JPH05503701A

JPH05503701A - 雄の生殖能の増大法

Info

Publication number: JPH05503701A
Application number: JP3503344A
Authority: JP
Inventors: アティー，ケニス・エム; マザー，ジェニー・ピー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1990-01-08
Filing date: 1991-01-04
Publication date: 1993-06-17
Also published as: EP0510073A1; CA2069442A1; DE69100231T2; ES2060362T3; EP0510073B1; AU634862B2; DE69100231D1; ATE92330T1; US5166190A; WO1991010444A1; AU7150491A; DK0510073T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】雄の生殖能の増大法発明の分野本発明は、精子数の低い雄哺乳動物の生殖能を増大させる方法にインヒビンは生殖腺、下垂体、脳、骨髄、胎盤、および副腎を含む様々な組織が生産する糖タンパク質である。最初、この糖タンパク質は、下垂体による卵胞刺激ホルモン（Ｆ　Ｓ　Ｈ）の分泌を阻害する能力によって同定された。Ｄｅ　Ｊｏｎｇおよび５ｈａｒｐｅ、　Ｎａｔｕｒｅ、　２６３ニア１−７２（１９７６）　；　ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＣｈａｎｎｉｎｇ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４　：T７２１−５７２４（１９７７）。ゴナドトロピン（性腺刺激ホルモン）分泌のこのような優先的制御は極めて高い関心を集め、過去５０年の間、多くの研究室を、精巣、精子、精巣調液、精液漿、および卵巣卵胞液から種々の生物検定法を用いてこの物質を単離し特徴づけようという試みに駆り立ててきた。Ｒｉｖｅｒら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３３：１２０（１９８５）　；　Ｌｉｎｇ等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ目、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２ニア２１７（１９８５）　；　Ｆｕｋｕр■ ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　４４：５５（１９８５）。数種から特徴づけられたインヒビンの構造は、２つのジスルフィド結合したサブユニット、α鎖およびβＡ鎖またはβＢ鎖、から構成されている。

インヒピンが同定された後、卵胞液中に天然物質としてアクチビン（ａｃｔｉｖｉｎ）が存在することが明らかになった。アクチピンはラット下垂体前葉細胞によるＦＳＨ放出を刺激し得ることがわかった。

ｖａｌｅら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１ニア７ロー７７９（１９８６）　：　Ｌｉｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１　ニア７９−７８２（P ９８６）。アクチビンはイン上ビンβサブユニツト（β６サブユニツトの場合もあり、β８サブユニツトの場合もある）のホモ二量体またはへテロニ量体から構成されている。Ｖａｌｅら、　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ、　Ｈｏｒｎ、　Ｒｅｓ、　４４：　１−１−３４（１９８゜ヒト、ブタ、ウシおよびラットのアクチビン間ではβサブユニットのアミノ酸が９５〜１００％保存されている。特定の棟内のβ、サブユニットとβ８サブユニツトは約６４〜７０％相同である。アクチビンβ６ホモニ量体およびアクチビンβ８ホモニ量体（それぞれ“アクチビンＡ ″および“アクチビンＢ”）が卵胞液中で同定されており、両分子ともクローン化され、その遺伝子が発現している。Ｍａｓｏｎら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３５：９５７（１９８６）　；　ＥＰ公開番号２２２４９１（１９８７年５月２０日公開）　ＨＭａｓｏｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ。

１、　、３：１３５２−１３５８（１９８９）。βＢサブユニットの完全な配列は、５ｅｒｏｎ。

Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、標題“インヒビシー卵胞刺激ホルモン分泌の非ステロイド調節（原題：Ｉｎｈｉｂｉｎ−Ｎｏｎ−３ｔｅｒｏｉｃｌａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆＦｏｌｌｉｃｌｅ　Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　５ｅｃｒｅｔｉｏｎ）”、　Ｈ，Ｇ、　Ｂｕｒｇｅｒら共編・・Ａ、　Ｊ、　Ｍａｓｏｎら要約、第４２巻、　７７−８８頁（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８７）＋標題“ヒト・インヒビンおよびアクチビン：構造および哺乳動物細胞中での組換え発現（原題：ｌ（ｕｍａｎ　Ｉｎｈｉｂｉｎ　ａｎｄ　Ａｃｔｉｖｉｎ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｍａ＋＋ｕａａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ） ’に公表されている。

アクチビンＡおよびアクチビンＡＢは共に天然の供給源から単離されているが、アクチビンＢは現在までのところ天然の供給源からは単離されていない。アクチビンのｍＲＮＡ（βいおよびβ８サブユニツト）、生物活性および免疫活性は、未熟のうｙトおよびブタからの精巣ライジノヒ細胞によって生産されると報告されている。Ｌｅｅら、　Ｓｃ　１ｅｎｃｅ、　２４３°３９６−３９８（１９ｇ９）　；　Ｌｅｅら、５ｅｒｏｎｏ　Ｓｙｏ＋ｐｏｓｉｕｍ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、標題“精巣の分子および細胞内分易学（原題：Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｅ５ｔｉｓ）、　Ｃｏｏｋｅおよび５ｈａｒｐｅ編、第５０巻、　２１−２７頁（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８８）。アクチビンＡがＦＳＨ放出活性と共に赤血球生成刺激活性をも有することが最近発見されている。ＥＰ公開番号２１０４６１（１９８７年２月４日公開；ここではこのタンパク質はＢＵＦ−３と呼ばれている）、Ｅｔｏら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４２：１０９５−１１０３（１９８７）およびＭｕｒａｔａら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　８５　：２４３４−２４３８（１９８８）　（ここではアクチビンをＥＤＦと呼んでいる）、およびＹｕら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３３０ニア６５−７６７（１９８７）（ここではアクチビンをＦＲＰと呼んでいる）を参照のこと。これらの系では、インヒビンがアクチビンの作用と拮抗した。

卵胞または小胞調節タンパク質として知られている分子量１２゜００〜１５，０００のタンパク質が、アロマターゼ（ａｒｏｍａｔａｓｅ）レベルを阻害し、ステロイド性ホルモンとは本質的に独立して成熟卵細胞の形成を変調させ、全身性処置によって雄ラットの生殖能を減じることがわかっている。これは下垂体の性腺刺激ホルモン産出に直接的な影響を与えない。米国特許第４７３４３９８号；　Ｔｓｕｔｓｕｍｉら。

Ｆｅｒｔｉｌ　５ｔｅｒｉ１．　、４７：６８９（１９８７）　：　Ｌｅｗら、０ｂｓｔｅｔ、ａｎｄ　Ｇｖｎｅｃｏｌ、７０：１５７−１６２（１９８７）　；　ｄｉＺｅｒｅｇａら、Ｍｅｉｏｔｉｃ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ：Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｎｔｒｏｌｏｆ　Ｍｅｉｏｓｉｓ（Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｒ＋ｃ、　、　１９８８）、　２０１−２２６頁；　ｄｉＺｅｒｅｇａら、　Ｊ、　Tｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　２７：３７５−３８３（１９８７）　；　Ｍｏｎｔｚら、　Ａｍ、　Ｊ、　０ｂｓｔｅｔ、　Ｇｖｎｅモ盾戟B 、　４３６−４４１（１，９８４年２月１５日）　ＨＡｈｍａｄら、　ｔｈｅ　Ａｎａｔｏｍｉｃａｌ　Ｒｅｃｏｒｄ、　２２４：５０ｇ−５１３（ｔ９ｇ９）。ＦＲＰとも呼ばれるこのタンｉ＜り質は精製され、部分的に配列決定されており、ソータ（Ｓａｌｋ）研究者らが初期の研究てＦＲＰと呼んでいるアクチビンとして知られているＦＳＨ放出放出タンパ石質何ら関連がない。

最近、それぞれ別個の遺伝子によってコードされているインヒヒ゛ン・サブユニット（複数）の発現が、卵巣および精巣に加えて数種の組織中で立証された。インビヒンのα、βい、およびβＢｍＲＮＡ力（胎盤、下垂体、副腎、骨髄、腎臓、を髄および脳組織中で検出された。Ｍｅｕｎｉｅｒら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８５：２４７−２５１（１９８ｇ）。

インヒビン・サブユニットｍＲＮ、Ａの発現は組織特異的な様式で数倍変化し、このことはこれらのタンパク質について、その結合様式および産生部位に依存する異なる機能を示唆している。

インヒビンおよびアクチビンは成長および分化因子族（ファミリー）の構成要素である。この族の始原型はトランスフォーミング成長因子−ベータ（Ｔ　Ｇ　Ｆ −β）（Ｄｅｒｙｎｃｋら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１６：７０１−７０５（１９８５））であり、この因子は、１つの供給源によれば、ＦＳＨ放出活性を持つている。Ｙｉｎｇら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１３５　：９５０−９５６（１９８６）。

ＴＧＦ−β族の他の構成要素にはミュラー（Ｍｕｌ　Ｉｅｒｉａｎ）阻害物質、ハエ・デカペンタブレギノク（ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）複合体、およびツメガエルＶｇ−１ｍＲ，ＮＡの産物が含まれる。

ヒトでは、成長している前排卵卵胞および黄体がＦＳＨ刺激に応答してインヒビンを循環中に分泌する。ＬｅｅおよびＧｉｂｓＯｎ、　Ａｕ５ｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｎ、　Ｓｃｉ、　、　３８：１１５−１２０（１９８５）　；　ＭｃＬａｃｈｌａｎら、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４８：P００１（１９８７）。したがってインヒビン関連ペプチド類は、下垂体フィードバック回路による生殖腺機能の変調において重要な役割を果す。

う、トの精巣細胞および卵巣卵胞膜間質細抱の初代培養では、インヒビンが、黄体形成ホルモン（ＬＨ）によって刺激された男性ホルモン生合成を促進し、一方アクチビン′か男性ホルモン生産を抑制することが報告されている。Ｈｓｕｅｈら＋　Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１ｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８４°５０８２−５［１８６（１９１！７）。他の研究者たちはこれらの観察を報告することができないている。ｄｅＫｒｅｔｓｅｒおよびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｃｌｕｃｔｉｏｎ、　４Ｑ：３３−３３−４７（１９，特に４１頁。ライジノヒ細胞ステロイド産生に対するＴＧＦ−βの阻害効果についても記述されている。Ｌｉｎら、　ＢｉｏｃｈｅＩｌ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４６：３８７（１９８７）　；　ＦａｕｓｅｒおよびＨｓｕｅｈ、　Ｌｉ■■ Ｓｃｉ、　、　４３：１３８３（１９８ｇ）　；　Ａｖａｌｌｅｔら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、@、　１４６：５７５（１９８７）。顆粒膜細胞では、アクチビンがプロゲステロン生産を阻害し、ＴＧＦ−βがプロゲステロン生産を促進することが報告されている。

ＩｇｎｏｔｚおよびＭａｓｓａｇｕｅ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２６１：４３３７（１９８６）。

顆粒膜細胞の初代培養では、ＴＧＦ−βだけでなくアクチビンおよびインヒビンもホルモンの合成と分泌にそれぞれ異なる様式で影響を及ぼすことがわかった。

Ａｄａｓｈ　ｉおよびＲｅ５ｎｉｃｋ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１１９：１８７９（１９８６）　；　Ｙｉｎｇら、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１３６：９６９（P９８６）　；　Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら＋　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　、　１４８　：１４０５（１９W７）；　Ｍｏｎｄｓｃｈｅｉｎら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２３：１９７０（１９８８）　：　Ｆｅｎｇら、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　b ｈｅｍ、　、　２６１：１４１６７（１９１１１６）。これらの分子はＦＳＨ依存性の顆粒膜細胞機能に対して正負両方の効果を持つ。Ｃａｒｓｏｎら、　Ｊ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　、　８５ニア３５−３５−７４６（１９゜またＴＧＦ−β／インヒビン遺伝子族の個々の構成要素が、卵胞細胞に対する直接作用によって卵巣機能を調節するたけでなく、この族の他の構成要素の産生速度に影響を与えることによって間接的にも卵巣機能を調節することが示唆されている。Ｚｈｉｗｅｎら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、５８：１６１−１６６（１９８８）。

アクチビンＡおよびインヒビンが２つの生殖腺細胞株（セルライン）の成長に変動を与えることが報告されており、これは、これらのタンパク質が生殖腺細胞の機能だけでなく繁殖をも調節し得ることを示唆している。Ｇｏｎｚａｌｅｚ−ＭａｎｃｈｏｎおよびＶａｌｅ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２５：１６６６−１６７２（１９８９）。黄体によるインヒビンの分泌がこの周期の黄体期におけるＦＳＨＩ度を抑制し、それゆえに卵胞発育の阻害を抑制することが提案されている。Ｂａ１ｒｄら、Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、５４１：１５３−１６１（１９１１１８）。

ある総説は、インヒビンが、排卵する運命にある卵胞の数を決定する因子の少なくとも１つてあり、インヒビンの作用による干渉が生殖能の調節に寄与しているかも知れないと主張している。Ｄｅ　Ｊｏｎｇ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　６８：５５５（１９８ｇ）。多くの研究者が、下垂体のレベルでのそのＦＳＨ阻害効果ゆえに、インヒビンが雄および雌の受胎調節に有用であり得ると考えてきた。５ｈｅｔｈおよびＭｏｏｄｂｉｄｒｉ、＾ｄｖ、　Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔ、　２：１３１−１３９（１９８６）　；　Ｆｉｎｄｌａｙ、　Ｆｅｒｔｉｌ、　５ｔｅｒｉ１．　、４６：７７０（１９８６）B しかし、別の著者は、（Ｂｒｅｍｎｅｒら、　Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　、　６８：１０４４（１９８１）を引用して）インヒビンが精子形成を阻害し得ることを疑問に忌い、インヒビンは精子形成に対してなんらかの直接的刺激効果をも有するであろうと述べている。Ｂａｋｅｒら、　Ｃｌ１ｎ、　Ｒｅｐｒｏｄ、　ａｎｄ　Ｆｅｒｔ、　、　２：１１ｉ１−１７４（１９８３）。

インヒビン／アクチビン・ポリペプチドのα、β６、およびβ８サブユニツトの分布かラットの精巣で研究された。ラットの精巣てはセルトリ細胞と間質細胞の両方がインヒビン／アクチビン・サブユニットを産出し、αおよびβサブユニットが未熟ラット中の間質細胞の異なる型によって生産されることがわかった。Ｒｏｂｅｒｔｓら、　Ｅｎｄ。

ｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２５：２３５０（１９８９）。また、免疫反応性インヒビン・サブユニットが精巣中の複数の細胞に存在し、輸精上皮中の免疫染色可能なサブユニットｌが弁別的に調節されることもわかった。５ｈａｈａら。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、　１２５：１９４１（１９８９）。

アクチビンの生物活性が試験管内で間質細胞によって分泌され、一方、セルトリ細胞はインヒビンまたはインヒビンとアクチビンの混合物を分泌することか報告されている。Ｌｅｅら、５ｅｒｅｎｏ　ＳｙｍｐｏｓｉｕｍＰｕｂｌ　１ｃａｔｉｏｎｓ（前掲）中；　Ｌｅｅら＋　５ｃｉｅｎｃｅ（前掲）。

精巣で生産される多くの物質が精巣の機能を局部的に調節することが示されている。Ｍａｔｈｅｒ、“Ｍａｃｏｎａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ”（Ｊ、Ｍａｔｈｅｒ編：Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、　１９８４）、　１６７−１９３頁。インヒビンおよびアクチビンは本質的に下垂体機能のフィードバック調節因子であると見なされてきたか、精巣における作用と複数の産出部位に関する最近のデータを考慮すると、精巣機能の局部的調節因子としての役割をも果しているように思われる。

妊娠の失敗は、結婚した夫婦６粗生１組程度を医学的手当をめる気にさせる病訴である。これらの夫婦のうち少なくとも４０％が男性因子欠乏症を有することを発見するであろう。不妊男性の約６１％が、精巣生検で低精子産生を有する。これらの患者は部分的胚芽上皮不全を有し、精液過少症および正常なテストステロン・レベルを示す。その病因はしばしば特発的であるか、抗新生物薬、潜在畢丸症、あるいは精索静脈瘤に関連することがある。

雄（男性）では、精子中の未熟胚芽細胞の成熟（精子産生）か性腺刺激ホルモン（ＬＨおよび特にＦＳＨ）および男性ホルモン（テストステロン）によって調節されると考えられている。精液過少症による男性不妊症の現在の治療はこの仮定に基づいている。これらには、テストステロンまたは同化促進性男性ホルモンが誘発する無精子症からの回復の誘発：外因性の性腺刺激ホルモンまたは性腺刺激ホルモン放出ホルモンの投与：クエン酸りロミフエンまたはタモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）の使用による内因性の性腺刺激ホルモン分泌の刺激；経口合成男性ホルモン・メステロロンの低投与量の投与；およびテストラクトンなどのアロマターセ阻害剤の使用か含まれる。

これらの治療の効用を決定的に立証した研究はないが、ある報告は、統計学的に有意な効果がクエン酸りロミフエンによってのみ発揮されることを示唆している。しかしクロミツエンは婦人が高服量で使用する場合に多くの問題を育することが示されている。さらに性腺刺激ホルモンおよび男性ホルモンは、胚芽上皮に直接的に影響を及ぼすセルトリおよび／またはライジッヒ細胞因子の刺激を通して、主として間接的様式で作用するであろう。

したがって本発明の目的は、局部的投与によって精液生産の直接的刺激をもたらす生殖能薬を用いる、精液過少症の男性の生殖能を増大させる方法を提供することである。

もう１つの目的は、低精子産生を治療するための安全かつ有効な生殖能薬を提供することである。　゛この目的および他の目的は当業者に明らかになるであろう。

発明の要約本発明は、雄哺乳動物にアクチビンの有効量を投与することからなる、胚芽上皮不全を示す雄哺乳動物の生殖能を増大させる方法を提供する。

もう１つの側面として本発明は、医薬的に許容される担体中のアクチビンの有効量を含有する、胚芽上皮不全を示す雄補乳動物の生殖能を増大させるための医薬組成物を提供する。

図面の簡単な説明図１は、アクチビンＡ（Ａ、　１００Ｈｇ／ｍｌ）またはインヒビン（１゜１１００Ｈ／ｍｌ）を加えたうｙトのセルトリおよび胚芽細胞の同時培養あるいは対照（Ｃ）の処理後２４時間、４８時間よび７２時間の３Ｈ−チミジン取り込みのレベルのグラフを示す。すへての条件は培地、−５Ｆ（これはインシュリン、５ μｓ／ｍｌ；）ランスフェリン、５μｇ／ｍｌ　；　ａ−ト）フエｏ−ル、５μ ｇ／ｍｌ；　ＥＧＦ、５Ｈｇ／＋ｎｌ；およびアブロテイニン（ａｐｒｏｔｅｉｎｉｎ）、　２５ｕ　ｇ／　ｍｌである）を含有した。

図２Ａはインヒビン処理ラットのセルトリおよび胚芽細、抱の同時培養の４８時間でのＤＮＡフロー細胞計測定量を対照（５Ｆ）と比較したグラフを示す。図２Ｂはアクチビン処理と対照（５Ｆ）を比較した類似のグラフを示す。

好ましい態様の説明本明細書で使用する場合、用語“アクチビン”はインヒピンのβ鎖のホモ二量体またはへテロニ量体、プレプロ型、およびプロ型、ならびにそのグリコジル化および／またはアミノ酸配列変種を意味する。成熟タンパク質からの切断の後、その前駆体部分はその成熟タンパク質と非共有結合的に結合していてもよい。アクチビンＡとは、２つのβ６鎖を伴うアクチビンを意味する。アクチビンＡＢとは、β４鎖およびβ８鎖を伴うアクチビンを意味する。アクチビンＢは２つのβ８鎖を伴うアクチビンを意味する。

完全な単離プレプロまたはプロドメインあるいは成熟β９およびβ８の配列は、合成法および／または組換え法を含むいずれの方法でも適切に合成されるが、例えば米国特許第４７９８８８５号（１９８９年１月１７日発効）に記述されているように組換え細胞培養中で合成するのが好ましい。

ヒト以外の動物、例えばブタまたはウシ供給源、から得たアクチビンをヒトの治療に使用することは本発明の範囲に包含される。例えばブタ・アクチビンβ鎖のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列は米国特許第４７９８８８５号（前掲）の図２Ａおよび２Ｂに認められる。さらに、家畜や農場動物および動物園、スポーツまたはぺ、ト動物など、他の哺乳動物種を治療することを望む場合、ヒト・アクチビンも他の種由来のアクチビンと同様に使用に適している。

一般論として、アミノ酸配列変種は、例えば米国特許第４７９８８８５号（前掲）に記載の哺乳類β鎖配列の対応部分と本質的に相同であろう。本質的に相同とは、２つのタンパク質問のアミノ酸残基の一致数を最大化するように並べたときに、その相同ポリペプチドの一次アミノ酸配列の約６０％以上がアクチビン鎖の配列に対応することを意味する。残基の一致を最大化する並べ方には、アミノおよび／またはカルボキシル末端の移動、必要な間隙の導入、および／またはその候補配列中に挿入物として存在する残基の削除か含まれる。典型的な場合、アミノ酸配列変種は対応する天然配列に対して約７０％以上相同であろう。

配列変化を導入する部位は予め決定されるが、変異そのものを予め決定する必要はない。例えばある部位の変異の効果を最適化するために、標的フトンまたは領域で無作為変異導入を実行し、発現したアクチビン変異体を望ましい活性の最適な組み合わせについてスクリーニングすることができる。既知の配列を有するＤ　Ｎ　Ａ中の予定した部位に置換変異を作る技術はよく知られており、例えばＭ１３プライマー変異法がある。

変異導入は、通常約１から１０アミノ酸残基程度のアミノ酸挿入を行うか、あるいは約１から３０残基の削除を行うことによって実行される。置換、欠失（削除）、挿入、あるいはその同型変異の組み合わせを、さらに組み合わせて最終構築物に到達することもできる。

しかし好ましくは、置換変異導入を行う。明らかに、コード化ＤＮＡ中の変異がその配列を読み枠外に置くことになってはならず、好ましくは、二次ｍ　ＲＮ　、Ａ構造をもたらし得る相補領域を生み出さなアクチビンの共有結合修飾は本発明の範囲に包含され、これには他の化学的部分との共有結合的または会合的複合体が含まれる。共有結合誘導体は、アクチビンのアミノ酸側鎖中またはＮ−末端あるいはＣ−末端に存在する基に、当該技術分野で知られている手段で官能基を結合させることによって製造される。例えばこれらの誘導体には、カルボキシル末端もしくはカルホキフル側鎖含有残基（例：アスパラギン酸残基）の脂肪族エステルまたはアミド：アリールまたはアラニルなど、ヒドロキシル基を含有する残基の０−アシル誘導体、およびアミノ末端アミノ酸もしくはアミン基含有残基（例：リジンまたはアルギニン）のＮ−アシル誘導体；が含まれるであろう。アシル基をアルキル部分（Ｃ３からＣ１０の直鎖アルキルを含む）の群から選択すればアルカノイル種が生成し、また炭層または複素環化合物の群から選択すればアロイル種が生成する。反応性基は、それ自体は反応性側鎖基を通してタンパク質を架橋して不溶性マトリックスにする際の使用が知られている二官能性化合物（例：ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）であることが好ましい。好ましい誘導体化部位はヒスチジン残基である。

“精巣に投与する”という表現は、精巣中に注射することだけでなく、アクチビンが精巣中に吸収されるように、結果として精巣を取り巻く領域をアクチビンで満たすことになるような技術をも意味する。また、好ましくは顕微鏡操作法を用いて、精巣に注ぐ管中にアクチビンを注射することもできる。さらに、アクチビンをインブラント（埋メ込み材）中に入れて精巣付近に置き、これを通して精巣にアクチビンを吸収させることもできる。例には、精巣内憂時間作用デボー製剤（例・微小球）または徐放性インブラントが含まれる。精巣への局部的なアクチビンの適用をもたらし、その結果が本明細書に述べる目的にとって有効である限り、他の技術も使用できる。

“胚芽上皮不全”という表現は、例えば精巣生検分析で決定した場合にいくつかの精祖幹細胞か存在するという条件下で、完全な胚芽上皮不全または部分的な胚芽上皮不全として特徴づけ得る雄哺乳動物の障害を意味する。このような障害の例には、いくつかの精祖幹細胞を有する患者に認められる無精子症ならびに部分的胚芽上皮不全と特徴づけられるものか含まれる。完全な不全症は高い基礎ＦＳＨレベルを伴う。

“部分的胚芽上皮不全”という表現は、精液過少症と無傷のライジノヒ細胞ステロイド産生能および下垂体細胞を示す哺乳動物の障害を意味する。このような雄は正常なテストステロン・レベルを有するが、精子数が少ない。はとんどの臨床医は、充分な体積、運動性および形態を有する精子密度が２子方７ｍＩ未満である時に、これが低精子数を示すと考える。精子の形態はもう１つの指標であり、異常精子率が４０％より高い場合には低精子数が明白であるという示唆を伴う。

部分的胚芽上皮不全として特徴づけられる障害は、アルコールおよび不法薬剤ならびに化学物質または化学療法薬およびサルファ抗生物質などの薬剤によってもらたされ得る。その他の考え得る原因には、遺伝的障害、生殖路感染、および精索静脈瘤が含まれる。不妊症男性の最大の群は、明白な病因の無い特発性精液過少症の範嗜に入る。生殖能の増大の必要性は一般に一次性精巣障害（即ち、視床下部または下垂体レベルではない）に起因する。

本発明は、アクチビンを使用して、ヒトだけでなく、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウマ、サル、およびヒツジなどのスポーツ動物、動物園動物、ベット動物および農場動物を含む、上述の患者集団に含まれる雄浦乳動物の生殖能を増大させることに関する。障害が部分的胚芽上皮不全であることが好ましい。

非経口、舌下、畢丸内、肺内、および鼻腔内投与を含む適切な技術のいずれかによって、アクチビンを哺乳動物に投与する。特定の投与経路は、例えばその、患者の医学的経緯などに依存するであろう。

非経口投与の例には、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、および腹腔的投与が含まれる。上述のように、アクチビンを精巣経路で投与することが好ましい。

この療法に使用すべきアクチビン組成物は製剤化され、個々の患者の臨床的状況、アクチビン組成物の送達部位、投与法、投与計画、および医師の知る他の因子を考慮のうえ、良い医療に適合する方法で投与されるであろう。したがって、本発明のための“有効量”は、このような考慮の上に決定される。

一般的提案として、投与１回あたりに投与されるアクチビンの総医薬的有効量は患者の体重の約１μｇ／ｋｇ／Ｅ〜ＬｏＩＱｇ／ｋｇ／日の範囲になるであろうが、上述のように、これは大いに治療的裁量の対象となるであろう。この投与量は約１０μｇ　／　ｋｇ／　ＥＩを越えないことが好ましい。適切な投与量を選択する際に不可欠な因子は、しよう液分析または積み細胞数による精子密度の増大か、もしくは医師が適当と見なす池の規準（例：生検）によって測定して得られる結果である。

投与のために、一般的には望ましい純度のアクチビンを、医薬的に許容される担体（即ち、使用する投与量および［において受容者に対して非毒性であり、その製剤中の他の成分と適合し得るもの）と混合することによって単位注射可能剤形（溶液剤、懸濁剤、または乳剤）に製剤化する。例えば本製剤は酸化剤およびポリペプチドにとって有害であることが知られている他の化合物を含まないことが好ましい。

一般に、アクチビンを均一かつ密接に液体担体または微細に分割した固体担体あるいはその両方と接触させることによって本製剤を調製する。次に、必要ならばその生産物を望ましい製剤に成形する。

担体は非経口用担体であることが好ましく、より好ましくは受容者の血液と等張な溶液である。このような担体賦形剤の例には水、食塩水、リンゲル溶液、およびデキストロース溶液が含まれる。不揮発性油およびオレイン酸エチルなどの非水性賦形剤もリポソームと共に本発明に有用である。

担体は等優性や化学的安定性を増大させる物質など、少量の添加物を含有することが適切である。このような物質は使用する投与量および濃度において受容者に対して非毒性であり、これらにはリン酸塩、硝酸塩、および他の有機酸塩などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化剤、低分子Ｉｔ（約１０残基未満）のポリペプチド（例：ポリアル牛ニンまたはトリペプチド類）；血清アルブミン、セラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、あるいはアルギニンなどのアミノ酸類；セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノース、デキストリンを含む単糖、三糖、および他の炭水化物、ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール：ナトリウムイオンなどの対イオン、および／またはツイーン（丁ｗｅｅｎ）、プルロニクス（ＰｌｕｒｏｎｉｃＳ）、またはＰＥＧなどの非イオン性界面活性剤が含まれる。

典型的には、このような賦形剤中にアクチビンを約０．１ｍｇ／ｎ１〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で生理学的ｐＨで製剤化する。上記の添加剤、担体、または安定化剤のうち、あるものの使用がアクチビン塩の形成をもたらすことは理解されるであろう。

治療的投与に使用するアクチビンは滅菌状態でなければならない。

滅菌状態は滅菌濾過膜（例：Ｑ、２ミクロン膜）を通して濾過することによって容易に達成される。

一般的には治療用アクチピン組成物を滅菌注入口の付いた容器（例えば皮下用注射針で突き刺せる蓋のついたバイアル）中に入れる。

通常は、アクチビンを、単位または複数投与量容器（例えば、封印したアンプルまたはバイアル）中に、溶液剤として、あるいは再構成用凍結乾燥製剤として保存するであろう。凍結乾燥製剤の例として、滅ｍａ過した１％（、／Ｖ）アクチビン水溶液５ｍｌをｌｏｍＩバイアルに入れ、得られた混合物を凍結乾燥する。

５ｍｌの滅菌水またはリンゲル溶液を用いてこの凍結乾燥アクチビンを再構成することによって注入溶液剤を調製する。

アクチビンを徐放系で投与することも適切である。徐放性組成物の適切な例には、成形物（例：フィルムまたはマイクロカプセル）の形態の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリラクチド類（米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルーＬ−グルタメートの共重合体（Ｕ、　５ｉｄＩＩｌａｎら、　Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、　２２．５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレートＸＲ，Ｌａｎｇｅｒら、　Ｊ、　Ｂｉｏｔｎｅｄ、　Ｍａｔｅｒ、　Ｒｅｓ、　、　１５：１６７−２７７（１９８１）およびＲ，Ｌａｎｇｅｒら、　Ｃｈｅｗ、　Ｔｅｃｈ、　、　１２：９８−１０５（１！１ｇ２））、エチレンビニルアセテ−）　（Ｒ，Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３− ヒドロキシラフ酸（ＥＰｌ、３３９８８）が含まれる。徐放性アクチビン組成物には、リポソームに封入したアクチビンも含まれる。

アクチピンを含有するリポソームは、それ自体は既知の方法：ＤＥ３２１８１２１　；　Ｅｐｓｔｅｉｎら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ｔ＋、　ｓ、　Ａ、　、　８２　：３６W８− ３８９２（１９８５）　；　Ｈｗａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　７７　：４０３O−４０３４（１９８０）　；　ＥＰ５２３２２　：　ＥＰ３６６７６　；　ＥＰ８８０４６　；　ＥＰ１４３９４９　；　ＥＰ１４２６４１　；日本特許出願８３−１１８００８　、米国特許第４４８５０４５号および同第４５４４５４５号、およびＥＰ１０２３２４　；によって製造される。通常は、これらのリポソームは、約３０モル％コレステロールより高い脂質含量（選択する比率は最適なアクチビン療法のために調節する）の小さい（約２００〜８００オングストローム）半模型のリポソームである。

アクチビン療法を他の提案された生殖化増大療法あるいは従来の生殖化増大療法と組み合わせることも適切である。例えばアクチビンを、胚芽細胞の増殖および分化を刺激するために使用される他の生殖能薬と共に投与することかできる。

他の療法または薬剤の例には、テストステロンまたは同化促進性男性ホルモンが誘発する無精子症からの回復の誘発；ヒト絨毛膜性＆’Ｈ１１１ホルモン（ｈＣＧ）、ヒト閉経期性腺刺激ホルモン（ｈＭＧ）、精製ＦＳＨ，または性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）などの外因性の性腺刺激ホルモンまたは性腺刺激ホルモン放出因子の投与か含まれる。別法として、内因性の性腺刺激ホルモン分泌を刺激するためにクエン酸りロミフエンまたはタモキノフェンをアクチビンと連係させて使用してもよい。さらに、経口合成男性ホルモンであるメステロロンあるいはテストラクトンなどのアロマターゼ阻害剤の低投与量を投与してもよい。

インヒビンと生殖能薬は、例えば投薬、患者の臨床的状況などに応じて、同時にあるいは異なる時間に、別の投与経路あるいは同じ投与経路で、別の手段あるいは同じ手段で、適切に送達される。このような生殖能薬かアクチビン組成物そのものに含まれる必要はないが、これらの薬剤を同じ投与経路で送達する場合にはこれが便利であろう。

アクチビンと一緒に使用する場合、典型的にはこのような薬剤を単独で使用する場合より少ない投与量で使用する。ｈＣＧを用いる場合、その有効量はテストステロンレベルが成体雄範囲になるまで週２回１５００〜２０００１．Ｕ、であることが好ましい。この時点で、１日置きに約１アンプルの投与量のｈＭＧをも投与する。クエン酸りロミフェン療法を使用する場合は、その処置は典型的には毎日２５ｍｇのクエン酸りロミフェンを２１〜２５日間であり、その後５〜７日間の休止期間をとる。この周期を一般的には少なくとも２４週間繰り返す。

典型的な混合組成物は、上記の量のアクチビンと約２５ｍｇのクエン酸りロミフェンを、乳酸化リンゲル溶液などの適切な腹腔内液中に含有するであろう。

次の実施例を参照することによって、本発明はより完全に理解されるであろう。

しかし、以下の記述が本発明の範囲を限定するものと見なすべきてはない。

実施例１２００日置雄スプラグードーリ−・ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　ｔｎｃ、　、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、　ＭＡ）から得たセルトリ細胞および胚芽細胞を血清非含培地中で同時培養した。培養は、￥ａｔｈｅｒおよびＰｈ１ｌｌｉｐｓら、　”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｒ　Ｃｅ１ｌｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｙｓｔｅｍ’　（Ｂａｒｎｅｓおよび５ａｔｏ＆ｉｉ：Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８４）。

２９−４５頁およびＲｉｃｈら、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　、　１１３：２２８４−２２９３（１９８３）に記述されているグリシン／コラ−ゲナーゼ法に従って調製した。

簡潔に述べると、精巣を取り出し、被膜剥離し、細管を高浸透性グリシン溶液中で引き離した。細管を等浸透圧培地に戻すと、細管を傷つけることなく間質組織の溶解が起こる。次に細管をより小さい断片に粉砕し、コラ−ゲナーゼ／ディスバー上（ｄｉｓｐａｓｅ）て酵素的に処理することによって基底膜および細管周囲細胞を除去した。

細管周囲細胞を捨て、セルトリ細胞および精祖細胞および積み細胞を含有する１〜５ｍｍ長の細管断片を、ＨＥＰＥＳおよびインシュリン、５μｇ／ｍｌ＋）ランスフェリン、５μｇ／ｍｌ；α−トコフェロール。

５μｇ／ａ＋Ｉ；上皮成長因子（Ｅ　Ｇ　Ｆ　）、　５　ｎｇ／ｍｌ　；およびアブロテイニン、２５μｇ／の１（５Ｆ）を補足した血清非含ハムＦ　１２／ＤＭＥ培地ｆｌａｗ’ｓ　Ｆ１２／ＤＥｊ　ｍｅｄｉｕｍ）に接種した。２０〜２４時間後、セルトリ細胞がその基質に付着し、広がって単層を形成した。積み細胞が、この単層に単一細胞または２細胞の群として付着しているか、もしくは付着せずに培地中に浮遊しているところを見ることができた。

接種の２４時間後に培地を交換し、付着していない細胞を捨てた。

新鮮な５Ｆ培地をすべての培養に加え、１１００ｎ／ＩＩＩ＋のヒト組換えインヒビンＡまたはアクチビンＡ（米国特許第４７９８８８５号（１９８９年１月１７日発効）に記述されているように製造し、精製したもの）をこの実験条件に追加した。すべての条件を３連て検定し、全実験を複数回（〉１０回）繰り返した。

処理の２４時間と４８時間の間に、数の増大した一次精母細胞と精粗細胞のクラスターがアクチビン処理ウェルに現れた。これらの細胞は、セルトリ細胞単層に付着した８〜３２細胞の連結したクラスターおよび懸濁した大きい細胞として見える。このような効果はインヒビンでは見られなかった。

それぞれのウェルは２百万細胞を含んでいた。アクチビンまたはインヒビン処理の２４．４８、または７２時間後に、合計１μＣｉの３Ｈ−チミジンを各ウェルに加えた。

３Ｈ−チミジンと共に２０時間インキュベートした後、細胞への標識の取り込みを測定した。１ｍｌｍｌピペットマンピペッターで激しくピペッティングすることによって細胞をその基質から脱離させ、ウェルの全内容物を、２つのガラス繊維フィルターと冷２０％トリクロロ酢酸５Ｉｌ１１を含有する１０ｍ１フイルターウエルに移した。沈殿した細胞をフィルター上に捕捉し、冷５％トリクロロ酢酸で２回洗浄することにより、取り込まれていない３Ｈ−チミジンを除去した。

フィルターを冷メタノールで１回洗浄し、水性試料に適したシンチレーション液中で計数した。

その結果を図１に示す。取り込みは、非処理対照またはインヒビン処理ウェルと比べて、すへての場合にアクチビン処理つェル中の方か高かった。培養４８時間において、対照（４５１５±５９７）およびインヒビン処理培養（５３５５＝４６６）に関して、アクチビンは最も高い取り込み（１１０４０ｃｐｍ±１５７２ＳＥＭ）にあった。このようにアクチビンは積み細胞の増殖を増大させる。

胚芽細胞分化に対するインヒビンおよびアクチビンの効果をフロー細胞計測分析で定量した。セルトリ細胞をナイルレッド（細胞内脂質小滴のための選択的蛍光染色）で染色し、染色しない胚芽細胞を電気的に制御した。Ｄ　Ｎ　Ａ特異的蛍光色素（ヘキスＩ−（Ｈｏｅｃｈｓｔ）　３３３４２）を用いてＮ、２Ｎまたは４ＮＤＮＡ含量を有する胚芽細胞の百分率を決定した。４Ｎを伴うものは一次精母細胞である。図２Ａおよび２Ｂかられかるように、４８時間で、アクチビン処理培養では対照またはインヒビン処理培養と比較して４Ｎ胚芽細胞の百分率がかなり増大した。

結論として、アクチビンは２０日齢ラットの精巣胚芽細胞の増殖および分化をインビトロで刺激し、これがこの雄の生殖能を増大させるであろうことを示す。またこのデータは、胚芽細胞にとって有糸分裂促進性であるアクチビンの、例えば精巣内デポ−刑法による局部的投与が、性腺刺激ホルモン分泌の変化とは独立した（あるいはある場合にはこれと協奏した）精子生産の直接的性腺刺激を引き起こすであろうことを示している。

（以下余白）２４時間　４８時間　７２時間Ｃ＝対照要約書雄哺乳動物にアクチビンの有効量を投与することからなる、胚芽上皮不全を示す雄哺乳動物の生殖能を増大させる方法を提供する。

該投与を該哺乳動物の精巣に対して行うことが好ましい。

国際調査報告 ’ＩＩ’１−−”Ｉ’　”Ｉｋ”””＝　ＰＣＴ／Ｕｓ９１１０００７４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．アクチビンの有効量を雄哺乳動物に投与することからなる、胚芽上皮不全を示す雄哺乳動物の生殖能を増大させる方法。
２．該アクチビンがプタまたはヒトのアクチビンＡ、アクチビンＡＢ、またはアクチビンＢである第１項の方法。
３．該アクチビンがヒトのアクチビンＡである第２項の方法。
４．該投与が精巣に対して行われる第１項の方法。
５．該投与が精巣中への注射による第４項の方法。
６．該哺乳動物がヒトである第１項の方法。
７．該有効量が約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの日量である第１項の方法。
８．該胚芽上皮不全が部分的胚芽上皮不全である第１項の方法。
９．医薬的に許容される担体中にアクチビンの有効量を含有する、胚芽上皮不全を示す雄哺乳動物の生殖能を増大させるための医薬組成物。
１０．該アクチビンがプクまたはヒトのアクチビンＡ、アクチビンＡＢ、またはアクチビンＢである第９項の組成物。
１１．ヒトのアクチビンＡを含有する第１０項の組成物。
１２．該担体が滅菌水、緩衝液、またはリンゲル溶液である第９項の組成物。