JPH05503636A

JPH05503636A - レトロトランスポゾンを用いた遺伝子導入法

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Publication number: JPH05503636A
Application number: JP4500142A
Authority: JP
Inventors: ホジソン，クラーグ　ピトマン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-10-25
Filing date: 1991-10-25
Publication date: 1993-06-17
Also published as: DE69129897T2; EP0506945A4; US5354674A; DE69129897D1; CA2072581A1; EP0506945B1; EP0506945A1; US5879933A; DK0506945T3; ES2121794T3; ATE169061T1; WO1992007950A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】レトロトランスポゾンを用いた遺伝子導入演技　術　分　野本発明は、分子生物学および細胞または生物の遺伝物質を変化させる方法の分野に関するものである。特に本発明は、レトロトランスポゾンを、種々のレベルの遺伝物質の発現に適するベクターとして用いること、に関するものである。本発明は、例えば動物および植物の品種改良並びに種々の遺伝性およびウィルス性の疾患の理解および治療等に広く応用できる。

従来の技術種々の方法が現在遺伝子工学で用いられており、細胞および生物のゲノムへの遺伝子の導入および発現が可能になっている。遺伝子は、細胞とＤＮＡをインキュベイトすることによって、おそらくはポリイオンまたはリン酸カルシウムのような化学薬品の存在下で、導入されている。遺伝物質は、また、細胞または接合体の核または細胞質に注入することができる。他の方法には、電気穿孔法、リポソームを介した遺伝子挿入法、アシアログリコプロティン遺伝子挿入法、パーティクルアクセレーションおよびウィルス形質導入法が含まれる。

形質導入におけるウィルスの使用は、レトロウィルスを用いた場合に大変効果的であることが示された。外来遺伝子は、複製欠陥または複製コンピテントウィルスベクター構成物（普通はプラスミドとして）のいずれかへ挿入され、ウィルスのパッケージングおよび複製に必要なすべての遺伝子を含む細胞へ導入される。

欠ｆｊｉｉ　（非複製コンピテント）ウィルスベクターが感染性粒子またはピリオンにパッケージされうる、特別な細胞系統（“ヘルパー”またはウィルスパッケージング細胞）が構成されている。ベクターそれ自身は複製に必要な遺伝子を宿しておらず、そのために、ベクターが細胞に感染した場合、ベクターはウィルス粒子中の酵素を用いてそれ自身を宿主ゲノム（染色体）に挿入して複製する。

ベクターは、本質的なウィルス遺伝子が（うまくいけば）“ヘルパー“細胞にのこされたため、更に複製できない。この技術は、そのような使用の安全性についての議論が進行中にもかかわらず採用され、最初のヒトの遺伝子治療の試みとして認められた。

ＲＮＡ腫瘍ウィルス（レトロウィルス）による形質導入は、それが早く、効率的であり、遺伝情報の少数のコピー（普通１〜２）の安定した組み込みを生ずるため、特別の魅力を有する。形質転換とは違って、レトロウィルスの組み込みは正確な形で、普通はウィルスゲノム中の正確な位置で起こり、挿入は宿主細胞ゲノム中の多くの位置で起こりつる。

残念ながら、レトロウィルスは、不都合な病原性のおよび腫瘍形成の効果を伴う。しかしながら、レトロウィルスベクターの感染力は、ヘルパー細胞と結合する遺伝的に欠陥のある型を用いることによって調節することができる。ベクターとして効果的に機能するためには、欠陥ベクターから除かれた必要な遺伝情報の一部は“トランスに′　（ベクターの外に位置するもう１つの遺伝子によって）に用意されなくてはならない。パッケージング、複製、放出および複製欠損ウィルスベクターの再挿入に必要なウィルスの機能を含む多くのヘルパー細胞系統は、一般的に用いられる数種の腫瘍ウィルスに用いられている。これらの有用なウィルスは、マウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）　、膵臓壊死ウィルス（ＳＮｖ）、トリ白血病ウィルス（Ａ　Ｌ　Ｖ）および細胞内皮症ウィルス（ＲＥ　Ｖ）を引き起こす病原体を含む。ＭＬＶおよびＲＥＶに対するヘルパー細胞系統には特許がされている（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｕ。

Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ、４．ｌ１８１．７１９　；　Ｔｅｍｊｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｕ、Ｓ、ＰａｔｅｎｔＮｏ、４．７６４）。

ＭＬＶウィルスは、ヒト細胞ばかりでなくある生殖細胞を含む、広範囲にわたる種類の動物細胞に適合するため、細胞および生物に対する動物の遺伝子工学に選択されるベクターになった。ＭＬＶは、ウィルスの外来遺伝子をマウスの生殖細胞系統に注入するのに用いられ、トランスジェニックマウスを作り出した（　Ｊａｅｎｉｓｃｈ　ｅｔａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ（ＵＳＡ）７３：　１２６０（１９７Ｂ）およびくつかの問題にもかかわらず、限定されたヒトの遺伝子治療の試みとして認められた。

レトロウィルスは遺伝子を細胞へ導入させる重要な手法になってきたが、一方でレトロウィルスベクターに関する主要な問題がある。１つのそのような問題として、欠損ウィルスベクターの配列が、ヘルパーウィルス配列または感染ウィルス粒子を生ずる細胞内ゲノム中の配列のいずれかと組み換えをおこす能力が挙げられる。この問題は、ヘルパー配列に多数の突然変異および転位を導入することばかりでなく、ベクターからウィルスの配列を除くことによっても対処された。同時に、これらのかわりに、ベクターが複製コンピテントに戻ることがより難しくなるが、また、ウィルスの滴定または感染力も低下する。しかしながら、組み換えの発生はレトロウィルスでは普通であり（Ｔｅａｉｎ　Ｈ，Ｍ、、　Ｇｅｎｏｓｅ３１　＋’１７−２２（１９１ｔ９）　）　、それゆえ変異および組み換えは問題のままであり続ける。

ＲＮＡ腫瘍ウィルスに関するもう１つの困難は、それらが発ガン性である、ということである。このクラスに含まれるものは、普通に用いられるＭＬＶベクターであって、少なくとも次の２つの機構、（１）ウィルスの転写調節領域における強力なエンハンサ−プロモーター配列の少なくとも一部のために、近くの細胞性ガン遺伝子（悪性腫瘍遺伝子）の転写を活性化すること、（２）次いでウィルスのゲノムの一部になり、ウィルスとともに生ずる早い発ガンを引き起こす、細胞性ガン遺伝子を組み換えすることにより多種の新生物を引き起こす。

現在、ヒトの遺伝子治療の目的とされているようなアンホトロピック（ホストの範囲が広い）なベクターの使用に関するさらなる問題は、アンホトロビックなベクターがヒトまたは動物の宿主中でもう１つのレトロウィルス、例えばアンホトロピックなＡＩＤＳ　（ＡＩＤＳウィルスは広範囲のヒト宿主に感染できる）を引き起こすものと組み換えを起こすかもしれない、ということである。

アンホトロビックなＭＬＶと組み換えまたは表現型混合を起こすことによって生ずる、アンホトロビ・ブタなＡＩＤＳウィルス（ＨＩｖ）が、ＨＩＶウィルスが複製できるヒト細胞の範囲に大きく広がることによって感染を開始するという可能性は理論上は存在する。

従って、遺伝子治療に用いられた非複製コンピテントＭＬＶベクターが転位または病原的な効果に対して低い力を有する、ということを確かにすることは重要なことである。理想的には、トランス作用ウィルス遺伝子がベクターから完全に離れ、ベクターが非ＭＬＶ由来、非病原性、非発ガン性であって、複製コンピテントウィルスを生ずる生産的な組み換えに限定するために、できるだけＭＬＶと相同性を生じないようにするべきである。トランスシュニックな作業に対しさらに有用になるために、ベクターは、宿主生物のゲノム中での長期間の居住に適応するものであるべきである。

本発明は、このように、遺伝子工学ベクターの候補として、自然の、転移性細胞遺伝子（レトロトランスポゾン）の使用に関するものである。本発明まで、レトロトランスポゾンは、動物の遺伝子挿入または遺伝子治療のような使用についての実際的な討論がなされていなかった。反対に、研究は他の分野に集中している。例えば、酵母における酵母ｔ’ｒｐｌ遺伝子に加え、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子が、酵母ＧＡＬ　Ｉ−”ｒｙ隔会合構成体その遺伝子を導入したあと増幅された（Ｂｏｅｋｅ　ｅｔ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ、２３９　：　２８０−２１１２゜１９８８）。このことは、Ｔｙエレメントを介した転位による転位を引き起こす。他の者らは、次いで収穫され、おそらく抗体、牛痘種、タンパク精製、診断およびこの種のものの生産に用いることができる酵母Ｔ３／レトロトランスポゾン粒子へ、隅台タンパクを目標にする方法を発展させた。

例えば、ＡｄａＩＩｓらの米国特許第４，９１８，１６６を参照。非しトロトランスポゾン（Ｐエレメント）は、また、ショウジヨウバエの遺伝的なトランスポゾンに用（１られている。例えば、Ｒｕｂｊｎらの米国特許第４，６７０゜３８８号を参照。これは、トランスポザーゼによって認識される決まった配列の間へのＤＮＡ物質の挿入、ショウジヨウバエ生殖細胞へのその物質を挿入すること、および、昆虫の遺伝性ゲノム（ただしトランスポゾンのエレメントおよび外来遺伝子が機能できる）の一部になるように、トランスポゾンのエレメントが、受容昆虫であるショウジヨウバエのゲノムに肯定的に挿入されることを含むものである。ホ乳類遺伝子の転位およびトランスジェニックは、Ｗａｇｈｅｒらの米国特許第４．８７３．１９１号（１９８９年）において議論されている。これは、外来の遺伝物質を、マイクロインジェクションによってホ乳類の接合体の前核に導入することを含む。接合体番よホ乳動物へと成長することができ、遺伝物質は少なくとも１つの遺伝子およびその方法に関する実施可能な調節配列を含む。従って、遺伝的に形質転換された接合体力（得られた。胚または接合体は偽妊娠した雌に移植され、胚は遺伝子が組み込まれ発現される期間まで成長することが許される。この取り組み方は完全に自然なものであり、レトロトランスポゾンのエレメントを含んで０な（肩（レトロトランスポゾンはマイクロインジェクションを必要としない）。生殖細胞系列に感染したレトロウィルスノ最も古い明らかな使用は、Ｊａｅｎｉｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ）ユニ　１２８０　（１９７Ｇ）およびＣｅｌｌＶａｎｄｅＷｏｕｄｅらの米国特許第４，４０５．７１２号が、マウス白血病肉腫ウィルス由来のあるベクターについておよびそれらを細胞にトランスフェクションし、表現型を選択し、次いで偽型としてパッケージングされたベクターとともに複製コンピテントなウィルスを得るために、カルチャーを重複感染させる過程について記述している。

これらのベクターおよび上記の方法は、今日の基準によっては全く原始的なものであり、レトロトランスポゾンベクターを含んでいない。

従って、多種のゲノムへ、細胞転位性因子を導入する新しく効果的な方法を発展させることは、明らかに利益のあることである。そのような方法の使用は、例えば、培養した細胞中の遺伝子発現の研究用のベクター、トランスジェニックな生物の生産用のベクターおよびヒトの遺伝子治療用のベクターを含む。

発明の開示本発明は、遺伝子工学におけるベクターとして、レトロトランスポゾンを用いる過程または方法に関するものである。レトロトランスポゾンまたは“ジャンピング遺伝子”は、細胞転位性遺伝因子である。レトロトランスポゾンは非複製コンピテント細胞由来のものであり、外来遺伝子を運ぶことができる。レトロトランスポゾンはレトロウィルスの寄生体として働くことができ、ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）　、レトロウィルスのプライマー結合部位およびこの種もの、のようなある古典的な特徴を保存している。しかしながら、レトロトランスポゾンは、普通、複製コンピテントなウィルスを生ずるように一般的に組み換えができる機能的なレトロウィルスの構造遺伝子を含んでいない。いくつかのレトロトランスポゾンは、いわゆる“利己的ＤＮＡ“の例であり、また、自己複製能力以上何もコードしていない遺伝子情報でもある。レトロトランスポゾンは偶然宿生細胞内に存在するレトロウィルスまたは逆転写酵素を利用することによってそうすることができ、効率的にそれ自身をウィルス粒子にパッケージングし、ウィルス粒子はそれを新しい宿主ゲノムへと運び、そこでそれは再びＲＮＡとして発現される。その中にどんな情報がコードされていようとも、ＲＮＡはジャンピング遺伝子とともに潜在的に運ばれる。

細胞または生物への外来遺伝子情報の導入は、外来遺伝子および／またはそれらの調節因子を、レトロトランスポゾン遺伝因子（Ｌ　ＲＴ　（ｌｏｎｇ　ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｒｅｐｅａｔＳ　）をもった細胞転位性遺伝因子）に最初に置き換えることによって達成される。ＬＴＲおよびフランキング部位は、複製、パッケージング、挿入およびレトロウィルス遺伝子の形質の導入の寄生体としての宿主細胞における遺伝因子の発現に必要な信号を含む遺伝子体（ＲＮＡまたはＤＮＡ）からなる。組み換えレトロトランスポゾンは、次に、ウィルス産生細胞またはいわゆるヘルパー細胞のようなレトロウィルスの（またはレトロウィルスのよう。

な）複製機能を与える細胞に感染させるか、またはそうでなければ導入される。

レトロウィルスのトランスの機能は、感染性のレトロトランスポゾン粒子またはピリオンを形成する組み換えレトロトランスポゾンのＤＮＡコピーから作られたＲＮＡ転写産物と結合する。新しい宿主細胞へ形質導入されたこれらのレトロトランスポゾン粒子は、ＤＮＡへ逆転写され、新しい宿主ゲノムに安定して導入され、このゲノム由来のＲＮＡ転写産物は、レトロトランスポゾン翻訳単位または有用な遺伝子の発現を指令する挿入された内部の翻訳単位のいずれかから再び発生させることができる。導入された遺伝子は介助（ｈｅｌｐｅｒ）機能が存在しないと、さらに複製することはできない。

本発明は、細胞培養物中の遺伝子治療、遺伝子挿入および発現の研究用に、トランスジェニック動物の産生用に並びに伝統的なＲＮＡ腫瘍ウィルスベクターが安全でなくまたは希望のものでないと考えられる他の例に用いることができる。

図面の説明図１は、転位性因子ＶＬＰＮＦ、によって安定して形質導入された細胞の発生を示す、本発明の概略図である。

図２ａおよび２ｂは、（ａ）構成されたｐＶＬＰＮＦおよび（ｂ）構成されたｐＶＬＰＮＲ中のレトロトランスポゾンと遺伝子の導入をあられした、制限酵素地図である。

図３ａおよび３ｂは、（ａ）マスカルチャーのＤＮＡ。

１ａｎｅｌ、およびＮＩＨ３Ｔ３細胞へ導入しＥ　ｃｏＲ１イズさせた、ＶＬＰＮベクターの独立したクローン、を示したサザンプロット（Ｉａｎｅｌ　：マスカルチャー、１ｉｎｅ２−７　：　ＶＬＰＮＦクローン、Ｉａｎｅ８　：　ＶＬＰＮＲｖスカルチャー、１ａｎｅ９　二ＶＬＰＮＲクローン）および（ｂ）推定されるＶＬ３０およびＰＥＰＣＫ　ｎｅｏＲＮＡのバンドを示す、ＶＬＰＮを導入したＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞のノーザンプロットの結果（Ｉａｎｅｌ−２：　ＶＬＰＮＦ７スカルチヤー、Ｉａｎｅ３−４．５−６．７−８　：　ＶＬＰＮＦクローン（各／／２Ｌ／−：／ずツ）　、Ｉａｎｅ９−１０　：　ＶＬＰＮＲクローン）をあられす写真である。

図４８および４ｂは、ＶＬＰＮＦが導入されたＰＡ３１７細胞クローンをあられした写真であり、（ａ）　ＸイズさせたＰＡ３１７のＤＮＡのサザンプロット、および、（ｂ）ｎｅｏにハイブリダイズさせたクローン由来のＲＮＡのプロットである。

発明を実施するための最良の態様以下の生物学的および遺伝学的用語の定義は、この発明の理解に有用である。

ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸、細胞染色体の遺伝物質。

ＲＮＡ　：リボ核酸、ＲＮＡ腫瘍ウィルスおよびレトロトランスポゾンのその生活環の一部での遺伝物質。

ＤＮＡ配列：４つのＤＮＡモノマーのいずれかの組み合わせから成る直鎖状の配列。ＤＮＡモノマー、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのヌクレオチド、は遺伝情報をコードしており、それはアミノ酸、プロモーター、調節または遺伝子産物をコードすることを含む。

特別なりＮＡ配列は公知の特別な機能を有し、例えば、特殊なポリペプチド、特殊な遺伝子の特徴をコードしまたは特殊な表現型の発現に影響を及ぼす。

遺伝子：最も小さく、独立に機能する遺伝物質の単位であって、それはタンパクの生産若しくは調節をコードしまたは転写に影響を与え、少なくとも１つのＤＮＡ配列を含む。

キメラ：組み換えＤＮＡ技術によって作り出されたハイブリッド遺伝子。

遺伝子型：細胞または生物の遺伝子の構成。

表現型：遺伝子型および環境の相互作用から生じた、細胞または生物により所有される形態的、生理的および生化学的な特徴の集まり。

表現型発現：ＤＮＡ配列または産物（例えば、ポリペプチドもしくはタンパク）を結果として生産する、または、接合体もしくは生物の自然の表現型の発現を変化させる配列のコードの発現。

染色体：繊維または糸状の構造であって、完全にまたは部分的に遺伝子の核酸から成る。

レトロウィルス：その生活環中ある時点で、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する必要があるウィルスであり、特にレトロウィルス科またはＲＮＡ腫瘍腫瘍イルイスる。

このファミリーは、ＲＮＡゲノムおよびＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）を含むすべてのウィルスを包含する。

レトロトランスポゾン：細胞転位性遺伝因子であって、逆転写に依存するものである。

ベクター；普通、疾病または自然の遺伝情報を伝達する媒介物をいい、他に指示がない限りここでは外来遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を伝達する遺伝的な媒介物に限る。

ゲノム：媒介物または生物の一倍体または二倍体の染色体の１組。

形質導入：ここでは、（ウィルス粒子またはウィルス機能によって他に指示がない限り）ウィルス、レトロトランスポゾンまたは外来の（加えられた）遺伝子の伝達に限る。

ヘルパー細胞系列：本明細書中では、遺伝子工学的に作られたか、または、逆転写酵素、ウィルスのコアタンパク、エンベロープ　グリコプロティンおよび／または逆転写をはじめるｔ　ＲＮＡとその種のもののようないくつかのまたは全ての必要とされるレトロウィルスのトランス作用機能またはタンパクを生じさせることができる遺伝子を自然に含む、細胞系統。ヘルパー細胞系列の例は、ｐｓ　ｉ２、ＰＡ３１７を含む。

複製コンピテントレトロウィルス：シスおよびトランス機能に必要なすべての遺伝子を生み出すレトロウィルスであって、付加したウィルスの機能なしに複製することができる完全なもの。

非複製コンピテント（欠損）レトロウィルス：複製するために補足的な機能を要求するか、または、それ自身で複製できないレトロウィルス。本明細書中では、それは通常上記のトランス作用機能を要求する。

トランス遺伝壬子通常ベクターによって挿入される外来遺伝子。

シス作用因子：転写プロモーターまたはエンハンス因子のようなプライマー結合部位およびその種のものを機能させるために、同じ核酸の断片に位置しなければならない遺伝因子。

トランス作用因子：シスに位置する必要のない遺伝因子。すなわち、細胞ゲノム中のようにどこにでも位置してよい。トランス因子の例としては、レトロウィルスのコアタンパク、ポリメラーゼおよびエンベロープグリコプロティン遺伝子がある。

ｐｓｉ配列配列子粒子ウィルスまたはレトロトランスポゾンのＲＮＡをパッケージすることができるようにさせるパッケージング機能をコードする遺伝子情報の配列。

１本発明は、細胞、生物またはレトロトランスポゾンを用いる種の中で、いずれかの遺伝子を導入し発現させる方法に関するものである。レトロトランスポゾンは、たいていのホ乳類のゲノムに見い出されるレトロウィルス様のＤＮＡ因子の種類である。レトロトランスポゾンは、ＤＮＡの中に本質的な複製因子［ロングターミナルリピート（ＬＴＲｓ）およびプライマー結合部位コを含むが、タンパク質もしくは粒子、観察できる表現型、または重要な病原性を生み出す能力を含む必要はないレトロウィルスと構造的な類似性を一般的に維持している。レトロトランスポゾンの中には、細胞にまたはレトロトランスポゾンの復製に重要なタンパクをコードしているものもある。レトロトランスポゾンは、レトロウィルスの感染中に、または、宿生中の外来のレトロウィルスもしくはレトロウィルスの遺伝子もしくは細胞の逆転写酵素のような宿主細胞の遺伝子が活性化される場合に、複製し分離する。従って、いくつかのレトロトランスポゾンはいわゆる“利己的ＤＮＡ”の一部であって、ヒトおよびたいていの種のゲノムの重要な機能を占める。しかしながら、そのような因子の広い範囲があり、その中には、細胞遺伝子またはレトロトランスポゾン機能に関する遺伝子を自然に生み出すものもある。レトロトランスポゾンが宿主に典型的に適合する一方で、本発明の以前は、レトロトランスポゾンは遺伝子導入用の貴重な道具として認められず、また発展しながった。

レトロトランスポゾンの一種としてマウスＶＬ３０がある。ＶＬ３０遺伝子は、散在した、中頻度反復ＤＮＡ配列のファミリーである。ＶＬ３０の名は、ＶＬ３０因子が“ウィルスのような”性質を示し、ある種のマウス細胞で３０５　ＲＮＡを産生する事実に由来している。

また、自然的に同じで遺伝的に関連する配列がラットゲノムに存在する。

マウスＶＬ３０遺伝子は、たいていのｍｕｓ断片の染色体に組み込まれた１００ −２００コピーに見い出される、〜５ｋｂ細胞遺伝因子である。ＶＬ３０遺伝子はパッケージし、効率的にマウスおよび霊長類のレトロウィルスによって伝達される。ＶＬ３０および他のレトロトランスポゾンは、ロングターミナルリピート、ｔＲＮＡプライマー結合部位およびレトロウィルス複製の多ｉな面を伴なう逆向きの末端の繰り返しのようなレトロウィルスの構造的な特徴を維持している。

しかしながら、ＶＬ３０レトロトランスポゾンは、ＭＬＶのようなマウスレトロウィルスとほとんどヌクレオチドの相同性を生じず、２つの配列したＶＬ３０は、長い読み取り枠を有しないことは明らかである。従って、特徴化されたＶＬ３０は、ＭＶＬのタンパク質コード領域と生産的に組み換えを起こすということはほとんど無いであろう。しかしながら、また、信号をパッケージングするＶＬ３０が、ＭＬＶのそれと組み換えをおこすというこは可能であり、というのは、これらの信号が明らかにＲＮＡをウィルス粒子に効率的にパッケージングすることに必須であるからであり、それはゲノムのこのパッケージング（またはｐｓｉ）領域にＬＴＲの境界での数塩基対とともにあり、ここにＶＬ３０レトロトランスポゾンとＭＬＶＯ間の最も強い相同性が見い出される。ＶＬ３０−ＭＬＶ組み換え体は、“ｐｓｉ”のみまたはパッケージング領域が欠失した、ミュータントの早い変異における役割を演じることが示唆された。

ＭＬＶベクターに対し構成された最初のヘルパー細胞系統の１つ、ｐｓｉ２、は、組み換えしやすいミュータント、Ｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、ｃｅｌｌ旦：１５３１５９　（１９８３）のようなものである。ＭＶＬウィルスゲノム（パッケージング配列を生ずる領域で一本の３５０ｂｐの欠失をもつ）は安定してＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞にトランスフェクションされた。回復した３つの系統のうち１つは、複製コンピテントにすぐに戻った。もう１つのヘルパー細胞系統、ｐｓｉ２、は組み換えする傾向があるにもかかわらず、有用な系統になり、今日でも依然として用いられている。

“ｐｓｉ−ｍｉｎｕｓ”のパンキングミュータント系統を“ｐｓｉ−ｐｌｕｇ” 表現型に変異させることに加えて、ウィルスゲノムはまた、ウィルス粒子によって変動的に導入されたが、ただし、非常に低い割合であった。

ｐｓ　ｉ２は、さらに進んだパッケージングであるか、または、ウィルスゲノムのシスおよびトランス作用部が組み換えをおこすことがさらに困難になるようなミュータントをさらに含む、ミラーらの米国特許第４．８６１゜７１９号で議論されているＰＡ３１７のようなヘルパー細胞系統に対する表現型であった。

ＶＬ３０は、他のＭＬＶおよび霊長類のレトロウィルスピリオンだけでなく、ｐｓｉ２細胞によっても自然にパッケージされ導入される。本発明で用いられたＶＬ３０は、公知の内在性構造遺伝子を含まず、ｐｓｉのような配列を含む。

ＶＬ３０は高い発ガン性ＭＶＬとの密接な関連にもかかわらず、発ガン性であることが知られていない。実験的には、ＭＶＬは多くの腫瘍を活性化し多種のガン遺伝子の単離を許したが、マウスＶＬ３０遺伝子が、直接腫瘍形成に加わった例はない。同様のラットＶＬ３０因子は、マウス上皮腫瘍を引き起こす）ＩａｒｖｅｙおよびＫｉ　ｒｓｔｅｎのＭＳＶレトロウィルス（Ｅｌｌｆｓｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ２９２　：５０６−５１１．１９８１　；　Ｒｏｏｐ　ｅｔ　ａｌ、、ＮａｔｕｒｅＭＬＶと組み換えをおこすことが示された。マウスＶＬ３０配列は種々の刺激下で大変活発に転写されるため、それらはマウスレトロウィルスと同じような遺伝子の活性化によって、挿入された突然変異原として作用する。

最近、Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウィルス中のラットＶＬ３０配列は、伴なっているｒａｓ遺伝子の転写活性を促進することが示された（Ｖｅｌｕ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６３　二１３８４−１３９２．１９８９）、次にｒａｓの相互発現は、マウスＶＬ３０の転写を活性化する（Ｏｖｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌＢ１ｏ１．、　１０　：　１−９．１９９０）、それらの発ガン性ＭＬＶウィルスとの密接な関連にもかかわらず、ＶＬ３０は上記したもののような詳細な例以外には、ガン遺伝子の活性化の出来事と直接関連しなかった。従って、ＶＬ３０はＭＬＶと較べると腫瘍形成にほとんど関係しない。このことは、また、多数のＶＬ３０がマウスのゲノム中に住み込み、一方で生殖細胞系列ＭＬＶはほとんどない、という理由を説明する。良性を維持することにより、および、過度の逆転写、腫瘍形成および翻訳の負担によって宿主生物を悪化させないことによって、ＶＬ３０および他のレトロトランスポゾンは適所を作り出した。利己的ＤＮＡの寄生体は、宿生によって許容されることが明らかである。

本発明によると、細胞または生物への外来遺伝子配列の導入は、外来遺伝子配列をレトロトランスポゾンゲノムに挿入することによって、および、組み換え型で転写的に活性なレトロトランスポゾンゲノムをレトロトランスポゾンＲＮＡまたはＤＮＡ、好ましくはＲＮＡ　（ヘルパー細胞）、を伝達できる細胞へトランスフェクションすることによって可能にすることができる。そのような細胞の成長媒介物は、その宿主の範囲（感染の範囲）がヘルパー細胞によって決定され、その感染力がひと回りの複製に通常限られる感染性レトロトランスポゾン粒子を含む。そのように生じたレトロトランスポゾン粒子またはピリオンがひとたび受容細胞に入ると、トランスポゾンＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、受容細胞のゲノムに挿入される。高く有用な産物中にレトロトランスポゾンを含む受容細胞の調製は、追加の感染性ピリオン粒子を追加の受容細胞に感染させることによって得られる。

組み込みレトロトランスポゾンは、ＲＮＡとして、好ましくは有用な表現型を結果として生ずるタンパク質として用いられるのならば、ＬＴＲプロモーター転写単位および／または内在性転写単位のいずれかを発現することができる。外来遺伝子は、プロモーターまたは潜在的に第３のプロモーターのいずれかがら転写されうる。さらに、発現なしに、唯一同定しうる“フィンガープリント″を与えるために、レトロトランスポゾンはこの方法で細胞、種または系統を区別するよう利用することができる。レトロトランスポゾンは、少なくとも］っの優勢な選択マーカーをコードしている遺伝物質を含む。有用な選択マーカーとしては、例えば、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅａ、Ｇ４１８．ＡＰＥＩ　）　、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）　、ハイグロマイシン−Ｂ −ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＥ　Ｉ）　、チミジンキナーゼ（ＴＫ）　、キサンチン−グアニン　ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴｌｇｐ　ｔ）　、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシェラーゼ、およびこの種のものがある。また、レトロトランスポゾンはペプチド、抗体、抗原、ホルモンまたは、細胞、生物または生物学的に重要なレベルの種に通常発現されない薬物をコードする遺伝物質をさらに含むことができる。

レトロトランスポゾンの主要な利点は、それらが比較的非発ガン性および非病原性である、ということである。

挿入した突然変異を除き、特徴的ベクターＶＬ３０は公知でない病気の原因または数百万年の間マウスの生殖細胞に居留していた腫瘍形成の歴史をもつ。そのような長い間の居留は、ＶＬ３０因子をＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウスゲノムに最近挿入した証拠とともに（Ｃｏｕｒｔｎｅｙ　ｅｔ　ａｌ、ｉ。

Ｖｉｒｏｌ　、　４旦：５１１−５１８．１９８２）　、ＶＬ３０が、また、長期間潜在的に安定であるトランスジエネシス（ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ＞に対する生殖細胞ベクターであるという事実上の証拠を構成する。外来遺伝子を有するＶＬ３０は効率的に伝達され、数１００までまたはそれ以上の遺伝子のコピーを細胞に挿入することができる。

本発明は、ヒトの遺伝子治療に潜在的に有用であり、その治療では、まれなガン遺伝子活性化の発生およびＭＬＶベクター配列による組み換えがレトロトランスポゾンベクターにかえることによって避けられる。

そのようなレトロトランスポゾンベクター中に伝達された遺伝物質の源は、他の生物、クローン、プラスミドおよびこの種のもの由来でありうるし、それは合成されたものであってもよい。本発明は、ある種を修飾し、また、新しい種を作り出すことに用いてもよい。ここでは５０またはそれ以上のコピーをゲノムに挿入することができ、その機会によって複数の特徴を導入する目的で、または、ともすると過剰発現のため多くの遺伝子を導入することが許される。また、縦方向の組み込みが起こるかもしれないし、これらのマルチマーの大きなＲＮＡ転写産物が自然に作られるかもしれない。従って、複数の細胞遺伝因子を、ＲＮＡにおいて直列にまたは単一の細胞もしくは生物中に分かれた転写単位として導入し、発現させることができる。

サイレントＶＬ３０転写単位が存在し、これは、逆転耳中最後のＬＴＲ領域をコピーするために、複製がちょうどひとまわりした後、ＶＬ３０をオフに切り換えることに用いられる。種々のＶＬ３０のＬＴＲは入手可能であり、細胞形質転換、ゲルコルチコイド、プロティンキナーゼＣ１血清（表皮成長因子）刺激等を含む特別な刺激に反応する調節因子を含む。これらは、それぞれの適応の発現の必要性に応じて調整されうる。必須な構造遺伝子が存在しないことが明らかなので、ここでは効果的に転位する能力をみださずに、外来遺伝子構成物を用いである領域を中断することができるということを例として示す。さらに、多くの発現の手段および方法並びにレトロウィルスベクター（欠失、二重発現、自己不活性化、生殖細胞挿入等のような）を用いたベクター学（ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ　）は、また、レトロトランスポゾンを用いて可能になり、それはそれらの伝達および発現の様式％式％ような存在する細胞系統は、レトロウィルスベクターと同じ方法でＶＬ３０をより増殖させるのにもいることができ、その主な違いは今日まではそのような系で用いられた腫瘍ウィルスではなくむしろ、細胞“ジャンピング遺伝子°レトロトランスポゾンの使用である。さらに、多様な他の種の使用は、高度に専門化された遺伝子工学に対して、特殊な貢献を与えるであろう。

産業上の利用可能性図１は、細胞が転移性因子ＶＬＰＮＦによって形質導入される、本発明の方法を一般的に表わした概略図である。逆転写されたＶＬ３０因子ＮＶＬ３のブラスミドクローンは、制限エンドヌクレアーゼＨｐａｌによって消化され、ラット細胞質中のホスホエノールビルベートカルボキシキナーゼ［ＰＥＰＣＫ］プロモーターおよびバクテリアのｎｅｏ遺伝子をもつ平滑末端フラグメントがその制限部位に連結された。プラスミドは、レトロウィルス介助機能（コアタンパク質、ポリメラーゼーインテグラーゼおよびエンベロープグリコプロティン）を含むｐｓ　ｉ２細胞へトランスフェクションされた。ＶＬＰＮＦ−ｐｓｉ２細胞は、高い効率で細胞に感染することができる、キメラ転位性因子ＶＬＰＮＦのＲＮＡコピーをもつ粒子を作り出した。一旦受容細胞に入ると、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、細胞のＤＮＡに組み込まれ、そこでそれはＲＮＡとして、そしてｎｅｏの表現型を発現するタンパクとして発現された。変形としては、ヘルパー細胞の代わりに複製コンピテントウィルスを用いることを含む。

本発明の方法によると、バクテリアネオマイシン耐性遺伝子（ｎ　ｅ　ｏ）とともに、外来遺伝子プロモーター、ラット由来のＰＥＰＣＫ、を種々の方向にＶＬ３０ゲノムに挿入させた。これらの構成物はヘルパー（ｐ　ｓ　ｉ　２）細胞にトランスフェクションされた。それは、他のいかなる複製コンピテントウィルスまたはヘルパー細胞系統も供与ヘルパー細胞の代わりに用いられる本発明の熟慮された範囲のものである。これらの細胞から、ＶＬ３０は外来遺伝子をＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞へ効率的に導入した（滴定１−０）。それは、滴定が遠心、濃縮カートリッジ、ポリブレンの使用のような方法によって増加しうる、本発明の意図された範囲内のものである。それは、また、いずれかの可能な細胞または生物が受容細胞として用いられる、本発明の熟慮された範囲内のものである。

ＶＬ３０遺伝子は、それらが受容細胞に選択しつる表現型（Ｇ４１８耐性）を与えるＲＮＡおよびタンパク質として発現された。それは、また、いずれかの可能で優性な選択しうる目じるし、または、表現型の選択技術がレトロトランスポゾンにコードされているかもしれない本発明の熟慮された範囲内のものである。

マウスＶＬ３０レトロトランスポゾンゲノムを運ぶ非組み換えプラスミドクローンは、制限エンドヌクレアーゼ　ＨｐａＩで消化され、ラット核ホスホエノールビルベートカルボキシキナーゼ［ＰＥＰＣＫ］プロモーターから成る組み換えＤＮＡ構成物、すなわち、転写開始部位の前３５５塩基対から開示部位の後７３塩基対までにわたる領域に連結され、次いで、完全なバクテリアネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子にポリアデニル化シグナルなしで連結された。キメラＤＮＡ構成物の両方向（順方向および逆方向）に相当し、今後ＶＬＰＮＦ（順方向）およびＶＬＰＮＲ（逆方向）とそれぞれ呼ぶ２つのクローンが回復された。キメラのレトロトランスポゾンＰＥＰＣＫｎｅｏ構成物は、ＤＮＡの連結混成物を大腸菌コンピテント細胞にトランスフェクションさせたあとに、原核生物プラスミド、ｐＧＥＭ３、中で生育させた。プラスミドＤＮＡは収穫され、リン酸力ルウシム法（Ｇｒａｈａｍ　ｅｔ、　ａｌ、、Ｖｉｒｏｌ、　５２　：　４５６−４６７（１９７３））によってｐｓ　ｉ２ヘルパー細胞（Ｍａｎｎ。

ｅｔ　ａｌ、、５ｕｐｒａ、＋　１９８３　）にトランスフェクションされた。

１日後、２００　μｇ　／　ｍ　１の薬物Ｇ４１８を加え、選択培地上のｐｓｉ２細胞の成長を更に１０日続けた。

Ｇ４１８生存細胞のマスカルチャーは、Ｇ４１８のない培地中で生育させ、急速に生育するｐｓｉ２細胞由来の精製培地がＶＬ３０レトロトランスポゾンを、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＡ３１７細胞およびニワトリ胚繊維芽のような受容細胞に導入することに用いられた。逆転写酵素測定は、供与および受容クローン中のヘルパーウィルスの存在または不在を確かめることに用いられた。ＤＮＡプロッティング（サザンプロット）およびＲＮＡプロ・ソティング（ノーザンプロット）は（Ｍａｎｉｔａｔｆｓ　ｅｔ　ａｌ−＋１９８４、“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　”　、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｔｎｇｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２に記載）、挿入配列の同定および発現をそれぞれ決定することに用いられた。Ｓ１ヌクレア一ゼ分析（Ｂｅｒｋ　ｅｔ　ａｌ、＋必要な引例）は、内部の転写カセットの転写開始部位を決定することに用いられた。逆転写酵素測定（Ｇｏｆｒｅｔ、ａｌ、１．Ｖｉｒｏｌ、、　３８　：２３９−２４８．１９８１．）は、細胞がＲＮＡを逆転写することができる感染性ウィルスを作り出すかどうかを決定することに用いた。

ＶＬＰＮベクターでトランスフェクションした後ｎｅｏ耐性を発現するｐｓ　ｉ２細胞由来の培地でＮＩＨ３Ｔ３細胞をインキュベートした後、Ｎ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞はＧ４１８中でそれ自身選択され、選択されうるｎｅ。

遺伝子がその粒子によって形質導入されたかどうかか見分けられた。

下記表ＩＡおよび］Ｂは、培地中での粒子の形質導入力を滴定することにより行った実験を示したものである。

表ＩＡ中のＶＬＰＮＦおよびＶＬＰＮＲ構成物は、ｐｓｉ２細胞にトランスフェクションされたものであり、ｐｓｉ２クローン由来のウィルス上清はＮ　Ｉ　Ｈ３Ｔ３細胞上で滴定され、Ｇ４１８を用いて１０日間で選択された。

ＰＳ１２−Ｎｉ１（３Ｔ３：１００１０−１１０”−２＝　−’ １０　１ＯＶＬＰＮＦ　＋　＋　＋　＋（５２）　−表ＩＢ中で、ＶＬＰＮＦで形質導入されたｐｓｉ２細胞由来のＰＡ３１７ウイルスヘルパー細胞のウィルスの濾液は、Ｇ４１８で選択されたあと、クローニングされ、これらの細胞由来の培地は、希釈しないか、１０，０００倍希釈するかいずれかのニワトリ胚繊維芽（ＣＥ　Ｆ）に形質導入することに用いた。ＰＡ３１７の３つのクローンは、１０４感染単位／■Ｉまたはそれ以上の滴定を生じた。

表ＩＢＰ＾３１７−ＣＥＦ：この実験は、１０００倍希釈した場合（≧１０３形質導入単位／■Ｉ）ＶＬＰＮＦは細胞を形質導入し、一方ＶＬＰＮＲは１００倍希釈で形質転換するが１０００倍希釈ではしない、ということを示す。

希釈液由来の細胞のクローンは、形成したコロニーから細胞を調製することにより単離された。受容細胞由来のＲＮＡおよびＤＮＡは、電気泳動法および上記のプロッティング法によって調べられた。バクテリアｎｅｏ遺伝子にハイブリダイズさせた場合、ゲルから単離した２つのＲＮＡ転写物は、図２ａおよび２ｂに示されるように、約６ｋｂおよび４ｋｂで、すなわちＶＬＰＮクローンのマツプから予想される大きさで、はっきりと観察された。より大きい大きさの転写物は完全長のＶＬ３０ゲノムのＲＮＡ転写物の大きさに対応し、その一方で、より小さい転写物はクローンＶＬＰＮＦのＰＥＰＣＫｎｅＯ内部の転写単位から期待される大きさである。ＶＬＰＮＲマスカルチャーおよびクローンは、内部のプロモーター由来の可能性のある異種のものを示唆する小さいしみしか表わさず、はっきりとＶＬ３０転写産物が観察されなかった。２つの構成物で感染された細胞クローンのＤＮＡプロットは、マスカルチャーおよびＶＬＰＮＦ由来のクローンが、ｎｅｏを含む配列の多数のおよび／または再配列したコピーを示唆する他のフラグメントを生ずることを除いては、図２ａおよび２ｂに示されるよううに、期待された大きさのＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメントを表わしていた。ＶＬＰＮＲクローンはレトロトランスポゾンに関するネガティブセンス中でＲＮＡを作ることができる逆転写単位を有するので、転写中の再転位、欠失および変異を生ずるいくつかの転写障害が予想される（ＨＯｄｇｓＯｎ　ｅｔ　ａｔ、、ｌ’り白血病ウィルスを用いた未公開の結果）。さらに、逆向きのＶＬＰＮＲキメラ中に知られるポリアデニル化がないので、内部のｎｅｏ転写産物がどこで終了するのかを言うことは不可能である。しかしながら、その配列の選択可能性は転写が起こるものもあるということを示している。ＶＬＰＮＲは、順方向のＶＬＰＮＦの実験に対するコントロールとして役立つ。

ＶＬＰＮＦ−ｓ　ｐ　ｉ　２産生細胞のマスカルチャーは、アンホトロビックな産生細胞系列ＰＡ３１７、すなわちヒト細胞を含む大変広い範囲の感染可能な宿主細胞をもつもう１つのヘルパー細胞系統に形質導入することに用いられた。多数のＶＬ３０が形質導入されうるかどうか見分けるために、ＰＡ３１７は、ｐｓｉ２細胞（すなわち２種類の異なった親和性のためにＰＡ３１７をくり返し感染させることができるもの）由来の培地の多数の薬にさらされた。次いで、ＰＡ３１７のクローンは単離され、これらの系統由来のＲＮＡおよびＤＮＡが屑べられた。マスカルチャーおよびＶＬＰＮＦで形質導入されたトを放出する。すべての細胞が少なくとも１度形質導入されたが、多数が繰り返し形質導入され、そして多種のＶＬ３０がｐｓｉ２産生物から形質導入させられるということはプロットから明らかである。これらのフィルムの視覚によるおよび数で表わした濃度の分析から、ＰＡ３１７細胞は、繰り返しの爆撃の間、１から約５０−１００コピーで形質導入された。欠失や期待したものより小さい大きさの挿入を生ずるいくつかのｎｅｏを含む形質導入物は回復し、ある物質は転位したということを示した。にもかかわらず、そのような物質の単一のコピーを生ずるこれらの細胞は、また、ｎｅｏ表現型（Ｇ４１８耐性）を発現し機能的なｎｅ○遺伝子が残ることを表わした。しかしながら、導入されたＶＬ３０レトロトランスポゾンのほとんどが、はぼ完全長のＶＬＰＮＤＮＡを含んでいたということが、図３ａおよび３ｂ中に表わされたプロットの実験から明らかである。従って、転位は可能であるが、発生しそうなことではない。だいたい同じ大きさの変異の繰り返しの挿入は、産生マスカルチャー中のｐｓｉ２細胞のクローンが、観察される特徴的な転位を繰り返し生み出す、ということを示唆した。

逆に、同じクローンでも繰り返し単離されたものがあったかもしれない。ＤＮＡはｐｓ　ｉ２細胞にトランスフェクションされたので、転位は形質導入中に行なったトランスフェクションの工程中に起こった。

ＤＮＡのプロットをＲＮＡのプロットと比較することで、発現がまたＤＮＡプロットで観察されるある種の挿入の特徴を表わしているということが明らかになった。

第一に、ＲＮＡプロット上の約６−７ｋｂのバンドが、ゲノムＶＬ３０転写産物の期待される近似的な位置を示し、一方で、高いバンドに特色がなくまた期待もされていない。これらの大きい転写産物に対する概算された１３および１９ｋｂの測定された大きさは、もしＶＬ３０の多重でタンデムな挿入が起こるならば、タンデム中に転写されうると予想される大きさである。もしこれが起こるなら、多重転写産物が多数の形質導入が起こったサンプル中でのみ観察されるはずである。

このような場合が（明らかな多重転写産物を生ずる多数の挿入をもつクローンに対して、ＲＮＡの唯一で独特なゲノムの大きさを生ずる明らかな単一コピーの配列：２に、２１．２ｍ、２ｎ、２ｔ、２”Ｕ、２ｙ、３ａ、１ａ、２ｄ、２ｅ）があるので、タンデム組み込みが起こり、１ゲノムの大きさよりも大きいＲＮＡ転写産物がそこから作られたということが推測される。多数のＶＬＰＮＦの挿入が発現の上昇したレベルを生じるかどうか、または、これらの細胞のゲノムＤＮＡ中の追加されたンス作用調節領域の存在が転写の要因の有用な供給を弱めるかどうかということがまた決定された。おそらく、各々の染色体の遺伝子座は、遺伝子発現へのそれ自身の特殊な効果を有しており、すなわち結果の多様性が期待された。しかしながら、転写のレベルを、測定されたコピーの数の基本で比較した場合、逆の効果はＶＬＰＮＦのさらなるコピーが増加した発現を必然的に生じなかった、ということを示唆することか示された。もう１つの解釈として、選択圧力がはたらいたので、クローンが選択された。すなわちそのクローン中で唯一のコピーをもつクローンがまた、十分に発現され、多数のコピー（そのうちのいくつかはサイレントであったかもしれなかった）をもつクローンとともに生存した。従って、ＶＬ３０ＬＴＲ由来の過剰発現が、与えられた挿入をもつ多数のコピーを挿入することによって可能になるかどうかはいまだに明らかではない。

観察されたＤＮＡフラグメント（図４ａに表わされるように）の大きさの測定から、共通の親を示しながら、その同じ大きさのミュータントが多くの分散細胞系統に存在することがわかる。このことは、変異がこの感染中ではなく　ＲＮＡの発生に先立って起こったかもしれないということを意味している。このことは、ＸｈＯＩフラグメントのほとんど（すべての内在ＶＬＰＮ−ＰＥＰＣＫｎｅｏ　＠質を含む）がＶＬ３０レトロトランスポゾンによって通過したたいていの挿入にそのままの形でのこったということを表わしたデータとともに、ＶＬ３０はむしろ安定で完全な物質を通過させることができるということを示唆する。いくつかの不安定性はすべての逆転写された物質を特徴づけ、このことはまた観察された。

マウス細胞は２，３の転写活性ＶＬ３０を含む、ＶＬ３０の多くのコピーを含むので、疑う余地もな（これらのベクターはｐｓｉ　２細胞によって継代されたＶＬ３０物質（）Ｉａｔｚｏｇｌｏｕｅｔａｌ、、１９９１．ｉｎ　ｐｒｅｓｓ、）（ｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）のみではない。これらの研究で用いられたハイブリダイズプローブは、いずれの天然のＶＬ３０またはこれらの細胞（ネガティブコントロールＰＡ３１７参照）に存在しない、挿入のキメラバクテリアの一部からのみ由来していた。はっきりと表わされていない他のデータとともに、ＶＬ３０でここで表わされたデータは、内在するプロモーターから発現の選択しつるレベルだけでなく、ＬＴＲプロモーターからの発現の高いレベルについても明らかにする。両プロモーターは外来遺伝子の配列を発現させることに用いられる。

従って、ＶＬ３０ベクターは、ｐｓｉ　２およびＰＡ３１７のようなすでに発育したヘルパー細胞系統で用いることができる。ＶＬ３０は、外来遺伝子の組み込みを維持し、実験室で容易に操作される外来遺伝子のコピーの個々または多数（＞　５０）を送り込むことができる。

本発明は、また、高レベルの発現、より高い滴定を得るＶＬ３０粒子の濃度、多数の挿入、どの配列が修飾することまたは遺伝子の転位についてその系を改善することに用いられるか決定する欠失変異の生成等を選択することを期待される。

また、ベクター、すなわちその中で第２世代のＶＬ３０転写単位が転写的にサイレントであリ、挿入された転写単位に対し中心の段階を許し、ＶＬ３０がもう１つのレトロウィルスによる宿主の二次感染中に伝達される可能性が減るものを作ることができる。

事実上、すべての技術はレトロウィルスがまたＶＬ３０にあてはめられることを改善することに用いられる。

ＶＬ３０の大きさは、遺伝情報の５ｋｂまでがいずれのＶＬ３０情報を欠失させる必要性なしに挿入されることを、認める（ＭＬＶ粒子は、約１０ｋｂまでの遺伝情報を二重にパッケージする）。さらに、多種のレトロトランスポゾンはＶＬ３０のように同じ方法で利用されてもよい。

しかしながら、ある系は、ここに記載された因子に用いられるものよりも異なった介助機能を必要とするということが認められた。

上、１記−で、議論したように、多種の遺伝子がレトロトランスポゾンベクターによる使用に適するということが期待さｉれる。さらに、他種のレトロトランスポゾンがベクターとして適当なものを提供することが期待される。また、好ましい、宿主の選択は、限定することを意味しておらず、多くの・他の宿主が許容されうるちのであることがわかるかもし”れない。本発明が、好ましい体系および実例と結びつくことで表わされた一方で、それはそれとして、先行する明細書を読んだ後普通の方法の１つが、種々の変化、置換または同等のものおよびここで述べた組成および方法への変化、に影響を与えることができるだろう。

従って、この特許出願の書面によって認められる保護は、書き添えた請求項およびそれと均等のものに含まれる定義によってのみ限定されることを意図するものである。

本発明は、アメリカ合衆国政府の援助により、国立医科学研究所許可番号ＧＭ４１３１４のもとでなされた。

政府は本発明について確定した権利を有する。

ネｆ？イシシ序λホΩトルｚｈ２−亡゛タ一バ２Ｔ１）　、ロ　・Ω × ＤＮＡ−εｃｏＲ１：王１工Ｇ、３Ａ二ミニＧ、３ＢＡ）ｅ＜ｒｏｃｏｕロｕＬ＆１ＬＬｌニー×−）２０ｃｂｏｖｓ＞＞Ｎ＜ｏ↑５　ｅ＋Ｉ−ＩＭ　ＮヘーＮμｍＭ　ＮＩＮ内へ閂へ−へへへへへへｎ−、Ｂ）発明の要約細胞、生物または種にいずれかの遺伝子を導入し、発現させる方法を開示する。

この方法は、遺伝子を単離しを供給する少なくとも１つのレトロトランスポゾン遺伝因子から成るベクターに前記遺伝子を導入し、ハイブリッド遺伝子を与えることを含む。このハイブリッド遺伝子は、パッケージングおよび他の細胞、生物または種へのレトロトランスポゾンの伝達ができる供与細胞に導入される。このハイブリッド遺伝子は、逆転写によってハイブリッド遺伝子が複製する供与細胞に導入させられ、受容細胞のゲノムへ挿入される。遺伝子は、遺伝子の表現型を与え、ＲＮＡおよび／またはタンパク質として好ましくは発現される。

国際調査報告ｉ＋怜哨−喝Ｍｌａｅｅｈｆ＊ｂｅ＊ｋＰ「ｉ／ＩＩＱＯ＋７ｎフＣｈｉ−Ｊ。

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の工程を含んでなる細胞、生物または種におけるいずれかの遺伝子の導入および発現方法：（ａ）遺伝子を単離し、（ｂ）前記遺伝子に対するロングターミナルリピートを伴う細胞転位性遺伝因子を含んでなるレトロトランスポゾンを少なくとも１つ含んでなるベクターを導入し、もってハイブリッド遺伝子を与え、（ｃ）パッケージングおよびレトロトランスポゾン遺伝因子のビリオンヘの伝達ができる供与細胞中に前記ハイブリッド遺伝子を導入し、（ｄ）前記ハイブリッド遺伝子を前記ビリオンによって受容細胞に導入し（ここで、前記ハイブリッド遺伝子は逆転写によって複製され、受容細胞のゲノム中に挿入される）、そして（ｅ）前記ハイブリッド遺伝子の表現型をスクリーニングし、前記ハイブリッド遺伝子を発現させる。
２．高くかつ有用な収量のハイブリッド遺伝子を含む受容細胞の調製が、請求項１のビリオンでさらなる受容細胞を感染することによって得られる、方法。
３．ベクターがマウスレトロトランスポゾンＶＬ３０由来のものである、請求項１記載の方法。
４．ベクターがＶＬＰＮＦおよびＶＬＰＮＲからなる群から選択されるものである、請求項３記載の方法。
５．供与細胞がｐｓｉ２およびＰＡ３１７からなる群から選択されるものである、請求項３記載の方法。
６．外来遺伝子が、細胞転位性遺伝子因子ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターによって発現される、請求項１記載の方法。
７．外来遺伝子が、キメラ細胞転位性遺伝子因子中に含まれる内在性転写単位によって発現される、請求項１記載の方法。
８．レトロトランスポゾンが、少なくとも１つの優勢な選択マーカーをコードする遺伝物質をさらに含んでなる請求項１記載の方法。
９．選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｅｎｏ．Ｇ４１８、ＡＰＨ）、ジヒドロホレートレダクーゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ、ｇｐｔ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）およびルシフェラーゼからなる群から選択されるものである、請求項８記載の方法。
１０．多数の細胞転位性遺伝因子が導入されかつＲＮＡとして発現させられる、請求項１記載の方法。
１１．多数の細胞転位性遺伝因子が導入されかつＲＮＡ中でタンデムに発現させられる、請求項１０記載の方法。
１２．多数の細胞転位性遺伝因子が導入されかつ単一細胞または生物中で別個の転写単位として発現させられる、請求項１０記載の方法。
１３．細胞転位性遺伝因子が、ペプチド、抗体、抗原、ホルモンまたは細胞、生物もしくは種において、生物学的に重要なレベルで一般に発現されたことのない薬物をコードする遺伝物質を含んでなる、請求項１記載の方法。