐｒ。

ＡＢ、ＬａｃＩ　、　ＩａｃＺ△Ｍｌ　５）　（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｌ　ａｌ： 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、；　１０１．２０−７８．１９８３）。プ ラスミドＤＮＡは少量のアルカリ溶解物のプロトコルによって調製され（Ｓａｌ ｌＩｌｂｒｏｏｋｅｌａｔ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒＩｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　ＬａｂｏｒａＩｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒａｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ）＋ 　そして電気形質転換（Ｃｒｕｘ−Ｒｏｄｘ　Ａ、Ｌ、　ｅｒ　ａｌ：　Ｍｏ１ ．　Ｇｅｎ、　ＧｅｎｅＬ、；　２２４゜１５２−１５４．１９９０）によって エンテロコツカス・ファエヵリスＪＨ２−２（ＦｕｓＲ，Ｒｉ　ｆＲ）　（Ｊａ ｃｏｂＡ、　Ｅ、　ｅｊ　ａｌ：　Ｊ、　Ｂａｅｌｅｒｉｏｌ、；　１１７．３ ６０−３７２．１９７４）中にシーンパルス装置（米国カリフォルニ乙　リンチ モンドのバイオランド社Ｍ）を用いて導入した。エンテロコツカス・ファエヵリ スとイー・コリがら精製したプラスミドの制限プロフィールはＤＮＡの最終編成 物の発見のために比較される。

融合プラスミドｐＡＴ１１３　（Ｍｏｂ”、ＥｍＲ，Ｋｍ’　。

ｏｒ　ｉＲ，ＰＡＣＹＣ１８４，ａ　ｔ　ｔＴｎ１５４５．ＬａｃＺａ）　（Ｔ ｒｉｅｕ−Ｃｕｏｔ　ｅ（ｉｆ：　Ｇｅｎｅ；　Ｉ（１６，２ｌ−２７）はトラ ンスポゾンＴｎ１５４５が結合した末端を有している。このベクターはグラム陽 性バクテリアを複製しないけれども、トランスポゾンＴｎ１５４５またはＴｎ９ １６のインテグラーゼによって組換えられた宿主の染色体を結合する（Ｔｒｉｅ ｕ−Ｃｕｏｌ　ｅｌ　ａｔ：前述）。

融合プラスミドは電気形質転換によってエンテロコツカス・ファエカリスＢＭ４ １４８　（ＪＨ２−２＋　：Ｔｎ９１６）中に導入した。これらの菌株はトラン スポゾンＴｎ９１６により修飾される（Ｆｒａｎｑｕｅ　ｅｊ　ａｌ：　Ｊ、　 Ｂａｃｌｅｒｉｏｌ、；　１４５．４９４−５０２．　１９８１）。

培養はハート・プレインブイヨン（ＢＨＩ）または寒天を用いて３７度で行った 。ミュラー・ヒントン培地を用いてバクテリアの最小阻止濃度を決定した（Ｓｔ ｅｅｒｓ　ｅｔ　ａｔ：　Ａｎｌｉｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍｏ＋ｂｅｒ、　Ｂａ５ ｅｌ：　９．３０７−３１１）。

組換えＤＮＡ技術 制限酵素（ヘーリンガー・マンハイム・ファルマシア社製）によるＤＮＡの断片 化、アガロースからの制限ＤＮＡフラグメントの精製、イー・コリ（ベーリンガ ー・マンハイム・ファルマシア社製）のＤＮＡポリメラーゼ■のＫ　ｌ　ｅ　ｎ 　ｏ　ｗのフラグメントでの結合末端の自由末端への変換、羊腸のホスファター ゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）でのＤＮＡ末端の脱リン酸化、およびＴ４ ＤＮＡリガーゼ（英国アマジャム社製）でのＤＮＡフラグメントの連結は標準的 手法で実施した（ＳａｍｂｒｏｏｋｅＩａｌ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎ ｉＢ、　ａ　１ａｂｏｒａｌｏｔｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　）（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒＩｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　ＮＹ）。

プラスミドの構成 ここの構成による組換えプラスミドのために使用するベクターと挿入体の源首下 記の通りである。

（１）プロモータ認識のためのベクターｐＡＴ７８：スタフィ口コッカス・アウ レウスのプラスミドｐｃ１９４のクロラムフェニコール・アヤチルトランスフェ ラーゼの遺伝子ｃａｔを増幅したＤＮＡ　（Ｈｏｒｉｎｏｕｅｂｉ　ｅｊ　ａｌ ：　Ｊ、　ＢａｃＬｅｒｉｏｌ、；　１５０．８１５−８２５．１９８２）は連 絡ベクターｐＡＴ２９の制限部位ＰｓｔＩとＳｐｈ　Ｉとの間に挿入した。ＰＣ Ｒ法による増幅は、メトキシホスホルアミド法（Ｍａｂｉｌａｔ　ｅｔａｌ：Ｐ ｌａｓｍｉｄ　２３．２７−３４．１９９０）によって合成された開始端Ａ１と Ａ２によって実施された。開始端Ａ１のシーケンス（５°ＧＣＴＧＣＡＧＡＴＡ ＡＡＡＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧ）は認識部位Ｐｓｔｌ（下線部分）と、遺伝子ｃａ ｔのリボゾーム（ＲＢＳ；１８位置から２３位置までのＡＧＧＡＧＧ）に対する 連結部位を含むｐｃ１９４の１８個の塩基（６から２３位置まで）とから構成さ れている。開始端Ａ２　（５’　ＣＧＣＡＴＧＣＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡ　ＧＣＣ ＡＧＴＣ）のシーケンスは切断部位５Ｐｈｌ　（下線部分）を含み、遺伝子ｃａ ｔの３′末端の１７個の塩基（８から２４位置まで）と相補的である。開始端Ａ １とＡ２で増幅されたＤＮＡフラグメントはそれゆえ解読開始（ｏｒｆ）フェー ズと９部位ＰｓｔＩと５ｐｈＩによって並ばれたＣＡＴ　（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈ ｉ等（Ｊ、　Ｂａｃ４ｅｒｉｏ１．；　１５０．８１５−８２５）の付けた番号 によれば１２３４から１９１２位置まで）に対するリボゾームの連結部位とから 構成されている。１２３４位置は、クコラムフェニコールが存在してなくて翻訳 を遮断するところのｍ　ＲＮ　Ａの二次構造のリングの内部に存在している。そ のように増幅されたシーケンスは、プロモーターｃａｔも、翻訳の調節にとって 必須であるリボゾームの相補的シーケンスも含んでいない（Ａｎ＋ｂｕｌｏｓ、 　Ｎ。

Ｐ、　ｅｌ　ａｔ：　Ｇｅｎｅ：　２８．１７＋−１７６、１９８４）。

（ｉｉ）発現ベクターｐＡＴ７９：エンテロコツ力スプラスミドｐ　Ｊ　Ｈ１（ Ｃａｉｌｌａｕｄ　ｅｌ　ａｌ：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、ｉ　２０ ７．５０９−５１３、１９８７ンの遺伝子ａｐｈＡ−３のプロモーターＰ２を有 する２４３ｂｐのＣＩａＩ−ＢｓｓＨＩＩフラグメントはｐＡＴ７８の制限位置 ＥｃｏＲＩと５ａｃＩの間に挿入された。

（ｉ　ｉ　ｉ）プラスミドｐＡＴ８０とその誘導体：ｐＩＰ８１６の５．５ｋｂ のＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｘｂａ　ＩフラグメントをｐＡＴ７８のＢａｍＨＩとＸｂ 　ａＴ部位に挿入した。得られたプラスミドはｐＡＴ８０と命名され、Ｈｉｎｃ ＩＩで部分的に消化され、トランスポゾンＴｎ９０３の遺伝子ａｐｈａ−Ｉに結 合された遺伝子を有するＥｃｏＲＶフラグメントで連結した（Ｏｋａ　Ａ。

ｅｌ　ａｌ：　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、；　１４７．２１７−２２６．１９ ８１）。このフラグメントは、タイプＩの３′−アミノグリコシドホスホトラン スフェラーゼをコードする遺伝子ａｐｈＡ−Ｉを含んでおり、カナマイシンに対 する抵抗力を付与する。ａｐｈＡ−１は、ｐＡＴ８０の異なる３つの部位に挿入 され、ｐＡＴ８１．ｐＡＴ８２およびｐＡＴ８３を作製した。ＢａｍＨＩとａｐ ｈＡ−Ｉを含むＥｃｏＲｌのカセットはｐＡＴ８０の部位ＢａｍＨＩ（プラスミ ドｐＡＴ８４を構成するための）と部位ＥｃｏＲＩ　（プラスミドｐＡＴ８２を 構成するための）に挿入された。

（ｉｖ）プラスミドｐＡＴ８６．１）ＡＴ８７．１）ＡＴ８８およびｐＡＴ８９ ニブラスミドｐＡＴ８６は、ｐＡＴ７９の部位ＳｍａＩのレベルで、ＶａｎＨと ＶａｎＡとをコードするｐＡＴ８０の２８０３ｂｐのＥｃｏＲＩ−５ａｃＩ　Ｉ フラグメントをクローン化することによって構成されている。プラスミドｐＡＴ ８７は、プロモーターｐＡＴ７８を検出するベクターの遺伝子ｃａｔの上流にｐ ＡＴ８０の３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメントを挿入することによ って得られた。プラスミドｐＡＴ８８は、ＥｃｏＲＩと、ｐＡＴ８０の１７３１ ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有するＢａｍＨＩとで消化された ｐＡＴ７８を連結することによって得られた。プラスミドｐＡＴ８９はｐＡＴ８ ０のＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ａｃｃ　Ｉフラグメント（１位置から２３５６位置まで ）を融合ベクターｐＡＴ１１３のポリリンカー中に挿入することによって作製さ れた。

Ｍ１３のサブクローニングとシーケンス化ＤＮＡフラグメントはバクテリオファ ージＭ１３の複製誘導体のポリリンカー中にサブクローニングされ、得られた誘 導体をｍｐ１８とｍｐ１９と命名された（Ｎｏｒ「ａｎｄｅｒ　ｅｌ　ａｌ：　 Ｇｅｎｅ１２６、１０１−１０６．１９８３）。Ｅ、ｃｏｌｉＪＭ１０３は組換 えファージでトランスフェクションされ、１本の単純なりＮＡｂｒｉｎを調製し た。このヌクレオタイドは、修飾したＤＮＡポリメラーゼＴ　７　（Ｓｅｑｕｅ ｎａｓｅ：米国ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製）と［α− ３ｓＳ］ｄＡＴＰ　（英国アマジャム社製）を使用して、サンガーらの方法に従 ってシーケンスされた（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｌ　ａｌ：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１１． 　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ：　７４．５４６３−５４６７、１９７７）。反 応生成物は６％ポリアクリルアミドのバッファー中で傾斜ゲル上で分解された。

酵素試験 Ｆ、ｆａｅｃａｌｉｓの誘導体ＪＨ２−２はスペクチノマイシンを３００マイク ログラム／ｍ１を含む完全ＢＨＩブロス培地中で光学密度［０Ｄ６ｏｏ］が０． ７になるまで培養した。細胞はりゾチームで処理し、超音波で溶解して、得られ た細胞残置はクールバランらの方法にしたがって１００ＯＯＯＧで４５分間遠心 分離をして除去した（Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ　ｅｔａｌ：　Ａｎｌｉｍｉｃｒｏｂ 。

Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｂｅｍｏｆｈｅｒ、；　１３．７１６−７２５．１９７８）。

５−チオ−２−ニトロベンゾエートの生成をクロラムフェニコールの存在下なら びに不存在下で３７度で測定し、そして特異的なＣＡＴ活性を１分間当たりのマ イクロモルとタンパク質１ミリグラム当たりのマイクログラムで表した（Ｓｈａ ｗ　ｅｌ　ａｔ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、；　４３、７３７−７５ ５．１９７５）。

結果 ｐｌＰ８１６の遺伝子ｖａｎＨとｖａｎＡは異種プロモータＰ２の制御下にある プラスミドｐＡＴ７９中にクローン化しくＣａ１ｌｌａｕｄ　ｅｌ　ａｌ：　Ｍ ｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、ｉ　２０７．５０９−５１３．１９８７）、作 製したプラスミドｐＡＴ８６は菌種Ｅ、ｆａｅｃａｌｉｓＪＨ２−２に対してバ ンコマイシンへの抵抗力を付与しなかった。

したがって、これらの遺伝子は抗生物質の不存在下ではペプチドグリカンの合成 には十分ではない。ｐＩＰ８１６の異なる制限フラグメントはベクターｐＡＴ７ ８にクローン化される。ｐＡＴ８０の５．５ｋｂのＢｇ　Ｉ　Ｉ　Ｉ−Ｘｂａ　 Ｉフラグメントはバンコマイシンに対する抵抗力を付与するよりも小さなフラグ メントであった。

遺伝子ｖａｎＲとｖａｎＳのヌクレオチドシーケンスｐＡＴ８０への挿入体のシ ーケンスは９部位Ｂａ　ｌ　Ｉ　ＩからＶａｎＨの翻訳開始コドンＡＴＧまでの ＤＮＡの二重ｂｒｉｎ上に決定されている。解読開始（ｏｒｆ）の二重フェーズ は明らかに２４７５ｂＰのシーケンスの内部に位置していて、解読開始の最初の フェーズはヌクレオチド３８６からヌクレオチド１１２３まで延びている。４３ １位置にはグラム陽性バクテリアのシーケンスＲＢＳに特徴的なシーケンスであ る翻訳開始コドンＡＴＧの上流に位置する６対の塩基が見いだされている（ＴＧ ＡＡＡＧＧＧＴ旦）。そのｏｒｆの他の翻訳開始コドンはその形式のシーケンス に先行していない。レベル４３１のコドンＡＴＧから１１２４位置のコドンＴＡ Ａまでの６９３ｂＰのシーケンスは分子量２６６１２Ｄａを有する２３１個のア ミノ酸のタンパク質をコードしていて、これをＶ　ａ　ｎ　Ｒと命名した。

解読開始の第２７エーズ（ヌクレオチド１０８９からヌクレオチド２２５５まで ）では、その中の最初の翻訳開始コドン（１１０４位置のＴＴＧ）から結論され たアミノ酸のシーケンスは分子量４３８４７ＤＡを有する３８４個のアミノ酸か らなるタンパク質をコードしていて、このタンパク質をＶ　ａ　ｎ　Ｓと命名し た。１１１６位置のコドンＴＴＧと１１６４位置のコドンＡＴＧは、Ｂ、５ｕｂ ｔｉｌｉｓのＲＮＡの結合部位１６３の末端３′ＯＨと弱い相補性を持つシーケ ンスによって先行されるフェーズ中の翻訳開始コドンである（それぞれＧＧＧＧ ＧｖａｎＳの最終コドンとｖａｎＨの翻訳開始コドンＡＴＧとの間に１７ｂｐの 繰返された逆転シーケンスを含む２１７ｂｌ）のシーケンスが識別されている。

このシーケンスは転写ターミネータ−のようには強力には機能しない。

データバンクで得られたシーケンスを比較したところ、１６８ＰＫ　（ヒスチジ ン　タンパク質　キナーゼ）のキナーゼドメイン中の、ストックら（Ｓｔｏｃｋ 　ｅｔ　ａｌ：帽ｃｒｏｂｉｏ１．　Ｒｅｖ、；　５３．４５０−４９０．１９ ８９）によって同定された保存アミノ酸の構成単位がＶ　ａ　ｎ　ＳのＣ末端基 中に見いだされることが示された。ＶａｎＳはＮ末端領域内に２種類の疎水性の アミノ酸を持っている。

ＶａｎＳのヒスチジン残基１６４はＰ　ｈ　ｏ　Ｒ（Ｍａｋｉｎｏ　ｅＩａｌ： 　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、；　１９２．５４９−５５６．１９＋１６）のＨｉ　ｓ残 基２１６と。

そのタンパク質におけるホスホリレーションの推定部位であるＥ　ｎ　ｖ　Ｚ　 （Ｃａｒｎｅａｕ　ｅｔ　ａｌ：　１６４．５７ｇ−５８４，１９８５）のＨｉ ｓ残基２４３と並んでいる。

同様に、ＶａｎＲの１から１２２までのアミノ酸は応答調節子ＲＲ（レスポンス ・レギュレーター）のエフェクタードメインと類似している。Ｖ　ａ　ｎ　Ｒの アスパラギン酸５３はホスホリレーションの部位であるかもしれず、この部位か らこの残基は。

ＣｈｅＡを合わせ持つＨＰＫによってホスホリレーションされ。

かつ、タイプＲＲの別のタンパク質（Ｓｔｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ：同上）中の不変 の位置に対応しているＣｈｅ　ＹのＡ　ｓ　ｐ　５７と並んでいる。Ｖ　ａ　ｎ 　Ｒは、Ｅ、ｃｏｌｉの因子σ７０５を含むポリメラーゼＲＮＡ　（Ｓｔｏｃｋ 　ｅｊ　ａｌ：同上）によって仲介される転写開始を活性化するＲＲのサブクラ スＯｍ　Ｒ−Ｐ　ｈ　ｏ　Ｂに所属しうる。

遺伝子ｖａｎの挿入による不活性化 プラスミドｐＡＴ８０中のカナマイシンに対する抵抗力のカセットを遺伝子ｖａ ｎのグループに挿入すると次のことが判明した。つまり、ｖａｎＲへの挿入はバ ンコマイシンとクロラムフェニコールに対する抵抗力を取り除いてしまい、ｖａ ｎＲはバンコマイシンに対する抵抗力についての遺伝子を発現するために必要な 転写活性化因子である。遺伝子ｖａｎＳの不活性化はクロラムフェニコールの最 小阻止濃度（ＭＩＣ）を２倍はど減少させ、また特異的ＣＡＴの活性を３倍はど 減少させるが。

バンコマイシンの最小阻止濃度は不変のままであった。したがっテ、遺伝子ｖａ ｎｓは、バンコマイシンに対する抵抗力の遺伝子を転写するレベルの力を得るた めに必要であるが、バンコマイシンに対する抵抗力の表現型を発現するのには必 要ではなりａ　ｎＨ（ＰＡＴ８３）、ｖａｎＡ　（ｐＡＴ８４）中へのまたはｖ ａ　ｎＡ　（１）ＡＴ８５）の下流の１．Ｏｋｂの領域中への挿入体を有するｐ ＡＴ８０の誘導体はクロラムフェニコールに対する抵抗力を取得することができ るけれども、バンコマイシンに対する抵抗力は取得することができない。この表 現型はバンコマイシンの存在下にバクテリアの細胞壁を構成するために必要なデ ブシベプタイドの前駆物質を合成する酵素をコードしている遺伝子を不活性化す るのに適合している。

遺伝子ｖａｎＡの下流には、明らかにｖａｎＡのコドンＴＧＡの後であるが部位 ５ａｃＩＩの前にある３６５ｂｐのシーケンスに等しい不活性なｏｒｆがｐＡＴ ８５に存在しており、これにはＲＢＳ様シーケンスに先行するフェーズの翻訳開 始コドンＡＴＧが含まれている。これらのシーケンスはグリコペプタイドに対す る抵抗力に必要な、ＶａｎＸと命名されたタンパク質をコードしていて、このタ ンパク質は最大で約３３０個のアミノ酸からなっている。

遺伝子ｖａｎの転写のトランスアクチベーションＶ　ａ　ｎ　ＲとＶａｎＳをコ ードしている融合プラスミドｐＡＴ８９をＥ、ｆａｅｃａ　Ｉ　ｉ　ｓＢＭ４１ ３８の染色体に導入した。

遺伝子ｖａｎＨ，ｖａｎＡおよびｖａｎＸを有するプラスミドｐＡＴ８７をプロ モーターの欠如した遺伝子ｃａｔの上流でクローンすると、そのｐＡＴ８７はこ の菌種についてバンコマイシンに対して抵抗力を付与するけれども、Ｅ、ｆａｅ ｃａｌ　１ｓＪＨ２−２に対しては抵抗力を付与しない。ｐＡＴ８７の遺伝子ｃ ａｔの菌種ＢＭ４１３８：　：ｐＡＴ８９とＪＨ２−２とへの発現のレベルは、 ＶａｎＲが遺伝子ｖａｎのグループの３′末端に位置する遺伝子の転写を活性化 することを示している。

ＣＡＴを合成する場合に同様なレベルがｐＡ７８８にも観察され、これはｖａｎ Ａの５′部分と遺伝子ｃａｔとの間での転写による融合物を有している。得られ たものは、Ｅ、ｆａｅｃａｌ　ｉ　ｓＢＭ４１３８　：　：　ｐＡＴ８９　（ｐ ＡＴ８７）中でＶａｎＲとＶ　ａ　ｎ　Ｓとがバンコマイシンに対する抵抗力を 取得するのを可能にするｐＡＴ８７のｖａｎＡ、ｖａｎＨおよびｖａｎＸの転写 を活性化する染色体をコードしていることを示している。

他方、遺伝子の発現は、ｖａｎＲとｖａ　ｎｓとが多重コピーのコスミッドｐＡ Ｔ８０に保持されたときに実質的には構成され、ｖＲ節タンパク質の遺伝子が宿 主の染色体上に存在するときに僅かに誘発される。

ＩＩＩ　エンテロコツカス・ガリナルムＢＭ４１７４の遺伝子ｖａｎＣのシーケ ンスの特長化 リガーゼＤ　−Ａ　］　ａ　−Ｄ−Ａ　］　ａとバンコマイシンに対する抵抗力 に関与している結合タンパク質とをコードする遺伝子の増幅のための包括的な開 始端部の定義並びに利用タンパク質ＶａｎＡは、グリコペブタイドに対する抵抗 力に等しい高さからＥ、ｆａｅｃ　ｉｕｍＢＭ４１４７に発現させるのが必要で あり、二のＥ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１３８はＥ。

ｃｏｌｉのリガーゼＤ−Ａ　１　ａ　−Ｄ−Ａ　Ｉ　ａとはアミノ酸が約２８％ から３６％までも共通しているが、このリガーゼのそれとは異なる基質に対して は特異性を有している。Ｅ、ｆａｅｃｉ　ｕ　ｍＢＭ４１４７に発現することが 必要である。得られたベプタイドはベプタイド１とベブタイド２と命名され、そ れらのベブタイドはＥ、ｃｏｌｉのりガーゼＤｄＩＡとＤｄｌＢ（Ｚａｗａｄｚ ｋｅ：　３０．１６７３−１６８２．１９９］）のシーケンス中に保持されてお り、またタンパク質ＶａｎＡ中においてそれらのベプタイドはリガーゼＤ−Ａ　 ｌ　ａ　−Ｄ−Ａ　１　ａもしくは結びつく酵素をコードする遺伝子の内部フラ グメントを増幅することを意図された包括的切り出し端部を合成するために選択 される。目標ペブタイドＧＥＤＧ　（Ｓ／Ｔ）　（Ｉ／Ｌ）ＱＧとＮＴ　（Ｉ／ Ｌ）ＰＧＦＴとは代わりに図ＩＶ、１に示すように変質したオリゴヌクレオチド ｖ１とｖ２を得るために翻訳される。Ｖａ　ｎＡのベプタイド１と２のように、 ＤｄｌＡとＤｄｌＢとは類似する長さのアミノ酸シーケンスによって分離され、 増幅生成物のために予定された切断片は約６４０ｂｐである。

Ｅ、ｃｏ　１　ｉ　ＪＭ８３とＥ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７のＤＮＡをもち いてのＰＣＲ法による増幅は、予想した切断片に相当する生成物を増幅するため に行われ、続いて精製されて。

バクテリオファージＭ１３ｍｐｌＯにクローン化した（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　２６．１０１−１０６．１９８３）　。Ｅ、ｃ　ｏ　 ｌ　ｉ　ＪＭ８３を用いて得られた挿入体をシーケンスすると、ＰＣＲでの生成 物がＤｄ　ＩＡの内部フラグメントであることが示された。３Ｍ４１４７を増幅 したフラグメントを用いて得られた組換えファージから作製したプライマーは３ Ｍ４１４７と３Ｍ４１４７−１のＤＮＡをサテン法で分析するために使用する。

３Ｍ４１４７−１はバンコマイシンに感受性を持つ３Ｍ４１４７の誘導体であり プラスミドｐＩＰ８１６が欠落しているものである（Ｌｅｃｌｅｒｃｑ　ｅｔａ ｌ：　Ｎ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｗｅｄ、；　３＋９．１５７−１６１．１９８ ８）。

このプライマーは３Ｍ４１４７の４ｋｂのＥｃｏＲＩのＤＮＡとハイブリダイゼ ーションされるが、Ｅ、ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７−１のＤＮＡとはハイブリ ダイゼーションされない。

同様に、遺伝子ｖａｎＡはｐＩＰ８１６の４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントによ って保持され、得られたものは、その切り出し端部が同様にｖａｎＡの部分の増 幅を可能にしていることを示している。したがって、オリゴペプタイドｖ１とＶ ２とはりガーゼＤ−Ａｌａ−Ｄ　Ａｌａに結びつく異なるタンパク質で。

しかも異なる種類のタンパク質をコードする遺伝子のフラグメントを増幅させる ことができる。

遺伝子ｖａｎＣの増幅、クローニングおよびシーケンスＰＣＲ法での増幅でＥ、 ｇａｌｌｉｎａｒｕｍＢＭ４１７４と得られた増幅生成物の全ＤＮＡが実現され 、約６４０ｂｐがバクテリオファージＭ１３ｍｐｌＯ中にクローンされた。組換 えファージから単離された単純なりｒｉｎのＤＮＡはプライマーＣを構成するの に用いられる（Ｈｕ　ｅｔ　ａｌ：　Ｇｅｎｅ；　１７．２１７１−２１７７、 １９８２）。サテン法での分析によって、そのプライマーは８Ｍ４１７４の１． ７ｋｂのＰｓｔＩフラグメントとハイブリダイゼーシヨンするが、ＢＭ４１４７ とＢＭ４１４７−１のＤＮＡとはハイブリダイゼーションしない。

８Ｍ４１７４のＤＮＡはＰｓｔＩで消化され、１．５ｋｂと２ｋｂのフラグメン トはアガロースゲルでの電気泳動により精製され、ｐＵｃ１８にクローンした（ Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ：　１９８３゜同上）。組換えプラスミドは形 質転換によってＥ、ｃｏｌｉＪＭ８３に導入され、プライマーＣを用いてコロニ ーでハイブリダイゼーションするためにスクリーニングされる（Ｓａｍｈｔｏｏ ｋｅｌ　ａｌ：　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔ ｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｔｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮＹ）　６同族体（ホ モローブ）は、ｐＡＴ２１６と呼ばれる。１．７ｋｂの挿入体Ｐｓｔｌを含んで いるプラスミドを収容している形質転換体を用いて検出できる。ｐＡＴ２１６の 挿入体の１３４７ｂｐの５ａｃＩ−ＰｓｔＩの部分のシーケンスはＤＮＡの二重 ｂｒｉｎ上に明らかに位置付けられている。それぞれのＤＮＡｂｒｉｎの３つの 解読カード中の終止コドンの位置決定によって。

ＯＲＦフェーズが位置４７と位置１２４４とにあるコドンＴＧＡの間に存在して いることが明らかになっている。位置２１５にある転写開始コドンＡＴＧは、Ｂ 、５ｕｂｔｉｌｉｓの結合部位１６５のＲＮＡと相補性のあるＲＢＳシーケンス に特徴的であるシーケンスＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡによって先行されている（Ｍｏ ｒａｎ　ｅｔ　ａｔ：　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｏｅｊ、；　１ｇ６．３３９ −３４６．１９８２）。

位置２１５のコドンＡＴＧから位置１２４４のコドンＴＧＡまで延びている１０ ２９ｂｐのシーケンスは、理論分子量が３７５０４ＤａでＶ　ａ　ｎ　Ｃと命名 された３４３個のアミノ酸からなるタンパク質をコードしうる。シーケンスの類 似性はＶａｎＣ。

ＶａｎＡおよびＥ、ｃｏｌｉのリガーゼＤ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｄ−Ａ　］ａの間に 検出される。特に、ＶａｎＡと腸内バクテリアのりガ−ゼＤ−Ａ　１　ａ　−Ｄ −Ａ　１　ａとの間に前もって見いだされた相同する部分の４つのドメインはＶ ａｎＣに等しく備わっている。そのタンパク質について算定した同定アミノ酸の 割合は二つで推定したとこれでは２９％−３８％であった。４つのシーケンスの 列は、オリゴヌクレオチドのプライマーｖ１とＶ２を規定するために使用される ベブタイド１と２を保持する残基を含む不変のアミノ酸５７個が存在しているこ とを明らかにしている。

遺伝子ｖａｎＣの挿入による不活性化 Ｅ、ｇａ　］　ｌ　ｉｎａ　ｒｕｍＢＭ４１７４についてバンコマイシンに対す る抵抗力に対する遺伝子ｖａｎＣの寄与具合を評価するために、遺伝子ｖａｎＣ を挿入して不活性化された。遺伝子ＶａｎＣ内の６９０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈｉ ｎｃ　Ｉ　Ｉフラグメントは、グラム陽性バクテリア中に複製できないｐＡＴ１ １４にクローンされた。得られたプラスミドｐＡＴ２１７は電気形質転換のため に８Ｍ４１７４に導入され（Ｃｒｕｘ−Ｒｏｄｚ　ｅｌ　ａｌ：Ｍｏ１．　Ｇｅ ｎ、　Ｇｅｎｅｔ、ｉ　２２４．１５２−１５４．１９９０）、　ｐＡＴ　２１ ７をＶａｎＣに組み込むホモローブ組換えの結果であると推測されるクローンを エリスロマイシンでスクリーニングした。クローンＢＭ４１７５をプライマーＣ とｐＡＴ１１４に対して特異的であるａｐｈＡ３とを使用したサザンハイブリダ イゼーションによってＢＭ４１７４と比較した。２つのプライマーはＢＭ４１７ ５の８．６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントとハイブリダイゼーションされる。そ の結果は６．１ｋｂのプラスミドｐＡＴ２１７が遺伝子ｖａｎＣに組み込まれて いることが示されている。バンコマイシンの８Ｍ４１７４ならびにＢＭ４１７５ に対する最小阻止濃度がそれぞれ１６　ｍ　ｇ　／　Ｉと２　ｍ　ｇ　／　Ｉで あることは遺伝子ｖａｎＣ中への挿入による不活性化によってバンコマイシンに 対する抵抗力が消失したことを示している。

したがって、ｖａｎＣはバンコマイシンに対する抵抗力にとり必要である。それ ゆえペプチドグリカンの前駆物質に組み込まれるがバンコマイシンによって認識 されないジペブタイドまたはデプシベブタイドをそれらのタンパク質に合成させ ることを考えることができる。

本発明の目的を達成するシーケンスはそのシーケンスの説明を含むシーケンスリ ストの後に示している。シーケンスリストの中には、タンパク質はタンパク質の 末端のアミノ酸に対応するヌクレオチド塩基の位置を示している。

シーケンスリスト （このリストには、下記に示すシーケンスＩ　（Ｉａ、Ｉｂ）とＩＩもしくは図 ５のシーケンスが含まれる）アミノ酸のシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１　（Ｖａ　ｎＨ）　：抵抗力を有する最初のタンパク質 のシーケンスで、解読開始フェーズ第３番のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩 基３５０１に始まり塩基４５２９にて終止し、塩基３５６４と４５２９との間に 遺伝子ｖａｎＨをコードするシーケンスを含んでいて１図５またはシーケンスＩ ａのヌクレオチド６０１８と６９８３との間のシーケンスに相当する ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２　（Ｖａ　ｎＡ）　：タンパク質Ｖａ　ｎＡのシーケン スで、解読開始フェーズ第１番のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基４４２９ に始まり塩基５５５３にて終止し１図５またはシーケンスＩａのヌクレオチド６ ９７７と７８０７との間のシーケンスに相当する ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　３　（Ｖａ　ｎＸ）　’抵抗力を有する三番目のタンパク 質のシーケンスで、解読開始フェーズ第３番のアミノ酸のシーケンスに相当し、 塩基５５２６に始まり塩基６１６７にて終止し１図５またはシーケンスＩａのヌ クレオチド７８１６と８６２１との間のシーケンスに相当するＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ　４　（Ｖ　ａ　ｎ　Ｒ）　：調節タンパク質Ｒのシーケンスで。

解読開始フェーズ第１番のアミノ酸のシーケンスに相当し。

塩基１４７７に始まり塩基２２１４にて終止し９図５またはシーケンスＩａのヌ クレオチド３９７６と４６６８との間のシーケンスに相当する ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　５　（Ｖａｎｅ）　：ｔンサータンパク質Ｓのシーケンスで 、解読開始フェーズ第２番のアミノ酸のシーケンスに相当し、塩基２１８０に始 まり塩基３３４６にて終止し１図５またはシーケンスＩａのヌクレオチド４６４ ８と５８００との間のシーケンスに相当する ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　１６　ニジ−ケンスＩｂのヌクレオチド位置１５０と３１１ ２の間に存在するアミノ酸に相当するトランスホヤ−ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　１７　 ニジ−ケンスＩａのヌクレオチド位置３１８７と３７５９の間に存在するアミノ 酸に相当するレゾルベースのシーケンス ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　１８　ニジ−ケンスＩａのヌクレオチド位置９０４６と９９ ６０の間に存在するアミノ酸に相当するＶ　ａ　ｎ　Ｙのシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１９　シーケンスＩａのヌクレオチド位置１０１１６と１ ０５９８の間に存在するアミノ酸に相当するＶ　ａ　ｎ　Ｚのシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２０　ニジ−ケンスリストＩＩにて示したアミノ酸のＶ　 ａ　ｎ　Ｃのシーケンス ヌクレオチドシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　６　：図５で示した並行シーケンスのような５個のタンパ ク質をコードするシーケンスを含むヌクレオチドのシーケンス ＳＥｏ　１０　Ｎｏ　７　：図５で示した塩基３５０１に始まり塩基６１６７で 終止する並行シーケンスのように３個のタンパク質ヲコードするシーケンスを含 むヌクレオチドシーケンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　８　：図５で示したシーケンス の塩基４４２９に始まり塩基５５５３で終止するかまたはシーケンスＩａのヌク レオチド６９７７と７８０７との間に位置するヌクレオチドシーケンスに相当す る遺伝子ｖａｎＡのシーケンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　９　ニジ−ケンスの塩基３ ５０１に始まり塩基４５２９で終止するＶ　ａ　ｎ　Ｈと命名された第１番目の 抵抗タンパク質をコードするシーケンスであって、特にコードされたシーケンス を持つｖａｎＨは図４で示したシーケンスの塩基３５６４と４５２９との間に位 置するか、または、シーケンスＩａのヌクレオチド６０１８と６９８３との間に 位置するヌクレオチドシーケンスに相当している。

ＳＥＱ　１０　Ｎｏ　１０　：図５で示したシーケンスの塩基５５２６に始まり 塩基６１６７で終止するかまたはシーケンスＩａのヌクレオチド７８１６と８６ ２１との間に位置するヌクレオチドシーケンスに相当する第３番目の抵抗力のあ るタンパク質ＶａｎＸをコードするシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１１　：　トランスボセース、レゾルベース、ＶａｎＲ。

Ｖａ　ｎ　Ｓ、　Ｖａ　ｎＨ，Ｖａ　ｎＡ、　Ｖａ　ｎＸ、　Ｖａ　ｎＹおよび Ｖ　ａ　ｎ　Ｚをコードし、そのＮ末端およびＣ末端で繰り返される３８ｐｂの 逆転シーケンスを含み、かつ、シーケンスＩａに相当するトランスポゾンのシー ケンスＳＥＱ　ＩＤＮｏ　１２　ニジ−ケンスＩｂの塩基１５０で始まり塩基３ １１２で終止するトランスポ七−スをコードするシーケンスＳＥＱ　ＩＤＮｏ　 １３　ニジ−ケンスＩａの塩基３１８７で始まり塩基３７５９で終止するレゾル ベースをコードするシーケンスＳＥＱ　ＩＤＮｏ　１４　ニジ−ケンスＩａの塩 基９０４６で始まり塩基９９６０で終止するＶ　ａ　ｎ　Ｙをコードするシーケ ンスＳＥＱ　１ＯＮｏ１５°シーケンスＩａの塩基１０１１６で始まり塩基１０ ５９８で終止するＶ　ａ　ｎ　ＺをコードするシーケンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　 ２１　：タンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｃに対応したリストＩＩに示したＶａｎＣをコ ードするシーケンスＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２２　：塩基１で始まり塩基１０８５ １で終止するＥ。

ｆａｅｃｉｕｍのトランスポゾンの完全なシーケンスＩａＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　 ２３　ニジ−ケンスＩａの塩基３９７６で始まり塩基４６６８で終止するタンパ ク質ＶａｎＲをコードするシーケンス ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２４　ニジ−ケンスＩａの塩基４６４８で始まり塩基５８ ００で終止するタンパク質Ｖ　ａ　ｎ　Ｓをコードするシーケンス 己仁　臣に　己乏　ヨ旨　臣８　ユ、　−←　＝←　＝Ｑ蚕蓋臣８ジ５■ヨヨ； ５コΩ卦 巳式芸ヨｄ日ミグう５迂裂髄Ｉａ巳 −ヒ　ψ（Ｊ　ｒ−ａ　）＜　二〇　−←　ω［−１ｏａ　コく：ｌ：Ｅ−＞Ｃ ：ｊ　−←　−←　−０−←　−８二Ｕ　ω←匪曇啄芸曇共啄言捷韮目３粁 矩８　＝む　＝乙　翼定　臣８　臣８　崖　ラミ　＝シ二捷シ５ＩＥ目間３扉ミ ご１牙 プご擾茸擾窪３９臼肝偽５ 畦肛■甚託肝ゴ己狂腿己 ※と甚畳璽￥葺Ｈ寡８し鮭１酬 臼肛ηヨコΩ基３８８矩８亜＝蓋 書ａ酬喪曇墓１村肝葺己墓葺芥 井９芥腿Ｌ）　２？　ｖ＋ｔＪ　ｌ／ＩＬ）肝窪３吐茸　隷　七　Ｂり　αＬｌ 　：（Ｊ　Ｊ（：）　）−１ご　蚕　８肝う５Ｅヨ目巳ηヨ冊冊５定＝号口＝ ｉ１５６　七’Ｅｉ：ｊ　５３　”ｊ：２　ＥＢ　Ｕ３　ＥＢ　目５　Ｕ３ＢＥ ＡＭ民慕＃目邑ヒ畦畳冨ミ目韮墓コミョ　５ヨ　箇ら　デ滅　圓　己巳　鼓　： ８　甲謔　繋定■Ｉコｊ廿隷肛箱躍丘ヨ蓬３１ 芸答曇藁巳ヨ言葺圓；あ＋８冊＝＝ミ銘＝５牙＝口り詳茸釜訂；ご計 ＥＢ　＝４５３？Ｅ牛菖罠誓　づＳ基亜淀ごａｏ　ｗ＜　ａｕ 雪上　ヨて　−Ｌ）　＜ｆ−−１（Ｊ　臣８　お　臣８　＝謔　Ｓ８〜ｉ−ａａ 　Ｌ）Ｑ　＞Ｌ）　＜ａ ηヨ酬う菖啄）に＝廿胃ｊ蚕） ジ托コ騒ミリ肝ａ９　ＥＢ　訂；１目８基肛粁囲５目践３翻目ご；Ｓ−８邑 フｄ：　ａａ　ψＬ）　ｌ１ｔ（Ｊ　：ご　３炬　ヒＯヒじ　コゴ　己ご茸　七 　３：５　買　、イ　Ｑ。甚　装　。。１０墓グ番己間コａ郭啄Ｅ纂誓葺粁韮 五ワジ５■裂腎畦Ｅ’　”　１８　’、３￥冒偽５Ｉ言己χＥＩＨ司「母ヨミ５ 冨コ 誕葺委す益５票ジ３Ｉ謹属畦；己！冒 Ｈ委す畦ぢヨ苧珪Ｅヨ基ｄ乙荘ａ書 ３乏昆ご′−８Ｂ−肛※５矩す畦ピｎ韮ｆｉｇ　ｊ：４　；７３Ｕ３　；Ｂ　’ ；：２　ａａ−）。、８゜８翻　′−８七　足ご　臣ち　５８　肝　ジゴ　番　 ８二・く　ωく　ψロ　−ト　り＜　にト　ン＜　のａ　５３　手ご＝定　ビシ 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ｄ　／ｌ　＃　ｄ　：　：　：　Ｉ：　ｌ：　：　：　：　：：要　約　書 ポリペブタイド組成物は、シーケンスリストにてＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１（Ｖａ ｎＨ）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ２　（ＶａｎＡ）　、　ＳＥＱ　ＩＤＮｏ３　（ ＶａｎＸ）またはＳＥＱ　１０　Ｎｏｌ　９　（Ｖａ　ｎＣ）によって同定され るアミノ酸シーケンスから選ばれた少なくとも１つのタンパク質またはタンパク 質部分、またはＶａ　ｎＨ，ＶａｎＡ、Ｖａ　ｎＸもしくはＶ　ａ　ｎ　Ｃに対 する抗体によって認識される全タンパク質もしくはタンパク質部分、または厳し いかまたはあまり厳しくない条件下でシーケンスリストにおいてＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ８．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ９．　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏｌ　ＯまたはＳＥＱ　 ＩＤ　Ｎｏ２１によって同定されるヌクレオチド連鎖の１つと、または下記に示 すシーケンスＶ１またはＶ２の１つとハイブリッドされたシーケンスによってコ ードされている全タンパク質もしくはタンパク質部分を含んでいる。

Ｖｌ：　ＧＧＸ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＧＸ　ＴＣＸ　ＴＴＸＣＡＡ　ＧＧＸ Ｖ２：　ＡＡＴ　ＡＣＸ　ＡＴＸ　ＣＣＸ　ＧＧＸＣＴ ＴＴＴ　ＡＣ さらに、ヌクレオチドシーケンスはポリペブタイドをコードしており、グリコペ ブタイドに対する抵抗力について診断することができる。

国際調査報告 ｌ１ｌＩ轡自−＾帥触・−Ｎ＠、ＰＣＴ／ＦＲ９１１００８５５国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シーケンスリストにてＳＥＱＩＤＮｏ１（ＶａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ２（ ＶａｎＡ），ＳＥＱＩＤＮｏ３（ＶａｎＸ）またはＳＥＱＩＤＮｏ１９（Ｖａｎ Ｃ）によって同定されるアミノ酸シーケンスから選ばれた少なくとも１つのタン パク質またはタンパク質部分，またはＶａｎＨ，ＶａｎＡ，ＶａｎＸもしくはＶ ａｎＣに対する抗体によって認識される全タンパク質もしくはタンパク質部分， または厳しい条件かまたはあまり厳しくない条件下でシーケンスリストにおいて ＳＥＱＩＤＮｏ８，ＳＥＱＩＤＮｏ９，ＳＥＱＩＤＮｏ１０またはＳＥＱＩＤＮ ｏ２１によって同定されるヌクレオチド連鎖の１つと，または下記に示すシーケ ンスＶ１またはＶ２の１つとハイブリッドされたシーケンスによってコードされ ている全タンパク質もしくはタンパク質部分を含むことを特徴とするポリペプタ イド組成物。 Ｖ１：【配列があります】 Ｖ２：【配列があります】 ２．グラム陽性バクテリアに対してグリコペプタイド群の抗生物質，特にバンコ マイシンおよび／またはテイコプラニンに対する抵抗力を付与するのに必要な， もしくはグラム陽性球菌群の菌種に対してかかる抵抗力を助長するタンパク質の １つもしくはそれ以上のタンパク質の少なくとも３つのタンパク質もしくは該タ ンパク質の全部分であって，該タンパク質または該タンパク質の部分が ａ）シーケンスリストにてＳＥＱＩＤＮｏ１（ＶａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ２（ ＶａｎＡ）またはＳＥＱＩＤＮｏ３（ＶａｎＸ）によって同定されるシーケンス の１つに対する抗体によって認識されるか，または ｂ）シーケンスリストにおいてＳＥＱＩＤＮｏ８，ＳＥＱＩＤＮｏ９またはＳＥ ＱＩＤＮｏ１０によって同定されるシーケンスか，または厳しい条件かもしくは あまり厳しくない条件下で該シーケンスもしくは相補性シークエンスの１つとハ イブリッドされているシーケンスもしくはシーケンスＶ１またはＶ２とハイブリ ドされているシーケンスを含む遺伝子によってコードされていることを特徴とす る請求の範囲第１項のポリペプチド組成物。 ３．該ポリペプタイドがＳＥＱＩＤＮｏ１（ＶａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ２（Ｖ ａｎＡ）およびＳＥＱＩＤＮｏ３（ＶａｎＸ）としてシーケンスリストにて同定 されたタンパク質の結合に対応していることを特徴とする請求の範囲第２項また は第３項のポリペプタイド組成物。 ４．タンパク質ＶａｎＣがＳＥＱＩＤＮｏ２のシーケンスに相当するタンパク質 ＶａｎＡに換えられたＳＥＱＩＤＮｏ１９のシーケンスに相当することを特徴と する請求の範囲第２項または第３項のポリペプタイド組成物。 ５．グリコペプタイド群の抗生物質，特にバンコマイシンおよび／またはテイコ プラニンに対する抵抗力の発現に必要なアミノ酸のシーケンスが，調節要素，特 に，シーケンスリストにおいてＳＥＱＩＤＮｏ４（ＶａｎＲ）またはＳＥＱＩＤ Ｎｏ５（ＶａｎＳ）として同定されたシーケンスに対応するタンパク質の制御下 にあることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか一項のポリペプタ イド組成物。 ６．該ポリペプタイドがシーケンスリストにおいてＳＥＱＩＤＮｏ６，ＳＥＱＩ ＤＮｏ１１およびＳＥＱＩＤＮｏ２２として示されるシーケンスの１つによって コードされていることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか一項の ポリペプタイド組成物。 ７．請求項の範囲第１項〜第３項のいずれか一項における組成物に含まれるタン パク質がＳＥＱＩＤＮｏ２（ＶａｎＡ）またはＳＥＱＩＤＮｏ１９（ＶａｎＣ） のシーケンスに相当することを特徴とする精製タンパク質。 ８．タンパク質がＳＥＱＩＤＮｏ１（ＶａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ３（ＶａｎＸ ），ＳＥＱＩＤＮｏ４（ＶａｎＲ）およびＳＥＱＩＤＮｏ１５（ＶａｎＳ）のシ ーケンスの１つに相当することを特徴とするタンパク質。 ９．請求の範囲第１項〜第８項のいずれか一項におけるアミノ酸シーケンスをコ ードしているかまたは相補性ＤＮＡもしくは対応するＲＮＡのシーケンスが関わ っていることを特徴とするヌクレオチドシーケンス。 １０．プラスミドＰＩＰ８１６から得られるところの制限フラグメントＨｉｎｄ ＩＩＩ−ＥｃｏＲＩに対応し，その制限フラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲ Ｉまたはそのフラグメント，特に，約３．４ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＩ−Ｘ ｂａＩもしくは約１．７ｋｂのフラグメントＥｃｏＲＶ−ＳａｃＩＩまたは３． ３ｋｂのフラグメントＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩの全ての部分を含んでいる約 ７．３ｋｂのヌクレオチドシーケンス。 １１．該ヌクレオチドシーケンスがプラスミドＰＩＰ８１６から得られた下記制 限部位の順番を含んでいることを特徴とする請求の範囲第１０項のヌクレオチド シーケンス。 ＨｉｎｄＩＩＩ，ＢｇＩＩＩ，ＢｇＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＸｂａＩ ，ＥｃｏＲＩ。 １２．該ヌクレオチドシーケンスが，ＳＥＱＩＤＮｏ６，ＳＥＱＩＤＮｏ７，Ｓ ＥＱＩＤＮｏ１１またはＳＥＱＩＤＮｏ２２によって同定された連鎖の１つに対 応するか，または該連鎖もしくは該連鎖のすべての部分，または全ての連鎖もし くは相補ＤＮＡ連鎖もしくは該ＤＮＡの１つに対応するＲＮＡの連鎖を含むんで いて，その連鎖が，特にグラム陽性球菌群の菌種において，グリコペプタイド群 の抗生物質，特にバンコマイシン及び／またはテイコプラニンに対する抵抗を検 出するためのハイブリダイゼーションのプライマーを構成しているか，それとも 特にグラム陽性球菌群の菌種において，グリコペプタイド群の抗生物質，特にバ ンコマイシン及び／またはテイコプラニンに対する抵抗を発現するために必要な または関連しているシーケンスをコードしているかのいずれかであることを特徴 とする請求項の範囲第８項〜第１０項のいずれか一項のヌクレオチドシーケンス 。 １３．該シーケンスが下記連鎖を含むかまたは下記連鎖に相当することをことを 特徴とする請求の範囲第１２項のヌクレオチドシーケンス。 Ｖ１：【配列があります】 または Ｖ２：【配列があります】 １４．該ヌクレオチドシーケンスが，ＳＥＱＩＤＮｏ８（ｖａｎＡ），ＳＥＱＩ ＤＮｏ９（ｖａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ１０（ｖａｎＸ），ＳＥＱＩＤＮｏ２１ （ｖａｎＣ），ＳＥＱＩＤＮｏ１２（トランスポセース），ＳＥＱＩＤＮｏ１３ （レゾルベース），ＳＥＱＩＤＮｏ１４（ｖａｎＹ），ＳＥＱＩＤＮｏ１５（ｖ ａｎＺ），ＳＥＱＩＤＮｏ２３（ｖａｎＲ），またはＳＥＱＩＤＮｏ２４（ｖａ ｎＳ）の連鎖の１つ，またはＳＥＱＩＤＮｏ８（ｖａｎＡ），ＳＥＱＩＤＮｏ９ （ｖａｎＨ），ＳＥＱＩＤＮｏ１０（ｖａｎＸ），ＳＥＱＩＤＮｏ２１（ｖａｎ Ｃ），ＳＥＱＩＤＮｏ１２（トランスポセース），ＳＥＱＩＤＮｏ１３（レゾル ベース），ＳＥＱＩＤＮｏ１４（ｖａｎＹ），ＳＥＱＩＤＮｏ１５（ｖａｎＺ） ，ＳＥＱＩＤＮｏ２３（ｖａｎＲ），ＳＥＱＩＤＮｏ２４（ｖａｎＳ）にて示さ れる連鎖にてコードされたタンパク質のそれに類似している免疫学的および／ま たは機能的な性質を有するタンパク質をコードしているその連鎖の１つの変異も しくはグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を有する菌種を検出するこ とが可能であるところの連鎖であることを特徴とする請求の範囲第１０項〜第１ ２項のいずれか一項のヌクレオチドシーケンス。 １５．該ヌクレオチドシーケンスが，ＳＥＱＩＤＮｏ６の連鎖またはＳＥＱＩＤ Ｎｏ２２の連鎖に対応するかまたはその連鎖を含むことをことを特徴とする請求 の範囲第９項〜第１２項のいずれか一項のヌクレオチドシーケンス。 １６．請求の範囲第９項〜第１４項のいずれか一項におけるヌクレオチドシーケ ンスが，特定の宿主について，特にバンコマイシンまたはテイコプラニンのよう なグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現を惹起しうる調節要素の 制御下において，含まれていることを特徴とする組換えシーケンス。 １７．請求の範囲第９項〜第１６項のいずれか一項におけるヌクレオチドシーケ ンスが，特定の宿主について，バンコマイシンまたはテイコプラニンのようなグ リコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力の発現を惹起しうる調節要素の制御 下において，その抵抗の複製にとって必須ではない部位に含まれていることを特 徴とする組換えベクター。 １８．該ベクターがプラスミドＰＡＴ２１４であることを特徴とする請求の範囲 第１７項の組換えベクター。 １９．請求項の範囲第９項〜第１６項のいずれか一項のヌクレオチドシーケンス または請求の範囲第１７項または第１８項のベクターが，特にバンコマイシンま たはテイコプラニンなどのグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を発現 させる条件下において含まれ，宿主細胞がバクテリア，特にグラム陽性球菌から 選択されることを特徴とする組換え宿主細胞。 ２０．ＤＮＡまたはＲＮＡが問題となり，かつ，請求の範囲第９項〜第１５項の いずれか一項のシーケンスとハイブリダイゼーションでき，プライマーが標識で きること，たとえば下記ヌクレオチドの１つが問題とされることを特徴とするヌ クレオチドプライマー。 Ｖ１：【配列があります】 または Ｖ２：【配列があります】 ２１．該ヌクレオチドがグラム陽性バクテリアについて特異的であり，該ヌクレ オチドが特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンのようなグリコペプ タイド群の抗生物質に対する抵抗を有するタンパク質をコードしていて該シーケ ンスの間において包括的であることを特徴とする請求の範囲第１９項のヌクレオ チドプライマー。 ２２．該ヌクレオチドが，グラム陽性バクテリアについて，特にバンコマイシン およびテイコプラニンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する高いレベ ルの抵抗力を発現するのに必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケン スに対して特異的であることをことを特徴とする請求の範囲第２０項のヌクレオ チドプライマー。 ２３．該ヌクレオチドが，グラム陽性バクテリアについて，特にバンコマイシン およびテイコプラニンのようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する低いレベ ルの抵抗力を発現するのに必要なタンパク質をコードするヌクレオチドシーケン スに対して特異的であることをことを特徴とする請求の範囲第２０項のヌクレオ チドプライマー。 ２４．該ヌクレオチドが，特にバンコマイシンおよび／またはテイコプラニンの ようなグリコペプタイド群の抗生物質に対する抵抗力を持つ菌種の非クロモゾー ムのヌクレオチドシーケンスとハイブリッドされること，特に該ヌクレオチドが グラム陽性球菌，例えば腸内球菌，好ましくはＥ．ｆａｅｃｉｕｍＢＭ４１４７ の非クロモゾームのヌクレオチドシーケンスとハイブリッドされることをことを 特徴とする請求の範囲第２０項〜第２３項のいずれか一項のヌクレオチドプライ マー。 ２５．請求の範囲第１項〜第６項のいずれか一項の組成物または請求項の範囲第 ７項もしくは第８項のアミノ酸シーケンスを認識することを特徴とするポリクロ ーナル抗体またはモノクローナル抗体。 ２６．たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍなどのたとえば腸内球菌の菌種が問題となる ，特にグラム腸性球菌に属する菌種であって，特にバンコマイシンおよび／また はテイコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つ菌種の存在を生 物試料につきｉｎ　ｖｉｔｒｏで診断するためのキットであって，下記をものを 含むことを特徴とするキット。 −標識された場合には，請求項２５の抗体−抗体−抗原免疫反応の検出のための 試薬−必要に応じて，試験試料の細胞を溶解するための試薬。 ２７．たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍなどのたとえば腸内球菌の菌種が問題となる ，特に球菌に属する菌種であって，バンコマイシンおよび／またはテイコプラニ ンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持つ菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏ で診断するためのキットであって，下記をものを含むことを特徴とするキット。 −請求の範囲第２０項〜第２４項のいずれか一項のヌクレオチドのプライマー及 び場合により −オリゴヌクレオサイドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧ ＴＰ −ＤＮＡのポリメライゼーション剤 ２８．たとえばＥ．ｆａｅｃｉｕｍもしくはＥ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍなどの腸 内球菌などが特に問題となる，特に球菌群に属する菌種などの，特にバンコマイ シンおよび／またはテイコプラニンなどのグリコペプタイドに対する抵抗力を持 つ菌種の存在をｉｎ　ｖｉｔｒｏで検出する方法であって，下記のステップを含 むことを特徴とする検出方法。 ａ）抵抗菌種を含む余地がある生物試料を，グリコペプタイドに対する抵抗力を 発現するために必要な対象ヌクレオチドシーケンスとハイブリダイゼーションが できるところの，上記ヌクレオチドシーケンスから構成されている開始端と、ま たは前記シーケンスの部分全と接触させる手段からなり、それらのシーケンスを マトリックスとして，その開始端とハイブリダイゼーションされるそれぞれのヌ クレオチドシーケンスに対して、マトリックスに相補するそれぞれの開始端から の延長生成物が合成されるようなハイブリダイゼーションの条件下で，４つの異 なるオリゴヌクレオサイドトリホスフェートとポリメライゼーション剤の存在下 にて使用するステップ ｂ）そのマトリックスおよび得られた延長生成物の分離ステップであって，その ときに後者をマトリックスのように作用させるステップ ｃ）対象ヌクレオチドシーケンスを検出できる量を得るための上記ステップａ） を繰り返すステップｄ）該ヌクレオチドシーケンスの増幅生成物を検出するステ ップ。