JPH05503302A

JPH05503302A - 巨核球成熟因子

Info

Publication number: JPH05503302A
Application number: JP3518291A
Authority: JP
Inventors: ハント，パメラ; アラカワ，ツトム
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1990-10-12
Filing date: 1991-10-02
Publication date: 1993-06-03
Also published as: CA2071479A1; IL99648A0; EP0505552A1; ZA918070B; AU8868891A; IE913601A1; EP0505552A4; WO1992006712A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】巨核球成熟因子本発明は血小板を生成するための方法及び医薬組成物に関する。本発明はより特定的には、循環血液中の血小板のＩを増加させる因子を用いる血小板障害の治療に関する。

本発明は血小板の生成分促進する因子を含む医薬組成物にも関する。

光透ノ２ＪＩＪＬ多分化能性造血幹細胞は種々のタイプの最終分化血液祁胞を発生させる。血液は、赤血球、白血球及び血小板からなる。血小板は、主として骨髄に存在する巨核球と称する大きい細胞の断片化に由来する。血小板は血液凝固及び創傷治慰て主要な役割と果たす６巨核球は種々の分化段階を経て成熟血小板含生成する。

まず、多分化能性ｆ＃細胞が巨核球の形成に閲与するようになり、細胞及び核の増殖を経て巨核球前駆ｍ胞プールご形成する。これらの前駆細胞はエンドデュープリゲーション（ｅｎｄｏｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）分径て、高度に分葉した（ａｕｌｔｉｌｏｂｕｌａ−ｔｅｄ）＠微性の核を特徴とする未熟な巨核球、即ち巨核芽球３形成する。巨核芽球から成熟巨核球が生成される過程では、血小板特有のタンパク質念含む細胞質顆粒が形成される。成熟巨核球はプロプレートレッド（ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｅ）と称する細胞質伸長物（ｃｙｔｏｐｌａｓ＋＋＋ｉｃ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を放出し、これが断片化して成熟血小板が生成される。

精製因子には、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで巨核球前駆細胞からの成熟巨核球の形成を刺激することにより巨核球の分化を促進するものがある。この種の因子としては、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ５Ｆ）　、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−Ｃ５Ｆ）−エリトロポエチン（ＥＰＯ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ、−６）及び巨核球コロニーＭａ因子（Ｍｅｇ−ＣＳＦ）が挙げられる（ｆｌｏｆｌ＋ａａｎら、Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅ１ｌｓ　１３．７５−８６　（１９８７）　；　Ｍａｚｕｒら、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１ｉ、１１２８−１１３３（１９８７）　；ＭｃＮｉｅｃｅら、Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、１６．８０７−８１０　（１９８７）　；　Ｌｕら、Ｂｒ１ｔＪ、ＨｅｎａＬｏｌ、７０．１４９−１５６　（１９８８）　；　ｌ５ｈｉｂａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ　。

Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、＾、８６．５９５３−５９５７　（１９８９））。米国特許第４，８９４，４４０号には巨核球刺激因子（ＭＳ　Ｆ　）と称する因子が開示されている。精製ＭＳＦは、巨核球中で血小板プロテオグリカン及び血小板特異的麗粒タンパク賀、例えば血小板第■因子の会成含刺激する能力を有することから明らかなように、巨核球の細胞質の成熟に関与する。精製Ｉ　Ｌ−６はｉｎ　ｖｉｖｏで血小板を増量させると報告されている（　ｌ５ｈｉｂａｓｈｉら、Ｂｌｏｏｄ　７４，１２４１（１９８９）　；’Ｈｉｌｌら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、８５．１２４２−１２４７＜１９９０））　。

血小板新生（Ｌｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｃ　）刺激活性は、血小板減少症思考の血漿、血清及び尿、並びにヒト肝腎（ＨＥＫ）ＭＪ胞の培養培地中に発見されている。この活性は、トロンボボエチン又は血小板新生刺激因子（ＴＳＦ）、即ち巨核球の成熟を副脚する重要なエレメントと考えられている因子によるものとされてきた（ＭｃＤｏｎａｌｄ　Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。

四重、１−２４（１９３７））、　ＨＥ　Ｋ細胞由来のＴＳＦは精製されたが（ＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｊ、１．ａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、１０６．ｌ６Ｚ−１７４（１９８５））、血小板減少症忍者の血漿に由来する対応する活性物質はまだ精製されていない、巨核球の形成におけるＴＳＦの役割はまだ確立されていない、しかしながら、精製ＴＳＦは単独では前駆細胞からの巨核球の形成を刺激しないため（Ｌｕら、Ｂｒ１ｔｊ、Ｉｌｅｍａｔｏｌ　、７０，１４９−１５６（１９８８））、より後期の巨核球分子ヒ段階て役割を果たすものと推測される。

巨核球の分化及び成熟の抑制及び逆転も観察されている。

血小板第■因了（ＰＦ−ＩＶ）及び形質転換成長因子（Ｔ　Ｇ　Ｆ　）−８は巨核球前駆細服の形成を抑止する（Ｉｓｈ　１ｂａｓｈ　ｉら、Ｂｌｏｏｄ　６９，１７３７−１７４１（１９８７）　；　（：ｅｗｉｒｔｚら、Ｊ、Ｃｌ１ｎ。

Ｉｎｖｅｓｔ、８３．１４７７−１４８６（１９８９）　；　Ｒａｎら、Ｂｌｏｏｄ　７５，１２３４−１２３９（１９９０）　’）。微小管の形成に作用する種々の化合物はプロプレートレッドの形成を抑制する（　Ｌｅｖｅｎら、Ｂｌｏｏｄ　６９，１０４６−１０５２（１９８７））　、また、血清由来のセリンエステラーゼであるトロンビンは、プロプレートレッド伸長物の収縮（ｒｅｔ−ｒａｃｔｉｏｎ）を刺激することにより巨核球の成熟を逆転させる（Ｒａｄｌｅｙら、Ｔｈｒｏｉｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　）Ｉａｅｍｏｔｏｓｉｓ　５８，７３２− ７３６（１９８７）　）。

モルモット巨核球は、適当な培養条件下ではｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化して、血小板の前駆体である長い細胞質伸長物を形成する（　Ｌｅｖｅｎら、前出の文献；　Ｈａｎｄａｇａｍａら、＾ｍ、ＪＪｅｔ、Ｒｅｓ。

４８．１１４２−１１４６）　、プロプレートレッドと称するこれらの伸長物は更に、モルモット血小板サイズの小さい無核細胞に分化することが観察されている。プロプレートレッドの形成は、巨核球から血小板への発達における重要な事象である。このプロセスに作用する因子は血小板の生成で重要な役割な果たす。

前述のように、巨核球の分化及び成熟の種々の段階を刺激し且つ巨核球の数及び大きさの増加な促進する因子は多数同定されている。しかしながら、成熟巨核球が更にプロプレートレッド担持細胞に分化するプロセス３刺激する精製因子は１つも報告されていない、プロプレートレンドの形成と刺激する因子の同定及び単離は、血小板障害に起因する過剰出血の治療に有用であろう。

成熟巨核球及び血小板の細胞質は、プロテオグリカンと血小板特有のタンパク質とからなる顆粒な含んでいる。プロテオグリカンは、タンパク質コアに共有結合したグリコサミノグリカン顕を少なくとも１つ有する酸性度の高い高分子である。あるプロテオグリカンは、グリコサミノグリカンのウロン酸分Ｉをモニターすることによりヒト血小板から精製され、タンパク質コアに結合したコンドロイチン硫酸ｚを４つ含んでいた（　０１＜ａｙａｎａら、ＢｉｏｃｈｅｍＪ、２３３．７３−８１　（１９８６））　、精製ヒト血小板プロテオグリカンタンパク質コアは配列決定された（Ｐｅｒｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、２５５．１００７ −１０１３（１９８８）　、Ａｌｌｉｅｌら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２３６，１２３−１２６（１９８８））。

この夕〉′バク質はアミノ酸１３１個分の長さ分有し、８つのＳｅｒ−ｇｌｙ配列の反復を有するアミノ酸１８個の領域を含んでいた。反復５ｅｒ　ｇｌｙ配列は既に別のプロテオグリカンのタンパク質コア領域に！！察されており、グリコサミノグリ力〉結合部位であると予測された。ヒト血小板１０チオグリカンの位＝６７及び６９のセリン残基はコンドロイチン硫酸銀て修飾されていると考えられた（Ａｌｌｉｅｌら、前出の文献）。ヒト血小板プロテオグリカンの生物学的活性は精製中も精製後も測定されなかった。

５ｔｅｖｅｎｓらのＰＣＴ公開Ｗ○９０１００６０Ｂ号には、ヒト前骨髄球性白血病細胞系ＨＬ−６０由来の分泌顆粒プロテオグリカンのタンパク質コア３コードするゲノム配列及びｃＤＮＡ配列が開示されており、これは５Ｌｅｌｌｒｅｃｈｔらによっても報告されている（　Ｎｕｃ　、Δｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、１７．７５２３（１９８９））、これらのＤＮＡ配列に基づいて、アミノ酸数１３１の成熟ポリペプチドとアミノ酸数２７のシグナルペプチドとを含む分子量１７．６００のタンパクπが想定された。この成熟ヒト分泌顆粒プロテオグリカンは、ヒト血小板プロテオグリカンについて報告されたものと同じアミノ酸配列を有していたくＡｌ１１ｅｌら、前出の文献）６ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの生物学的活性は前出の５ｔｅｖｅｎｓらの文献には記述されていない。

本発明の目的の１つは、血小板の生成を促進する因子を投与することからなる過剰出血の治療方法にある０本発明の別の目的は、プロプレートレッドを増量させそれによって血小板の生成を刺激する因子の精製にある。本発明の更に別の目的は、血小板の生成を促進する因子を含む医薬組成物の製造にある。

光遭しＬ阪Ｉ一本発明は、血小板を増量させる方法、並びに巨核球の成熟及びプロプレートレットの形成に関与する因子を用いて血小板障害を治療する方法に関する。巨核球は成熟してプロプレートレッドと形成し、このプロプレートレンドが断片化して血小板を放出する。プロプレートレフト旦の変化は、生成される血小板の量に直接影響する。

巨核球からのプロプレートレットの形成き刺激する本発明の因子は、巨核球成熟因子（Ｍ　Ｍ　Ｆ　）と称する。これらの因子は血小板を増量させ、過剰出血の治療に有用である。

血小板障害の治療に使用されるＭ　ｋＩ　Ｆは天然Ｍ　Ｍ　Ｆのアミノ酸配列の一部又は全部を有し得、Ｍ　Ｍ　Ｆ　’７コードする外来ＤＮＡ配列の原核又は真核発現産物であり得、且つ安定性、溶解性及び循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ）を増加させるためにポリエチしングリコールのような水溶性ポリマーで具有結合的に修飾し得る。

巨核球成熟因子は単独で、又は血小板を増量させる池の治療法と組合わせて使用し得る。ＭＭＦと組合わせて使用するのに有用な他の因子は幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、Ｉ　Ｌ−６、Ｍ　ｅ　ｇ　−Ｃ３Ｆ、ＭＳＦ及びＥＰＯである。

本発明は、巨核球の成熟に作用する因子の精製方法を提供する。ＭＭＦ含有物質から巨核球成熟因子を精製する方法の１つは、イオン交換クロマトグラフィーステップを１つ以上含む。

本発明は、巨核球成熟因子のアッセイ方法も提供する。

この方法は、ＭＭＦ　（未精製又は精製したもの）を巨核球と共にインキュベートし、巨核球からのプロプレートレットの形成をモニターすることからなる。このアッセイではＭＭＦがプロプレートレッドの生成を刺激する。

本発明は、精製し単離した巨核球成熟因子の医薬的に許容し得る組成物にも関する。本発明は更に、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−ＣＳＦＪｉＳＦ及びＥＰＯの医薬的に許容し得る組成物をも含む、巨核球成熟因子の医薬的に許容し得る組成物も提供する。

パ　の、°ｔ・第１Ａ図はプロブレートレフト形成前のモルモット巨核球をＭｅｇａｃｏｌｏｒ染色した状態で示している。

第１Ｂ図はプロプレートレット形成後のモルモット巨核球をＷｒｉｇｈｔ　Ｇｉｅｍｓａ染色した状態で示している。

第２図はヒト血清の添加によるｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイでのプロプレートレッド形成の抑制を示している。

第３図はプロプレートレッド形成がトロ〉ビシによっては抑制されるが、トリプシン、キモトリプシン又はトロンポジチンによっては抑制されないことを示している。

第４図はプロトロンビン及びトロンビンによるｉｎ　ｖｉｔｒ。

アッセイでのプロプレートしット形成の抑制を示している。

第５図はプロトロンビン及びトロンビンによって誘導されたｉｎ　ｖｉｔｒｏでのプロプレートレッド形成の後退を示している。

第６Ａ図及び第６Ｂ図はそれぞれ、トロンビンの不活性化がプロプレートレット形成の抑制及びプロプレートレットトの収縮に及ぼす効果分水している。

第７図はプロプトートレット形成を抑制するヒト血清及びプロＩ・ロンビンのＤＥＡＥクロマトグラフィーを示している。

第８図はプロプレー１〜レツド形成な抑制するヒト血清及びプロ１〜ロンビンの５ｕｐｅｒｏｓｅ−６クロマトグラフイ第′９図は巨核球、プロプレートレッド及び血小板によるプロトロンビンからトロンビンへの変換を示している。

第１０Ａ図及び第１０Ｂ［Ｊは、ヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物及びＣＨＡＰＳ溶解物によるｉｎ　ｖｉｔｒｏアツセイでのプロプレートレット形成の刺激を示している。

第１１図は塩化グアニジニウムの存在下で溶解したヒト血小板のＤＥＡＥクロマトグラフィーを示している。

第１２図はヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物に由ｉするＭＭＦ−ＩＩＩのＭｏｎｏＱクロマトグラフィーを示している。

第１３図はヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物に由来するＭＭ　Ｆ　−Ｉ［［の５ｕｐｅ　ｒｏｓｅ−６クロマトグラフイ一分示している。

第１４図はヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物に由来する。ｌ１丁１１　Ｆ　−ｍのＣ４逆相５ｐＬｃａ示している。

第１５図はＣＨＡＰＳ緩衝液の存在下で溶解したヒト血小板のＤＥＡＥクロマトグラフィーを示している。

第１６図はヒト血小板のＣＨＡＰＳ溶解物に由来するＭＭＦ−１［［のＭｏｎｏ　Ｑクロマトグラフィーを示している。

第１７図は５ＤＳ−ＰＡＧＥによる塩化グアニジニウム溶解物及びＣＨＡＰＳ溶解物由来のＭＭＦ−１［［の分析を示している。

第１８Ａ図及び第１８Ｂ図はそれぞれ、トロンビンを濃度を増加させながら存在させたｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイでのＭ　Ｍ　Ｆ　’−’″１によるプロプレートレット形成の刺激及びプロプレートレッド収縮の抑制を示している。

第１９図はプロプレートレッド形成に対するＭ　Ｍ　Ｆ　’−”’及びＭＭ　Ｆ　”−”’の活性の比較を示している。

第２０図はコンドロイチン硫酸を除去した後のＭＭＦし１５１の活性を示している。

第２１図はＭＭＦ’−”’を４μｇ／日又は２０μｇ／日で投与したマウスの血小板量を示している。

第２２図はヒト組換えＩ　Ｌ−６を２μｇ／日又は１０μｇ１日で投与したマウスの血小板量を示している。

第２３！２１は２０μｇ／日のＭＭＦし１３１を投与するが、２ｔｔｇＺ日のＩＬ−６を投与するが、又は２０ｔｔｇ／日の１’ｉｉ　Ｍ　Ｆ　’−”’と２μ ｇ／日のＩＬ−６と３組合わせて投与したマウスの血小板量を示している。

光１！」■１ｒ皿朋一本発明は、巨核球の成熟とプロプレートレッドの形成とを刺激し、それによって循環血小板を増量させる巨核球成熟因子（ＭＭＦ＞Ｈに関する０本発明の因子は、抑制因子が存在しても、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで巨核球がらのプロプレートレッドの生成を促進する性質を有する。実施例２で述べるように、前記抑制因子の１つはヒト血清中に存在する。

ＭＭＦは種々の由来源、例えばヒト血清、尿、巨核球及び血小板等から得られる。巨核球及び血小板中のＭＭＦ活性の存在については実施例７及び８で説明する。但し、１ｎｖｉｔｒｏでプロプレートレッド形成を促進する生理物質は総てＭＭＦ源として使用し得、ｒＭＭＦ含有物質」という用語はこのような生理物質を意味する。

プロプレートレッド形成を刺激する因子はこれまて開示されたことがない。巨核球の形成を促進する造血因子、例えばＧ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−３及びＩ　Ｌ−６をｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイて検査したところ、血清抑制物質の存在下ではプロプレートレッドの形成を刺激しなかった。従って、これらの因子の活性は本発明の因子の活性とは異なる。

本発明は巨核球成熟因子のアッセイ方法も提供する。この方法は実施例１で述べるように、未［！又は精製ＭＭＦを巨核球と共にインキュベートし、巨核球からのプロプレートレットの形成をモニターすることからなる。この方法はプロプレートレット形成抑制物質の存在下で行うのが好ましい、あるプロプレートレッド形成抑制物質はヒト血清中に存在する（実施例２参照）。

本発明は、巨核球の成熟とプログレートレットの形成とを抑制する因子にも関する１本明細書ではこれらの因子を巨核球成熟抑制物質と称する。巨核球成熟抑制物質は、巨核球からプロプレートレットへの自然の成熟を抑止し、１ｎｖｉｔｒｏでプロプレートレッド伸長物の収縮を刺激する性質を有する。ヒト血清は巨核球の成熟を抑制する（実施例２）。

ヒト血清中に存在する抑１１活性物質は、トロンビンの酵素的に不活性の前駆体であるプロトロンビンと一緒に同時精製される（実施例５）６μ製したプロトロンビン及びトロンビンは両方ともプロプレートレンドの形成を抑制するが、トロンビンはプロトロンビンよりも低い濃度で抑Ｍ活性を示す、トロンビンはヒト血清中に存在する巨核球成熟抑制物貫であり、ヒト血清中のプロトロンビンはトロンビンに変換されてから巨核球を抑制する。単離した巨核球はプロトロンビンからトロンビンへの変換も行う（実施例６）、トロンビン及びプロトロンビン以外の因子であって、プロプレートレット形成を抑制し且つプロプレートレッドの収縮を誘起する因子はｉｎ　ｖｉｔｒｏアＺセイで容易に検出される。

本発明はＭＭＦｃｒ）精製方法も提供する。この方法は、ヒト血小板を溶解し、ヒト血小板溶解物を２つのイオン交換クロマトグラフィーステップ（例えばＤＥＡＥ及びＭｏｎｏ　Ｑ）にかけることからなる、この操作全体にわたって、ヒト血清又はＭ製トロンビンのうちいずれかの抑制物質の存在下での巨核球からプロプレートレットへの１ｎｖｉｔｒｏ成熟によりＭＭＦの存在を検出する。血小板は塩化グアニジニウム又はＣＨＡＰＳＭＩＩ液の存在下で溶解する（実施例８）が、血小板の溶解に適した別の方法分使用してもよい、実施例９で述べるように、いずれかの方法によって得た血小板溶解物をＤＥＡＥりロマトグラフィーにかけると、プログレートし・／ト形成活性の３つの異なるピークが観察される（第１１区及び第１５図）、これら３つのピークはカラムからの溶出に必要な塩濃度に応じてＭＭＦ−Ｉ、ＭＭＦ−１及びＭＭＦ−Ｉ［［と称する。第１５図では、プロプレートレッド形成に関するＭＭＦ−１含有フラクシヨンのアッセイは行われていない、ＭＭＦ−１，ＭＭＦ−ｎ及びＭＭＦ−ｍの生理活性については実施例１２で述べる。

ＭＭＦ−ＩＩＩは更にＭｏｎｏＱクロマトグラフィーで精製する（第１２区及び第１６図）。

ヒト血小板からは２つの異なる生物学的活性形態のＭ、ＭＰ−Ｉ［Ｉが精製される。実施例１０で述べるように、血小板プロテアーゼを失活させるべく塩化グアニジニウムの存在下で血小板を溶解させると、Ｙ−Ｐ−Ｔ−Ｑで始まるアミノ末端配列を有するＩ製ＭＭＦ−Ｉ［Ｉが得られる。血小板をＣＨＡＰＳ［ｌ液の存在下で溶解させると、Ｒ−Ｉ−Ｆ−Ｐで始まるアミン末端配列を有する精製ＭＭＦ−Ｉ［［が得られる。塩化グアニジニウム溶解物に由来するＭＭＦ−■のアミン末端から来るアミノ酸１６個の配列は、精製ヒト血小板プロテオグリカンのアミン末端から来るアミノ酸１６個の配列と同じである（八１ｌｉｅｌら、前出の文献ＨＰｅｒｉｎら、前出の文献）。ヒト血小板プロテオグリカンのアミノ酸１３１個の完全な長さの配列（ＡＩｌｉｅｌら、前出の文献）は、ＣＨＡＰＳ溶解物に由来するＭＭＦ−Ｉｆｆの最初の９個のアミノ酸と合致するアミノ酸９個の内部配列を５８〜６７の残僅に含んでいる。塩化グアニジニウム溶解物に由来するＭＭＦ−Ｉｎは以後ＭＭＦ’−”’と称する。これは、ヒト血小板プロテオグリカンと同じものである。

ＣＨＡＰＳ溶解物に由来するＭＭＦ　ｍは、完全な長さのタンパク質のカルボキシ末端側の部分に相当する、先端の欠けた形状のヒト血小板プロテオグリカンであり、以後ＭＭＦ５８−１＝１と称する。精製ＭＭＦ’−’３’はトロンビンが存在している時にｉｎ　ｖｉｔｒｏでプロプレートレッド形成を刺激し、トロンビンによって誘起されるプロプレートレッドの収縮を抑止する（第１８Ａ図及び第１８Ｂ図）。

ヒト血小板プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部又は全部を有する因子が巨核球の成熟と促進してプロプレートレッドを形成させる能力を有することは、これまで明らかにされていなかった。ヒト血小板プロテオグリカンが血小板第■囚子を血管損傷部位まで運ぶキャリヤーとして機能し得るか又は補足的副成分Ｃ１ｑの抑制剤として機能し得ることは示唆されていた（Ｏｋａｙａｍａら、前出の文献；　Ｐｅｒｉｎら、前出の文献）。しかしながら、ヒト血小板プロテオグリカンのｉｎ　ｖｉＬｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏの生物学的活性は明らかにされておらず、ヒト血小板プロテオグリカンの投与の結果得られる治療上の利益も記述されていない。

本発明は、ＭＭＦｌ″′３１のアミノ酸配列の一部又は全部を有し、且つ成熟巨核球からのプロプレートレッドの形成を促進する性質を示す巨核球成熟因子にも関する。本明細書に記載の因子は、生理活性ペプチドフラグメントと天然ＭＭＦ ’−１３’のアミノ酸の変形とを含む、前Ｈ己生理活性ペプチドは、プロプレートレッド形成刺激能力を有するタンパク質コアフラグメントを形成すべく、１１ＪＭｐ１−１３１のタンパク質加水分解を、細胞プロテアーゼのその場（ｉｎ　５ｉｔｕ＞での作用によって行うか、又は完全な長さの精製ＭＭＦ’−”’のプロテアーゼ処理により形成する１例えば、ウロン酸量に基づいて比較すると、精製Ｍ　Ｍ　Ｆ　”−”’は完全な長さのＭＭＦ’−”’と同等＋７）７Ｄ７レートレツト形成活性を有する（実施例１１）。

Ｍ　Ｍ　Ｆは、好ましい実施態様では、外来ＤＮＡの原核又は真核発現産物である。即ち、ＭＭＦは組換えＭＭＦが好ましい０組換えマウスＭ　ＭＦ及びヒトＭ　Ｍ　Ｆ　ｌ　−１：ｌ　＋と実施例１３で説明する。挿入すべき外来ＤＮＡはゲノムもしくはｃＤＮＡクローニング、又は遺伝子合成によって得る。

ＭＭＦの発現は原核宿主細胞（ａ菌）又は真核宿主細胞（酵母、Ｎ物、昆虫又は哺乳動物の細胞）中で生起させる。

本発明はＭＭＦ類似体（ａｎａｌｏｇ）にも間する。これらの類似体は１、Ｍ　Ｍ　Ｆ＋　−１３１のタンパク質コアをコードするＤＮＡ配列を操作してこのコード配列内でヌクレオチドの欠失、付加又は置換を発生させ、それによってアミノ酸配列を変化させることにより得られる。これらの類似体は当業者に公知の手順で製造する。

天然ＭＭＦとは異なる炭水化物構造を有する精製ＭＭＦも本発明の範囲に含まれる。巨核球成熟活性を得るためには、ＭＭＦ’−”’上にグリコサミノグリカン側鎖が存在していることが重要である。これは、精製Ｍ　Ｍ　Ｆ＋　−１２１をコンドロイチナーゼＡＢＣで処理して結合炭水化物鎖（糖Ｈ）を除去すると失活することから明らかである（実施例１１）。

炭水化物構造が変化すると、総電荷の異なるイソホーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）と称するＭＭＦ分子が発生し得る。

ＭＭＦイソホームは互いに分離し、先行技術の等電点；気泳動又はクロマトフオーカシングのような方法によって精製する。

本発明は、非修飾ＭＭＦに比べ、大きい溶解性、安定性及び／又は循環半減期を示し得る化学的に修飾した形態のＭＭＦも提供する。ＭＭＦへの水溶性ポリマーの共有結合はポリエチレングリコールか又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーであってよい。

このポリマーは、未置換とするか又は一端をアルキル基で置換する。これらの修飾及び関連した修飾は米国特許第４．１７９，３３７号に記述されており、本明細書はこの先行特許を参考として包含する。

本発明は、精製ＭＭＦに特異的に結合する抗体にも関する。これらの抗体は、複数の抗原決定基に対する抗体（ポリクローナル）又は単一の決定基に対する抗体（モノクローナル）であり、当業者に公知の手順で製造される。これらのポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体は、精製グリコジル化又は脱グリコジル化ＭＭＦ’−”’及びＭ　Ｍ　Ｆ１ａ−１３１に結合する。ＭＭＦに対する抗体は、培地、血清又は尿からＭＭＦを選択的に除去するためにアフイニティクロマトグラフイーで使用し得る。また、ＭＭＦに特異的に結合してｉｌ　ｖｉｔｒｏでプロプレートレット形成を抑制する抗体は、循環血小板量を安定させるか又は減少させることにより、過剰な血小板産生の結果生じる状態を治療するのに使用し得る。

本発明は、ＭＭＦを単独て又は他の療法と組合わせて血小板障害の治療に使用する方法も提供する０本発明の方法及び組成物は、循環血液中の正常値以下の血小板量を特徴とする症状であり、異常出血の最も一般的な原因である血小板減少症の治療に有用である。血小板減少症は、（１）血小板生成不足、（２）血小板破壊の増大、及び（３）体内における血小板分布の異常という３つのプロセスによって引き起こされる。血小板減少症に関連した特定障害を表１に示す（Ｗｉｎｔｒｏｂｅら、Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　［Ｉｅｍａｔｏｌｏｇｙ−第８版、ｐｐ。

１０９０〜１１２７（１９８１）＠照）。

表　１血小板障害 ■、血小板生成不足Ａ、の多　＼　（化学的及び物理的物質くイオン化放射能、抗腫傷薬）、無形成貧血、先天性巨核球形成不全、を髄ろうプロセス、ある種のウィルスｅ染。

Ｂ、・自・ハビタミンＢ１２又は葉酸の欠乏に起因する障害。

Ｃ１メ　ニズムの血小板新生の不足、周期性血小板減少。

Ｄ、Ｌ］１多くの遺伝性形態。

■、血小板破壊の促進Ａ、　プロセスに　・る　の特発性血小板減少性紫斑病、薬剤誘導抗体、種々の溶血性貧血、胎児母体不適合性、輸血後。

Ｂ、　プロセスに　のＫａｓａｂａｃｈ−Ｍｅｒｒｉｔｔ症候群、血栓症性血小板減少性紫斑病、怒染（ウィルス、細菌、原生動物）、大量輸血。

■、血小板分布の異常Ａ、ｆｆ臓障害Ｂ、低体温性無感覚症本発明は、血小板生成不足に起因し、場合によっては血小板破壊の増大に起因することもある血小板減少症に有利に適用される。成熟巨核球の量は正常であるが血小板の量が少ない場合には、プロプレートレットの形成を刺激して血小板生成量を増加させるべく、ＭＭＦを単独で使用する。

血小板量の不足が巨核球量の不足に起因している場合は、巨核球量及び血小板量を両方とも増加させるべく、ＭＭＦを１種票以上の別の造血因子、例えば幹細胞因子（ＳＣＦ＞、Ｇ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＳＦ及びＥＰＯと組合わせて使用する。

血小板生成不足は多くのプロセスに起因する。最も一般的なのは、幹細胞又は巨核球のコンパートメントを減らすプロセス、例えば骨髄抑圧性薬剤又は照射による骨髄損傷、無形成貧血、先天性巨核球形成不全又はを髄形成異常症候群である。幹細胞因子（ＳＣＦ）と称する精製因子は、巨核球前駆細胞を含めた初期造血前駆細胞の形成を刺激する能力を有する。ＳＣＦは米国特許出願第５７３，６１６号に開示されており、本明細書はこれを参考として包含する。幹細胞の欠乏に起因する血小板減少症の患者は、医薬的に有効なＩのＳＣＦを医薬的に有効な量のＭＭＦと組合わせて投与することにより治療する。巨核球量の欠乏に起因する血小板減少症は、治療上有効なＩのＧ−Ｃ３Ｆ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ −６、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ、ＭＳＦ又はＥＰＯを治療上有効な量のＭＭＦと組合わせて投与することにより冶僚する。

血小板生成不足は、例えば巨赤芽球性造血の場合のように、成熟巨核球量は正常であるか又は多いが血小板の生成が不十分である非効率的血小板新生によっても生じ得る。

この場合は、治療上有効なＩのＭＭＦだけで十分に血小板量を増加させることができる。更に、周期性血小板減少症のような血小板新生制御に関連した異常は、治療上有効な量のＭＭＦで治療する。

血小板破壊の増大は、巨核球の成熟による血小板の生成を上回る血小板消費（ｔｕｒｎｏｖｅｒ　）に起因する血小板減少症を引き起こす。自己免疫応答を介する血小板破壊の増大を特徴とする特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）のような障害は、血小板生成速度の低下を示し得る。このような場合には、治療上有効なＩのＭＭＦでＩＴＰを治療する。

本発明は、治療上有効な量のＭＭＦを適当な希釈剤、アジュバント、可溶化剤、防腐剤及び／又はキャリヤーと共に含む医薬組成物にも関する。治療上有効な量のＭＭＦとは、Ｉｌｉ礼動物の循環血小板量を増加させるのに十分な量のＭＭＦを意味する。医薬組成物中のＭＭＦの治療上有効な量は、ＭＭＦ製剤の半減期、投与方法及び治療すべき臨床状態等の変動要因を考慮して、当業者により決定され得る。

ＭＭＦ医薬組成物は、ＭＭＦに適合したｐＨ範囲及びイオン強度を有する種々の緩衝液（例えばトリス−ＨＣｌ、アセテート、ホスフェート）の希釈物、可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ、Ｐｏ１ｙｓｏｒｂａｔｅ）、防腐剤（例えばＴｈｉｍｅｒｏｓｏｌ、ベンジルアルコール）、並びにキャリヤー（例えばヒト血清アルプミンン３含む、ＭＭＦを含む組成物は治療すべき状態に適した任意の方法、例えば継続的注入、調節放出配合、又は注射によって投与し得る。

好ましい投与方法は当業者には明らかであろう。

本発明は、ＭＭＦと１種類以上の他の造血因子、例えばＳＣＦ、Ｇ−Ｃ８Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−Ｃ５Ｆ、ＭＳＦ及びＥＰＯとを含む組成物にも関する。

巨核球成熟抑制物質は血小板量を安定させるか又は増加させるために使用される。過剰な血小板濃度は過剰な血液凝固と起こし得る。これは、深夜静脈血栓症及び手術後の回復に伴う血栓症で観察される状態である。成熟抑制物質は単独で、又は抗凝血剤のような他の治療手段と組合わせて使用する。抗凝血療法では現在ヘパリン及びアスピリンが使用されている。

本発明３より詳細に説明すべく、以下に非限定的実施例を挙げる。

実施例１プロプレートレッドの〉　に　ツセイ巨核球からの血小板前駆体の形成に関するｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイと、前出のｌ’Ｊａｄｌｅｙら及びＬｅｖｅｎらの観察に基づいて行った０文献（Ｌｅｖｅｎら、前出）の記載に従ってモルモット巨核球を骨髄から精製した。約５，０００個（血球計で測定）の巨核球を、５０μＭの２−メルカプトエタノールと１００μｇ　／　ｍ　Ｉの熟不活性化ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）とを加えた１００μｌのｌ５ｃｏｖｅｓ培地（Ｇｉｂｃｏ）中で、ウェル数９６の平底マイクロタイタープレート（Ｆａｌｃｏｎ＞のウェル内に配置した。７％ＣＯ２９３７℃で１８時間インキュベートした後、細胞を１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．３７％ホルムアルデヒド中で固定し、明視野顕微鏡検査で各ウェル内のプロプレートレッド形成を起こした細胞の数を調べた。このデータはウェル当たりのプロプレートレット形成数（ＰＰＦ／ウェル）で表す。この条件では、培地に他の物質な加えなくても、モルモット巨核球が細胞質伸長物（プロプレートレット）を生成する。インキュベーションの前及び後の巨核球形成の顕微鏡写真を第１Ａ図及び第１Ｂ図に示した。

実施例２゛に　るプロプレートレッド乏　の実施例１で述べたように調製し且つ培地中３７℃で１８時間インキュベートしたモルモット巨核球に加えるヒト血清（Ｇｉｂｃｏ）を増量させていくと、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでプロプレートレッド形成が抑制された（第２図）、ヒト血清の添加Ｉがｏ、０３％を超えると、プロプレートレッド形成は完全に抑制された。

このｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイでのヒト血清によるプロプレートレット形成の抑制は一時的なものであった０表２に示すように、０．１％ヒト血清中でインキュベートした巨核球は３７℃で１８時間の条件ではプロプレートレッドを形成しないが、３７℃で４２時間インキュベートするとプロプレートレッドを形成する。

表　２ヒト血゛にょるプロプレートレットン成の−　・抑１！ＩＩＪＬ　ｐ　Ｐ　Ｆ　／ウェル比重１　仕ｉ］ヒト血清中で培養　０１８９培地中で培Ｉｔ　３７１　３２２実施例３プロトロンビン　トロンビンに　るプロプレートレット肚五！」旧【血清由来のセリンプロテアーゼであるトロンビンと１ｎｖｉｔｒｏのプロプレートレフト形成抑制について検査した。

高純度トロンビン（Ｓｉｇｍａ）は１０ｐｐＨよ以下の濃度でプロプレートレッド形成抑制効果を示し、濃度２５ｐＭでは完全な抑制が観察された（第３図）、トロンビンの抑制効果は特異的なものであり、同じ濃度のセリンブロテアーゼトリズシン（Ｃａｌｂｉｏｅｈｅｍ社のヒトすい尿由来のもの）又はキモトリプシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ−社のヒトすい尿由来のもの）では観察されなかった。

ナノモルのレベルのトリアジン及びキモトリプシンは巨核球にとって致死的であったが、同程度の量のトロンビンは巨核球の分化を抑止してもその生存能力にハ作用シナかっり、更ニ、Ｌ咀阻ｐｅａｔ二五毒液由来のトロンビン様セリンプロテアーゼであるトロンボシトシン（ｔｈｒｏｍｂｏｅｙｔｏｃｉｎ−Ｋｉｒｂｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１８，３５６４−３５７０（１９７９）、Ｓ　ｉｇｍａ社から入手）を、プロプレートレット形成の抑制について検査した。抑制は観察されず、細胞の生存能力は２．８ｎＭまで維持された。

文献（Ｌｏｔｔｅｎｂｅｒｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、８０．３４１−３６１（１９８１）　）に記載のように、色素産生物質Ｓ５−２２３８（Ｓｉ＋ｉａ）又はＣｈ　ｒ　ｏ　ｍ　ｏ　ｚ　ｙ　ｍ　ｅ　−Ｐ　ｃ　ａ　（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　）を用いて比色アッセイでトロンビン活性を検出した。複合混合物中にトロンビンが存在している場合には、特異的抗トロンビン試薬であるヒルジンの添加により反応の特異性が確認された。このアッセイを用いると、プロプレートレッド形成を抑制した多くのヒト血清中にトロンビンが検出されたが、その量は、観察されたような程度の抑制を引き起こすにしては少なすぎるものであった（第２図参照）、これに対し、トロンビンの未処理前駆体であるプロトロンビンはヒト血清中に１〜２μＭ存在すると報告されてし）る（　Ｎａｎｏら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、８０．２８６−３０３（１９８１））。

精製プロトロンビンは、２〜５ｎＭまで加えた時に１ｎｖｉｔｒｏでプロプレートレッド形成３抑制したく第４図）、完全な抑制は５ｎＭ″Ｃ観察された。

ヒト血清の場合と同様に、トロンビン又はプロトロンビンによるプロプレートレッドの抑制は一時的なものである。

０．３５％ヒト血清、２５ｐＭトロンビン又は５ｎＭグロトロンビンの存在下３７℃で１８時間のインキュベーション後にはプロプレートレッドの形成は見られなかったが、４２時闇経過するまでには抑制効果が消滅していた（表３）。

表　３トロンビン　びプロトロンビンに　プロプレートレッド′　の− 畦ｌ目１ヌー　ＰＰＦ／ウェル追１１　佼１１ヒト血清　３２５２トロンビン　０２２７プロトロンビン　０１６３なし　２２９　３１２トロンビン及びプロトロンビンはプロプレートレッド形成を抑止する他に、プロプレートレットの脱分化を誘発した。約５０００個のモルモット巨核球を実施例１と同様にインキュベートしてプロプレートレッドを形成し、トロンビン又はプロトロンビンをそれぞれ６６ｐＭ又は５．７ｎＭまで加え、培養物を３７℃に戻した。残留プロプレートレッドの数を図５に示した時点で計数した。

実施例４トロンビンの　パがプロプレートレッド　に　ぼ４０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）、１００ｍＭのＮａＣ１，２ｍＭのＣａ　ＣＩ　２及び１５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン中の精製トロンビン（１２，５μｇ／Ｉ）と、最終濃度４．２ｍＭのフロオロリン酸ジイソプロピル（ＤＦＰ、５ｉＢａ社から入手）とを室温で２時間反応させてセリンエステラーゼ活性を失活させた。インキュベーション後、ＤＦＰと反応したトロンビンを、使用前に、４０ｍＭのトリス（ｐＨ８，０）、１００ｍＭのＮａＣ１及び２ｍＭのＣａ　Ｃ１２に対して十分に透析した。

セリンエステラーゼ活性の失活は、ＤＦＰと反応したトロンビンがｃｈｒｏ−ｍｏｚｙｍｅ−Ｐｃａを基質として使用できなくなったことにより確認された。

ＤＦＰ反応トロンビンと未処理トロンビンとを、プロプレートレッド形成抑制能力（第６Ａ図）及びプロプレー１・レット伸長物の収縮を誘発する能力（第６Ｂ図）について比較した。失活トロンビンは、プロプレートレッド形成の抑制ではトロンビンの活性の２％を示し、プロプレートレット収縮の誘発ではトロンビンの活性の１．５％を示した。

トロンビンの化学的失活に加えて、トロンビンを中和するか又はプロトロンビンからトロンビンへの変換を妨害する物質をプロプレートレットアッセイに加えると、トロンビンによるプロプレートレッド形成の抑制が回避される。

表４に示すように、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．０４単位／ｍｌのヘパリン、０．Ｃ４単位／ｍ＋のヒルジン、又は０．１０単位／　ｍ　１の抗トロンビン■を加えるとｉｎ　ｖｉｔｒ。

でプロプレートレッドが形成される。

表　４０ンビン　に　プロプレートレット多皿ｌヱ旧１１− ヒト血清　なし　２ヒト血清　２．５ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１０６２　なし　なし　２３０ヒト血清　なし　２ヒト血清　０．０４単位／端１ヘパリン　２１４ヒト血清　０．０４単位／ｍｌ　ヒルジン　１４３４　なし　なし　２５５ヒト血清　なし　２４ヒト血清　０．１０単位／ｍｌ抗トロンビン■２７８実施例５ヒト　゛　の　Ｉ　プロトロンビン　のヒト血清中に存在する抑制活性物質をＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー（第７図ン及び５ｕｐｅｒｏｓｅ６クロマトグラフイー（第８図）によって精製した。ヘビ毒液１０トロンビナーゼ（Ｏｗｅｎら、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ、３．７０５−７１４（１９７３）、Ｓｉｇｍａ社から入手）でプロトロンビンをトロンビンに変換することによりプロトロンビンＩを測定し、トロンビンに関して実施例３で説明したようにア・ンセイした。

ヒト血清２０鴎１を４０ｍＭのトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ８，０）に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したべ・ンドボリューム３００ｍ１のＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｃｍＸ１５ｃｍ）に２ｍｌ／分て添加した。カラムに結合したタンパク質を同じＭ衝液中ＯからＩＭまでの直線ＮａＣＩ勾配で溶出した。第７図に示すように、プロプレートレッド抑制活性のピークはプロトロンビンアッセイで得られたピークと合致した。このピークに対応するフラクションをプールし、濃縮し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、Ｏ，ＩＭのＮａＣ１，０，０１％のポリエチレングリコール６００（ｐＨ７，０）中で平衡化した５ｕｐｅｒｏｓｅ−６ゲルー過カラムに０．７５ｍ１／分で添加した。第８図に示すように、プロプレートレッド抑制活性は、ウシ血清アルブミンよりやや大きい分子量を有し且つプロトロンビンアツセイで得られたピークと合致する単一の広いピークとして溶出された。

実施例６に　プロ　ロンビン）　トロンビンへのプロトロンビンは酵素によってトロンビンに変換するまでは生理的に不活性である。巨核球がプロトロンビンをトロンビンに変換する能力を第９図に示した。

巨核球と実施例１と同様に調製した。巨核球を実施例１と同様にインキュベートして、プロプレートレ・／ト形成巨核球（ＰＰＦ−Ｍｅｇｓ）を調製した。遠心分画によりモルモット骨髄から血小板を単離した。これらの血小板は５００ｘｇの遠心後に１０分間上清中に残留させておき、１．５００Ｘｇでベレット化する。指定数のモルモット血小板、巨核球（ｍｅｇｓ）又はプロプレートレッド形成巨ＦＥ球（ＰＰＰ−Ｍｅｇｓ）にプロトロンビンを最終濃度１４３μｇ　／　ｍ　１で加え、培養物を３７℃で１時間インキュベートした。培養上清を回収し、実施例３で説明したように発色団Ｓ−２２３８を用いてトロンビンを定量した。

これらの条件では、細胞及びプロトロンビンが両方とも存在していた時にだけトロンビンが生成した。巨核球及びプロプレートレッド形成巨核球はプロトロンビンからトロンビンへの変換で同等の効果を示したが、この変換には巨核球の数百倍の血小板が必要であった。

実施例７に　る　゛　の０．０３５％のヒト血清、２５ｐＭのトロンビン又は５ｎＭのプロトロンビンと、ｉｎ　ｖｉｔｒｏアッセイに関して説明した条件に従い、４℃又は３７℃で４２時間インキュベートした。約５，０００個の巨核球を加え、１８時間後に形成されたプロプレートレフトの数を調べた。プロプレートレッドの形成は観察されなかった。しかしながら、ヒト血清、トロンビン又はプロトロンビンを最初に巨核球と共に３７℃で４２時間インキュベートし、次いで５゜μｌの反応上滑を新しい巨核球培養物に移すと、１８時間後に大規模なプロプレートレッド形成が生じた（表５）。

予め巨核球と共にインキュベートすることによって、ヒト血清、トロンビン及びプロトロンビンの抑制活性が中和されたのである。

表　５の　ｆプロブレー　し・・　乏　に臣虹１１弘ｉ４１ヒト血清　０　６２　３２７トロンビン　ＯＯ２１８なし　２７９　２９８　３４３抑制物質を存在させずに実施例１と同様の培地で巨核球を４２時間３７℃でインキュベートした。このならし培地を回収し、　ＣｅｎＬｒ１ｃｏｎ−１０メンブランフィルタ−を通して遠心することにより１／６に濃縮し、この濃縮培地５０ μｌ乞同量の新しい巨核球及びヒト血清もしくはトロンビンと共に３７°Ｃて゛１８時間インキュベートした。巨核球ならし培地を使用した場合にはプロプし一トレッドの形成が観察されたが、非ならし培地の存在下では抑制が生じた（表６）。

表　６・ｔ・ら　稗　に　プロプレートレット多　のなし　非使用　２０５ヒト血清　非使用　１５ヒト血清　使用　２５８トロンビン　非使用　１８トロンビン　使用　２２３これらの実験で、巨核球が、ヒト血清又は精製トロンビンによるプロプレートレッド形成の抑制分中和するが又は機能的に消滅させる可溶性因子を生成し分泌することが立証された。これらの因子を巨核球成熟因子（Ｍ　Ｍ　Ｆ　＞と称する。

実施例８ヒト　ハｆｌ　によるプロプレートレット多　の刺ヒト血小板溶解物を調製し且つｉｎ　ｖｉｔｒｏでプロプレートレッド形成アンセイにかけることによって、血小板中の巨核球成熟因子の存在を調べた（第１０図）。

１當ドナーに由来するヒト血小板を、約２００ｍ１の高血小板含量血漿（ｐｌａＬｅｌｅｔ　ｒｉｃｈ　ｐｌａｓａ＋ａ＝　ＰＲＰ、ＨｅｍａＣａｒｅ社から入手）中に約３〜４に１０１１個の血小板を含むブレ１−　シ・ノドフェレシスバック（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｈｅｒｅｓｉｓ　ｐａｃｋ）の形態て入手した。血小板は容器から出して２４時間以内に使用した。この血液バッグ（ｂｌｏｏｄ　ｂａｇ）にアビラーゼ（Ｓａｇｓ）を最終濃度２単位／ｍｌで直接加え、３７℃で２０分間インキュベートした。ＰＲＰを５０ｍ１ポリプロとレンチューブに移し、室温で８分間１２０Ｘｇの遠心にかけて混入血液細胞を除去した。上清をポリカーボネートチューブに移し、１，５００Ｘｇで２０分間遠心して血小板をベレ／ト化した。

ＣＨＡＰＳ中て′血小板溶解と行うべく、得られたベレットを室温で２０分間１．５００＝ｇの遠心にかけることにより３回洗浄し、２８０ｍ　ｌのタイロード緩衝Ｊ　（１３７１１１ＭＮａＣＩ、　２．７ｍＭ　ＫＣＩ、　１２ｍＭ　ＮａＨＣＯ，、０，４ｓ＋ＨＮａＨ２ＰＯ，、１ｓ＋Ｈｇｃ＋、、２ｍＭ　ＣａＣｌ２．５．５Ｊデキストロース、ｐＨ７，３５ンに０．４％のヒト血清アルブミンと２単位／ｍ＋のアビラーゼとを加えたＷａｓｈ　１＋１４０ｍ１のタイロード緩衝液に２単位／ｍｌのアビラーゼを加えたＷａｓｈ２；１４０ｍ１のタイロードＭ衝液からなるＷａｓｈ３に再懸濁させ、次いで最終的遠心にがけな、血小板を、氷上で１時間にわたり、５ｍＭの３−（３−コラミドプロピル）−ジメチル −アンモニオ−１−１０パンスルホネート（ＣＨＡ　Ｐ　Ｓ　、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｒａ社がち入手）中に１．６ｘ１ｏ１゜血小板／ｍｌで溶解した。溶解物を２，２００Ｘｇで遠心し、４０ｍＭのトリス（ｐＨ８）に対して、この外液を４回交換しながら透析した（１回の交換量は４１）、血小板溶解物を１５０．０００Ｘｇで６０分間遠心して清澄化した。

血小板の溶解を塩化グアニジニウム中で行うべく、前記ベレットを、２８０ｍ１のタイロード緩衝液に２２ｍＭのクエン酸三ナトリウムと０．４％のヒト血清アルブミンと２＃４位／ｍｌのアビラーゼとを加えたＷａｓｈ　１＜ｐＨ６，５）；　１４０ｍ１のタイロード緩衝液に２２ｍＭのりエン酸三ナトリウムと２単位／ｍｌのアビラーゼとを加えたＷａｓｈ　２（ｐＨ６，５）；　１４０ｍ１のタイロード緩衝液に２２ｍＭのクエン酸三ナトリウムを加えたＷａｓｈ３（ｐＨ６，５）で逐次洗浄し、次いで最終的遠心にかけた。

血小板ベレットを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル及び１０ｍＭ　６−アミノヘキサン酸中６Ｍの塩化グアニジニウム（ｐＨ６，０）に８×１０ｇ血小板／ｍ＋で加え、静かに撹拌しながら４℃で３時間可溶化した。この溶液を４０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、１ｍＭのＰＭＳＦに対して、外液を４１／回で４回交換しながら透析し、１５０，０００ｘｇで６０分間遠心することにより清澄化した。

実施例９ヒト　ハ　か　の　軌　の　Ｉヒト血小板由来ＭＭＦを下記の手順て精製した。精製中のＭＭＦの存在は、成熟阻害剤存在下でのｉｎ　ｖｉｔｒｏのプロプレートレッド形成によって検出した。

Ａ、塩化グアニジニウム抽出血小板からのＭＭＦの精製ヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物（２４ｏｍｇのタンパク質を含むもの１６０ｍ１）を実施例８と同様に調製しな、この溶解物を４０ｍＭのトリス−ＭＣＩ（ｐＨ８，０）で平衡化し、１ｍｌ／分の流速で２２０ｍ１（２，６ｃｍｘ４０ｃｍ）ＤＥＡＥ−セファロースカラムに添加した。このカラムをトリスＭ衝液で洗浄し、同じ緩衝液中０からＩＭまでの直線ＮａＣｌ勾配で展開したく総勾配量は８００ｍ１であった）、第１１図に示すように、プロプレートレッド形成活性にてするカラムフラクションのアッセイでは、異なるＮａＣ１濃度で溶出する３つの独立したピーク、ＭＭＦ−１、ＭＭＦ−ＩＩ及びＭＭＦ−１［［が観察された。

ＭＭＦ−Ｉ［［に対応するフラクションをプールし、５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％ＰＥＧ６００　（ｐＨ５゜０）に対して透析した。透析したプール（０，０１２Ａ２．。

／ｍｌで２３７ｍ１）を、５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０１％ＰＥＧ６００　（ｐＨ５，ｏ＞で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑ　ＦＰＬＣカラム（０，５Ｘ５ｃｍ）に添加した。流速は０．５ｍｌ／分に調整した。同じ緩衝液で洗浄した後、カラムをＯからＩＭまでの直１ｉＮａｃｌ勾配で展開しく総勾配量は６０ｍ１であった）、次いでＩＭのＮａＣ１で洗浄した。第１２図に示すように、プロプレートレット形成に対応する広いピークが２８０ｎｍでの吸光ピークに合致する。このピークに対応するフラクションを集め、得られたプール（０、０７２Ａ　ｘｓｏ／　ｍ　ｌで１８ｍ１）を純度、分子量及びアミノ酸配列について分析しな。

Ｂ、塩化グアニジニウム溶解物から精製したＭＭＦの分析Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ− ＩＪ７過装置を用いて限外濾過により２ｍｌのＭｏｎｏ　Ｑプールを２００μｌまで濃縮し、４０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、０．１ｍＭ　ＮａＣ＋、２ｍＭ　ＣａＣ１ｚ（ｐＨ８゜０）中で流速０．５ｍｌ／分で５ｕｐｅｒｏｓｅ−６ゲル濾過カラム（１ｃｍＸ３０ｃｍ）に添加した。第１３図に示すように、プロプレートレット形成活性に対応する活性ピークが、ボイドボリュームに現れる２３０ｎｍでの吸光度によって測定したピーク及び肩に合致する。これは、ＭＭＦ−ｍ調製物の大きさは不均一であるが、種々の形態のＭＭＦ−１［Ｉの活性レベルは顕似していることと示２ｍｌのＭｏｎｏ−Ｑブールを０．１％トリフルオロ酢１！＊　（ＴＦＡ）に対して透析し、Ｃｅｎｔｒｉｅｏｎ−１０濾過装置を用いて限外濾過により２００μｍまで濃縮した。濃縮した試料を０．１％ＴＦＡ中で０．７５ｍ１／分で４Ｃ−逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム（０，４６Ｘ２５ｃｍＶｙｄａｃ　Ｃ４カラム２１４７Ｐ５４　）に添加し、このカラムを０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル濃度を勾配させて展開した。

第１４図に示すように、７０プレートレツド形成活性の広いピークが２１４ｎｍでの吸光度ピークと合致した。これも、活性ＭＭＦ−１［［の異なる形態を示すものである。

Ｃ，ヒト血小板のＣＨＡＰＳ溶解物からのＭＭＦの精製実施例８に記載のようにＣＨＡＰＳ［衝液で抽出し且つ４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）で平衡化した血小板溶解物と、塩化グアニジニウム抽出血小板について説明したようにＤＥＡＥ−セファロース及びＭｏｎｏ−Ｑカラムクロマトグラフィーによって精製した。第１５図に示すように、２つの別個のプロプレートレット形成活性ピークＭＭＦ−Ｉ［及びＭＭＦ−ＩＩＩがＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィーによって得られた。第３の活性ピークＭＭＦ−ｒはフロースルー（ｆ　ｌｏｗ−ｔｈｒｏＢｈ）フラクションには存在するが、この調製物では検出されなかった。フラクション３８付近の活性ピーク（グアニジニウム溶解物由来のＭＭＦ −Ｉ［［に対応する）をプールし、Ｍｏｎｏ−Ｑカラムにかけた。第１６図に示すように、プロプレートレッド形成活性がフラクション２８〜３６の広いピークに溶出された。

Ｄ、５ＤＳ−ＰＡＧＥによる精製ＭＭＦ−１［の分析塩化グアニジニウム溶解物及びＣＨＡＰＳ溶解物に由来するＭｏｎｏ−Ｑプールのアリコートを、４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０＞中で、室温で２４時間にわたり、０．１単位のコンドロイチナーゼＡＢＣで処理した。試料を５ｐｅｅｄ−ｖａｅで乾燥し、未処理試料と共に１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した（第１７図）。コンドロイチナーゼＡＢＣで処理しなかった試料はゲル中に検出されなかった。これは、ＣＨＡＰＳ溶解物又は塩化グアニジニウム溶解物から精製したＭＭＦ−ＩＩに、ゲル中への侵入分妨害する共有結合炭水化物が相当置台まれていたことを示唆するものである。コンドロイチナーゼで処理した試料は幾つかのバンドの形態で５ＤＳ−ＰＡＧＥ上を移動した。これは、徹底した消化の後でも総ての炭水化物がタンパク質コアから除去され得るわけではないことを示唆するものである。

実施例１０ヒト血ハ　の　！グアニジニウム゛・　びＣＨＡ　Ｐ　Ｓ　”解物に由来　るＭＭＦ−１１［のＮ末端アミノヒト血小板の塩化グアニジニウム溶解物及びＣＨＡＰＳ溶解物から精製したＭＭＦ−Ｉ［Ｉを、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓのモデル４７０＾及びモデル４７３＾シーケンサ−を使用し、同社の高圧液体クロマトグラフィーシステムを用いるオンラインＰＴＩＩ分析と併行しながら、Ｎ末端配列決定にかけた。配列決定はサイクル毎のクロマトグラムの比較によって行った。

下記の配列が決定された：塩化グアニジニウム溶解物由来のＭＭＦ−１［［：Ｙ−Ｐ−Ｔ−Ｑ−Ｒ−Ａ−Ｒ −Ｙ−Ｑ−Ｗ−Ｖ−Ｒ−Ｘ−Ｎ−Ｐ−ＤＣＨＡＰＳ溶解物由来のＭＭＦ−１［［：Ｒ−１−Ｆ−Ｐ−Ｌ−Ｓ−Ｅ−Ｄ−Ｙ塩化グアニジニウム溶解物由来のＭＭＦ−Ｉ［［について決定されたＮ末端アミノ酸配列は、ヒト血小板プロテオグリカンのＮ末端配列（ＡＩｌｉｅｌら、前出の文献；　Ｐｅｒｉｏら、前出の文献）と同じであった。ヒト血小板プロテオグリカンと同じである塩化グアニジニウム溶解物由来のＭＭＦ−Ｉ［［をＭＭＦ’ −”’と称する。

ＣＨＡＰＳ溶解物由来のＭＭＦ−ＩのＮ末端配列は、ヒト血小板プロテオグリカンのアミノ酸５８〜６６の配列（Ａｌｌｉｅｌら、前出の文献ＨＰｅｒｉｎら、前出の文献）と同じであった。ＣＨＡＰＳ溶解物由来のＭＭＦ−Ｉは、ヒト血小板プロテオグリカン（即ちＭＭＦ’−”’）のカルボキシ末端のアミノ酸７４個のフラグメントと同じであり、ＭＭｐ５ｇ−１ｆｆ＋と称する。

実施例１１ＭＭＦ’−’コｌ　ＭＭ）ｌ”５８−１ゴＩのパＭＭＦし１コ１及びＭＭＦ５ｍ −１ｆｆ＋を、文献（Ｂｉｔｔｅｒ及びＭｕｉｒ、＾ｎａｌ　、Ｂｉｏｃｈｅｍ、４，３３０−３３４（１９６２）　）に記載の方法でウロン酸含量についてアッセイした。各形態のアミノ酸配列データと配列決定時に得られたアミノ酸収率とに基づいて計算した消衰係数によりタンパク質濃度を調べた。

ＭＭＦ５ｇ−１３１はタンパク質１μｇ当たり約１４０μｇのウロン酸を含んでおり、Ｍ　Ｍ　ｐ　＋　−１：ｌ　＋はタンノマク質１μｇ当たり約８０〜１００　ノｔ　ｇのウロン酸を含んでいた。

トロンビンによって誘発されるプロプレートレ・ノド形成抑制を阻害する能力についてＭＭＦ’−”’をアツセイした（第１８Ａ図）、精製トロンビンをｌ５ｃｏｖｅｓ培地又はＭ　Ｍ　Ｆ　＝”’調製物中に逐次希釈し、培養ウェルに加え、３７℃で３時間インキュベートした。ＭＭＦ＋−”’は０．１Ｂｇ　／　ｍ　Ｉのタンパク質及び１０μｇ／ｍｌのウロン酸で存在し、トロンビンは０．３５〜１１００ｐで存在していた。ウェル当たり約５０００個の巨核球と加え、１８時間後に各ウェルのプロプレートレッド数を数えた。

トロンビンによって誘発されるプロプレートレッド収縮。

を阻害する能力についてＭＭＦ’−”’ｔアッセイした（第１８Ｂ図）、精製トロンビン及びＭＭＦ’−”’調製物を前述のように培養ウェルに分配し、４℃で１８時間インキュベートした。ウェルの中味をプロプレートレットが入っているウェルに移し、１０分後に残留プロプレートレッドの数を数えた。

実施例１で説明したｉｎ　ｖｉＬｒｏプロプレートレット形成ア・ソーｔ＝　イ４．：Ｍ　Ｍ　Ｆ　’−”’及びＭ　Ｍ　Ｆ５　ｍ　−１３１を同等のウロン酸濃度で加え、プロプレートレッド形成を調べた（第１９図）。

このアッセイではＭ　Ｍ　ｐ’　Ｉ　−１２１及びＭ　Ｍ　Ｆ５ｇ−ｌｊ　１が同等の活性（ウロン酸１Ｂｇ当たり）を示した。

ＭＭＦ−Ｉ［［の生物学的活性で結合炭水化物（硫酸コンドロイチン）が果たす役割を調べた。ＤＥＡＥクロマトグラフィー由来のＭ　Ｍ　Ｆ　”−’コ１を、０．１単位／ｍｌのコンドロイチナーゼＡ　Ｂ　Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を存在させて又は存在させずに、４０ｍＭトリス、４０ｍＭ＃酸ナトリウム（ｐＨ８，０）中で１８時間３７℃でインキュベートした。処理したＭ　Ｍ　Ｆ　”−”’をｌ５ｃｏｖｅｓ培地に移し、プロプレートレットアッセイに５０容量％まで加えた。

第２０図に示した結果から明らかなように、コンドトロイチナーゼＡＢＣで処理したＭＭｐＳ＝−１３１は検出可能なプロプレートレット形成活性を示さない。

実施例１２ＤＥＡＥ　ロマト　−フ　−で　ｔ゛　軌　の表７は、ヒト血小板を実施例８と同様にＣＨＡＰＳＭ衝液中で溶解し且つ実施例９と同様にＤＥＡＥクロマトグラフィーにかけて得たＭＭＦ−１、ＭＭＦ−ｆｆ及びＭＭＦ−■の生物学的活性の比較を示している。

表７ヒト血小板溶解物に由来するＭＭＦプールの特性鼠欣ニー上　鼠社ニーｌ　Ｋ鼠ユニ皿分子量　工、高い　５０，０００　高い２、５０，０００安定性　熱及びｐＨに敏怒　熱及びｐｌ（に敬啓　安定トロンビンによるプロブレートレッド形成抑制を阻害するか？　試験しながった　する　するプロトロンビンからトロンビンによるブトロンビンのアミド実施例１３マ　ス　ヒ　ＭＭＦ’−１３’　の　ローニン特記しない限り、　Ｍａｎｉａｔｉｓらの組換えＤＮＡ手Ｎｉ（Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　７．Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｆｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ｐｐ、２１２−２４６（１９８２））を使用した。

Ａ、マウスＭＭＦ　ｃＤＮＡの増幅及びクローニングトリフルオロ酢酸セシウムベレット化プロトコル（Ｏｋａ−ｙａａ＋ａら−Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｇ＋、１５４．３−２８（１９８７））を用いて、マウス細胞系ＭＣ／９．５、即ちＭＣ／９のサブクローン（＾ＴＣＣＮｏ。

ＣＲＬ　８３０６）からＲＮＡを精製した。マウス肥満（マスト）細胞分泌顆粒プロテオグリカンの公表されているｃＤＮＡ配列（Ａｖｒａｈａｍら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、＾ｃａｄ、ｓｅｉ、ＵｓＡ　８６，３７６３−３７６７（１９８９））から以下に述べるオリゴヌクレオチドプライマーＭ１〜Ｍ４を設定し、＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ　ＤＮ＾合成器で合成した。

第１鎖ｃＤＮＡの合成は鋳型としてのＭＣ／９．５ＲＮＡ及びアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）プライマー５’　−ＣＴＧ＾＾ＴＡＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣ＾丁ＣＧ−３°　（Ｍｌ）とから行った。このプライマーの配列は、タンノ（り質コード領域の３゛末端側でマウス肥満細胞分泌顆粒プロテオグリカンのｃＤＮＡ配列の一部分に対して相補的なものである。ｃＤＮＡ合或は、製造業者（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅｒａｃｈ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ、（：ａｉａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＨＤ）によって決められた手順に従い、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素を用いて行った。

約６０ｎｇのＲＮＡからの第１　Ｈｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、コード領域の５゛末端側に位置するセンス値（ｓｅｎｓｅ　５ｔｒａｎｄ）プライマーであるオリゴヌクレオチドブライマー５”　−ＣＴ＾＾ＴＣＣＡＧＡＣＧＣＴＧＡＧＴＧＣ＾−３ °　（Ｍｌ）を用いるポリメラーゼ開反応（ＰＣＲ）増幅（Ｓａｉｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３９，４８７−４９１（１９８８）ンの鋳型として使用した。コノＰＣＢ増幅の産物を、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ＞プライマー及び５　’　−ＧＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＣＡＴＴＣＡ−３’　（Ｍ４　）を用いて更に増幅した。プライマーＭ３はマウスＭＭＦ−■をコードする配列の直前の配列５’−ＣＣＡＣＣ−３’を含んでいる。このような配列は既に翻訳効率がよいことが明らかにされている（Ｋｏｚａｋ、Ｎｕｃ、＾Ｃｉｄ　Ｒｅｓ、１５．８１２５−８１４８（１９８７））。

プライマーＭ３及びＭ４を使用するＰＣＲ増幅の産物をＢ’ａｍＨＩ及び５ａｌＩで消化し、ベクターｐＣＤ誘導体であるｐ　Ｄ　Ｓ　Ｒａ　２　（Ｏｋａｙａｍａら−Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ１．３，２８０−２９８（１９８３））に連結反応させて組換えプラスミドｐＤＳＲα２（ｍ　ｕ　Ｍ　Ｍ　Ｆ　）を得た。

マウスＭＭＦ挿入体のＤＮＡ配列をジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ　、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、、ＵＳＡ阻。

１９３４−１９３８＜１９７７）ンによって決定した。このマウスＭＭＦの配列は、マウス肥満紺胞分泌顆粒グロテオグリカンについて報告されているもの（Ａｖｒａｈａｍら、前出の文献）と同じであった。

Ｂ、ヒトｌ−１″’ｃＤＮＡの増幅及びクローニング前述の手順でヒト白血病細胞系（ＨＥＬ、＾ＴＣＣＮｏ、ＴＩＢ　８１０）からＲＮＡを精製した。ヒト分泌顆粒プロテオグリカンの配列（５ｔｅｖｅｎｓら、前出の文献）からオリゴヌクレオチドブライマーＨ１〜Ｈ４を設定した。

第１　鎧ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合或は鋳型としてのＨＥＬ　ＲＮＡとヒ）ＭＭＦアンチセンスプライマー５　’−ＴＧＣＴＡＡＣＴＡＡＴＴＧＣＣＴＧＧＴＧτ−３’　（Ｈｌ）とから行った。

ＰＣＲ増幅は、プライマーＨ１と５’−ＧＡＧＡＧＣＴＡＧＡＣＴＡＡＧＴＴＧＧＴＣＡ−３’　（Ｈ２）とを用いて実施した。

制限部位ＨｉｎｄＩ［Ｉ及び５ａｉｌをそれぞれ含むネステッ及び５　’　−ＧＣＣＧＴＡＧＴＣＧＡＣＡＡＣＣ’！’ＧＧＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＴ−３’　（Ｈ４）を用いてＰＣＲ産物を更に増幅した。

プライマーＨ３及びＨ４を用いるＰＣＲ増幅の産物を、前述のようにＨｉｎｄｌｌｌ及び５ａｌＩで消化し且つｐＤＳＲα２に連結反応させて組換えプラスミドｐＤｓＲα２＜ｈｕＭＭＦ’−”’）を得た。超らせんＤＮＡの不可逆的変性に次いでジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、前出の文献）によりヒトＭＭＦのＤＮＡ配列を決定した。ヒトＭＭＦの配列はヒト分泌顆粒プロテオグリカンについて報告されているもの（Ｓｔｅｖｅｎｓら、前出の文献）と同じであった。

Ｃ，マウス及びヒトＭＭＦ−Ｉ［［の発現マウス及びヒトＭＭＦを発現させるために、プラスミドｐＤｓＲα２（ｈｕＭＭＦ−１［［）もしくはｐＤｓＲα２（ｍ　ｕ　Ｍ　Ｍ　Ｆ　）をエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によりＣｏＳ細胞中にトランスフェクションする（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ、ＮａＬｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵｓＡ　８１，７１６１−７１６５（１９８４））か、又はリン酸カルシウム共同沈降によりチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ○）細胞中にトランスフェクションした（Ｈｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１１，２２３−２３２（１９７７））、　）ランスフェクションしたＣＯ８細胞を、１％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えたダルベツコの改質必須培地（ＤＭＥＭ）中で２〜５日にわたり３７℃で増殖させた。ならし培地を回収し、実施例１で述べたようにｉｎ　ｖｉｔｒｏプロプレートレッド形成に関してアッセイした。

トランスフェクションしたＣＨＯＩＩ胞を低密度（〜１０５細胞／　１００　ｍ　ｍ皿）で接種し、非必須アミノ酸と１０％の透析したＦＣＳとを加えたＤＭＥＭ中で１０〜１４日にわたり３７℃で増殖させた。コロニーを採取するか又は細胞をトリプシンで処理して、更に１０〜１４日間にわたり新しい培地に移した。

ならし培地を回収し、実施例１と同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏプロプレートレッド形成についてアッセイした０次いで、プロプレートレッド形成を刺激するトランスフェクションしたＣＨＯ細胞培養物をメトトレキセートの存在下で増殖させて、ＭＭＦ発現を増幅した。

実施例１４ハ　の　に　ＭＭＦ’−＋３’のＭＭＦ’−１ｆｆ’の投与が循環血小板量に及ぼす影響を調べるように設計した実験を、６〜８週齢のメスＢ　ａ　ｌ　ｂ　／　ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）に対して行った。１つの実験の総ての動物は同齢同腹のものとした。

ＭＭＦ’−”’を実施例つと同様にヒト血小板から精製した。ヒト組換えＩＬ− ６をＣＨＯ細胞ならし培地から精製した。１５０ｍＭ　ＮａＣｌ−０，１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中のＭＭＦ’−”’又はＩＬ−６２００μｌを、８時間間隔で一日に２回の割合で合計１０回マウスに皮下注射した。最後の注射から３時間後に、較正した微細管を使用し、側方尾部静脈に入れた小さい切れ目を介して各動物から２０μｍの血液試料を採取した。これらの試料をＳｙｓｍｅｘマイクロセル計数器Ｆ−８００（Ｔｏ＾Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｏ−ｎｉｃｓ　Ｃｏ、）での分析に必要な希釈剤中に直接希釈した。得られたデータをＳｔａｔｖｉｅｗ５１２＋ソフトウェアプログラムを用いる５ｅｈｅｆｆｅのＦテストによって分析した。９５％以上で有意性を有するデータには星印を付けた。

ＭＭＦ’−”’は、４μｇ／日又は２０μｇ／日で投与すると血小板を増量させたく第２１図）　、　Ｍ　Ｍ　Ｆ＋−１ｆｆ＋を２０μｇ／日で投与すると、統計的に有意な２１％の血小板増量が観察された。ＩＬ−６も２μｇ７日又は１０ μｇ／日で投与すると血小板と増量させ、１０μｇ７日では統計的に有意な３４％の増量が観察された（第２２図）。

２０μｇ／日のＭＭＦｌ−Ｉｆｆ＋ｆｆ上２μｇ７日のＩＬ−６投与とを組合わせて行うと血小板が４０％増量した。この増量は、Ｍ　Ｍ　ｐ　＋　−１３１だけを２０μｇ７日投与するか又はＩＬ−６だけを２μｇ／日投与した場合に得られる増量と比べて統計的に有意なものである。この実験の条件では、ＭＭＦ’− ”’及びＩＬ−６の使用量自体をさらに上げても、血小板が更に著しく増量することはなかった。他の血液学的パラメータ、例えば白血球及び赤血球の数及びヘマトクリット値は、ＭＭＦ’−”’又はＩＬ−６処理の影響を受けなかった。

以上、本発明の好ましい実施Ｂ１ａを説明してきたが、これ以外にも様々な変形例が当業者によって想到されるであろう、これらの変形例は総て、「請求の範囲」によって規定される本発明の範囲内に含まれるものとする。

ＰＰ形成／ウェルＰＰ形成の抑制　％ＰＰ形成数／ウェルＰＰ形成／ウェルＰＰ形成／ウェルＰＰ形成／ウエル抑制単位／ｍｌ　（０−○）抑制単位／ｍｌ　（ｏ　ｏ）プロトロンビン　（ｕｇ／ｍｌ；　◇−◇）生成トロンビン　（ｕｑ／ｍ１）ＰＰ形成／ウニルＰＰ形成／ウェルＰＰ形成／ウェル　（０−０）ＰＰ形成／ウェル　（ｏ　−ｏ）Ａ２３０（−＞ＰＰ形成／ウェル　（０−０）１．工、ウェアｂ（ｏ　０）Ａ２８０（−＞ＰＰ形成／ウェ、、（ｏ−ｏ＞ＰＰ形成／つ＝ル　（０−０）ＦＩＧ　２１ＦＩＧ　２２ＦＩｏ、２３要約本発明は、循環血小板量を増加させる因子により血小板障害を治療する方法に関する。本発明は、これらの因子を得る方法、並びに血小板生成因子を含む医薬組成物にも関する。

国際調査報告１−−１−ｍ−ｍ、　ＦＣＩ’Ｚ［１！Ｒ１１０７３５７Ｓｅｒｉａｌ　Ｎｏ、ＰＣτ／ＬＩＳ９１／９７：１６７＾ｒｔ　Ｕｎｉｔ　１８１４Ｔｈｅ　ｃｌａｘｓｇ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ａ　ｐｉｕｒｓ工ｉｔｙ　ｏｆ　ｍｕｔｕａｌｌｙ　ｆＸｃｌｕｆｆｉＬｖｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　１ｎｖｅｎｔ４ｏｎｓ　ａｓ　ｉｏＬ工ｏｗｓ：Ｎｏｔｅ　ｔｈ＠ｔ　ｔｈｅ　工ｏｌｌｏｖｉｎｇ　ａｒｅ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｉｎｃｔ　虐ｐｅｃｚｅｓｐｅｒｔ４ｎｅｎｔ　ｔｏ　ｔｈｅ　１ｎｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ　ｗｈｅｒｅ　ｍｌ　ｉｇ　ｔｈｅ　ヱエｒａｔｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｗｉｌｌ　ｂｅ　５ｅａｒｃｈｅｄ　ｗｉｔｈ　ｅｉｍｉｓｗｇ　ｉ４　ａｎｄ　１ｉ−１４ｉｎ　ｔｈｅｅｖｅｎｔ　ｔｈｓｔ　ｎｏ　ｏｔｈｅｒ　ｆｅｅｓ　−ｒｅ　ｐａｉｄ、　Ｎｏｔｅ　ｔｈａｔ　ａ　５ｅａｒｃｈ　ｏｆ　ａｎｙａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｗｉｔｈｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｘ　ｒ＠ｑｕｉｒｅｓ　ｐａｙｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｄｄｉｔｔａｎａ■ ａｌ　ａ　ｅｏｍｐｏｇｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＦ　ａｎｄ　ＳＣＦ　（ｃｌ＠ｉｍ　Ｚ　ｏｒ　６）１ｂｌ　ａ　ｅｏｍｐｏｇｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ８Ｆ　ａｎｄ　Ｇ−Ｃ５Ｆ　ｌｃよ―二ａｍ　２　ｏｒ　６ンｌｅ）　ａ　ｃｏ＋ｓｐｏ＊１ｔｉｏｎ　ｏｆ　？１ＭＦ　ａｎｄ　ＧＷ−Ｃ５Ｆ　（ｃｉｍｉｗｓ＋　２　ｏｒ　６１１ｄｌ　ａ　ｃｏ＋＋＋ｐｏ＊１ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＩＩＰ　ａｎｄ　ＸＬ−３１ｃ↓ａｉｍｓ　２　ｏｒ　６１７ｅｌ　ａ　ｃｏ＋ｓｐｏｇｉｔ４ｏｎ　ｏｆ　ＭＭＦ　ｓｎｄ　ＩＬ−６ｔｃｌａｉ＋ｍｓ　２　ｏｒ　＆＋１ｆｌ　ａ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＦ　＠ｎｄ　ｌｅｇ−Ｃ５Ｆ　ｉｅｌａ１１ｍ＠　２　ｏｒ　６１７ｇ１　ａ　ｃｏｗ＋ｐｏｍｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＭＭＦ　ａｎｄ　ＭＳＦ　（ｃｌａｉｍ　２　ｏｒ　６１Ｂｈｌ　ａ　ｃｏ＋ｓｐｏｇｌｔｌｏｎ　ｏｆ　ＭＭＦ　ａｎｄ　ＥＰＯｉｃｌａｉｍｇ　２　ｏｒ　６１７ｊｌ　ＭＭＦ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒａ＋＊　ｕｒｉｎｅ　Ｔｅ１ａ１＊　１２１；ｋｌ　ＭＭＦ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏ＋ｍ　ｍｅｇａｋｍｒｙｏｅｙｔｅｓ＋　ｏｒ　ｐｌａｔ書１ｅｔｓ　（ｃｌａｉｍ　１２Ｊ

Claims

【特許請求の範囲】１．治療上有効な量の巨核球成熟因子を投与することからなる、哺乳動物の血小板を増量させる方法。２．治療上有効な量のＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＳＦ又はＥＰＯの投与をも含む請求項１に記載の方法。３．巨核球成熟因子がＭＭＦＩ−１３のアミノ酸配列の一部又は全部を有するものである請求項１又は２に記載の方法。４．巨核球成熟因子が外来ＤＮＡ配列の原核又は真核発現産物である請求項１又は２に記載の方法。５．治療上有効な量の精製単離巨核球成熟因子と、医薬的に許容し得る１種類以上のアジュバント、希釈剤、可溶化剤、防腐剤又はキャリヤーとを含んでいる組成物。６．治療上有効な量のＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ−ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＳＦ又はＥＰＯをも含んでいる請求項５に記載の組成物。７．巨核球成熟因子がＭＭＦ１−１３１のアミノ酸配列の一部又は全部を有している請求項５又は６に記載の組成物。８．巨核球成熟因子が外来ＤＮＡ配列の原核又は真核発現産物である請求項５又は６に記載の組成物。９．巨核球成熟因子が水溶性ポリマーに共有結合している請求項５又は６に記載の組成物。１０．ポリマーがポリエチレングリコールか又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーから選択されたものであり、このポリマーが未置換であるか又は一端をアルキル葦で置換したものである請求項９に記載の組成物。１１．プロプレートレット形成アッセイでＭＭＦを巨核球と共にインキュベートし、ＭＭＦに対する巨核球の応答をモニターすることからなる巨核球成熟因子のアッセイ方法。１２．ＭＭＦがヒト血清、尿、巨核球又は血小板に由来するものである請求項１１に記載の方法。１３，ＭＭＦ含有物質をイオン交換クロマトグラフィーにかけるステップを１つ以上含む、ＭＭＦ含有物質から巨核球成熟因子を精製する方法。１４．ＭＭＦ含有物質がヒト血小板である請求項１３に記載の方法。１５．非効率的な血小板新生又は血小板新生制御の異常に起因する哺乳動物の血小板減少症の治療方法であって、治療上有効な量の巨核球成熟因子を投与することからなる方法。１６．血小板減少症が巨赤芽球造血又は周期性血小板減少症に起因するものである請求項１５に記載の方法。１７．血小板破壊の増大に起因する哺乳動物の血小板減少症の治療方法であって、治療上有効な量の巨核球成熟因子を投与することからなる方法。１８．血小板減少症が特発性血小板減少往紫斑病に起因するものである請求項１７に記載の方法。１９．斡細胞又は巨核球コンパートメントの減少に起因する哺乳動物の血小板減少症の治療方法であって、治療上有効な量の巨核球成熟因子と治療上有効な量のＳＣＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＳＦ又はＥＰＯとを投与することからなる方法。２０．血小板減少症が骨髄抑制薬剤又は照射に起因するものである請求項１９に記載の方法。２１．血小板減少症が再生不良性貧血に起因するものである請求項１９に記載の方法。２２．血小板減少症が先天性巨核球形成不全に起因するものである請求項１９に記載の方法。２３．形成減少症が脊髄形成異常症候群に起因するものである請求項１９に記載の方法。