JPH05503584A

JPH05503584A - 蛍光検定装置

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Publication number: JPH05503584A
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Authority: JP
Inventors: ブロック，マイロン　ジェー．; ラッキー，スティーヴ　ジェー．
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Filing date: 1991-11-08
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、化学的リガンドおよび生化学的リガンドの蛍光検定を達成するための光学装置に関し、特に、射出する蛍光に関する所望の検定情報をその射出を形成する好ましくないバックグラウンド（背景）から分離するためのシステムに関する。

広範囲の分析用または検定用の化学システムおよび生化学システムの間で、光学システムは減衰内面全反射（Ａ　Ｔ　Ｒ，ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｔｏｔａｌ　１ｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ　）分光法の原理を利用している。特に免疫検定に役立つこのような光学システムは、たとえば、抗体を原子対を共有して固定化あるいは吸収などをした外表面の一部（すなわち、検出ゾーン）に対して光ファイバまたは光学ロッドを使用している。この抗体は、溶液中で検定または試験される抗原などのリガンドに反応すべく選定される。光ファイバの一方の端に導入された光ビームは、ファイバの重液で内面全反射されて、周囲のより希な媒質または試験溶液内で、エバネッセント波成分として知られるｍｓ波形を生成する。実用目的のため、エバネッセント波成分は。

ファイバと試験溶液との間の界面を横切る波長の一部にしか及ばない。ただし、エバネッセント波成分と、試験溶液において抗原が合成し、かつ、光源が存在することができるいかなるバルク溶液にも最小限にしか存在しない固定した抗体と、の間の検出ゾーンにおいて、この透過によって、実際に光学的な相互作用を十分に起こすことができる。さらに、このような光学的相互作用によって抗原を検定することができる。検定に関して内面全反射分光法を使用するこのようなシステムの多くは、知られるところであり、記述されてきた。たとえば、米国特許第４．１３３，６３９号は、分析物によるエバネッセント波の吸収に基づくシステムを開示する。また、米国特許第４．３２１，０５７号および第４，３９９．０９９号は、ファイバを介して伝えられるｔ１！ｉ射に関する変化を検出するシステムを開示する。さらに、米国特許第４，４４７．５４６号には、蛍光免疫検定システムを記載する。

蛍光免疫検定システムでは、エパネッセント波による励起のために検出ゾーンに生じる蛍光放射は全反射角度内でファイバ内を再通過し、ファイバ内部に閉じ込められる。蛍光の振幅は、ファイバに沿った検出ゾーンの長さにともない増加する。ただし、　（ファイバの直径および開口数によって決定される）システムの光学的処理量は一定の状態である。ファイバに沿って検出ゾーンの全表面より生じるすべての蛍光信号は、励起中の検出ゾーンに拡散される蛍光成分に関する増加によって高められるが、ファイバ内の反射の臨界角度によって決定される制限された角度を通じてその入力端においてファイバを励起する明スポットで（すなわち、ファイバの断面によって設定された寸法に対して）得られる。このような信号は高効率でしかも小型の検出器に合う処理量で容易に集められる。

周知のように、励起放射は初期には屈折率ｎｏの光ファイバを介して伝わり、そうでない場合には、屈折率ｎ１の物質によって囲まれているので、ファイバへの入力放射の最大受入角度Ｂは、次の等式からめられる。

（１）ＮＡ＝ｎ２　ｓ　ｉ　ｎｂ＝　（ｎｏ　２−ｎ、　２）”２ここで、ｎ２は、放射をファイバの一端に入射するように送る媒質（一般には、空気）の屈折率であり、ＮＡは、ファイバのいわゆる開口数である。さらに、最大受入角度Ｂは、簡略的に次のように定義される。

（２）Ｂ＝ｓ　ｉ　ｎ−’ＮＡまた、　（例えば、ｎ２が乾燥空気に対する場合などの）ｎ２＝１の場合、Ｂ＝ｂである。このため、ファイバの心材が非常に高い屈折率であり、検出ゾーンを囲んでいる媒質が非常に低い屈折率である場合、すなわち、ｎ、）＞＞ｎ、である場合には、ファイバの検出ゾーンにおける開口数は最大になる。たとえば、通常の屈折率の透明なファイバ（ガラス、シリカ、重合体など）が、一般に約１．３３乃至　１３５の屈折率を有する水溶液によって囲まれる場合は、十分な感度が得られる。上述の既知のタイプの蛍光免疫検定装置は、十分に機能するが、特に、ファイバが各検定の度に廃棄される場合などは、石英光ファイバの費用が比較的高いために、このような既知の装置に使用する光ファイバが石英から成る場合には、免疫検定を行なうための費用が比較的高くなる傾向がある。さらに、これらの免疫検定装置は、比較的扱いにくく、このため石英ファイバを用いた十分なフローセルファイバ界面を得るには費用が高（なる傾向にある。

これらの間顕に対する明瞭な解決方法は、石英ファイバの代わりに射出成形した合成重合体を使用することである。残念ながら、光ファイバとして使用することができるポリスチレンなどの重合体は、適当な励起光にさらされた場合には、一般に、それ自体が励起されて、広帯域放射の放出する。これによって、少なくとも一部が免疫検定複合体の成分の特定の結合の結果として生成される所望の蛍光と同じ放射帯の範囲内にある、好ましくないバックグラウンドが生じる。同様に、興味のあるすなわち所望の特定の結合に起因する蛍光の出力放射の部分を決定することは非常に困難になる。さらに悪いことには、検定と同じタイムスケールで、高分子ファイバからの内部放出は急速に不定期に減衰する。重合体が好ましくないバックグラウンドを生成する実際のメカニズムは、蛍光であると思われているが確ではないし、りん光あるいはラマン放出とさえも考えられると仮定されているが、一般には、説明の目的上蛍光とみなされている。

この好ましくない蛍光に関する問題は、特定の高分子成分を組み込んだある種の蛍光システムにおいては克服されている。たとえば、蛍光タグを検定される免疫化学複合体の成分に使用するマイクロテストウェルシステムでは、好ましくない蛍光に関する問題は、少な（とも２つの方法で回避されてきた。たとえば、米国特許第４，５０１．９７０で開示されるように、パネルを透明にする試験サンプルを支持するために使用されるプラスチック検定パネルに顔料が加えられる。また、米国特許第４，７２５．３８８号に開示されるように、サンプルは、そのウェルではなく試験サンプルのみが実際に視野に入るように高分子マイクロテストウェルの開口先端を通して読み取られる。

これらの好ましくない蛍光に関する２つの問題は、合成高分子光ファイバを使用する蛍光検定装置に実際的には適用できない。このような蛍光検定システムは光を伝えるためのファイバの能力に基づいているので、ファイバを明瞭に透明にするための顔料を加えることは、ファイバの蛍光に関する問題に対しての解決法ではない。同様に、蛍光検定装置の検出器は、視野においてファイバの入射／出射端を維持しなければならないので、米国特許第４．　７２５．　３８８号に開示される重合体蛍光の問題に対する解決法も、実効可能な選択ではない。

本発明の目的の１つは、検定複合体の成分を取り巻いた表面の支持要素として合成高分子光ファイバを使用する光フアイバ検定システムを提供することにある。

本発明の別の目的は、好ましくない蛍光と特に要素の表面を取り巻いたリガンドからの所望の蛍光とに起因する蛍光免疫検定システムの光学的要素の出力蛍光の部分を決定するためのシステムを提供することにある。

本発明のもっと別の目的は１重合体ファイバによる望ましくないバックグラウンド蛍光の内部生成にかかわらず、重合体光ファイバを使用する蛍光検定を実行する方法を提供することにある。

これらのおよびその他の目的は、内面全反射によって励起放射を内部に伝えることができる細長い光ファイバと、励起放射の光源と、そのような放射の入射円錐の頂点の部分をファイバの入射端すなわち近位端に向けるための手段と、を含む検定システムにおいて、励起放射により励起され、かつ、ファイバの端から放射される蛍光放射の角度に関する分布を決定するための手段を含み、そのような分布から蛍光のバックグラウンドの部分を決定することができる検定システムを提供することによって達成される。特にこのような分布は、ファイバ表面の検出ゾーン近隣の開口数［Ｎ　Ａ　、ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　ａｐｅｒｔｕｒｅｌを変化させるための手段を用いて入射円錐の選択された同一線上の円錐形の部分のみがファイバに沿って伝わるようにファイバへの励起放射の進入を制御することと、蛍光放出の選択された同一線上の円錐形の部分のみを試験するようにファイバからの蛍光の出口を制御することと、を交互に行なうことによって決定してもよい。

開口数を変化させるための手段は、入射円錐の第１および第２のそのような部分であって、それぞれがファイバに導入されるときに、光ファイバの活性帯または部分におけるそれぞれの高開口数（ＮＡ）とそれぞれの低開口数（ＮＡ）とを提供する部分を選択するための手段と、さらに、同心的に光ファイバの入射端にそれらの円錐部分を交互に導入するために設けられている手段とを含む。同様に、出射蛍光放射は、励起放射の部分によって検出ゾーンにおいてそれぞれの励起から生じる放出を表す第１および第２の部分に交互にまたは同時に分割される。ここにおいて使用される「同一線上の円錐部分Ｊとは、その円錐の回転に対して同じ軸を共有し、円錐形ではあるが必ずしも元の円錐の面葉と適合する必要がない外側の面葉を有し、立体的な中実の円錐とその軸に直角の環状の断面を伴う円錐とを含む円錐の部分を意味することを意図していることは理解できよう。

一般に、本発明のシステムは、さらに、好ましくは光ファイバの入射端から放射される蛍光のそれぞれの部分を検出し、かつ、検出された蛍光の強さの関数として変化する情報を含む出力信号を提供するための手段を含むことができる。さらに好ましくは、本発明のシステムは、ファイバから放射された全蛍光の部分が興味のあるリガンドをファイバの複合体へと結合する結果として生成される蛍光に起因するようになった。前述の情報がら決定するための検出器手段と結合したコンピュータを含む。

本発明の好ましい態様では、開口数を変化せるための手段は、平板が円錐の（外側の環などの）第１の同一線上の円錐部分を選択するための手段を構成する第１の位置と、平板が円錐の（内部の中心部すなわち円錐の中心などの）第２の円錐部分を選択するための手段を構成する第２の位置と、の間で入力する放射の円錐に関する移動可能に設けられた透明な平板を含む。

本発明の別の目的は、後述において、一部は自明であり、一部は記載される。したがって、本発明は、以下の開示において例示される構成、組合せおよび配列を持つ装置を含んでいる。

本発明をより十分に理解するために、添付図面を参照して、以下に詳細に記述する。

図面の簡単な説明図１は、本発明の原理を具体的に示す型光検定システムの概略図図２は、光ファイバの近位端と、対物レンズと、本発明の開口数（ＮＡ）を変化させるための手段の一実施例とを含む概略的側面図図３は、本発明の一実施例の検出器からの出力の理想的な波形を示すプロント図である。

図４は、開口数（ＮＡ）を変化させるための手段の別の実施例である平板の２つの位置を示す概略的な正面図である。

図５は、開口数（ＮＡ）を変化させるための手段のさらに別の実施例である平板の２つの位置を示す別の概略的正面図である。

図６は、ファイバの近位端の前方および近隣に位置する開口数（ＮＡ）を変化させるためのさらに別の手段であり、図５に示す実施例と類似するさらなる概略的正面図である。

図７は、光ファイバからの出射蛍光を検出するための検出システムの別の実施例を含むことを除いて１図１と同様である。

図８は、検出システムのさらに別の実施例を示すことを除いて、図７と同様である。

図９は、図８に示す検出システムの検出器の正面図である。

本発明は、図１の符号２ｏで示される実施例である流体用蛍光免疫検定システムにおいて、特に、その利用が見出される。検定システム２０は、励起光を平行化したビームを、光源２２から発せられた励起光のビームの進路に関して４５°の角度に調整したグイクロイックミラー２４のようなビーム分割手段に対して供給する光源２２を有する。さらに、システム２０は、ダイクロイ・ンクミラー２４から反射された平行光を集め、その光を集束して円錐を形成し、その円錐の頂点を光ファイバ３０の近位端２８に向けるようにするための対物レンズ２６のような集束手段を含む。システム２０はファイバ３０を支持するための固定手段３２を含み、近位端２８は、固定されて、すなわち対物レンズ２６に関して実質的に対物レンズ２６の焦点の位置に所定の関係にある。囲い３４は光ファイバ３０を収めて、検定されるべき溶液を収容するために設けである。さらに、システム２０は、ファイバ３０の近位端２８から放射されて、レンズ２６とミラー２４とを介して伝わる蛍光を検出し、その放射された蛍光の強度の関数として変化をする出力信号を提供するための検出器３６を含む。

ファイバ３０は、近位端すなわち入射面２８から遠位端すなわち終端４０に至る細長い物体である。ファイバ３０については、方形またはその他の幾何学的な断面形状でもよいが、ファイバの長さよりもはるかに小さい寸法の実質的に円形断面を有することが好ましい。典型的には、近位端２８の表面は、ファイバの長手方向軸に直角に配置された平面であるが、あらゆる欠陥すなわち入射光および射出光が散乱するようなきずすなわち表面の欠陥を最小限にするために、高度に研磨されることが好ましい。あるいは、ファイバの近位端２８を、たとえば、拡大光学表面またはマツチング光学面などとして機能する別の所望の形状にしてもよい。

好ましい実施例、すなわち、ファイバに沿って伝えられる励起放射によってファイバの表面に誘導された蛍光は、励起放射が注入されるファイバの近位端に集められて観察される場合では、迷放射がファイバを遠位端４０から近位端２８に逆戻りをしないようにすることが望ましい。したがって、終端４０は、その内側において入射光が漏光するような形状にしてもよいが、励起放射に関して非宙光かつ吸光の材料などのように、終端４ｏを囲む媒質の屈折率に調和する材料で被覆することが好ましい。典型的には、カーボンブラックを加えたエポキシ樹脂がこのような働きをする。

ファイバオブティクスの当業者らにあフては周知のように、ファイバ３０は、その長さに沿って、複数の内面全反射によって、実質的にはファイバの長軸に対して対称的な上述の円錐の受入れ角度内で近位端２８に入射する光励起放射を伝えるようになっている。ファイバ３０は、たとえば、ガラス繊維のようなガラス状の材料や、石英、サフアイヤ等のような結晶質や、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリプロピレン等のような合成重合体などの励起放射を光学的に透過する非常に多くの実質的に同質の材料でもよいが、相対的に剛いほうが好ましい。ただし、本発明は、特に、比較的低コストの合成重合体光ファイバを使用することができるようにするには、本発明に使用する光ファイバは、合成高分子重合体から成ることが好ましい。ここで、ファイバ３０は、以下に述べるように、流体検定に用いるためのものであり、ファイバ３０を形成する材料の屈折率（ｎｏ　）はｎｌすなわち検定する流体の屈折率よりも十分に大きくなければならない。免疫検定装置を目的とするには、ファイバ３０の長さは３ｃｍ乃至５ｃｍの範囲にするが、４ｃｍが好ましい、一般に。

ファイバ３０の直径は、約０．　５ｍｍ乃至２ｍｍの範囲であり、約１゜５ｆｆｌＩＩ＋が好ましい。ただし、このような長さや直径などが単なる例にしかすぎず限定的でないことは理解できよう。

実施例においては、ファイバ３０の表面の機能部分または検出ゾーンは、検定を実施する活性領域の面積によって規定するものとする。典型的には、このような活性領域または検出ゾーンを設けるには、光ファイバの表面部分に対して、本明細書に参考のために収録した米国特許第４．４４７．５４６号で詳細に述べであるように、コーティング４４を設ける処置を行なう。この技術分野では、周知のように、コーティング４４は、ファイバ３０の表面に固定化したリガンドを含み、そのリガンドによって検定の結果として蛍光を発する複合体の一部が形成され得る。上述に関してさらに述べると、システム２０は、本明細書に参考のために収録した米国特許第４゜９０９．９９０号で述べられる免疫検定システムとほぼ一致する。

本発明のために、検定システム２０は、入射円錐の選択された部分のみが交互にファイバ３０に沿って伝わることができるようにすることによって、ファイバ３０の表面の検出部分に近隣のエバネッセント帯における開口数（ＮＡ）を変化させるための手段をも含む。

そのような手段の１つはＮＡ変調装Ｗ１５０の形態になるが、そのいくつかの例が以下に詳細に述べられる。

ここで用いる「表面結合蛍光」とは、ファイバ３０の活性表面領域に、またはファイバ３０の検出ゾーンで結合された免疫検定複合体などの複合体によって生成される蛍光のことを言う。このような蛍光は、複合体中の蛍光成分がファイバに沿って伝わる励起放射のエバネッセント波成分によって励起されるときに、生成される。上述したように、この表面結合蛍光は、ファイバ内を通り、ファイバの近位端から放射されるため、このような放射される蛍光は、特に、「放射光」または「放射蛍光」と呼ぶ。

励起光（場合によっては、蛍光放射）の「低開口数（ＮＡ）部」とは、　−−ファイバ３０の近位端２８の平均的な平面台に直角に、または該平面に対し比較的大きな角度を成す光線、たとえば実質的にはファイバの長平方向軸に平行な光線のことを言う。励起光（場合によっては、蛍光放射）の［高開口数（ＮＡ）部」とは、ファイバの近位端の平均的な平面に対して相対的に小さい角度に延びる光線のことを言う。したがって、励起光の低開口数（ＮＡ）部は、相対的に狭い角度すなわち中実な円錐の光線を形成する。一方で、高開口数（ＮＡ）部は、相対的に広い角度の円錐形の環状光線を形成したり、入射円錐全体から成っていてもよい。

高分子の基質で生成する広帯域蛍光は、表面的な現象というよりはバルク的な現象であり不安定であり、光誘導ドリフトを示す。この内部に生成した蛍光は、この蛍光がファイバの内部においてランダムな方向に放射するので、角度に関しては一定であるが、表面結合蛍光は、蛍光がファイバ３ｏを通り抜けて戻る結果として、大きい角度に強く重みがかかるので、角度に関して不均一である。したがって、　（検定に重要なデータを組み込んで）エバネッセント波によって励起される蛍光信号は、はぼＮＡ９と同量であることが望ましいが、バックグラウンド蛍光が（励起に対してＮＡ２であって、集光に対してＮＡ２である）ＮＡ４とほぼ同量であることは望ましくない。全ＮＡが限定されるので、表面結合蛍光は、重合体の蛍光による信号よりも急速に減少する。内部に生成された蛍光の信号の大きさが検出ゾーンにおいて異なる値を取る場合、相互に直接修正することができる。単に、低開口数（ＮＡ）における蛍光に対する測定値を破棄して、ＮＡで測定した蛍光を所望の蛍光信号であるとみなすこともできるが、このようなアプローチでは、後者の測定には未知の量のバルク蛍光が尚も含まれるので、結果が不正確になる。

したがって、所望の表面結合蛍光信号に対して正確な測定を行なうには、２つの異なるＮＡにおいて蛍光を測定し、高ＮＡにある蛍光の値から、低ＮＡにある蛍光の測定による関数を減算することもできる。

検定、暗レベル、反射励起およびそれに類する下でのバルク溶液に関するバックグラウンド蛍光などの一定の項を無視した概念的に理解するための簡略的なアプローチは次のようになる。

ここでは、２つの独立した系統の測定が交互に行なわれるが、その１つでは、　ファイバ３０に入射する励起放射は入射円錐の小さな中央の心のみに限定されているため、ファイバ３０の活性帯は比較的低いＮＡになる。２番目の系統の測定は、励起放射によって入射円錐のすべてが含まれるときに行なわれるため、活性帯は比較的高いＮＡになる。

活性帯が高ＮＡ（ＮＡ、、）を有するときに検出された全信号（Ｔ）のピーク振幅は、見出すべき所望の結合蛍光信号（ＤＪと、好ましくないバックグラウンド蛍光（Ｕ）との和である。すなわち、次式（３）によって表される。

（３）Ｔ＝Ｕ＋Ｄ検出ゾーンが低ＮＡ　（ＮＡｔ　）で励起されるときに検出される信号（Ｔ−）は、好ましくない信号に対するＮＡの４乗にほぼ等しいが、所望の信号はそのＮＡの９乗である。ＵおよびＤを用いてＴ。

を表すには、次式（４）のように適当なスケールファクタ（Ｋ）を与えることができる。

（４）Ｋ＝　（ＩｉＡＭ　／ＮＡＬ　＋したがって、Ｔ−を次式（５）によって表す二とができる。

（５）ＴＬ　＝Ｕ／に’　＋Ｕ／に９さらに、わかりやすくするために、高ＮＡ信号（Ｔ）はＮＡ＝０．８８を取り、低ＮＡ信号（ＴＬ　）はＮＡ＝０．４を取ったものとする。したがって、スケールファクタには、　（０，８８１０，４）になり、その４乗は約２３．４であり、その９乗は約１２０７であるので、　（５）式は１次のようになる。

（６）ＴＬ　＝Ｕ／２３．４＋Ｄ／１２０７式（３）を変形して、式（６）にＵの代わりにＴ−Ｄを代入すると５次のようになる。

（７）ＴＬ　＝　（Ｔ−Ｄ）／２３．４＋Ｄ／１２０７すなわち、（８）Ｄ＝１．０２Ｔ−２３，８７７゜したがって、一般には、ここで０１およびＣ２は、主として円板の直径によって決定する定数である。以下の記述で明らかになるように、ＴおよびＴＬは本発明の原理を使用して直接測定することができる。所望の信号（ＤＪを獲得するために必要な計算は、回路８４からの高ＮＡの出力信号と低ＮＡの出力信号とを受け取るために連結された従来のデジタルコンピュータ８６で行なってもよい。所望の信号を計算するための手順を遂行するために必要な特定のプログラミングステップについてはここでは記載しないが、その書き方は、当業者によって周知である。

図２に示すように１円形の近位端２８を有する光ファイバを使用するために意図された装ｆ５０のＮＡを変化させるための手段の好ましい一実施例は、光源２２により供給される励起放射を比較的速さない材料から成る円形の薄い平円板７ｏを含む。さらに、装置ｔ５０は、半径に沿って円板７ｏの一方の表面につなげられた細長いシャフト７２と、シャフト７２をその長平方向軸の周りに、かつ円板７０をその直径に回りに回転駆動するモータ７４と、を有する。モータ７４は、シャフト７２がレンズ２６の光軸とファイバ３ｏの延びる方向の同一線上の軸とに対して直角になるように、対物レンズ２６に近隣して設置することが好ましい。さらに、シャフト７２の長さとモータ７４の配置は、対物レンズ２６の前表面４６に関して円板７０が近隣し、平行で、中央にある位置に置くことができるように選択される。モータとモータを取り付けた円板７ｏが、ファイバ３０の近位端２８に対して３つの直交軸に沿って移動調節することができるように設計されたＸＹＺテーブル７６上に、モータ７４を支持することが好ましい。テーブル７６を適当に調節して、円板７０が対物レンズ２６の光軸とできるだけ同軸を有する位置に設置することが重要であり、この結果１本実施例では近位端２８と平行なときに１円板７０は、入射する励起放射円錐（または、場合によっては、出射蛍光放射）の外側の部分から形成された正規の環（すなわち、内部半径および外部半径が一定の値を取り、一定の広さを有する）のみの通過を許す。

モータ７４は、円板７０の平行で平らな両表面がファイバ３ｏの近位端２８の均一的な平面に平行に広がる第１のすなわち平行位置と１円板７０の平らな表面が近位端２８の均一的な平面に垂直に広がる第２のすなわち直角位置との間で、シャフト７２とそれに取り付けられた円板７ｏとを回転させる働きをする。この回転は、　（例えば時計回りなどの）１方向で継続的に行なってもよいし、平行位置と直角位置との間で時計回りと反時計回りに交互に断続的に行なってもよい。

モータ７４は、円板７ｏが直角位置にあるときに、対物レンズ２６に接触しないように制限を定めて、対物レンズ２６の開口平面に対してできるだけ接近する位置に置くことが好ましい。本発明の一実施例では、モータ７４は、小型のＤＣモータから成り、該モータはシャフト７２に取り付けられて、シャフトがその長平方向軸の周りに選択したスピード（たとえば、３２乃至２００　ＲＰＭの範囲で）で連続的に回転できるようにする。別の実施例では、上述の第１の位置と第２の位！との間で断続的に反転して円板７０を動かすステップモータまたはリレーによってシャフト７２を駆動する。

円板７０の直径の選択は、それが近位端２８に平行に位置するときに、円板７０がその円周付近で高ＮＡの励起光を含む環状円錐部分を通通し、励起光の低ＮＡ部（たとえば、励起光の雄部分の内部の中実円錐部分）のみがファイバ３ｏに到達するのを遮断し、蛍光放射の低ＮＡ部（たとえば、蛍光放射の内部の中実円錐部分）が検出器３６に到達しないように遮断するが、蛍光放射のうち高ＮＡ部は通過できるようにされる。本実施例では、明らかに１円板７０が近位端２８の平均平面に垂直であるときは、実質的には、入射円錐全体（および出射蛍光放射）が伝送される。円板７ｏの特定の直径は、対物レンズ２６の寸法の関数として、円板７０で測定した励起光の円錐の大きさ、遮断または伝送を望む低ＮＡ部と高ＮＡ部の相対量およびその他の要因に応じて変化させる。円＠７０の厚さは、円板７０が図５に示すように近位端２８に垂直にひろがる位置に置かれる時に遮断する励起光の量を最小限にするように選定することが好ましい。典型的には、円板７０の厚さは、約０．１ｍｍである。

以下の本発明の作動に関する記載は、上述の図２に示されたＮＡを変化させるための手段である好ましい実施例に関する。さらに、以下の記載で、ファイバ３０は励起光を照射されるときにバックグラウンド蛍光を内部に発生する重合体から成るものとする。

免疫検定複合体の成分が表面結合する結果として発生する所望の蛍光に起因するファイバ３ｏの近位端２８から放射される蛍光の部分は、検出器３６の出力信号に関する情報に基づいて決定される。

円板７０がその垂直位置と平行位置との間で回転する場合には、図３において理想化した形で示す検出器３６からの出力信号は１円板７０の回転速さの関数として、異なる値開で周期的に変調される。

このため１円板７０が近位端２８に平行な位置にあるときは、励起光の実質的部分はファイバ３０に到達するのを阻止され、放射蛍光の環状部分のみが円板７０の周囲に観察されるので、検出器３６の出力信号の大きさくｌ圧）は比較的低くなる。そうでないと　低ＮＡの光の阻止された部分が、ファイバ３０の表面の複合体から生じる若干の蛍光を誘導して、ファイバ３０をさらに励起して比較的有密な強さのレベルで蛍光を放出させることになるであろう。円板７０が垂直位置にある場合、この円板は、あらゆる励起光またはそれによる蛍光放射を相対的にほとんど遮断しない。したがって検出器３６の出力信号の大きさは、相対的に大きくなる。

このため、検出器３６からの出力信号は、本質的に、励起光のより高いＮＡ部分による励起に応答して生ずる蛍光を第一義的に表す第１の成分と、励起光の低ＮＡ部に応答して生ずる蛍光を第一義的に表す第２の成分と、を含む変調された直流信号である。ピーク対ピーク変調は低ＮＡ部を表し、上方ピークの先端の包絡線は、全ＮＡ項を表す。それは、励起光の高ＮＡ部によって励起された出方は号の一部は、正確には安定状態ではない。何故ならファイバ３ｏの内部において生成される不規則な予測できない変化によって、変化する蛍光があるからである。

当然周期的な変調の成分は、モータ７４によって回転する円板７０の周波数の２倍の周波数になる。

変調項のピーク対ピーク値と実行値との間の差は、実質的には一定であり、式（９）に用いられたスケールファクタの値に反映することができる。変調成分の実効値と直流項の平均を得ることは、ピークを得ることよりも容易であり、このために１本発明は、平均値と実効等価値とに検出器の出力を分層するために検出器３６に組み合わされた多数の市販の分１１＠路８４を含む。高ＮＡチャネルと低ＮＡチャネルとの両方で変調された信号のフィードスルーが有意な場合もある。

このフィードスルーは、高ＮＡチャネルと低ＮＡチャネルとの出力で適当な低域フィルターを使用することによって減らしてもよい。

したがって２分離回路８４の出力はコンピュータ８６に接続され。

′そこで、検出器の出力を本質的に取りだして変調成分から平均的な直流成分を分離し、変調成分の実効値を決定し、その実効値に定数を乗算（すなわち、本発明の独特のシステム用に予め決定されたゲインによって増幅）して、その結果を平均的な直流成分から減算することによって所望の出力を得る。

ＮＡを変化させる手段としては、さらにいくっがの実施例を採用できるが、図４にその一つを示す。装置５０に関するこの第２実施例では１円板７０の表面にシャフト７２が取り付けられていることに関しては１図２に示した実施例と同様である。ただし、この第２実施例では、モータ７４の代わりにインデクレンズモータ９ｏを含み、円板７０が近位端２８に常に平行な共通平面においてシャフト７２に取り付けられている点に関しては１図２に示す実施例とは異なっている。図４の仮想線で示したように、円板７ｏが励起光と放射光との通路内にない第１の位！と１　図４に実線で示したように円板７０が対物レンズ２６の＠側表面に近隣の励起光および放射光の通路の中心に位置する第２の位置との間を、ファイバ３０の延びる軸に垂直な共通平面内をシャフト７２と円板７０とが動くように、インデクレンズモータ９０は設計および配置がなされている。モータ９０は共通平面に沿って円板７０を往復させるか、または、共通平面内の１方向に回転するように設計できることは理解できよう。

いずれの場合においても、シャフト７２と円板７０との動作によって、対応する光学ロンドまたは光ファイバの検出ゾーンのＮＡに関して必要な定期的な変化が供給されることは明らかである。

図５は、Ｎ　ＡＪ整装置５０の第３の実施例を示し、それは少なくとも１つの比較ｒノ大型の円形の開口と１つの比較的小型の円形の開口とを有する不透明な円板１００を含む。大型の開口と小型の開口との中心がそれぞれ、円ＷＩＯＱの中心から半径方向の所定距盾に位置するように、複数の大型の円形開口１０２と複数の小型の円形開口１０４とを円板１００の周囲の縁の近隣の円形の通路に沿って交互に置くことが好ましい。大型の各開口の直径の選定は、大型の開口を円板１００が対物レンズ２６の光軸と同心の大型の開口が対物レンズ２６に近隣の位置にあるときに、励起光と放射光の高ＮＡ部と低ＮＡ部とが大型の開口を通過するようにする。小型開口１０４の直径は、大型の開口がレンズ２６に対して同様の位置にあるとき、励起光および放射光の高ＮＡ部が円板１００によって遮断され、低ＮＡ部のみが小型の開口を通過するように、選定する。

図５の実施例では、さらに、対物レンズ２６付近に円板１００を支持するための、かつ、円板を中心の周りに回転するためのモータ１０６を含む。モータ１０６は、表面１０８に取り付けられ、その寸法と設計とは円板１００の前表面と後表面とが対物レンズ２６の光軸に垂直になり、また１円板１００の回転に応じて、大型円形開口１０２と小型円形開口１０４とが近位端２８を用いて集めた放射に向かって引き続き移動するように、円板１００を対物レンズ２６の前表面４６付近に支持するようにする。さらに５円板１００の動作とそれに関連する開口とが、関連する光学ロッドまたは光ファイバの検出ゾーンでＮＡについて、必要な周期的な変化をもたらすことは明かである。

図５は、さらに、大型円形開口１０２と小型円形開口１０４がファイバ３０の近位端２８に間して心合わせされる時期を決定し、このような心合わせが生じるときに逐次コンピュータ８６に出力信号を供給するために、コンピュータ８６と連結した位置検出システムを含むことが好ましい。さまざまな装置を利用して、このような位置合わせに関してコンピュータ８６に通知してもよい。ただし、本実施例の位置検出システムでは、円板】００の周辺縁付近に固定支持体に取り付けた補助検出器１】０を含む。検出器１１０は、典型的には、ホトダイオード（図示せず〕および関連する光学素子などのような、赤外放射信号を円板１００の周辺縁に伝えるための手段と、開口１０２および１０４のそれぞれ付近に置かれるように１円板１００の周辺縁に取り付けた複数の反射器１１２と、を含む。検出器＋１０は、反射器１１２で反射された赤外放射を受け、そのような反射を受ける度にコンピュータ８６に出力信号を供給するようにされる。

所望の信号（Ｄ）は、次の２つの点を除いて、上述の方法と同様の方法で図５の実施例を用いて決定する。第］に、検出器３６の出力信号をゲート制御して、ファイバ３０の近位端２８に関して、大型円形開口１０２または小型円形開口１０４の１つの心が合ったことを示すコンピュータ８６への信号を供給する場合に限り、コンピュータ８６に対して検出器３６による出力信号を供給するようにしなければならない。このようなゲート制御は、当業者によって容易に認められるように、従来のゲートサーキットを用いて達成してもよい。このため　上述の所望の信号を決定する手順は、ファイバ３０の近位端２８に関して大型円形開口１０２または小型円形開口１０４の心が合う瞬間に生成される検出器３６からの情報を用いて実行される。第２に、本発明の第３実施例において、所望の信号を算出するために用いた比例係数は、ＮＡ調整装Ｗ５０の他の実施例に用いられる係数とは異なる。小型の開口１０４が低ＮＡ部のみを受け入れるが、　「結合ＮＡＪ位置にある時（すなわち、円板７０が図２の実施例の場合垂直位置にあり、または１円板７０が図４の実施例の場合ファイバ３０の一方の側に移動する時）には、高ＮＡの光と低ＮＡの光との両方が円板７０を通過することができるので、異なる比例係数が必要になる。

図６に示すＮＡ調整装置５０の実施例は透明円板１１４を含み、それは、円板の周辺縁付近にかつ同心円上の環状線に沿って相互に選定された距離に置かれた複数の円形不透明スポット１１５を有する透明な円板１１４を含む。図６の実施例は、表面１０８に！！１され対物レンズ２６付近で円板１１４に接続されかつ円板を支持するモータ１０６を含み、スポット１１５が近位端２８に関して同心円上に連続的に移動するように円板を回転させるようになっている。

複数のスポット１１５のそれぞれは、スポットが近位端２８に関して同心円上を移動するときに、スポットが励起光および放射光を遮るような寸法とされる。スポット１１５間の円板１１４の透明部分が放射光の光源と近位端２８との間に介在する場合、すべての放射光は近位端２８に到達し、かつ、それらの放射光は円板１１４を通過する。

検出器３６の出力信号を平均的な直流信号と実効値等価信号とに分離するための回路８４を２・要としてなくてもよいように、図１に示す本発明のシステムは、図７に示すように、ミラー２４を介し捜土器３６に向けて送られる光ビームの通路の関して４５°の角度に位置する細長いミラー１２０を含むように修正してもよい。ミラー１２０は、ミラーの縁の回りの環形のようなより高ＮＡ部を検出器３６に伝えるが、光の低ＮＡの部分のみを遮断するように形を決め（たとえば、典型的には楕円のような）かつ寸法決定が行なわれる。

ファイバ３０からの蛍光放射を検出するための第２の検出器１２２は、ミラー１２０に近接してそれにより反射する光の通路内に置かれるが、検出器３６と同一のものであってもよい。

図１のシステムにミラー１２０と検出器】２２とを付は加えることによって、ファイバ３０から放射された蛍光の低ＮＡ部の強さは、検出器１２２の出力信号の大きさに基づいて決定してもよいし、ファイバ３０から放射された蛍光の高ＮＡ部の強さは検出器３６の出力信号の大きさに基づいて決定してもよい。さらに、所望の信号（Ｄ）は、それのＮＡへの関係が上述の４乗よりもむしろ２乗に近いので、容易に決定される。

図７に示したシステムの利益を獲得するためには、２つの検出器を必要することなく５図１に示したシステムを、図８および図９に示すように、回路８４を除去して検出器３６を検出器１３０と取り替えてもよい。検出器１３０は、光学手段１３２によって円錐状の光路にそって像がつくられる低ＮＡ光の存在を検出するための第１の感応領域１３４と、光学手段１３２によって送られる高ＮＡの光の存在を検出するための第２の感応領域１３６と、を含む。感応領域１３４と１３６とは、共通平面上に位置する。検出器１３０は２つの、すなわち感応領域１３４と】３６とのそれぞれに対して】つずつの出力チャネルを含む。

光学手段１３２は、開口平面（すなわち、ファイバ３０の近位端２８に平行に区がり、対物レンズ２６の前表面４６に隣接する位置にある平面）における放射蛍光を集めて、検出器１３０上に同心の分離された像を合体するためのレンズシステムを含む。検出器１３０は、感応領域１３４および１３６が位置する平面が、開口平面における像が光学手設置３２によって合焦される焦平面と共用するような位置に置かれる。

明細書中に含まれる本発明の範囲から逸脱せずに上述の装置においである程度の変更がなされる得るので、上述の記述に含まれるまたは添付する図面に示されるすべての内容は、実例的な意味で解釈すべく意図されたものであって、限定的な意味で解釈すべきではない。

要−一約一−１内面全反射をする光フアイバ蛍光装置を使用したシステムによって、高分子ファイバに生じる内部に生成された蛍光を識別する問題を克服する。このシステムは、ファイバの入射端に向けられた励起放射の入射円錐の中央の同一線上の円錐部分に障害を置くことと障害を取りのぞくこととを交互に行なうために動かすことができる円板を含むことによって、ファイバ表面の検出領域における開口数を定期的に変化させる。開口数が相対的に低いときに受信した信号の値に関して、開口数が相対的に高いときに受信した信号の値を分析することによって、装置の光ファイバから放射された蛍光のどの部分が、さまざまなバックグラウンド蛍光から区別してファイバの表面の検出領域において所望の表面結合蛍光に起因するかを決定することができる。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．内面全反射によって励起放射を通して伝搬することがでぎる細長い光学要素を含み，その表面部分に近隣し、蛍光部分を前記伝搬する励起放射のエバネッセント波によって蛍光放射に励起することができる検出ゾーンと、前記励起放射の円錐の頂点を前記要素の一端に向けるための手段とを含む検定システムにおいて、前記励起放射によって励起され、かつ、前記エバネッセント波によって励起される前記蛍光放射を、前記要素における前記励起放射によって励起されるその他の放射とは別に、前記要素の一端から放射される蛍光の角度分布を調べる手段のための手段を含む改良を特徴とする検定システム。
２．前記蛍光の選択された異なる円錐の同一線上の部分のみを調べるように、前記要素の前記一端から放射される蛍光の出口を制御するための手段を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の検定システム。
３．蛍光の角度分布を調べるための手段が、前記入射円錐の選択された異なる円錐の同一線上の部分のみが前記要素に沿って伝わるように，前記要素への前記励起放射の進入を交互に制御することによって前記検出ゾーンにおいて開口数を変化させるための手段を含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のシステム。
４．前記閉口数を変化させるための前記手段は、前記要素に導入されるときに、前記要素の前記部分における相対的に高い開口数を供給する第１の前記部分を前記円錐から選択するための手段と、前記要素に導入されるときに、前記要素の前記部分における相対的に低い開口数を供給する第２の前記部分を前記円錐から選択する手段と、前記要素に沿った伝搬用の前記要素の一端に対して前記円錐の前記部分を交互に導入する手段と、を含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記載のシステム。
５．前記第１の部分が円錐の環であり、前記第２の部分が前記環の面葉とほぼ同じ値の立体角を有する円錐であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のシステム。
６．前記第１の部分が円錐の現であり、前記第２の部分が前記環の内角とほぼ同じ値の立体角を有する円錐であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載のシステム。
７．前記開口数を変化させるための手段は、前記位置のうち第１の位置の前記円板は、前記円錐の前記第１の部分を選択するための手段を構成し、前記位置の他方では、前記円錐の前記第２の部分を選択するための手段を構成する少なくとも２つの位置の間において前記円錐に関する移動できるように設けられた透明な円板を含むことを特徴とする請求の範囲第２項に記数のシステム。
８．前記円板は、前記円錐の光源と前記光学的要素の前記一端との間において後者とともに置かれ、かつ、前記円板が少なくとも前記円錐の実質的な部分を遮断ずる前記第１の位置と前記円板が前記円錐の相対的に小さい部分を遮断する前記第２の位置との間のシャフトの周りに回転自在に設けられていることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のシステム。
９．前記円板が、実質的に平らであり、かつ、その平面自体に関し、前記第１の位置と前記第２の位置との間の移動できるように設けられていることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のシステム。
１０．前記円板がその平面内を回転できるように設けられていることを特徴とする請求の範囲第８項に記数のシステム。
１１．前記円板は、実質的に平でありかつ相対的に薄いものであり、かつ、前記第１および第２の位置の間で、実質的には、その平面自体に対して直角に移動できるように設けられていることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のシステム。
１２．前記円板が、その平面に関して実質的に直角に回転できるように設けられていることを特徴とする請求の範囲第１１項に記載のシステム。
１３．前記円板が、それを通じて広がる少なくとも第１および第２の開口を規定し、前記第１の開口が前記円錐の前記第１の部分を選択するための手段を構成するように寸法が決定され、かつ、前記第２の開口が前記円錐の前記第２の部分を選択するための前記手段を構成するように決定されることを特徴とする請求の範囲第７項に記載のシステム。
１４．化学複合体の第１および第２の成分の間の反応に基づいた蛍光検定を実行するためのシステムであって、前記成分の１つが内面全反射によって励起放射を伝搬することができる細長い光学的要素の表面部分に固定されることにより、前記複合体を同定するために伝えられる前記励起放射による蛍光に励起することができる手段を実行するためのシステムにおいて、実質的には入射円錐としての前記励起放射を前記ファイバの入射端に向ける手段と、前記要素に沿って伝搬する前記放射によって励起され、前記入射端から放射される蛍光を検出し、かつ、前記蛍光の強さの関数として変化する出力信号を供給するための検出器手段と、前記蛍光の選択された異なる円錐の同一線上の部分のみを調べるように、前記要素の前記端から放射される蛍光の出口を制御する手段と、を有することを特徴とするシステム。
１５．前記入射円錐の選択された異なる円錐の同一線上の部分のみが前記要素に沿って伝わることと、前記蛍光を励起することとが交互にできることによって、前記要素の表面部分における開口数を変化させるための手段を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載の検定システム。
１６．前記要素が導入されるときに、前記表面部分において相対的に高い開口数を供給する第１の円錐の同一線上の部分を前記円錐から選択するための手段と、前記要素が導入されるときに、前記表面部分において相対的に低い開口数を供給する第２の円錐の同一線上の部分を前記円錐から選択するための手段と、前記要素に沿った伝搬に関し、前記円錐の前記部分を前記要素の入射端に交互に導入するための手段と、を前記開口数を変化させるための前記手段が含むことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のシステム。
１７．前記伝搬する励起放射のエバネッセント波によって、前記放射によって励起することができる前記手段の励起に起因する前記要素の前記一端から放射される前記蛍光の部分を、前記出力信号に基づいて決定するための前記検出器手段に結合されたコンピュータ手段をさらに含むことを特徴とする請求の範囲第１６項に記載のシステム。
１８．実質的に出射円錐としての前記蛍光を前記検出器に向けるための手段と前記蛍光の円錐を２つの円錐の同一線上の部分に分離するための手段とを含むことを特徴とする請求の範囲第１５項に記載のシステム。
１９．前記蛍光の円錐の回転軸を横切って広がる軸にして、前記蛍光の円錐の部分のうちの１つを反射するためのミラー手段と、前記蛍光の円錐の前記部分の一方を検出し、かつ、検出される蛍光の強さの関数として変化する第１の出力信号を供給するための第１の検出器手段と、前記蛍光の円錐の前記部分の他方を検出し、かつ、検出される蛍光の強さの関数として変化する第２の出力信号を検出するための第２の検出器手段と、を前記検出手段が含むことを特徴とする請求項１８記載のシステム。
２０．前記入口から放射される前記蛍光が第１の軸と前記検出手段とに沿って広がるシステムにおいて、前記ファイバの前記入射端に近隣する開口平面において出現する放射蛍光を焦光面上で像にするための光学的手段と、前記焦光面に置かれた第１および第２の感応領域を有する検出器手段であって、前記開口数の値が相対的に高い場合に生じる蛍光放射の部分を検出するために置かれる前記第１の感応領域と、前記開口数の値が相対的に低い場合に生じる蛍光放射の部分を検出するために置かれる前記第２の感応領域とを有する検出器手段と，を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項記載のシステム。
２１．前記光学的要素の入射端が平面上の入口面を有し、前記ファイバが合成重合体から成ることを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のシステム。
２２．前記光学的要素が、さらに、前記要素の活性表面部分に結合した免疫検定複合体の第１の成分を含むことを特徴とする請求の範囲第２１に記載のシステム。
２３．蛍光に励起することができる前記手段によって生成された蛍光に起因する前記検出器手段に起因する出力信号の部分を決定するための前記検出器手段に結合したコンピュータ手段を含むことを特徴とする請求の範囲第１４項に記載のシステム。
２４．装置内の光学的要素の表面の活性領域に結合した蛍光物質から生じる放射に起因する内面全反射蛍光検定装置の出射蛍光の部分を決定するための方法において、励起放射を前記放射を励起するための前記光学的要素の入射端に向けるステップと、前記蛍光の選択された異なる同一線上の部分のみを調べるために、前記要素の前記端からの蛍光の出口を制御するためのステップ、前記強さのレベルの測定から前記蛍光物質から生じる蛍光の該部分を計量するためのステップと、を含むことを特徴とする方法。
２５．前記励起放射の選択された部分のみが交互に前記光学的要素に沿って伝わることができることによって、前記活性領域の開口数を変化させるためのステップと、前記開口数を変化させている間に、前記出射蛍光の強さのレベルを測定するための手段と、を含むことを特徴とする請求の範囲第２４項に記載の方法。
２６．前記要素が導入されたときに、前記活性領域において相対的に低い開口数を供給する前記励起放射の部分を遮断するステップを含む前記開口数を変化させるためのステップにおいて、前記励起放射の部分が遮断される場合に前記入射端において現われる蛍光の第１の強さのレベルであって、第１の値として格納される前記第１の強さのレベルを測定するステップと、前記励起放射のすべてを実質的に前記要素に導入できるようにするステップと、前記励起放射の全てを実質的を導入する場合に前記入射端において現われる蛍光の第２の強さのレベルであって、第２の値として格納される前記第２の強さのレベルを測定するステップと、を含むことを特徴とする請求の範囲第２５項に記載の方法。
２７．内面全反射によって、放射すなわち入射円錐の形態で供給される前記放射を内部に伝えることができる細長い光学的要素の表面の選択された部分に近隣する開口数を変化させるための装置において、前記円錐の第１の円錐の同一線上の部分であって、前記要素に導入されたときに前記表面の前記部分における相対的に高い開口数を設定する前記第１の部分を選択する手段と、前記円錐の第２の円錐の同一線上の部分であって、前記要素に導入されたときに前記表面の前記部分における相対的に低い開口数を設定する前記第２の部分を選択する手段と、前記円錐の部分を前記要素に沿った前記部分において前記放射の伝搬のための前記要素の一端に交互に導入するための手段と、を含むことを特徴とする装置。