JPH05503699A

JPH05503699A - 雌の生殖能の増大法

Info

Publication number: JPH05503699A
Application number: JP3502983A
Authority: JP
Inventors: ウッドルフ，テレサ・ケイ; マザー，ジェニー・ピー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1991-01-04
Publication date: 1993-06-17
Also published as: CA2069755A1; EP0509040A1; DE69105114T2; DK0509040T3; DE69105114D1; ATE113842T1; AU638310B2; EP0509040B1; ES2065673T3; WO1991010445A1; AU7173491A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】雌の生殖能の増大法本発明は、離開乳動物の生殖能を増大させるためにインヒビンを使用することに関する。

関連技術の説明インヒビンは生殖線、下垂体、脳、骨髄、胎盤、および副腎を含む様々な組織が生産する糖タンパク質である。最初、この糖タンパク質は、下垂体による卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）の分泌を阻害する能力によって同定された。Ｄｅ　Ｊｏｎｇおよび５ｈａｒｐｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６３ニア１−７２（１９７６）　；　ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＣｈａｎｎｉｎｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　：T７２１−５７２４（１９７７）。ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）分泌のこのような優先的制御は極めて高い関心を集め、過去５０年の間、多くの研究室を、精巣、精子、精巣調液、精液漿、および卵巣卵胞液から種々の生物検定法を用いてこの物質を単離し特徴づけようという試みに駆り立ててきた。Ｒｉｖｅｒ：）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３３：１２０（１９８５）　；　Ｌｉｎｇ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｖａｔ　１．Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２ニア２１７（１９８５）　；　Ｆｕｋ浮р■ ら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、４４：５５（１！１８５）。数種から特徴つけられたインヒビンの構造は、２つのジスルフィド結合したサブユニット、α鎖およびＩＡ鎖またはβＢ鎖、から構成されている。

インヒビンが同定された後、卵胞液中に天然物質としてアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）か存在することが明らかになった。アクチビンはラット下垂体前葉細胞によるＦＳＨ放出を刺激し得ることがわかった。

１／ａｌｅら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１　ニア７ロー７７９（１９８６）　；　Ｌｉｎｇら、　１ｆａｔｕｒｅ、　３２１ニア７９−７１R２（１９８６）。アクチビンはイン上ビンβサブユニツト（β□サブユニ、トの場合もあり、βＢサブユニットの場合もある）のホモニ量体またはへテロニ量体から構成されている。Ｖａｌｅら、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ、　Ｈｏｒｍ、　Ｒｅｓ、　４４：！−３４（１９８ｇ）。ヒト、ブタ、ウシおよびラットのアクチビン間ではβサブユニットのアミノ酸が９５〜１００％保存されている。特定の棟内のβ６サブユニ、トとβ８サブユニツトは約６４〜７０％相同である。アクチビンβ８ホモニ量体およびアクチビンβ８ホモニ量体（それぞれ“アクチビンＡ” および“アクチビンＢ”）か卵胞液中て同定されており、両分子ともクローン化され、その遺伝子が発現している。Ｍａｓｏｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３５：９５７（１９８６）　；　ＥＰ公開番号２２２４９１（１９８７年５月２０日公開）　ＨＭａｓｏｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

１、　、３：１３５２（３５ｇ（１９８９）。β８サブユニツトの完全な配列は、５ｅｒｏｎ。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、標題“インヒビシー卵胞刺激ホルモン分泌の非ステロイド調節（原題：１ｎｈｉｂｉｎ−Ｎｏｎ−３Ｌｅｒｏｉｄａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆＦｏｌ　１ｉｃｌｅ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ）”、　ＪＴ、　Ｇ、　Ｂｕｒｇｅｒら共編、ＩＡ、　Ｊ、　Ｍａｓｏｎら要約、第４２巻、　７７−８８頁（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８７）＋標題“ヒト・インヒビンおよびアクチピン：構造および哺乳動物細胞中での組換え発現（原題：Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｎ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖｉｎ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ）″ に公表されている。

アクチビンＡおよびアクチビンＡＢは共に天然の供給源から単離されているが、アクチビンＢは現在までのところ天然の供給源からは単離されていない。アクチビンのｍＲＮＡ（β４およびβＢサブユニ、ト）、生物活性および免疫活性は、未熟のラットおよびブタからの精巣ライジノヒ細胞によって生産されると報告されている。Ｌｅ８ら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４３＋３９６−３９８（１９８９）　；　Ｌｅｅら、５ｅｒｏｎｏ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、標題“精巣の分子および細胞内分泌学（原題：Ｔｂｅ　Ｍ。１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｅ５ｔｉｓ）”、Ｃｏｏｋｅおよび５ｈａｒｐｅ編、第５０巻、２１−２７頁（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８８）。アクチビンＡがＦＳＨ放出活性と共に赤血球生成刺激活性をも有することが最近発見されている。

ＥＰ公開番号２ＩＯイ６Ｉ（１９８７年２月４日分開；ここではこのタンパク質はＢ　Ｕ　Ｆ−３と呼ばれている）、Ｅｔｏら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４２　：１０９５−１１０３（１９８７）およびＭｕｒａｔａら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　`ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　８５：２４３４−２４３８（１９８８）（ここではアクチビンをＥＤＦと呼んでいる）、およびＹｕら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３０　ニア６５−７６７（１９８７ＸここではアクチビンをＦＲＰと呼んでいる）を参照のこと。これらの系では、インヒビンがアクチビンの作用と拮抗した。

最近、それぞれ別個の遺伝子によってコードされているインとビン・サブユニット（複数）の発現か、卵巣および精巣に加えて数種の組織中で立証された。インビヒンのα、β８、およびβａｍＲＮＡか胎盤、下垂体、副腎、骨髄および脳組織中で検出された。Ｍｅｕｎｉｅｒ％、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：２４７−２５１（１９８８）。インヒビン・サブユニｙ　）ｍＲＮＡの発現は組織特異的な様式で数倍変化し、このことはこれらのタンパク質について、その結合様式および産生部位に依存する異なる機能を示唆している。

インヒビンおよびアクチピンは成長および分化因子族（ファミリー）の構成要素である。この族の始原型はトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β ＸＤｅｒｙｎｃｋら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６：７０１−７０５（１９８５））であり、この因子は、１つの供給源によれば、やはりＦＳＨ放出活性を持っている。　Ｙｉｎｇら＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｂｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　＋　１３５：９５０−９５６（１９８６）。ＴＧＦ−β族の他の構成要素にはミュラー（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ）阻害物質、ハエ馨デカペンタブレギノク（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）複合体、およびツメガエルＶｇ−１ｍＲＮＡの産物が含まれる。

ヒトでは、成長している前排卵卵胞および黄体がＦＳ）（刺激に応答してインヒビンを循環中に分泌する。ＬｅｅおよびＧｉｂｓｏｎ、　Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｓｃｉ、　、　３８：１１５−１２０（１９８５）　；　ＭｃＬａｃｈｌａｎら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４８：P００１（１９８７）。したかってインヒビン関連ペプチド類は、下垂体フィードバイト回路による生Ｍ腺機能の変調において重要な役割を果す。

ラットの精巣細胞および卵巣卵胞膜間質細胞の初代培養では、インヒビンか、黄体形成ホルモン（ＬＨ）によって刺激された男性ホルモン生合成を促進し、一方アクチビンか男性ホルモン生産を抑制することが報告されている。Ｈｓｕｅｈら、　Ｐｒｏｃ、　Ｗａｌｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４：５Ｏ８２−５０８６（１９８７）。池の研究者たちはこれらの観察を報告することができないでいる。ｄｅＫｒｅｔｓｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、　４０：３３−３３−４７（１９゜ライジッヒ細胞ステロイド産生に対するＴＧＦ−βの阻害効果についても記述されている。Ｌｉｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４６：３８７（１９８７）　；　ＦａｕｓｅｒおよびＦｌｓｕｅｈ、　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、　、　４３：１３６３（１９８８）　：　Ａｖａｌｌｅｔら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４６　：５７５（１９８７）。顆粒膜細胞では、アクチビンがプロゲステロン生産を阻害し、ＴＧＦ−βがプロゲステロン生産を促進することが報告されている。Ｉｇｎｏｔｚおよび１１ａｓｓａｇｕｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６１　：４３３７（１９８８）。顆粒膜細抱の初代培養では、ＴＧＦ −βだけでなくアクチビンおよびインヒビンもホルモンの合成と分泌にそれぞれ異なる様式で影響を及ぼすことがわかった。

ＡｄａｓｈｉおよびＲｅ５ｎｉｃｋ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１９：１８７９（１９８６）　；　Ｙｉｎｇら、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１３６：９６９（１９８６）　；　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、　Ｂｉｏｃ■■香B Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４８：１４０５（１９８７）　；　Ｍｏｎｄｓｃｈｅｉｎら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ戟B ｇｙ、　１２３：１９７０（１９８ｇ）　：　Ｆｅｎｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　、　２６１：　１４１６７（１９８６）Bこれらの分子はＦＳＨ依存性の顆粒膜細胞機能に対して正負両方の効果を持つ。Ｃａｒｓｏｎら、　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　８５ニア３５−７４６（１９８９）。またＴＧＦ−β／インヒビン遺伝子族の個々の構成要素が、卵胞細胞に対する直接作用によって卵巣機能を調節するだけでな（、この族の他の構成要素の産生速度に影響を与えることによって間接的にも卵巣機能を調節することが示唆されている。Ｚｈｉｗｅｒｌら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　５８：１６１−１６６（１９８１１１）。

アクチビンＡおよびインヒビンが２つの生殖腺細胞株（セルライン）の成長に変動を与えることが報告されており、これは、これらのタンパク質が生殖腺細胞の機能だけでなく繁殖をも調節し得ることを示唆している。ＧｏｎｚａｌｅｚＪａｎｃｈｏｎおよびＶａｌｅ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２５：１６６６−１６７２（１９８９）。黄体によるインヒビンの分泌がこの周期の黄体期におけるＦＳＨＩ度を抑制し、それゆえに卵胞発育の阻害を抑制することが提案されている。Ｂａ　ｉ　ｒｄら、＾ｎｎ、　Ｎ、　Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　５４１　：１５ｌ５３−１６１（１９８゜ある総説は、インヒビンが、排卵する運命にある卵胞の数を決定する因子の少なくとも１つであり、インヒビンの作用による干渉が生殖能の調節に寄与しているかも知れないと主張している。Ｄｅ　Ｊｏｎｇ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　６８：５５５（１９８ｇ）。多くの研究者が、下垂体のレベルでのそのＦＳＨ阻害効果ゆえに、インヒビンか雄および雌の受胎調節に有用であり得ると考えてきた。５ｈｅｔｈおよびＭｏｏｄｂｉｄｒｉ、　Ａｄｖ、　Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔ、　２：１３１−１３９（１９８６）　；　Ｆｉｎｄｌａｙ、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４６：７７０（１９８６）B 別の著者は、（３ｒ２ｍｎｅｒら、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　６８：１０４４（１９８１）を引用して）インヒビンか精子形成を阻害し得ることを疑問に思い、インヒビンは精子形成に対してなんらかの直接的刺激効果をも有するであろうと述へている。Ｂａｋｅｒら、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　ａｎｄ　Ｆｅｒｔ、　、　２：１６１−１７４（１９８３）。

ヒツジをインヒビンまたはインヒビンα鎖で免疫化すると、内因性インヒビンの免疫中和ゆえに排卵速度が増大する。ＣｕＩＩＩＩｎｉｎｓら、ｊ。

Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔｉｌ、　、　７７：３６５（１９８６）　；　ｆ（ｅｎｄｅｒｓｏｎら、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　、　P０２　：３０５−３０９（１９８４）　；　Ｆｏｒａｇｅら、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　、　１１４：Ｒ１（１９８７）　；　Ａｌ−０ｂａｉр■ ら、　Ｊ−Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　ｌｔｌ　：４０３−４１４（１９８７）。ラットでも同じ効果が観察されてゝゝるｏＲｉｖｉｅｒおよびＶａｌｅ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２５：１５２（１９８９）。さらにＲｉｖｉｅｒとＶａｌｅは、追加の卵胞成長および発育を刺激するには増大したＦＳＨだけで十分であり、抗インヒビン血清での処理が卵胞の発育を増大させる主要な機構は、増大した血漿ＦＳＨレベルによるものであることを示唆している。他の研究者らは、ヒツジに対するインヒビンの投与かその処置計画に応じて無排卵か、あるいは排卵速度の増大を誘発することを報告した。Ｆｒａｎｃｈｉｍｏｎｔら、　Ｒｅｖ、　ｆｒ、　Ｇｖｎｅｃｏｌ、　０ｂｓｔｅｔ、　、　８３　：６０７（１９８８）。

ラット発情期周期中のインヒビン・サブユニットｍＲＮＡの変動は熱心に研究されてきた。ＷｏｏｄｒｕｆＴ　；）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９：１２９６（１９８８）。

卵巣のインヒビンおよびアクチビンと下垂体ＦＳＨとの間の統合的なフィードバンク関係が部分的に解明されたのは、つい最近のことである。Ｈａｓｅｇａｗａら２“インヒビン：ＦＳＨ分泌の非ステロイド調節（原題用ｎｈｉｂｉｎ：Ｎｏｎ−５ｔｅｒｏｉｄａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＦＳ）ｆ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎＮ中、ＪＢｕｒｇｅｒら編、　４２：１ｌ１９−１３３（Ｎｅ　Ｙｏｒｋ：Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８７）　；　Ｗｏｏｄｒｕｆｆら。

５ｃｉｅｎｃｅ、　２３９：１２９６−１２９９（１９８ｇ）。簡潔に述へれば、卵巣は発情前期の末期に低レベルのインヒビンを生産する。これはＦＳ）Ｉが発情期の初期の間ずっと上昇したまま（第２ＦＳＨサージ（急増））であることを可能にする。Ｒｉｖｉｅｒら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３４　：２０５−２０８（１９８６）。第２ＦＳＨサージは排卵プールに一組の新しい卵胞を補充し、インヒビン・サブユニットｍＲＮＡ発現の開始を招く。インヒビン生産の結果として、下垂体ＦＳＨ分泌が下方調節される。インヒビンｍ　ＲＮＡレベルは、その周期の中を進行するにつれて成熟しつつある卵胞中で増大する。閉鎖性（非排卵性および高度にステロイド産生的月こなる卵胞はインヒビンｍ　ＲＮ　Ａをほとんど、あるいは全く持たない。ＷＯｏｄｒｕｆＴら、“成長因子と卵巣（原題：Ｇｒｏｗｔｈ　ＦａｃｔｏｒＳａｎｄ　ｔｈｅ　０ｖａｒの”中、　ＨｉｒｓＭ　１ｅｌｄ編、　２９１−２９５頁（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）。インヒビン・サブユニットｍＲＮＡの蓄積は健康な卵胞の発情前期の後半に、第１次ＬＨおよびＦＳＨサージと同時に頂点に達する。Ｍｏｏｄｒｕｆｆら、５ｃｉｅｎｃｅ（前掲）。

１９７８年に初めて試験管内受精法が成功して以来、複数の卵胞および卵母細胞の発育を誘発するために薬剤またはホルモン類を使用するという試みが行われてきた。したがって試験管内受精妊娠は、内分泌正常患者における複数卵胞発育を誘発するための、クエン酸りロミフェンおよびヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンの使用に従う婦人をもたらすことができた。Ｔｒｏｕｎｓｏｎら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２１２：６８１−６８４（１９８１）。

混合された外因性の性腺刺激ホルモンＦＳＨおよびＬＨの適切な適用が試験管内受精療法中の複数非回収や排卵誘発に関して有効性を示してきたことは十分確立されている。しかし、外因性性腺刺激ホルモン類（複数）の投与による卵巣の刺激は管理が難しい。いくらか有用な別の薬剤はＦＳＨ単独、あるいはＦＳＨと性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤との組み合わせである（米国特許第４８４５０７７号に記述されている）。

ＦＳＨもしくはＦＳＨとＬＨの混合物による治療は、この周期の卵胞および初期黄体期中のインヒビン血清レベルの増大をもたらす。

ＭｃＬａｃｈｌａｎら、　Ｌａｎｃｅｔ、　１　：　１２３３−１２３４（１９８６）　：　Ｔｓｏｎｉｓら、　Ｊ、　Ｃ１ｉｒｅ、　Ｅｎр盾モ■ ｉｎｏｌ、　Ｍｅｔａｂ、　、　６８：９１５（１９８８）　；　Ｂｕｃｋｌｅｒら、　Ｊ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、　、　１２２　：２７９|２８５（１９ｇ９）　ＨＴｓｕｃｈｉｙａら、　Ｆｅｒｔ、　５ｔｅｒｉ１．　、５２：８８（１９８９）。しかし別の研究者は、排卵時には、インヒビン活性も、あるいはステロイドまたは性腺刺激ホルモンの卵胞レベルも、試験管内受精法における卵母細胞の究極の結果を予言するための適当な規準ではないことを発見している。Ｌｅｆｅｖｒｅら、　Ｆｅｒｔ、　５ｔｅｒｉ１．　、４６：３２５（１９８６）。

本発明の目的は、性腺刺激ホルモンあるいは他の処置に応答しない患者の生殖能を増大させるためにインヒビンを使用することである。

本発明のもう１つの目的は、試験管内受精および肝移植のために排卵を誘発することである。

これらの目的およびその他の目的は当業者に明らかになるであろ発明の要約離隔乳動物の卵巣にインヒビンの有効量を投与することからなる、離隔乳動物の生殖能を増大させる方法。

もう１つの側面として、本発明は、医薬的に許容される担体中に有効、量のインヒビンを含有する生殖能を増大させるための医薬組成物を提供する。

インヒビンが、発情間期から発情前期への移行期の卵胞発育の調節因子であることを発見した。未熟雌ラットの卵巣にインヒビンを片側性注射し、形態学、卵胞直径、および発育中の卵胞への３Ｈ−チミジンの取り込みでその腔卵胞の成熟を分析することによって、生体内研究を実行した。その結果は、意外にも、卵巣卵胞の成長および発育が卵巣に対するインヒビンの局部的投与によって維持され得ることを示している。したがって、性腺刺激ホルモン処置に対して応答しない不十分な卵胞発育ゆえに不妊症である雌は代替療法を図１は、対照（食塩水）および妊娠している雌鳥（ロバ・ラバ）の血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）で処理したラットの卵巣における卵胞分布のグラフである。

図２は、インヒビンーおよびアクチビンー処理した卵巣における卵胞分布のグラフであり、★は主として閉鎖性の応答を示す。

好ましい態様の説明本明細書で使用する場合、用語“インヒビン”はインヒビンのα鎖とβ鎖のへテロニ量体、プレプロ型、およびプロ型、ならびにそのグリコジル化および／またはアミノ酸配列変種を意味する。成熟タンパク質からの切断の後、その前駆体部分はその成熟タン７−、Ｎり質と非共有結合的に結合していてもよい。インヒビンＡとは、α鎖およびβ、鎖を伴うインヒビンを意味する。インヒビンＢとは、 α鎖およびβ６鎖を伴うインヒビンを意味する。

完全な単離プレプロまたはプロドメインあるいは成熟βい、β８、およびαの配列は、合成法および／または組換え法を含むいずれの方法でも適切に合成されるが、例えば米国特許第４７９８８８５号（１９８９年１月１７日発効）に記述されているように組換え細胞培養中で合成するのが好ましい。

ヒト以外の動物、例えばブタまたはウシ供給源、から得たインヒビンをヒトの治療に使用することも本発明の範囲に包含される。例えばブタ・インヒビンα鎖のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は米国特許第４７９８８８５号（前掲）に認められる。さらに、家畜や農場動物および動物園、スポーツまたはベット動物など、他の哺乳動物種を治療することを望む場合、ヒト・インヒビンも他の種由来のインヒビンと同様に使用に適している。

一般論として、アミノ酸配列変種は、例えば米国特許第４７９８８８５号（前掲）に記載の哺乳類αまたはβ鎖配列の対応部分と本質的に相同であろう。本質的に相同とは、２つのタンパク質問のアミノ酸残基の一致数を最大化するように並べたときに、その相同ポリペプチドの一次アミノ酸配列の約６０％以上がインヒビン鎖の配列に対応することを意味する。残基の一致を最大化する並べ方には、アミンおよび／またはカルボキシル末端の移動、必要な間隙の導入、および／またはその候補配列中に挿入物として存在する残基の削除が含まれる。典型的な場合、アミノ酸配列変種は対応する天然配列に対して約７０％以上相同であろう。

配列変化を導入する部位は予め決定されるが、変異そのものを予め決定する必要はない。例えばある部位の変異の効果を最適化するために、標的コドンまたは領域で無作為変異導入を実行し、発現したインヒビン変異体を望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることかできる。既知の配列を有するＤＮＡ中の予定した部位に置換変異を作る技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー変異法がある。

変異導入は、通常約１からｌＯアミノ酸残基程度のアミノ酸挿入を行うか、あるいは約１から３０残基の削除を行うことによって実行される。置換、欠失（削除）、挿入、あるいはその同型変異の組み合わせを、さらに組み合わせて最終構築物に到達することもできる。

しかし好ましくは、置換変異導入を行う。明ろかに、コード化ＤＮＡ中の変異かその配列を読み枠外に置くことになってはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造をもたらし得る相補領域を生み出さない。

インヒビンの共有結合修飾は本発明の範囲に包含され、これには他の化学的部分との共有結合的または会合的複合体が含まれる。共有結合誘導体は、インヒビンのアミノ酸側鎖中またはＮ−末端あるいはＣ−末端に存在する基に、当該技術分野で知られている手段で官能基を結合させることによって製造される。例えばこれらの誘導体には、カルボキシル末端もしくはカルボキシル側鎖含有残基（例：アスパラギン酸残基）の脂肪族エステルまたはアミド；アリールまたはアラニルなど、ヒドロキシル基を含有する残基の○−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸もしくはアミノ基含有残基（例：リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体；が含まれるであろう。アンル基をアルキル部分（Ｃ３からＣＩＯの直鎖アルキルを含む）の群から選択すればアルカノイル種が生成し、また炭層または複素環化合物の群から選択すればアロイル種が生成する。反応性基は、それ自体は反応性側鎖基を通してタンパク質を架橋して不溶性マトリックスにする際の使用か知られている二官能性化合物（例・ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）であることが好ましい。好ましい調厚体化部位はヒスチジン残基である。

“卵巣に投与する”という表現は、骨液嚢内法なとによって卵巣中に注射することだけでなく、インヒビンが卵巣中に吸収されるように、結果として卵巣を取り巻く領域をインヒビンで満たすことになるような技術をも意味する。これは腹部中に、あるいは卵巣を貫いて、顕微鏡を用いであるいは顕微鏡を用いないで切開を作ることによって達成できる。また、好ましくは顕微鏡法を用いて、卵巣に注ぐ管中にインヒビンを注射することもできる。さらに、インヒビンをインブラント（埋め込み材）中に入れて卵巣付近に置き、これを通して卵巣にインヒビンを吸収させることもできる。卵巣への局部的なインヒビンの適用をもたろし、その結果が本明細書に述べる目的にとって有効である限り、その他の技術も使用できる。

本発明は、ヒトだけでなくイヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、サル、およびヒツジなどのスポーツ動物、動物園動物、ペット動物、農場動物を含む離開乳動物の生殖能を増大させるためにインヒビンを使用することに関する。生殖能増大の必要性は、一般に不充分な卵巣卵胞発育に起因する。

上述のように、インヒビンを哺乳動物の卵巣に投与する。特定の投与経路は、例えばその患者の医学的経緯などに依存するであろう。

この療法に使用すべきインヒピン組成物は製剤化され、個々の患者の臨床的状況、投与法、投与計画、および医師の知る他の因子を考慮のうえ、良い医療に適合する方法で投与されるであろう。したがって、本発明のための“有効量”は、このような考慮の上に決定される。

一般的提案として、投与１回あたりに投与されるインヒピンの総医薬的有効量は患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／日〜１０　ｌｌ１ｇ／　ｋｇ／日の範囲になるであろうが、上記のようにこれは大いに治療的裁量の対象となるであろう。この投与量は約１０μｇ　／　ｋｇ／日を越えないことが好ましい。適切な投与量を選択する際に不可欠な因子は、卵胞発育の増大か、もしくは医師が適当と見なす他の規準によって測定して得られる結果である。

投与のために、一般的には望ましい純度のインヒビンを、医薬的に許容される担体（即ち、使用する投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、その製剤中の他の成分と適合し得るもの）と混合することによって単位注射可能剤形（溶液剤、懸濁剤、または乳剤）に製剤化する。例えば本製剤は酸化剤およびポリペプチドにとって有害であることが知られている他の化合物を含まないことが好ましい。

一般に、インヒビンを均一かつ密接に液体担体または微細に分割した固体担体あるいはその両者と接触させることによって本製剤を調製する。次に、必要ならばその生産物を望ましい製剤に成形する。

担体は非経口用担体であることが好ましく、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。このような担体賦形剤の例には水、食塩水、リンゲル溶液、およびテキストロース溶液か含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤もリポソームと共に本発明に有用である。

担体は等張性や化学的安定性を増大させる物質など、少量の添加物を含有することが適切である。このような物質は使用する投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、これらにはリン酸塩、硝酸塩、および他の何機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子Ｍ（約１０残基未満）のポリペプチド（例：ポリアルギニンまたはトリペプチド類）、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはアルギニンなどのアミノ酸類；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖、三糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムイオンなどの対イオン、および／またはツイーン（Ｔｖｅｅｎ）、プルロニクス（ＰｌｕｒｏｎｉｃＳ）、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。

典型的には、このような賦形剤中にインヒビンを約０．１ｍｇ／ｍ）〜１．００ｍｇ／ｍｌの濃度で生理学的ｐＨで製剤化する。上記の添加剤、担体、または安定化剤のうち、あるものの使用がインヒビン塩の形成をもたらすことは理解されるであろう。

治療的投与に使用するインヒビンは滅菌状態でなければならない。

滅菌状態は滅菌濾過＠（伊１：０．２ミクロン膜）を通して濾過することによって容易に達成される。

一般的には治療用インヒビン組成物を滅菌注入口の付いた容器（例えば皮下用注射針で突き刺せる蓋のついたバイアル）中に入れる。

通常は、インヒピンを、単位または複数投与量容器（例えば、封印したアンプルまたはバイアル）中に、溶液剤として、あるいは再構成用凍結乾燥製剤として保存するであろう。凍結乾燥製剤の例として、滅菌濾過した１％（−／ｖ）インヒピン水溶液５国１を１０ｍ１バイアルに入れ、得られた混合物を凍結乾燥する。

５ｍｌの滅菌水またはリンゲル溶液を用いてこの凍結乾燥インヒビンを再構成することによって注入、容液剤を調製する。

インヒビン療法を他の提唱されている生殖能増大療法あるいは従来の生殖能増大療法と適切に組み合わせる。例えば、利用可能な卵細胞数を増大させるために使われている他の生殖能薬と共にインヒビンを投与することができる。さらに、性腺刺激ホルモン放出拮抗剤など既知の生殖能薬の効果を増大させる、あるいは相助作用する薬剤とインヒビンを組み合わせることもてきる。

制御された複数卵胞成熟を誘発するために使用される薬剤の例には、クエン酸りロミフェンまたはヒト閉経期性腺刺激ホルモン（例：米国特許４８４５０７７に記述されているＦＳＨ，あるいはＦＳＨとＬＨおよび／またはヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンとの混合物）が含まれる。ヒト閉経期性腺刺激ホルモン療法に対する応答の著しい個体変動性を減じるために、性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤を投与することができる。代表的な性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤は、Ｒｅｅｓら、　Ｊ、　Ｗｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　、　１７：１０１６（１９７４）　：　Ｃｏｙら、　Ｐｅｐｔ　１ｄｅｓ。

１９７６（Ｌｏｆｆｅｄ編、　Ｅｄｉｔｉｏｎｓ　ｄｅ　Ｌ’　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ　ｄｅ　Ｂｒｕｘｅｌｌｅ　１９７７）、　４６３頁、Ｂｅａｔｔｉｅら、　ＪＭｅｄ、　Ｃｈｅｗ、　、　１８：１２４７（１９７５）　：　Ｃｈａｎｎａｂａｓａｖａｉａｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　８６：１２６６（１９７９）、および米国特許第４３１７８１５号および同第４４３１６３５号に記述されている。これらには、（Ａｃ− ｐＣＩＰｈｅ’、ｐｃＩＰｈｅ”、ＤＴｒｐ３．ＤＡｒｇ’、ＤＡｌａ”）Ｇ　ｎ　ＲＨＨＣｌ　、　［Ｄ−Ｐｈｅ”コーＬ　ＨＲＮ　、　［Ｄ−Ｐｈｅ”、　Ｄ−Ｐｈｅ’ニーＬ　ＨＲＮ　、　［Ｄ−Ｐｈｅ’、　Ｐｈｅ３．　Ｄ−Ｐｈｅ ’］−ＬＨＲＮ、〔Ｄ−Ｐｈｅ”、　Ｄ−Ｔｒｐ’、　Ｄ−ＰｈｅリーＬＨＲＮ、［Ｄ−Ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ−Ｄ−ＡＩａ’３−ＬＨＲＮ、および［Ａｃ−Ｄ７Ｐｈｅ’、　Ｄ−Ｐｈｅ”、　Ｄ−Ｔｒｐ”　”コーＬＨＲＮか含まれる。

インヒビンと生殖能薬は、例えば投薬、患者の臨床的状況などに応じて、同時にあるいは異なる時間に、別の投与経路あるいは同じ投与経路で、別の手段あるいは同じ手段で、適切に送達される。このような生殖能薬がインヒビン組成物そのものに含まれるＺ、要はないが、これらの薬剤を同じ投与経路で送達する場合にはこれが便利であろう。

インヒビンと一緒に使用する場合、典型的にはこのような薬剤を単独で使用する場合より少ない投与量で使用する。ＦＳＨを別個に使用する場合その有効量は、好ましくは１ヨあたり約７０〜２２０／１．Ｕ、、　より好ましくは１５〜４　Ｑ　Ｉ　、　Ｕ、／ｋｇである。性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤をＦＳＨとの関連で使用する場合には、性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤の投与量、は１日あたり約１．０〜４．０ｍｇ／　ｋｇであることが好ましく、より好ましくは１．５〜２　、５　ｍｇ／　ｋｇである。これらの後の薬剤の投与に関する詳細については米国特許第４８４５０７７に認められる。

典型的な混合組成物は、上記の量のインヒビンと約７０〜２２０／１．Ｕ、のＦＳＨを、乳酸化リンゲル溶液などの適切な腹腔内液中に含有するであろう。

胚移植を達成するための排卵誘発を受けている婦人のためには、インヒビンによって排卵が誘発された後、どの胚移植法でも使用できる。これらには、例えば試験管内受精および胚移植（ＩＶＦ−ＥＴ）（Ｑｕｉｇｌｙら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ　１．　、３８：６７８（１９８２乃、生殖子ファロピアン内（ｉｎｔｒａｆａｌｌｏｐｉａｎ）移植（Ｇ　Ｉ　Ｆ　、Ｔ　ＸＭｏｆ　ｔｏｙら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４７：２ｇ９、（１９８７乃、および前核期卵管移植（Ｐ　ＲＯＳ　Ｔ　）（Ｙｏｖｉｃｈら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４８：８５１（１９８７））が含まれる。このような方法の成功は、回収される卵母細胞の数および移植された生存可能な胚の数と正の相関関係にある。

卵巣の事象の予定か期待通りに進行する場合には、超音波または腹腔鏡検査法によって、卵巣表面上で成長しつつある、膨張した管と充分な半透明性を有する卵胞（単数または複数）を周期中央付近で見ることかできる。これは排卵に近い優勢な卵胞の普通の外見である。代表的な試験管内受精法のためには、針を卵胞およびその内容物（−卵母細胞であってもよい）中に通し、自発的な卵巣周期中に吸引する。経膣超音波誘導卵胞吸引を用いて卵母細胞の回収を行う。

排出後、卵胞が崩壊する。卵胞を吸引した時、卵細胞を顕微鏡で調へることによってその状態を評価する。

卵細胞の正常性を見積もるための主観的規準には、周辺顆粒膜細胞の数、粘液被覆の密度、透明帯の厚さ、および掻体の有無１こよって、その生存可能性および成熟性を評価することが含まれる。Ｑｕｉｎｎら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４４：４９３（１９８５）から得られるヒト卵管液１こ１０％熱不活化母性または胎生常襲（ｃｏｒｄ　ｓｅｒｕｍ）を補足したものを、ｒＶＦおよび胚培養に用いることができる。吸引後の予定した経過時間（６〜８時間など）に、洗浄し移動した精子（典型的には１卵あたりＩ　Ｑ　００００〜２０００００）で成熟卵母細胞を受精させる。典型的には精液注入の１２〜１８時間後に受精を評価し、その卵母細胞を成長培地に移す。正常に受精した卵母細胞たけを、典型的には回収の４８〜５６時間後にその２〜８細胞期で患者に移植する。ＩＶＦの成功は、供与された胚の移植につづいて妊娠をもたらす。

ＩＶＦの一般的操作法には、Ｔｒｏｕｓｏｎら（前掲）　；　ＴｒｏｕｓｏｎおよびＬｅｅｔｏｎ、　”Ｈｕｍａｎ　Ｃｏｎｃｅｐｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ ”（ＥｄｗａｒｄｓおよびＰｕｒｄｙ編、ＮｅｖＹ。

ｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９ｇ２）中、およびＴｒｏｕｓｏｎ、　”ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｆｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ’（ＣｒｏｓｉｇｎａｎｉおよびＲｕｂｉｎ＆ｉ：、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８３）中１３１５頁に開示されているものが含まれる。

ＩＶＦ中に起こり得る非ホルモン誘導性黄体期ホルモン欠乏症のきざしは、１以上の黄体に相当する分泌液をまとめて投与することによって改善され得る。

ＧＩＦＴ法のためには、卵母細胞の回収を標準的な腹腔鏡誘導卵胞吸引技術で行うことが適切である。Ｒｅｎｏｕら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉｌ、　３５：４０９（１９８１）。典型的な方法のためには、いったん卵母細胞を集め、選別したら、直ちに生殖子、最大５卵母細胞、をファロピアン管に移す。卵母細胞収集の約３〜４時間前に精液試料を集め、自動性精子の最終懸濁液を１ｏｏｏｏｏ〜２０’００００／３５μｌに調節する。

ＧＩＦＴカテーテルに精子懸濁液および卵母細胞を負荷する。Ｍｏ１ｌａｙら、　Ｐｅｒｔ、　５ｔｅｒｉ１．　、４７：２８９（１９８７）に記述されている方法でファロビアン管にカテーテル挿入し、生殖子を移植する。

ＰＲＯＳＴ法のためには、卵母細胞吸引、精液懸濁？＆調製および精液注入のすべての操作をｒＶＦ法と同じ操作を用いて行う。卵母細胞の受精を評価した後、ＧＩＦＴ法と同じ操作で２つの前核卵母細胞をファロビアン管中に移植する。

次の実施例を参照することによって、本発明はより完全に理解されるであろう。

しかし、以下の記述が本発明の範囲を限定するものと見なすべきではない。

実施例１２５日齢の雌スプラグ・ドーリ−・ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　Ｍ＾）を、８０　ｍｇ／　ｋｇの塩酸ケタジン（Ｙｅｔａｆａｒ、　Ａｖｅｃｏ　Ｃｏｍｐａｎｙ）と４　ｒａｇ／　ｋｇのキシロジン（ｘｙｌｏｚｉｎｅＸＧｅｍｉｎｉ、　Ｒｕｇｂｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の組み合わせで麻酔した。次いで、そのラットの左背面腰部領域を刺毛し、７０％イソプロピルアルコールおよびヨウ素洗浄溶液で準備した。皮膚層を通過して、ちょうど尾から最後の肋骨までに５〜７開の切開を作った後、腹膜中に３〜５ｍｍの切開を作った。次に卵巣を可視化し、周囲の脂肪をつかむことによって穏やかに外在化した。子宮の左角と周囲の脂肪との間に１対の直根麦粒鉗子（ｓｔｒａｉｇｈｔ−ｅｙｅ　ｄｒｅｓｓｉｎｇ　ｆｏｒｃｅｐｓ）を置き、それらを開くことによって卵巣を注射に供した。付着している脂肪を安定化のためにつかみながら、１０μＩのヒト組換えインヒビンＡまたはアクチビンＡ（米国特許第４７９８８８５号（１９８９年１月１７日発効）に記述されているように製造し、精製したもの）を、ツベルクリン注射器に取り付けた２８ゲージ針を通して尾から輸卵管にｔ液嚢内注射（ｌμ ｇ／卵巣）した。ＦＳＨとＬＨの組み合わせであるＰＭＳＧを２５国際単位（Ｉ　Ｕ）で腹腔内注射した。

動物を次の群に分けた。

第１群１食塩水（ｎ＝５）；第２群：ＰＭＳＧ（ｎ＝６）：第３群：インヒビンＡ（ｎ＝８）；第４群：インヒビンＡおよびＰＭＳＧ（ｎ＝７）；第５群ニアクチピンＡ（ｎ＝７）；第６群、アクチビンＡおよびＰＭＳＧ（ｎ＝８）。

各実験で使用した動物の総数を括弧内に記載する。これは２回の独立した反復を表す。別の動物群には、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）を次に示すホルモンと同時にｔ液嚢内注射した。

第７群・３Ｈ−チミジン（食塩水中）：第８群：３Ｈ−チミジンおよびＰＭＳＧ；第９群゛３Ｈ−チミジンおよびインヒビンＡ；第１０群：３Ｈ−チミジン、インヒビンＡ、およびＰＭＳＧ０各動物について１卵巣にホルモンを注射し、他方の卵巣を対側対照とした。投与体積を約１０μｍとした。投与直後に、綿塗布棒で注射部位にわずかな圧力をかけた。次に卵巣を注意深くもとに戻し、切開を２つの９ｍｍ創傷クリップで閉じ、動物をケージに戻し、立ち直り反射が回１夏するまで観察した。

投与２４時間後に検死を行った。組織試料を集め、組織学的分析のためのＩＩとして４％ホルマリン中に入れた。

卵巣を４％ホルマリン中で１２時間固定し、パラフィン中に包埋し、３μので切片化した。段階切片を顕微鏡スライド上に５０μＪごとにのせた。５０μｍの間隔は卵母細胞の直径（８０μＭ）に基づいて、各卵胞が余剰性なく分析されるように選択した。切片をヘモトキシリン（ｈｅｍｏｔｏｘｙｌ　１ｎ）−エオシンで染色した。健康な卵巣一対一閉鎖性卵胞を次の規準によって形態学的に評価した二卵母細胞の外見、顆粒膜細胞層の配列、および顆粒膜細胞層の数。Ｖｏｏｄｒｕｆｆら、　”Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　０ｖａｒｙ ”（Ａ、　Ｎ、　Ｈｉｒｓｈｆｉｅｌｄ編）中、、２９１−２９５頁（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９）　；　０ｓＩＩｌａｎ、　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔｉｌ、　、　７３：２６１−２７０i１９８５）。

３Ｈ−チミジンで処理した卵巣を、非放射活性試料と同様に固定し、３μＭで切片化した。スライドをオートラジオグラフィー乳液に浸け、４°Ｃで２〜４週問暴露し、染色した。

バイオファント（ＢｉｏｑｕａｎｔＴｌ″）画像分析システムを用いて卵巣の直径を決定した。卵母細胞および小丘への顆粒膜細胞橋のレベルで互いに正しい角度で２つの測定を行った。最初の切片画像を記憶装置に保持した後、次の切片にそれを！を置することによって、測定の重複を避けた。最初の切片で測定した卵胞は使用しなかった。

図１は、代表的動物群について、食塩またはＦＭＳＧの前液嚢内注射後の各サイズ群の卵胞数を示している。図２は、代表的動物群について、インヒビンＡまたはアクチビンへの前液嚢内注射後の各サイズ群の卵胞数を示している。

食塩を注射した卵巣および非処理（対何）の卵巣は卵胞分布が類似していた。ＰＭＳＧで処理した動物は小さいものく２５０μｍ）から大きいもの（＞　５００ μｍ）まてに分布した卵胞をもっていた。インヒビン処理も、より大きいサイズ群に向かって移動する卵胞の集団的移動をもたらしたか、この変化はＰＭＳＧ− 処理した動物の場合はど顕著ではなかった。Ｐ　Ｍ　Ｓ　Ｇ処理した動物の卵胞サイズに対するインヒビンの効果はＰ　Ｍ　Ｓ　Ｇ処理単独の場合と異ならなかった。

アクチビンによる処理は★で示すように閉鎖性卵胞をもたらした。

興味深いことに、ＰＭＳＧ背景下でのアクチビン処理はＰＭＳＧ単独の場合と類似の卵胞分布をもたらした。卵胞サイズは生殖能の指標である。卵胞のサイズは卵胞が成熟し排卵の準備をするにつれて増大するので、成熟しつつある卵母細胞の形態学的標識である。

成長している卵胞中への３Ｈ−チミジンの取り込みを追跡することによっても、卵胞の健康を監視した。食塩水で処理した思春前期の卵胞は、壁在性顆粒膜細胞、卵胞膜細胞、および生殖円板（ｄｉｓｃｕｓ　ｐｒｏｌｉｇｅｒｕｓ）（小丘の細胞および隣接細胞）中の低レベルの取り込みを示した。この処理群の卵胞はすべて標識されなかった。ＰＭＳＧ処理は、分裂する顆粒層細胞および卵胞膜細胞中への３Ｈ−チミジン取り込みの促進を伴って、卵胞成長の刺激をもたらした。さらに、数サイズ群のほとんどの卵胞が標識を取り込んだ。

インヒビンの注射は標識された顆ｆｉ膜細胞の同心性様式をもたらした。２つの細胞層、閉鎖性腔を整列させる細胞および基底膜付近の細胞、が標識された。インヒビンをＰＭＳＧと同時注射した場合、その標識化様式はＰＭＳＧ単独の場合と同一であった。

このように、局部的に投与されたインヒビンは、２５０μｍから３５０μｍへの卵胞成長の彼を引き起こすことによって、卵胞産生に影響を与えた。このサイズ増大は発情期から発情後期に移行中の成体で認められるものと類似している。さらに、細胞分裂は腔および基底層の顆粒膜細胞で著しかった。有糸分裂のこの向心性様式は、Ｈｉｒｓｈｆ　１ｅｌｄが成体周期動物について報告した様式と同一である。Ｈｉｒｓｈｒ　１ｅｌｄ、　Ｅｉｏｌ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　、　３４　：２２９−２３５（１９８６）。ＰＭＳＧで処理した思春前期の動物には同じ様式は認められなかった。このように未熟うｌト卵巣に対するインヒビンの添加は、成体卵胞成長と同一の卵胞発育応答をもたらす。第２ＦＳＨサージは卵胞選択にとって充分であり（成体動物）、卵胞発育は大量の外因性ＰＭＳＧ投与によって維持できる（未熟動物）が、卵巣プール中の卵胞の維持にとってはインヒビンの産出が必要であると思われる。

結論として、上記の生体内データは、インヒビンが生Ｎ＃！能の性腺内上方調節においてＦＳＨと同様に有効であることを立証している。したがって、完全に発育した卵胞を持たない雌をインヒピンで適切に処置することによって、排卵が誘発され、それによりその生殖能か増大する。さらに、インヒビンは生体内でもう１つの生殖能薬ＦＳＨとはいくらか異なる挙動を示すようであり、このことはＦＳＨに対して非応答性の、患者にインヒビンが有用であり得ることを示している。

（以下余白）ＦＩＧ、　１２５０−２９９　３５０−３９９　＞５００卵　抱　叶　イ　ズ　（ｐｍ）ＦＩＧ、２卵　胞　サ　イ　ズ（ｐｒｎ）要約書離隔乳動物の卵巣にインヒビンの有効量を投与することからなる離隔乳動物の生殖能増大法を提供する。この方法は生体内受精操作での肝移植に特に有用である。

国際調査報告 −一一一一〜−−姉−ｋ　ＰＣＴ／ＬＩＳ　９１１０００７９−１１？鳩馴１＾ −一紗、ｌｌＮ、、ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０００７９

Claims

【特許請求の範囲】

１．雌哺乳動物の卵巣にインヒビンの有効量を投与することからなる雌哺乳動物の生殖能を増大させる方法。
２．該哺乳動物がヒトである第１項の方法。
３．該投与が該卵巣中への注射による第１項の方法。
４．該インヒビンがブタまたはヒトのインヒビンＡまたはＢである第１項の方法。
５．該インヒビンがヒトのインヒビンＡである第４項の方法。
６．該有効量が約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの日量である第１項の方法。
７．さらに生殖能薬の有効量を該哺乳動物に投与することからなる第１項の方法。
８．該生殖脂薬がクエン酸クロミフェン、ヒト閉経期性腺刺激ホルモン、およびヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンからなる群から選択される第７項の方法。
９．さらに卵胞刺激ホルモンの有効量を単独で、あるいは黄体形成ホルモンまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤と組み合わせて該哺乳動物に投与することからなる第１項の方法。
１０．卵胞刺激ホルモンの日量が約７５〜２２５／１．Ｕ．であり、性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤の日量が約１．０〜４．０ｍｇ／ｋｇである第９項の方法。
１１．該生殖能薬がインヒビンと同時に投与される第７項の方法。
１２．該生殖能薬がインヒビン投与とは別個に投与される第７項の方法。
１３．インヒビン投与の後、ほぼ周期中央で、該哺乳動物の卵巣の卵胞中の卵母細胞を取り出し、精子と混合して受精させる第１項の方法。
１４．該受精が試験管内で起こる第１３項の方法。
１５．該受精が生体内で起こる第１３項の方法。
１６．医薬的に許容される担体中のインヒビンの有効量を含有する雌哺乳動物の生殖能を増大させるための医薬組成物。
１７．該インヒビンがブタまたはヒトのインヒビンＡまたはインヒビンＢである第１６項の方法。
１８．さらに生殖能薬の有効量を含有する第１６項の組成物。
１９．該生殖能薬がクエン酸クロミフェン、ヒト閉経期性腺刺激ホルモン、およびヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンからなる群から選択される第１８項の組成物。
２０．該生殖能薬が卵胞刺激ホルモンのみ、もしくは黄体形成ホルモンまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモン拮抗剤と組み合わされた卵胞刺激ホルモンである第１８項の組成物。