JPH05503777A - 円二色性及び分光光度吸収検出法及びその装置 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 この発明は臨床化学検出方法における円二色性（ｃｉｒｃｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒ ｏｉｓｍ）及び吸収検出の使用に関する。より詳細には、臨床サンプルにおける コレステロール測定及びコレステロールサブ分画測定、及び、同化ステロイドや 他のステロイド生成物の検出、血清試験サンプルにおけるリポ蛋白質のレベルの 測定における使用に関する。この発明はまた上記の化学的な方法のそれぞれにお いて効果的な一定のＣＤや吸収装置を提供するものである。

発明の背景 分光光度吸収は試験化合物溶液を通した入射光の吸収あるいは透過率の測定に関 するものである。典型的には、関心のある化合物は特徴のある吸収スペクトルを 有し、特定の波長の光を透過あるいは吸収し、これを使用することにより、試験 サンプル内にこの化合物が存在することを決定することができる。分光光度吸収 のために設計された機器は、発光波長がわかっており調節することのできる光源 と、透過した光の希望の波長に感応する１つ以上の検出器を備えている。分光光 度吸収は試験サンプル中に存在するある化合物を定量するするために使用される 。

円二色性は特別な型の吸収方法であり、化合物の分子組成は特定の波長において だけでなく特別の偏光状態でも入射光の示差吸収という結果となる。円二色性は 、異なる鏡像異性体、即ち、１．つ以上の不斉炭素原子（キラルの）中心を有す る光学異性体間の区別をすることができるチルオプティカル（ｃｉ　ｉ　ｒｏｐ 　ｔ　ｉ　ｃａ　ｌ）方法である。ＣＤを利用する場合、一般にサンプルに、− 斉に進む光の２つの円偏光されたビームがあてられる。ビームは両方共同時にサ ンプルを通過し、吸収される。サンプルが光学的に活性化すると、ビームは異な る程度に吸収される。ビームの吸収における差はＣＤスペクトルとして入射光ビ ームの波長の関数として表示される。光学的に不活性な吸収物に対しては、吸収 における差異が観察されず、そのためこれらの化合物はＣＤ検出システムでは検 出されない。

手光学方法としてＣＤを使用するものは、科学文献（１）に詳細に記されている 。

ＣＤ方法を初期に適用したものは、最初分子構造の解明を扱ったものであり、特 に、絶対立体化学を確認したり確立することのできる技術が重大な自然生成物の 解明を扱ったものである。しかしながら、伝える所によると、ＣＤはまた血液血 漿内の複合していないビリルビンを定量するための臨床方法において使用されて きた。開示された方法においては、複合体はビリルビン分析のためのＣＤプロー ブとしてビリルビンと人間の血清アルブミン間で形成された。

円二色性の臨床への適用はまた、参考文献中に示されている、アナリティカル　 ケミストリポ、Ｖｏ１．６１．Ｎｏ、２においてネイル　パーノイ及びキャシイ Ａ、により議論されている。コレステロールレベルの測定及び同化ステロイドの 検出を含む、ＣＤの可能な臨床における適用が開示されている。しかしながら、 そのような試験を実行するために適した化学試薬は開示されていない。

コレステロールレベルを測定するためにこの明細書で開示されている分光光度吸 収あるいはＣＤ法及び装置の使用に関しては、一般の人々は慎重に血清コレステ ロールレベルを知り、制限の無い食事や運動不足がアテローム性動脈硬化や冠状 動脈心臓病の危険性が増加する動脈斑の蓄積につながることもあることを常に思 い出しておくように絶えず忠告されることに注意すべきである。統計学的な研究 により、年齢、性、遺伝、煙草やアルコール消費量などの他の危険因子もまた、 危険について患者に助言する際には考慮しなければならないことが示されている 。

一般大衆をスクリーニングするためのプログラムは非常に重要なので、コレステ ロール定量をする自動的な方法が必要である。現在使用されているこれらの試験 は、複雑さにおいて、様々な溶解分子種の中のコレステロールの分布が決定され る精巧な脂質プロファイル試験に対する、ペーパー軸上での色感応反応を使用し た、ディツプスティックアプローチとは異なる。ディツブステインクは予備的な 定性試験にすぎず、これに基づき、より詳細でより定量的な測定に対する決定を することができる。

健康の危険因子が血清コレステロールのレベル増加とどのように関連しているか についての現在の広範囲にわたる研究の結論として、全国コレステロール教育プ ログラム（ＬＳＰ）によって報告（６）が準備され、そのなかでは、危険の大き さは総コレステロール（ＴＣ）の３つの範囲と相関があることが示されている： ２００ｍｇ／ｄＬより小さければ危険性は低い；　２００−２３９ｍｇ／ｄＬＮ Ｏ範囲では危険性は限界に近い：２００ｍｇ／ｄＬより大きければ危険性は高い 。−人の特定の個人をこれらの範鴎の１つか２つの中に入れるために、必要なこ とは血清ＴＣ測定だけである。他の危険因子（３，４）はその後、更に患者に助 言するための基礎として付は加えられる。この相対的に簡単なアプローチは、相 対的な危険がＴＣの５に等しい高密度リポたんばくコレステロール（ＨＤＬ−Ｃ ）に対する比を使用して確立された初期の忠告（３，７）と取って代わっている 。５より小さい比５は高レベルのＨＤＬ−Ｃと低い相対危険度を含む。この診断 のために、ＨＤＬ−Ｃが第２の独立試験で測定される。

同じ報告（６）で、人間の血清参照標準に存在するＴＣの量を定量する際に多く の臨床研究所でなされた測定では、重大な精度の悪さが存在したことが急いで付 は加えられた。

統計学的には、結果から、１５００の研究所からのデータにおいて、４７％が± ５％の分散係数（ＣＶ）内で真実の値を測定することができず、１８％が±１０ ％で測定することがてきなかいことが示された。結論として、ＬＳＰは１９９２ までに、ＴＣに対して±３％内にＣｖを改善すべきあると勧告した。最近の調査 では、公認の研究所が、現在の臨床方法や機器を使用してその挑戦を満たしてい る途中であることが示差される。ＬＳＰは、様々な脂質やリポたんばく中のコレ ステロールの分布の決定と関連した間違いを報告していないが、評価が将来なさ れるだろうと示唆した。血清あるいは血漿ＨＤＬ−Ｃの測定における技術の未熟 さと信頼性の欠如が３つの最近の刊行物で流暢に記述されており（７，９，１０ ）、その中で３８％もの研究所間のＣＶが報告された。２０００以上の研究所に よるＨＤＬ、−Ｃに対し同じサンプルの測定をするアメリカの病理学者の大学に よる１９８７年の評価では、３分の１以上が参昭値と５％以上の大きさで異なる ことが示された。同じ方法を用いたグループ内での研究所間のＣＶは１６５％に 改善されが、依然とし精度が悪いので、臨床値を予想することはできない。こう いう理由で、ＴＣ：ＨＤＬ−Ｃ比は、真実の臨床写真を定義する際に好都合であ るにもかかわらず、危険度評価にもはや使用されない。

現在使用されている脂質プロファイル研究に関しては、コレステロールは血清中 に主に高密覚リポたんば＜　（ＨＤＬ−Ｃ）及び低密度リポたんば＜　（ＬＤＬ −Ｃ）分画、非常に低い密度のリポたんばくコレステロール（ＶＬＤＬ−Ｃ）分 画としてトリグリセリドと結合して分散している。多くの長期に渡る臨床試験か ら、高い割合のＨＤＬ−Ｃ及び低い割合のＬＤＬ−Ｃは相対的に低い危険度（３ ゜４）に結合する、あるいは簡単に言うと、高いレベルのＬＤＬ−Ｃはできる限 り避けるべきであることを保証する多くの統計学的な証拠がある。ＨＤＬ−Ｃは そのレベルが過度に低くなければ、３０ｍｇ／ｄＬより小さくなければ（７）、 有益である。ＶＬＤＬ−Ｃコレステロールはどのような危険決定にも関係してい ないが、高いトリグリセリド自身は重大な問題になりつる。典型的な脂質プロフ ァイル研究においては、総及びＨＤＬ−Ｃコレステロールが直接測定される。Ｖ ＬＤＬ−Ｃは、別の分析で直接測定されるトリグリセリドの固定分画（例えば０ ．２）であると考えられる。ＬＤＬ−Ｃはこれらの数値から計算され、直接測定 されない。３つの独立した測定のそれぞれにおける誤差の広がりにより、ＬＤＬ −Ｃは、心臓血管の危険の最も重要な面かもしれないが、全体の精度が最も低い 分画とされる。このため、ＬＤＬ−Ｃ減少治療において臨床が発展してきたこと を検討し、保証することは困難である。

同化ステロイド及び他のステロイド生成物を検出するためのＣＤ方法を使用する ことに関しては、ケトステロイドは直接ＣＤ検出に従うことが開示されている。

いくつかの同化ステロイドはまた識別されるＣＤスペクトル（１■）を示すこと が示されている。

発明の概要 この発明の目的は臨床サンプル中のいくつかの特別のリポたんばくサブ分画と結 合して存在するコレステロールを直接測定するための分光測光法を提供するもの である。これらの分光測光法はＣＤと従来の吸収分光測光法の両方を、別々にあ るいは結合して、含むものである。ＣＤ方法により、同化ステロイドあるいは池 のステロイド生成物も測定することができる。

この発明の他の目的は臨床試験サンプルにおけるコレステロールレベルを測定す る方法を提供するものであり、この方法においては、ＣＤあるいは分光光度吸収 を使用して、結合されたＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃレベルが直接定量され、ある いはＬＤＬ−ＣＳＶＬＤＬ−Ｃレベルが別々に直接定量することができる。更に 、この発明の目的は試験サンプル中のＬＤＬ−Ｃ，ＶＬＤＬ−Ｃ１結合ＬＤＬ− Ｃ十■Ｌ　Ｄ　Ｌ　−Ｃ、ＨＤ　Ｌ　−Ｃレベルがすべて直接、希望があれば同 時に、定量できる方法を提供するものである。更にこの発明の目的は、同一の反 応条件を使用して、ＣＤ吸収によるコレステロールサブ分画の直接測定と分光光 度吸収によるＴＣの直接測定を結合させることである。また、この発明の目的は このような検出方法を実行するための新規の装置を提供することである。

この発明の他の目的は異なるコレステロールサブ分画と結合されたリポたんばく の存在を検出するための方法と装置を提供するものである。

従って、本発明は、試験サンプル中のコレステロール、リポたんばく、同化ステ ロイドあるいは他のステロイド生成物との反応生成物を形成し、その後以下の（ ａ）、（ａｏ）、（ａ”）の段階を経ることよって、血清試験サンプル中のコレ ステロール、リポたんばく、同化ステロイドあるいは他のステロイド生成物の定 量をするための臨床方法を提供する・ 段階（ａ）は１５０から７００ｎｍ（好ましくは約２４０ｎｍから６２５ｎｍ） の範囲に渡って、ＣＤ及び／又は試験サンプルの吸収を決定する： 段階（ａ“）は１５０から７００ｎｍ（好ましくは約２４０ｎｍから６２５ｎｍ ）の範囲内の１つ或いはそれ以上の別個の波長で試験サンプルのＣＤ吸収を決定 する・ 段階（ａ、”）は４００から７００ｎｍ　（好ましくは約４５０ｎｍから６２５ ｎｍ）の範囲内の１つ或いはそれ以上の別個の波長で試験サンプルの分光光度吸 収スペクトルを決定する。

本発明は更に、この発明の方法を実行するための装置を提供する。以下にこの装 置の例を示すが、これに限られるものではない。

試験サンプル中に存在するＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−ＣＳＨＤＬ−Ｃ１総コレステ ロール（ＴＣ）を定量するための検出機器であり、第１あるいは第１と第２の波 長でのＣＤ吸収によりサンプル内に存在するＨ　Ｄ　Ｌ−Ｃを定量する手段と、 第３の波長でのＣＤ吸収によりサンプル内のＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃを定量す る手段と、第３の波長での分光光度吸収によりサンプル中のＴＣを定量するだめ の手段と、あるいは代わりに、サンプル中のＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ，ＨＤＬ −Ｃに対して得た値を基に計算によりサンプル中のＴＣの量をめる手段とを備え たものである。

サンプル中に存在するＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ，ＨＤＬ−Ｃ。

総コレステロール（ＴＣ）を定量するための検出機器であり、第１の波長での分 光光度吸収によりサンプル中のＴＣを定量するための手段と、第１の波長でのＣ Ｄ吸収によりサンプル内のＶ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃを定量する手段と 、サンプル中のＶＬＤＬ−Ｃ十ＬＤＬ−Ｃ，ＴＣに対して得た値を基に計算によ りサンプル中のＨＤＬ−Ｃの量をめる手段とを備えたものである。

試験サンプル中に存在する総コレステロール（ＴＣ）と、結合したＶＬＤＬ−Ｃ 十ＬＤＬ−Ｃ，ＨＤＬ−Ｃを定１するための分光光度吸収機器機器であり、第１ の波長でサンプル中のＴＣの量を直接定量するための分光光度吸収手段と、第２ の波長でサンプル中のＨＤ　Ｌ　−Ｃの量を直接定量するための分光光度吸収手 段と、ＴＣ及びＨＤＬ−Ｃに対して得た値を使用して計算により結合されたＬＤ Ｌ−Ｃ１ＶＬＤＬ−Ｃを定量するだめの手段と、試験サンプル中のＶＬＤＬ−Ｃ の量を直接定量するための随意に設けられた分光光度吸収手段とから成るもので ある。

下記の用語の解説は、この明細書の中て使用されているある用語や略語の使用に 関して存在するかもしれない曖昧さを取り除くためのものである。

この明細書で使用される“ＣＤ機器”という語は、円二色性機器を意味する。こ のような機器は市販のものを購入するかあるいは市販の部品から組み立てること ができる。更に、図６はこれに添えられた、ＣＤがどのように作動するかを簡単 に図示したものである。

図６に示されるように、光源（ＬＳ）からの光は直線型の偏光子で直線偏光され 、その後円形の偏光子（Ｑ）により逆方向に円偏光され、試料セル（Ｓ）を通し 、その後検出器（Ｄ）により吸光度が測定され、差が測定され、ＣＤスペクトル を生成するために波長の関数としてプロットされるか、あるいは、代わりに前も って選んだ波長で記録することもてきる。

この中で使用される“ＬＤＬコレステロール”　（略してＬＤＬ、−Ｃ）は、低 密度のリポたんばくコレステロールを意味する。”ＨＤＬコレステロール”　（ 略してＨＤＬ−Ｃ）は高密度のリポたんばくコレステロールを意味する。”ＶＬ ＤＬコレステロール”　（略してＶ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　−Ｃ）は非常に低密度のリポ たんばくコレステロールを、０総コレステロール”　（略してＴＣ）は試験サン プル中のコレステロールサブ分画の総Ｉ、すなわち、ＴＣ＝ＨＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ −Ｃ１意味する。”コレステロールサブ分画°はＨＤＬ−Ｃ，ＬＤＬ−Ｃ１ＶＬ ＤＬ−Ｃに対応する。

この中で使用される“同化ステロイド１はテストステロン、その１．７−ニビマ ー、デヒドロテストステロン、１７−アルキルテストステロン、ノルテストステ ロン、メスタノロン、メタントリオールなどのステロイドを意味する。”ステロ イド生成物”は１７のケトステロイド、アドレナルコルチコイドなどの他のステ ロイドを意味する。

“リポたんばく”は人間の血漿中にみられる脂質とタンパク質の高分子複合体を 意味する。このようなリポたんば（の例としては、低密度リポたんば（、非常に 高密度のリポたんばく、中間の密度のリポたんばく、ＬＰリポたんばく、カイロ ミクロン、アポリポたんぼ＜　（、’、−１，、へ−１，１，８−４８，Ｂ−１ ００，Ｃ，Ｄ、　Ｅなど）、などがある。

“チュガーエフ反応生成物”は、コレステロール、同化ステロイドあるいはステ ロイド生成物あるいはりボタンバクの、氷酢酸と９８％塩化アセチル中ての、２ ０％ｗ／ｖＺｎｃ１２などのチュガーエフ反応物質による反応生成物などを意味 する。本発明のチュカーエフ反応生成物を形成するために利用される”チュガー エフ反応”は、文献（１２）に開示され、光学的に活性な有色反応生成物を形成 するためにはステロイドの脱水とＢ−環の開環を含むことが示唆される。

”試験サンプル′、”臨床試験サンプル”あるいは”血清試験サンプル”は、全 血試験サシプルあるいは遠心力または適当なろ過メカニズム、これらの手段は両 方ともその技術の熟練者にはよく知られている、を用いて除去された細胞体を有 する全血試験サンプルを示す。

”ビリルビン複合体”は、約ｐＨ５，０−５，１での、ヒリルビンと血清リポた んばく、アポリポたんばくあるいはたんばく間てみられる複合体を意味する。複 合体はコレステロールサブ分画と結合された、リポタンパクあるいはアポリポた んばくを使って形成されたものが好ましい。

”分光光度吸収”は、光の偏光の状態に関係なく、特定の波長での有色化合物に よる入射光の吸収（あるいは、逆に透過）の測定を示す。

”アルカリ金属硫酸塩”は硫酸ナトリウム、硫酸リチウム、硫酸カリウムなどを 意味し、硫酸塩はアルカリ金属と共に形成される。

”アルカリ土類金属硫酸塩”は硫酸カルシウム、硫酸バリウムなどを意味し、硫 酸塩はアルカリ土類金属と共に形成される。

“遷移金属硫酸塩”は硫酸スカンジウム、硫酸チタン、硫酸クロム、硫酸マンガ ン、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛、硫酸銅、硫酸カドミウムなどを意味し、硫酸塩は 遷移金属と共に形成される。

“アルカリ金属過塩素酸塩”は過塩素酸ナトリウム、過塩素酸リチウム、過塩素 酸カリウムなどを意味し、過塩素酸塩はアルカリ金属と共に形成される。

図面の簡単な説明 本発明は以下の詳細な説明及び添付図面により、より理解し易くなるであろう。

図面は実例として添付されただけてあり、本発明を限定するものではない。

図１はコレステロールとのチュガーエフ反応物質の反応から得られた、光学活性 有色生成物に対する全ＣＤスペクトルである。曲線（ａ、）は総コレステロール を示し、陰をつけた領域はＬＤＬ沈降試薬を添加した後のスペクトルであり、こ のため、ＨＤＬ分画のみを示すものである。

図２は従来技術工程を使用した２つの異なる研究所（研究所ＡとＢ）により処理 された血清サンプル中で測定された総コレステロールと、本発明（この研究所） の方法により測定した総コレステロールとの間の相関を示す：ｙ＝−１０．２０ ９＋１．００５５ｘ、Ｒ２＝０．８３５゜ 図３（、へ）は本発明の方法（この研究所）を使用したＴＣ対（ＶＬ＋ＬＤＬ） −Ｃのグラフである：ｙ＝５．０５５４＋０．８４６９３ｘ、Ｒ−２＝０．９３ ２゜ 図３（ｂ）は従来技術による工程（研究所−４へ）を使用したＴＣ対（ＶＬＤＬ ＋ＬＤＬ）−Ｃのグラフである；ｙ＝−４７，６７２＋０．９８７５ｘ、Ｒ１＝ ０．９８７゜図３（Ｃ）は従来技術による工程（研究所−Ｂ）を使用したＴＣ対 （ＶＬＤＬ十ＬＤＬ）−Ｃのグラフである：ｙ＝−４６．５２２２＋０．９８６ ９ｘ、Ｒ−２＝１９８゜図４（ａ）は本発明の方法（この研究所）を使用したＴ Ｃ対ＨＤＬ−Ｃのグラフである；ｙ＝５．２８６１＋０．１４９９５ｘ、Ｒ〜２ ＝０．３３５゜ 図４（ｂ）は従来技術による工程（研究所−Ａ）を使用したＴＣ対ＨＤＬ−Ｃの グラフである；ｙ＝４７．６４８＋〇、０１２５９６９ｘ、Ｒ−２＝０．００１ ゜ 図４（Ｃ）は従来技術による工程（研究所−Ｂ）を使用したＴＣ対ＨＤＬ−Ｃの グラフである；Ｙ＝４６．５２２＋０．０１３１ｘ、Ｒ，＝０．０６゜ 図５（ａ）は人間の血清アルブミン＋ヒリルビン複合体のＣＤスペクトルのｐＨ 依存性を示すグラフである：曲線（ａ）＝ｐＨ５゜６：曲線（ｂ）＝ｐＨ４，８ ；曲線（ｃ）＝ｐＨ４，４３図５（ｂ）は人間の血清アルブミン＋ビリルビン複 合体のＣＤスペクトルの更にｐＨ依存性を示すグラフである：曲線（ａ）＝ｐＨ ８２、曲線（ｂ）＝ｐＨ７，４：曲線（ｃ）＝ｐＨ９，８：曲線（ｄ）＝ｐ）（ ５，ｏｏ。

図６はＣＤの概略図であり、ここで、ＬＳは高強度の従来の光源あるいはレーザ 源、Ｍｌ、Ｍ２は全スペクトルデータに必要なモノクロメータであり、Ｐは直線 偏光素子、Ｑは円偏光素子、Ｓはサンプルセル、Ｄは検出器（３つまで可能であ る）　、ＲＥＣは記録器である。

図７はコレステロールとのチュカーエフ反応物質の反応から得られた、光学活性 有色生成物の正常な吸収スペクトルを示すグラフである。ここで、 吸収曲線（ａ）はサンプルとチュカーエフ反応物質との反応後に観察される１ 吸収曲線（ｂ）は約２％ｗ／ｖＮａ２ｓＯ４あるいは他のアルカリ金属かアルカ リ土類金属硫酸塩が添加されたチュガーエフ反応物質との反応後に観察される： 吸収曲線（Ｃ）は約２％ｗ／ｖ硫酸デキストランあるいは過塩素酸ナトリウムの ようなアルカリ金属過塩素酸塩が添加されたチュカーエフ反応物質との反応後に 観察される。

発明の詳細な説明 本発明の以下の詳細な説明により、本発明を実行する際の補助となる。この中で 記述されている多くの論議は試験サンプル中に存在する総コレステロール及びコ レステロールサブ分画の量を決定する方法と機器に関するものであるが、本発明 はこのような論議に不都合にも限られると考えるべきてはない。この技術に熟練 した者が、本発明による方法と装置を広範囲の有色化合物と自然光学異性体及び 合成光学異性体を含む光学異性体の存在を測定するのに使用することができるこ とを広く理解すれば、これは正しい。例えば、ここで開示されている方法と装置 は、一般の広範囲のリポ蛋白とタンパク質の測定における場合と同様、試験サン プル中の同化ステロイド及びステロイド生成物の測定あるいは検出に関連して適 用される。

以下の論議はまず、ここで開示された発明の方法を考慮し、ここで開示された方 法を実行する際に特に効果的である新規の装置の論議を使用して結論づけた。

方法 １、ＣＤ吸収及び／または分光光度吸収を使用したコレステロール分画の直接検 出。

Ａ、ＣＤを使用した直接検出 その技術における軌線者が直接様式で低密度のコレステロール分画を高精度で定 量することができる本発明に関連して、いくつかの利点がある。これらの利点の １つはチュガーエフ反応（１２）として文献に記述されている呈色反応の導入で ある。

チュガーエフ反応において使用される試薬は氷酢酸中の２０％Ｗ／ｖＺｎｃＩ２ と９８％塩化アセチルである。これらの試薬は別々の容器で貯蔵され、約４０℃ で貯蔵されれば何週間も安定した状態を維持てきる。更に、これらの乾燥の度合 いは注意深く制御する必要がない。この反応生成物は赤橙色を示すコレステロー ルの複合トリエンＣＤ−活性誘導体である。これが現在公知の方法の改良であり 、呈色種は二次染料でコレステロール誘導体ではない。また、これらの強度は元 のコレステロール濃度にのみ比例する。

希望があれば、チュガーエフ反応に対する反応物質も、琥珀ガラス、テフロンや 同様の容器で、気密状態で貯蔵した場合、氷酢酸中のＺｎＣｌ２と９８％塩化ア セチルの比が約１．１から４＝１で共に貯蔵することができる。これに関しては 、少なくとも４週間琥珀瓶中４０°Ｃで共に貯蔵された反応物質では、変色に対 する安定期間の延長が観察された。

上記反応物質の比に関しては、塩化アセチルがかなり短時間に（約８分）チュガ ーエフ呈色反応工程を生成するのに重要であるが、上記使用される塩化アセチル の体積は使用される体積が少ない場合はど重要ではないことに更に注意が必要で ある。例えば、塩化アセチルの１は２　Ｑｍｌのアリコートの塩化亜鉛につきＱ 、５ｍ！より大きくなくてはならないと考えられるニスベクトルデータは０７５ ｍ１あるいは１．Ｑｍｌの塩化アセチルが２ｍｌアリコートの塩化亜鉛と混合さ れた場合と本質的に同じものが得られた。

チュガーエフ反応物質が本発明において使用される場合、Ｎａ２Ｓ○４などの試 薬が約１−２％ｗ／ｖの量で反応物質溶液に添加され、溶液は完全に乾燥され（ 水が除去され）、空気安定化する。しかしながら、！’＋ａ、２Ｓ○４の添加は サンプルに対して得られたＣＤ及び分光光度吸収曲線を変化させる。具体的には 、ＣＤ及び吸収曲線はシフトし、変化し、このため、約２４０から５２５ｎｍの 範囲で、ＨＤ　Ｌ　−Ｃｌ：対するシングルＣＤピークが約４７５−４８０ｎｍ で起きる。これはＮａ２ＳＯ４が添加されない場合と異なり、ＨＤＬ−Ｃの量が 約３９０ｎｍで生じる負のピーク及び／又は約４７５ｎｍでの正のピークから計 算でき、あるいは２つのピークの代数和が好ましい。

本発明の第２の利点は、従来の分光測光方法に比べＣＤによると異なるコレステ ロールサブ分画に関して特異性及び選択性が向上するので、コレステロールに対 する検出方法において円二色性を使用することである。

ＣＤにおいては、試料は光のの２つの円偏光ビームが照射される。この２つのビ ームは同時に進行し、反対の方向に偏光されている。両方のビームが同時に試料 を通過し、吸収される。試料が光学的に活性であれば、ビームは異なる程度で吸 収される。この差はＣＤスペクトルとしての入射光ビームの波長の関数として表 示される。

光学的に不活性な吸収物質では差異が観察されず、このためこれらは検出されな い。技術は典型的なＣＤ装置として文献（１）に詳細に記述されている。コレス テロールとのチュガーエフ反応からの橙色の光学活性生成物の全てのスペクトル が図１に図示される。サンプルはＮＢＳコレステロール標準物質（ＳＲＭ９１１ ａ）のクロロホルム溶液である。このスペクトルは以後の全ての血清コレステロ ール測定にたいする標準として使用される。

従来の分光光度吸収方法に対しＣＤ検出によるチュガーエフ反応を使用した場合 の利点の例は以下の通りである６（１）、ＣＤスペクトルはコレステロールが試 験サンプル巾にフリースチロールとして存在しようと脂肪酸エステルとして存在 しようと同じてあり、このため、エステルの酵素けん化の工程が不必要となる。

（２）赤色色素は光学活性でなく、このためＣＤ検出器に対し透明であるため、 溶血した血液細胞からの妨害を受けない；（３）非常に高いトリグリセリドレベ ルにより、反応あるいは検出のどちらも妨害されない： （４）ＣＤスペクトルはコレステロールに対し唯一のものであり、このため検出 は非常に選択性が高い： （５）基準スペクトルは第１の標準物質、すなわち、入手できる最も純粋なコレ ステロールに対し測定され、第２のキャリブレータ標準に対して測定されない。

（６）ＣＤ検出においては吸光度の差を測定するので、色は非常に安定であり、 このため、色の強度が時間と共に失われても、差は実質的には一定のままである 。

（７）色生成工程では酵素は一切含まれず、チュカーエフ反応物質はどちらも安 定で安価である。

これらのどの利点よりも重要なことは、ＨＤＨ−Ｃ及び（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）− Ｃ分画は、ＣＤ吸収スペクトルにおいて異なるバンドと共に結合され、ＨＤＬ− Ｃを決定するための沈澱工程の必要なく直接同じ試料から測定することができる ことである。これに関しては、５２５ｎｍでの測定により、結合（ＶＬＤＬ＋Ｌ ＤＬ）−Ｃ分画に対する結果が得られ、３９０ｎｒｎでの測定（あるいは好まし くはそれぞれ３９０ｎｍ、４７５ｎｍでの負の及び正のＣＤ吸収ピークの代数和 ）により、ＨＤＬ−Ｃ分画に対する結果が得られる。

この発明はＨＤＬ−Ｃに対して得た値に関して、約３９０ｎｍでのＣＤ吸収測定 のみを使用する方法に対し、低い変動係数を一様に提供するので、ＨＤＬ−Ｃレ ベルを決定する場合には、約３９０及び４７５ｒ＋ｍでのＣＤ吸収ピーク高さの 代数和をめるのが好ましいと考えられる。前者の方法で変動が減少するのは、ベ ースラインドリフト効果が２つのピークの代数和を計算した場合に減少されると いう事実による結果である。

上記考慮に基づき、使用されている従来の方法と異なり、ＣＤが利用される本発 明による方法により得た結果は、常に、他の従来の方法に比べ精度が最も高く、 変動の小さい、低及び高密度分画の測定を提供するのであると考えられる。

図１においては、総コレステロールに対するＣＤスペクトル、図１では曲線（ａ ）と、リンタングステン酸−Ｍｇで選択的に低密度の脂質分画を沈澱させた後の 同サンプルに対するスペクトル、すなわち図工では影をつけた部分を比較するこ とにより、バンドの帰属を行った。５２５ｎｍハンド極大はＮＢＳコレステロー ル（ＳＲ〜１９１１　ａ）を使用して較正された。３９０ｎｍ極大の較正はノグ マケミカル会社により供給された第２のＨＤＬ−Ｃキャリブレータを使ってなさ れた。

本発明の方法の１つを実行し、試験サンプル中のコレステロール分画の量を決定 する例を以下に示す・ （ａ、）ＣＤ機器の較正　５０μＬアリコツトのＡＲダグレードクロロホルム中 ５ｘ１０−３　（ＳＲＭ９１１ａ）：ｌレスチロール溶液をＩＱｍＬ総容積のカ ラス瓶中に入れる。塩化亜鉛試薬２．ＯＯｍＬを添加し、混合物を注意深く振り 混ぜる。１．ＯＯｍＬの塩化アセチルを注意して添加し、混合物を振り混ぜ、ガ ラス瓶の蓋をし、６７℃で８分間放置する。カラス瓶を除去し、直ちに水で冷却 する。クロロホルム（１，ＯＯｍＬクロロホルム）をその後添加し、ガラス瓶中 の容積を増加させる。希望があれば、このようなりロロホルムの添加は省略する ことができ、あるいは代わりに、適当な溶剤を用いてもよい。溶液は次に１ｃｍ パスレングスキュベツトに移され、ＣＤスペクトルが６２５−３２５ｎｍから作 動する。スペクトルは反応物質混合物のみに対するスペクトルを減することによ りセルブランク及び機器ベースラインに対する日々の基準に基づいて補正される 。

（ｂ）ＣＤスペクトルの較正：　（ａ）における手順は、選択された多（の溶液 濃度が試験サンプル中の典型的な範囲の血清コレステロールレベルと一致するよ うに繰り返される。結果として得られた較正曲線から、５２３ｎｍでの（ＶＬＤ Ｌ＋ＬＤＬ）−Ｃレベルに対するシグナルの大きさに関連した比例定数は１００ ｍｇ／ｄＬ毎に１６２ミリ度である。３９０ｎｍでの較正も同様に行われたが、 純粋コレステロール純粋コレステロールはングマＨＤＬ−Ｃキャリブレータによ り置換された。３９０ｎｍてのＨＤＬ−Ｃレベルに対するシグナルの大きさは１ ００ｍｇ／ｄＬ毎に２．０８ミリ度である。

（ｃ）ＣＤによる臨床試験サンプル中のコレステロール定量・　（ａ）における 手順が５０μＬアリコツトの血清に対し繰り返される。

キュベツトに移される前に、試料は２分間高速で遠心分離される。

（ＶＬＤＬ−＋−ＬＤＬ）−Ｃ分画は５２５ｎｍでの測定シグナルの高さから計 算され、ＨＤＬ−Ｃ分画は３９０ｎｍでのソゲナルの高さから計算される。これ らの和は試料中の総コレステロールを与える。ＨＤＬ−Ｃ分画を測定するための 低密度分画の選択的な沈殿は定期測定で必要ない。このため、フィンカースティ ックはどの少量でコレステロール−脂質プロファイルを行い、低密度の脂質分画 の測定において今まで得られなかった最も良い精度を得ることが可能である。

反応物質は（ａ）機器の較正において示した順序で添加することができることに 注意すべきである。しかしながら、これらの反応物質は前もって混合されたもの として同時に添加することもでき、あるいは逆の順序で、例えば最初に塩化アセ チル、それからＺｎＣ１２試薬という順で、添加することもてきる。後者の試薬 添加方法は試験サンプルにおける沈澱量を減少させるという予期しない効果を有 していた。このため、入射光の散乱を大幅に減少させることができ、これにより 、以後のＣＤあるいは従来の分光吸収による吸収の測定を容易にすることができ た。

研究調査結果：それぞれアボット研究所（研究所Ａ）及びデュポン（研究所Ｂ） により開発された市販の吸収方法を採用している２つの異なる研究所から提供さ れた血清サンプルについてコレステロール定量を行った。総コレステロールレベ ルに対する相関性は非常に良く　（図２）、ＬＳＰによって強要されている限界 内によくおさまる。

この新しい方法が従来の方法に対する改良であることを信じるための良いケース は、別々に処理された３つのデータの組みに対する相関性を比較することである 。総コレステロール対（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃのプロットは全ての場合におい て線形であるが、両方の吸収方法、図３（ｂ）と（Ｃ）、に対するＸ−軸上の切 片においてほとんど５０ｍｇ／ｄＬの偏りがあり、これらの同じデータの組み、 図４（ｂ）と４（ｃＬに対しては総とＨＤＬ−Ｃデータ間にゼロ相関がある。比 べると、チュガーエフーＣＤデータ相関は低い相関切片で非常に良く（図３（ａ ）と４　（ａ）　）　、相関勾配は、これらのサンプル集団に対し、ＨＤＬ−Ｃ 及び（’ｖ’　Ｌ　Ｄ　Ｌ　＋　Ｌ　Ｄ　Ｉ−）　−Ｃ分画に対する“平均”パ ーセンテージはそれぞれ１５％、８５％であり、これらは超遠心分離データに基 づく人間の血清分布に対して典型的として通常考えられている値と良く一致して いることを示唆する。従来の分光光度吸収方法に対する相関勾配は、可能でない もの、及びＨＤＬ−Ｃに対する５０ｍｇ／ｄＬの本質的に一定な測定値が、（Ｖ ＬＤＬ＋ＬＤＬ）−Ｃに対する結果を得るために、測定されたＴＣ値から減ぜら れ生じるものの両方である。

精度及び分析時間　ＬＤＬ−Ｃ及びＶＬＤＬ−Ｃに対しては市販の標準がないの で、精度について評価することはできない。しかしながら、（ＶＬＤＬ＋ＬＤＬ ）　−Ｃ測定における精度及び再現性は±２％より良い。このレベルの精度では 、食事療法及び／又は運動改善を含む減量療法研究でのＬＤＬ−血清コレスチロ ールにおける変化の相関をとる可能性の信頼度は大きく改善される。

ＣＤ検出を伴うチュガーエフーＣＤ法による１回の分析に対するおおよその時間 は１５分である。これはＴＣ測定にのみ使用される市販の吸収方法に比較して長 いが、低及び高密度分画の両方に対する結果が同時に得られる。このように、Ｃ Ｄによるサブ分画の測定を含むコレステロールの完全な分析に必要な総時間は従 来の方法を使用した場合に必要な時間より短い。色が安定しているため、いくつ かのサンプルを１度に定温放置することにより応答時間をかなり減少させること ができる。入射光強度が強いと、サンプルのバスレングスは１ｃｍより減少させ ることができ、測定を自動化することができる。このような手順では、従来の方 法（ＣＤを利用する本発明の方法の選択性や感度を有しない）と時間競争が可能 であると充分予想できる。

上記のような手順においてチュガーエフ反応物質を利用して、いくつかの国立標 準局ＳＲＭ総コレステロール標準もまた検査された。試験された３つのサンプル は（１６５１−１）（２１０，３６±２．４６ｍｇ／ｄＬ　総）、（１９５１− ２）（２４２，２９＝１．５３ｍｇ／ｄＬ　総）、（１９５］、−３）（２８１ ，９７±１゜８３ｍｇ／ｄＬ　総）としてＮＢＳカタログに列挙されている。分 析のＮＢＳ証明書によれば、血清はＣＤＣによって寄贈された。括弧内の数字は ＮＢＳて測定されたものであり、改良アベールーケンダール法を使用したＣＤＣ 定量と充分匹敵する。２つの分画（ＨＤＬ　−Ｃ及びＶＬＤ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ） に対するＣＤ吸収値を加算することにより、チュカーエフから得た数字は、それ ぞれ、２０６ｍｇ／ｄＬ、２４１．１ｍｇ／ｄＬ、２８６．６ｍｇ／ｄＬである 。

これらの結果は、コレステロールレベルを直接、精度よく決定する際の本発明の 方法の効果をはっきりと証明している。

Ｂ９分光光度吸収を用いた直接検出 上記のように、チュガーエフ試薬を乾燥させ、安定化するために物質を添加する と、試験サンプルのＣＤスペクトルに予想外の変化が生じた。これに関して、試 験サンプル中のコレステロールとのチュガーエフ反応光学活性呈色生成物は約２ ４０−７００ｎｍの範囲に渡って吸収スペクトルが拡張する〔図７、吸収曲線（ ａ）〕ことに注意しなければならない。約５２５ｎｍで強い吸収極大を示し、こ れはサンプル中の総コレステロール（ＴＣ）に関連し、これに比例していること がわかる。溶血血液細胞の赤色色素による強い妨害がなければ、５２５ｎｍにお ける吸光度測定はＴＣを決定するために使用することができる。５２５ｎｍでの 測定からの較正データにより、呈色生成物に対するモル吸光率は約１３５００の オーダーであることが示唆される。

チュガーエフ試薬中に特別の添加剤が添加されていない場合、試験サンプル中の コレステロールの別々のサブ分画により選択的な吸光度が示されない。１−２％ ｗ／ｖ無水Ｎａ２ＳＯ４を基本チュガーエフ試薬に添加すると、吸収スペクトル に急激な変化が現れる。

特に１．５２５ｎｍでの強い吸収ピークが無（なり、強度の小さいピークと約４ ８０ｎｍの吸収極大が明らかになる〔図７、吸収曲線（ｂ）〕。他の添加剤、即 ちアルカリ金属硫酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、約１−２％ｗ／ｖの量の！Ｈ ２ＳＯ４あるいは少量のａＨ２５０４により同様の効果が生じる。遷移金属硫酸 塩もまたこの効果を示すが、呈色溶液を形成し、このため選択するのは好ましく ない。臨床サンプルと７グマバイオケミカルから入手した市販の標本のＣＤスペ クトルデータ間の比較により、この４８０ｎｍのピークはＨＤＬ−Ｃに相関性が あることが示唆される。図から４８０ｎｍピークに対するモル吸光率は約４００ ０のオーダーであることが示唆される。チュガーエフ試薬に添加剤を添加しない 場合、このピークから５２５ｎｍピークでの主な吸収バンドまでの小さな寄与が ある。このため、５２５ｎｍで測定した光学的な強度間の差異は結合ｖＬ　Ｄ　 Ｌ　−Ｃ＋　Ｌ　Ｄ　Ｉ−−Ｃサブ分画の和に比例する。

他の添加剤、すなわち硫酸デキストランや、過塩素酸ナトリウムなどのアルカリ 金属過塩素酸塩などの沈澱試薬を約１−２％ｖ／ｗ量で添加すると図７　〔吸収 曲線（Ｃ）〕に示されるように吸収スペクトルが変化する。研究により、このピ ークは約５００ｎｍで極大吸収を有し、結合ＨＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃサブ分画 と相関性がある。このように、金属過塩素酸の添加後にも存在するバンドはＶＬ ＤＬ−ＣとＬＤＬ−Ｃサブ分画間の識別をするのに使用することができることが 証明され、このため、これら２つのサブ分画の量も定量することができる。

基本のヂュガーエフ試薬の生成物に対する約５２５ｎｍでの測定及びこの中で述 べたような適当な硫酸塩を添加したチュガーエフ試薬の生成物に対する約４８０ 　ｎ　ｍでの測定を使用して繰り返し、ＴＣ及びＨＤＬ−Ｃに対する値をそれぞ れ直接衣めることができる。

約５２５ｎｍでの差異により、結合’ｖ’　Ｌ　Ｄ　Ｌ−ＣＴ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　− Ｃに対する値が得られる。チュカーエフ／過塩素酸試薬、この中で述べたもの、 を使った反応の後、約５２５１ｍで行った第３の測定から、これらの分離が可能 となる。

ＨＤＬ−Ｃに帰するハンドの強度は約４８０ｎｍでＴＣスペクトルの強度の半分 のオーダーであるため、３つのサブ分画に対するスペクトルの加重平均を使って 基本的なチュガーエフ試薬（約４００７００ｎｒｎ）から得た総コレステロール に対するスペクトルに曲線をあてはめるために数学的なアルゴリズムを書くこと ができると考えられることにも注意しなければならない。それ自体、基本的なチ ュカーエフ試験試薬との臨床サンプル中のコレステロールの反応の呈色生成物か らのスペクトルのみを使用して、コレステロール脂質分析を実行することができ る。

上記分光光度吸収反応はＣＤ機器の使用が必要ないが、臨床サンプル中のコレス テロール及びコレステロールサブ分画の同時、オンライン検出に対！−同様の機 会を提供する。このようなチュガーエフ反応試薬を使用した分光光度吸収方法を 使用すると、入射光の大変小さな一部のみがＣＤノグナル生成に使用することが できるので、ここで開示されているＣＤ法よりもずっと大きい感度を見込むこと ができる。それ自体、ここで開示された分光光度吸収方法により少量のサンプル の使用が可能となり、これにより、他の物質や反応により生成した沈澱の総量に より引き起こされた妨害の可能性を減少させる。しかしながら、逆に、これらの 反応は血液サンプルの溶血により放出された色素からの妨害の影響をＣＤより受 けやすい。結局、上記のＣＤ研究の様に、最初にサンプルに塩化アセチルを添加 し、その後ＺｎＣｌ／酢酸試薬を添加すると、臨床サンプルの沈澱により引き起 こされる妨害をさらに減少する。実際、全血サンプルを使用して二の適用に対し 分光測光吸光度反応を実行することができる。

上記考慮に基づき、ここで新規の分光光度吸収検出方法を提供する。この方法に おいて、試薬は臨床サンプル中のコレステロールと反応し、これにより、コレス テロールサブ分画の直接定量が可能となる。測定は約４００−７００ｎｍの範囲 にわたる全スペクトルとして、あるいは２つ以上の選択された波長、すなわちＨ ＤＬ−Ｃに対しては約４８０ｎｍ、ＶＬＤＬ−Ｃに対しては５００ｎｍ、結合Ｖ ＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ（あるいは希望があればＴＣ）に対しては５２５ｎｍ、 での全スペクトルとして行うことができる。吸収及びＣＤ方法の間の主な手順の 差は使用する標準に関連する。コレステロール自体はＣＤ反応に対する標準とし て使用することができるが、ＣＤＣ，ＣＡＰ、あるいは市販の源から得たＴＣ及 びコレステロールサブ分画に対する臨床基準は吸収分光計を較正するために使用 しなくてはならない。

２、ＣＤを使用した（関連したリポたんば（による）コレステロール分画の間接 検出 約５．０−５．１で緩衝剤処理された新しいビリルビン複合試薬（チュガーエフ 試薬の代わり）を使用する以外は上記に開示したものと同様のＣＤ技術を使用し て、血清中のＨＤＬ−Ｃレベルを間接的に測定することができる。これはＨＤＬ −Ｃと結合した１つ以上の異なるリポたんばくあるいはアポリポたんばくの血清 レベルを直接定量することにより行われる。これに関連して、Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　 −Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ分画と結合したリポたんばくは通常ベータリポたんばくを示し 、Ｂ−１００ＣおよびＥアプリプロたんばくを含むが、ＨＤＬ−Ｃ分画と結合し たリポたんばくはαリポたんばくを示し、八−１，Ａ〜１１．　Ｃ，Ｄ、Ｅアポ リプ口たんばくを含む。ＨＤＬ−Ｃ結合リポたんばくあるいはアポリプ口たんば くと共に形成されたビリルビン複合体はこの方法により直接測定され、血清中の ＨＤＬ−Ｃの量は測定したリポたんばくあるいはアポリプ口たんばくの量に比例 する。

サンプル中のαリポたんばくの存在を決定するのに適す上記ビリルビン複合体方 法論に関連する明確な説明は以下の通りである。しかしながら、以下に示すよう に同様の技術（すなわち、約５．０−５．２のｐＨに緩衝剤で調整されたビリル ビン複合体を使用するもの）が血清中に存在する様々なたんばくあるいはリポた んばくの量を測定するのに有効であるので、上記方法は本発明に制限されないα −リポたんばくに対するビリルビン吸収試験ビリルビンは血清たんばくと結合す ることが知られており、実際、人間の血清アルブミン（Ｈ３Ａ）と結合された後 、ＣＤ検出（２）を使って分析されている。ビリルビンはそれ自体、ＣＤ活性で はない。ペプチド結合発色団のため、Ｈ５Ａは遠紫外線中でＣＤ活性である（２ １ｇｎｒｎ付近で極大）。水溶液中でも共に、分子はスペクトルの可視領域で吸 収し、ＣＤ活性となる強い結合錯体を形成する。溶液の色は遊離ビリルビン溶液 の色に比べて顕著には変化しないが、遊離ビリルビンとＨ５Ａ−複合ビリルビン の吸収スペクトルはわずかであるが異なる。変化が非常に小さいので、吸収検出 を使用したＨ　Ｓ　Ａ及びビリルビンの臨床分析はできない。複合型のみＣＤス ペクトルを有し、条件を注意深く制御することにより、一方の分子が他方の分析 に適した試薬となりうる。

ビリルビン（及び／又は他の有機染料）はすべての血清たんばくに結合する能力 を有する。Ｈ５Ａは、他のすべてのたんばくに対し非常にモル過剰に存在してい るので、好ましいホストである。様々なビリルビン−たんぽ（錯体中で識別でき る選択性を有する検出器がたんばくの認識及び血清たんばくのプロファイルを描 くために開発され、全スペクトルＣＤ検出はこの課題を完了するために充分な程 度の選択性を有するだろう。これに関して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　、 Ｈ５Ａ、カンマ−グロブリン（ＧＧ）に対しては異なるＣＤスペクトルが存在す ることが予備的証拠により示唆される。

Ｈ５Ａ−ビリルビン錯体のＣＤスペクトルは典型的な並数を２つもつものであり 、個々のバンドはｐＨが増加するにつれ極性が逆になる（図５　（ａ）　）。Ｈ ５Ａに対する等電点付近の範囲のおおよそ中心である、Ｉ）Ｈ５，Ｏ−５，２で は、ＣＤスペクトルは実際ベースラインである。僅かに異なる等電領域を有する たんばくは５，０−５．２ｐＨ＠囲におけるビリルビンに対し好ましいホストと なる。このように考えて、ビリルビン複合体が人間の血清の試料に添加され、Ｃ ＤスペクトルがｐＨの関数として測定された。予想された通り、緩衝剤で調整さ れたほとんどのｐＨ値で優勢なスペクトルはＨＳＡ−ビリルビン複合体に対する ものであり、ＨＳ　Ａ標準（／グマ）に対し調べることて確認した。しかしなが ら、ｐＨ５，ＱのスペクトルはＨＳＡの典型でなく（図５（ｂ））　、ＧＧ−ヒ リルビン錯体に対するスペクトルと一致もしない。

ある血清に対し再現性のあるスペクトルを得るために標準手順が開発された。詳 細は以下の通りである：１０ｍＬのガラス瓶中の２００ｕＬの血清に対し、３． ０ｍＬのｐＨ５，０緩衝溶液と５０μＬのｌＸｌ０−３〜ｉ　（７ｍｇ／１０ｒ ｒ＋Ｌ水）のビリルビン複合体（ポルフィリ　プロダクト　Ｉｎｃ　、ローガン 、ユタ州）溶液を添加する。振り混ぜ、５分間放置する。その溶液を１ｃｍのパ スレングス、３ｍＬの総容積の分光測光キュベツトに移し、約５７５から３７５ ｎｒｎまでＣＤスペクトルを作動させる。ビリルビン貯蔵溶液は、ビリルビンが その中では直ちに酸化されビリベルノンになるｐＨ５、０緩衝溶液ではなく、蒸 留水を使って準備される。水中で貯蔵すると、数時間は充分安定であるが、−晩 じゅう（約１６時間）では安定ではない。

いくつかの血清サンプルに対し作動させたスペクトルは広く一般的な類似性を示 したが、勾配及び分岐点（すなわち、ＣＤノグナルがゼロとなる波長）において 僅かに変化が観察される。４９５ｎｍで測定された／グナル強度は、サンプル毎 に異なるが、シグナルの高さが好ましいホストであるたんばくなら何でもその血 清含量に依存することを示している。

Ｉ　Ｓ　ＯＬ　Ａ　Ｂセパレータ（ヘパリン−アガロースカラム）からのα−リ ポたんばくは、ｐＨ５，０でビリルビン複合体と反応させた場合、はっきりとし た特色のない“血清たんばく”との複合体に対するＣＤスペクトルと類似したＣ Ｄスペクトルを提供することが観察される。ｐＨ５，０でビリルビンと結合する 血清組成はαリポたんばくであること、すなわち、ＨＤＬ−コレステロールと結 合したものであることが示唆される。類似のスペクトルはまたングマケミカルＣ ｏ　から得たＨＤＬ−コレステロール標準溶液のヒリルビン錯体に対しても観察 された。少数の血清サンプルに対して行われた予備測定では、実際、錯体に対す る４９５ｎｍでのシグナルの高さとチュガーエフ法によって測定されたＨＤＬ− コレステロール含量との間には相関があることが示唆される。

上記考虜に基づいて、上記技術を使用して、試験サンプル中のα−リポたんばく の量を測定でき、示されたリポたんばく量はサンプル中に存在するＨＤＬ−Ｃの 量に比例すると考えられる。この技術はほとんど全ての試験サンプル中の血清た んばく、尿たんばく、食物たんばくなどを含むが、それだけに限定はされない、 様々なたんばくの測定にも適用できる。

本発明による方法がコレステロールサブ分画あるいはコレステロール結合αリポ たんばく血清レベルを決定するのに効果的であることを更に証明するために、以 下の実験データを表１に示す。

表１ ：ｌ：ｔ　ｉ＜＆画分 Ｈ丑　“：５ Ｇ　３６　３Ｇ Ｕ　１５７　４６　５２　４９ １、チュガーエフ試薬を用い５７５ｎｍでＣＤ吸収測定を行ったＶＬ十ＬＤＬ　 （Ｃｈｕｇ）−コレステロールサブ分画ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＤＬ−Ｃ０ ２、チュガーエフ試薬を用い３９０と４．７５　ｎ　ｍでのＣＤ吸収測定の代数 和を取って得られたＨＤＬ　（Ｃｈｕｇ）−コレステロールサブ分画ＨＤＬ−Ｃ ０ ３、ｐＨ５，０でビリルビン複合体を使用し、４９５ｎｍでＣＤ吸収を取ること によりＨＤＬ−Ｃ分画を結合したαリボたんばくを直接測定することによって得 たＨＤＬ（ＢＲ，）−サブ分画ＨＤＬ−Ｃ４、研究所（Ａ）、研究所（Ｂ）によ り指定された酵素方法を使用して得たＨＤＬ　（ｅｎｚ）−サブ分画ＨＤＬ−Ｃ ８木星印は、４０℃で４週間貯蔵された混合チュガーエフ試薬を使用して試験が 患者の血清について行われたことを示す。

［コニ括弧は他の方法を使用したＨＤＬ測定とは実質的に異なるＨＤＬ測定を示 唆する。

表１に示された実験結果から、ＨＤＬ−Ｃ（Ｃｈｕｇ）およびＨＤＬ−Ｃ（ｅ　 ｎ、　ｚ）方法のそれぞれに対する２０の値の内１２は１０ｍｇ／ｄＬ内であり 、ＨＤＬ−Ｃ（ＢＲ）に対する２３の値の内１６が１０ｍｇ／ｄＬ内であること に注意するべきである。このような結果により、本発明の精度が証明される。

発明による装置 上記方法の部を再検討すると、試験サンプル中のコレステロールレベルの決定、 ステロイドの検出などに対し、現在知られている方法と比較した場合、本発明の 方法が多くの利点を有することが容易に確認される。しかしながら、本発明は新 しい装置も含み、その装置によれば、この技術の熟練者は著しく迅速な速度で、 本発明の方法を行うことができる。この発明による機器は上記に概略が示してい る（”発明の概要”と表題のつけられた部分参照）。

一般に、上記に概略を示した新しい発明による機器によれば、ＴＣ＝ＶＬＤＬ− Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃ＋ＨＤＬ−Ｃ（式１）という事実、及び希望があれば、同一ある いは異なる波長でＣＤ及び分光光度吸収測定を同時に行う機器を構成することが できるという事実を利用することにより、血清試験サンプルに関する処理時間が 減少できる例えば、ここで含まれる検出機器は、希望があれば、同時に第１の波 長（約３９０　ｎｍ）で、及び／または第２の波長（好ましくは３９０と４７５ ｎｍ）でＣＤ吸収によりＨＤＬ−Ｃを同時測定でき、希望があれば、策３の波長 （好ましくは約５２５ｎｍ）でＣＤ吸収によりＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃを同時 測定できる。ＴＣはその後コンピュータ／計算機手段により、すでに決定したコ レステロールサブ分画の量を加算することで間接的に決定できる。このような機 器を準備する手段はＣＤ機器を差備するための技術において一般的に知られた手 段を含むであろう。このような機器はまた、そのような希望があれば、モニタさ れた個々の異なる波長でＣＤ吸光度あるいは分光光度吸収を検出するための別々 の検出システムを含むであろう。

ここで含まれる別の検出機器では、分光光度及びＣＤの吸収測定は、ＴＣ及びＬ ＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃのレベルをそれぞれ決定するために、単一波長で行われ る。このようなシステムでは、２つの別々の検出システム（１つは分光測光吸光 度に対し、１つはＣＤ吸光度に対する）が、そのような希望があれば、使用する ことができる。しかしながら、このような機器ではＣＤ検出動作モードから分光 光度吸収検出モードに変更することのできるスイッチ素子を利用することが好ま しいと考えられる。というのは、２つの吸収測定は単一波長で行われ、それ自体 、時間因子はスイッチ素子を使用することにより太き（増加するものではないと 考えられるからである。

希望があれば、ここで含まれる機器もまた、３つの別々の検出システムを備える ように構成することができる。このようなシステムは、試験サンプル中の異なる ３つのコレステロール、すなわち、ＨＤＬ−Ｃ，ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−ｃ　（ ＣＤ検出システム）、ＴＣレベル（分光光度検出システム）の吸光度を同時にモ ニタリングする手段（分光光度あるいはＣＤ検出システム）の一部として使用で きる。しかしながら、また、スイッチ素子（Ｓ）を動作のＣＤモード（ｓ）及び ／または動作の分光光度モード（ｓ）間の切り替えを行うために使用することが できることに注意する。このような機器において、このようなスイッチ素子（Ｓ ）を使用することは好ましいと考えられる。　以上で概略を記した新しいＣＤ機 器のうち、ＨＤＬ−ＣとＴＣあるいはＶＬＤＬ−Ｃ十ＬＤＬ−Ｃが直接測定され ル（逆ニ、Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　−Ｃ＋　Ｌ　Ｄ　Ｌ−ＣあるいはＴＣが計算される ）機器が最も使用するのに有利である。というのは、このような機器は２つのコ レステロールだけを直接測定すればよく、第３のコレステロールレベルは上記式 １に基づいて決定されるからである。吸収分光学に対しては、上記と同様の理由 で、ＴＣとＨＤＬ−Ｃが直接決定でき、Ｌ　Ｄ　Ｌ　−Ｃ＋　Ｖ　Ｌ　Ｄ　Ｌ　 −Ｃが計算される機器を使用することが望ましいと考えられる。同様に、ここで 述べた機器のうち、上記式１を使用しないで３つの別々のコレステロールレベル を直接決定する機器は好ましくない。それにも関わらず、２つの異なる方法が独 立したコレステロール測定を行うために利用できる場合はいつでも、これにより 臨床測定に対し品質管理確認として補助することができることに注意すべきであ る。このような理由のため、ここで開示された本発明による検出機器のそれぞれ は、本発明の方法において使用すると有利であると考えられる。

しかしながら、ここで含まれる別の機器はＣＤ性能を有しない分光光度機器でも 良い。このような機器は、約４００−７００ｎｍの範囲（好ましくは約４５０− ６２５ｎｍ）に渡り、あるいは約５２５ｎｍや４８０ｎｍ、できれば約５００ｎ ｍなどの離れた点で、チュガーエフ試薬の呈色生成物の吸収を測定することので きる検出器を備えていなければならない。自動化されれば、沈澱を減少させるた めに上記の順にチュガーエフ試薬を添加することもできるはずである。更に、自 動化された機器が使用された場合、分析するための別々のサンプル容器に添加剤 を添加したあるいは添加していないチュガーエフ試薬を添加するか、あるいは、 同じ容器に添加剤を添加し、続けて基本のチュガーエフ試薬を添加する手段を有 することが好ましい。これにより、ＴＣ及びＨＤＬ−Ｃの両方が同時にあるいは 続けてオンライン定量できる。結局、このような吸収分光計は、マニュアルであ ろうと自動化されたものであろうと、ＴＣ及びＨＤＬ−Ｃ値から計算により、試 験サンプル中のＬＤＬ−ＣキＶＬＤＬ−Ｃのレベルを決定する手段を有すること が好ましい。上記のように約５００ｎｍでＶＬＤＬ−Ｃを決定し、臨床サンプル 中のＬＤＬ−Ｃの計算においてその値を使用する手段も備えても良い。

以上で開示したような分光光度吸収装置によると、試験サンプル中のＴＣレベル は直接読みとることができ、ＨＤＬ−Ｃレベルは適当な硫酸塩を添加した後直接 読みとることができる。吸収の読みとりは１つのチューブに基本的なチュガーエ フ試薬を、第２のチューブに硫酸塩添加物を含む基本のチュガーエフ試薬を添加 した後、２つの別々のキュベツトで同時になされる。このような装置で、基本の チュガーエフ反応試薬がキュベツト中の試験サンプルに添加され、サンプルの吸 収の読みとりがなされ、それから適当な硫酸塩添加物がチューブに添加され、サ ンプルの第２の吸収の読みとりがなされるという連続工程を使用することもでき る。結合ＶＬＤＬ−Ｃ＋ＬＤＬ−Ｃは、希望があれば、その後、２つの吸収の読 みとりから自動的に計算することができる。

以上で開示されたような分光光度吸収装置により、ＴＣ，ＨＤＬ−Ｃ，ＶＬＤＬ −Ｃレベルを直接決定することもてきる。このような手順においては、基本的な チュガーエフ試薬を添加された試験サンプルは少なくとも第１及び第２のキュベ ツト（あるいはチューブ）に入れられ、サンプルの１つの吸収のの読みとりが行 われる。その後、適当な硫酸塩添加物が第１のキュベツト中のサンプルに添加さ れ、第２のキュベツト中のサンプルに適当な過塩素酸塩（あるいは硫酸デキスト ラン）が添加され、それぞれのキュベツト中の試験サンプルに対し分光光度吸収 の読みとりが行われる。サンプル中のＬＤＬ−Ｃレベルは、希望があれば、３つ の吸収の読みとりから自動的に計算することができる。

ここで含まれる、本発明の方法を実行するための機器は、別々の光の列がＣＤ及 び分光光度吸収シグナルに対し存在するように設計することができる。更に、こ のような機器でレーザ光が使用される場合、モノクロメータは省略することがで きる。

本発明は以上のように説明されるが、様々に変更することができるのは明きらか である。このような変更は本発明の精神及び範囲から逸脱しないものであり、こ の技術に熟練した者にとって明きらかであるような変更は全て、以下の請求の範 囲に含まれる。

参考文献 １　、　Ｌａｍｂｅｒｔ、　Ｊ、　Ｂ、　、　５ｈｕｒｖｅ１１．　Ｈ，Ｆ、　 、　ＶｅｒｂｉＬｔ、　Ｌ、　Ｃｏｏｋｓ、　Ｒ，Ｇ、　、yび５ｔｏｕ ｔ、　ｃ、　Ｈ，、“有機構造分析”、マクミラン、ニューヨーク、Ｎ、　Ｙ、 　１９７６年。

２、　Ｇｒａｈａｎｅｎ、Ａ、、Ｓｊｏｈｏｌｍ、１．、及びＭｉｃｈａｅｌｓ ｓｏｎ、　Ｍ、　、クリニカ　ケミ力　アン乙　５２巻、１８７−１９６ページ （１９７４）。

３　、　Ｋａｎｎｅｌ、　Ｗ、　Ｂ、　、　Ｃａ５ｔｅｌｌｉ、　Ｖ、　Ｐ、　 、　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｔ、など”血清コレステロール、リポたんばく、及び冠状 動脈心臓病：フラミンガム研究”、＾ｎｎ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｍｅｄ　１９７ １年；７４：１−１１゜４　、　Ｃａ５ｔｅｌｌｉ、　Ｗ、　Ｐ、　、　Ｇａｒ ｒｉｓｏｎ、　Ｒ，Ｊ、　、　Ｗｉｌｓｏｎ、　ｆ、　Ｆ、　、＾ｂｂｏｔｔ、 　ＲCＤ、　、　Ｋａｌ。

ｕｓｄｉａｎ、Ｓ、、Ｋａｎｎｅｌ、ｊＢ、、　”冠状動脈心臓病の発生とリポ たんばくコレステロールレベル”、ＪＡＭＡｌ　９８６年、２５６　：　２８３ ５−２８３８゜ ５　＾ｂｂｏｔｔ、　Ｒ，Ｄ、　、　Ｇａｒｒｉｓｏｎ、　ＲｌＪ、、　Ｗｉｓ ｏｎ、　Ｐ、　Ｗ、　Ｆ、など、“リポたんばくコレステロール類の同時分布、 フラミンガム研究“動脈硬化１９８３年、３　：　２６０−２７２゜ ６、研究所規格化パネル、ＮＣＥＰ、“合衆国の臨床研究所における血液コレス テロール測定の現状、国家コレステロール教育プログラムの研究所規格化パネル からの報告”、Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　１９８８年、３４、：１９３−２０１ ゜ ７、５ｕｐｅｒｋｏ、Ｈ，Ｒ，、Ｂａｃｈｒｉｋ、Ｐ、Ｓ、、ｆｏｏｄ、Ｐ、Ｄ 、、“高密度リポたんば（コレステロール測定−実際の臨床医学において補助あ るいは妨害となるか”ＪＡＭＡ１９８６年、２５６　：　２７１４−２７１７゜ ８、　Ｐｏｎ５ｉｃｋ、Ｌ、どコレステロール試験で良い結果を示す研究所、デ ータの開示”　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　Ｎｅｗｓ　１９８９年：１５　（９） ：１４で報告９　、１ｌｌａｒｎｉｃｋ、　Ｇ、　Ｒ，、Ａｌｂｅｒｓ、　Ｊ、 　Ｊ、　、　Ｔｅｎｇ−Ｌｅａｒｙ、　Ｅ、“ＨＤＬ：ｌレスチロール・いくつ かの研究所にまたがる実力試験結果”Ｃ１１ｎ、　ＣｈｅＩｌｌ、　１９８０年 ；２６：１６９−１７０゜ １０　、　Ｇｒｕｎｄｙ、　Ｓ、　Ｍ、　、　Ｇｏｏｄｍａｎ、　Ｄ、　Ｗ、　 、　Ｒｉｆｋｉｎｄ、　Ｂ、　Ｍ、　、　Ｃｌｅｅｍａｎ、@Ｊ、　１．　“コ レステロール管理におけるＨＤＬの位置。国家コレステロール教育プログラムか らの展望“＾ｒｃｈ、　Ｉｎｔｅｒ、　Ｍｅｄ　１９８９年＋１４９：５０−５ １０ｖ １１　、　Ｐｕｒｄｉｅ、　Ｎ、　、　Ｓｗａｌｌｏｗｓ、　Ｋ、＾７．”旋光 分析、旋光分散、円二色性１″＾ｎａＬ、Ｃｈｅｍ、、　１９８９年；６１：　 ７７Ａ−８９Ａ。

１２、　Ｃｏｘ、Ｂ、Ｈ，及び５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｅ、　Ｙ、　、　Ｃａｎ、　 Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　、　２９．２１７（１９５１年１３、　Ｋａｔｚｕｎｇ、Ｂ 、Ｇ、“基礎及び臨床薬理学、第４版−、Ｐ、　４１９−４２１．　Ａｐｐｌｅ ｔｏｎ　＆　Ｌａｎｇｅ、　Ｅｎｇｌｅｖｏｏｄ　Ｃ１１ｆｆｓ、　Ｎ、　Ｊ、 （１９８９年）ＦＩＧ、　Ｉ ＴＣ（本発明） ＴＣ（総コレステロール） ＴＣ ＴＣ ＴＣ Ｃ 国　腔　慣　ｌ＊　組　と 本発明は吸光光度法、臨床化学検出のために従来の分光分叶又は円二色性を使用 することに関する。特に、タンパク質同化ステロイおよび他のステロイド生成物 の検出だけでなく、臨床サンプル中６コレステ、ロールレベル（ａ度）の測定お よびコレステロールサブ分Ｃの重接測定において、そして臨床テストサンプル中 のりボタンパニレヘル（濃！ｆ）の測定において、このような吸光光度法を使用 するとに関する。また、本発明は上記化学的方法の各々において有効１使用され る特定のＣＤおよび従来の吸光光度装置を提供すること（関する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．臨床試験サンプル中に存在するコレステロール、リポたんぱく、同化ステロ イドあるいは他のステロイド生成物の量を決定するための臨床検出方法において 、該方法は、（ａ）上記試験サンプル中に存在するコレステロール、リポたんぱ く、同化ステロイドあるいは他のステロイド生成物と、光学的に活性な呈色反応 生成物を形成する過程と；（ｂ）約１５０ｎｍから７００ｎｍまでの範囲で、上 記試験サンプルのＣＤ吸収スペクトルを決定する過程とからなる臨床検出方法。 ２．上記光学活性な呈色反応生成物は、チュガーエフ試薬と、上記コレステロー ル、リポたんぱく、同化ステロイドあるいは他のステロイド生成物との反応によ り形成されたものである請求項１記載の臨床検出方法。 ３．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールの量が決定される請求項１記 載の臨床検出方法。 ４．上記反応生成物はチュガーエフ試薬と上記試験サンプル中に存在する上記コ レステロールとの反応により形成される請求項３記載の臨床検出方法。 ５．チュガーエフ試薬は塩化亜鉛、氷酢酸、塩化アセチルからなる請求項２記載 の臨床検出方法。 ６．チュガーエフ試薬は塩化亜鉛、氷酢酸、塩化アセチルからなる請求項４記載 の臨床検出方法。 ７．チュガーエフ反応生成物は試験サンプルに以下のチュガーエフ試薬 （１）塩化アセチル、それから （２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項２記載の臨床検出方法。 ８．チュガーエフ反応生成物は試験サンプルに以下のチュガーエフ試薬 （１）塩化アセチル、それから （２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項４記載の臨床検出方法。 ９．臨床試験サンプル中に存在するコレステロール、リポたんぱく、同化ステロ イドあるいは他のステロイド生成物の量を決定するための臨床検出方法において 、該方法は、（ａ）上記試験サンプル中に存在するコレステロール、リポたんぱ く、同化ステロイドあるいは他のステロイド生成物と、光学的に活性な呈色反応 生成物を形成する過程と；（ｂ）約１５０ｎｍから７００ｎｍまでの範囲内の１ つ以上の別々の波長で、上記試験サンプルのＣＤ吸収を決定する過程とからなる 臨床検出方法。 １０．上記光学活性な呈色反応生成物は、チュガーエフ試薬と、上記コレステロ ール、リポたんぱく、同化ステロイドあるいは他のステロイド生成物との反応に より形成されたものである請求項９記載の臨床検出方法。 １１．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールの量が決定される請求項１ ０記載の臨床検出方法。 １２．上記反応生成物はチュガーエフ試薬と上記試験サンプル中に存在する上記 コレステロールとの反応により形成される請求項１１記載の臨床検出方法。 １３．ＨＤＬ−Ｃ及びＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−ＣレベルがＣＤ吸収により決定さ れ、総コレステロールレベルがＨＤＬ−ＣとＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃレベルを 加算することにより決定される請求項１１記載の臨床検出方法。 １４．更に、分光光度吸収により総コレステロールレベルを決定する過程を備え る請求項１１記載の、試験サンプル中のコレステロールの量を決定するための臨 床検出方法。 １５．総コレステロールレベルからＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃレベルを減算する ことにより、ＨＤＬ−Ｃレベルを決定する請求項１４記載の臨床検出方法。 １６．コレステロールの総量が吸収により決定され、ＬＤＬ−Ｃ＋ＶＬＤＬ−Ｃ とＨＤＬ−Ｃレベルを加算することにより決定された総コレステロールレベルと 比較される請求項１４記載の臨床検出方法。 １７．チュガーエフ試薬は塩化亜鉛、氷酢酸、塩化アセチルからなる請求項１０ 記載の臨床検出方法。 １８．チュガーエフ試薬は塩化亜鉛、氷酢酸、塩化アセチルからなる請求項１２ 記載の臨床検出方法。 １９．チュガーエフ反応生成物は試験サンプルに以下のチュガーエフ試薬 （１）塩化アセチル、それから （２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項１０記載の臨床検出方法。 ２０．チュガーエフ反応生成物は試験サンプルに以下のチュガーエフ試薬 （１）塩化アセチル、それから （２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項１２記載の臨床検出方法。 ２１．臨床血清試験サンプル中に存在するリポたんぱくの量を決定する臨床検出 方法において、該方法は、（ａ）約５．０から５．２のｐＨでリポたんぱくとの ビリルビン複合体を形成する過程と；（ｂ）約３７５から５７５ｎｍの範囲の少 なくとも１つの点に対する、上記試験サンプルのＣＤ吸収を決定する過程とから なる臨床検出方法。 ２２．上記リポたんぱくはα−リポーたんぱくである請求項２１記載の臨床検出 方法。 ２３．上記試験サンプルのＣＤ吸収は約４９５ｎｍで決定される請求項２１記載 の臨床検出方法。 ２４．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールの量を決定するための臨床 検出において、 上記コレステロールとの呈色反応生成物を形成し、該反応生成物の分光光度吸収 を決定する臨床検出方法。 ２５．上記呈色反応生成物はチュガーエフ試薬と上記臨床試験サンプルの少なく とも一部を反応させることにより形成する請求項２４記載の臨床検出方法。 ２６．呈色反応生成物は、チュガーエフ反応生成物を形成する試験サンプルに以 下の成分（１）塩化アセチル、それから（２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項２５記載の臨床検出方法。 ２７．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールリポたんぱくサブ分画の量 を決定するための臨床検出において、上記コレステロールリポたんぱくサブ分画 と呈色反応生成物を形成する過程と、該反応生成物の光学吸収スペクトルを決定 する過程とからなる臨床検出方法。 ２８．呈色反応生成物は以下の工程 （ａ）上記臨床試験サンプルの少なくとも一部をチュガーエフ試薬及びアルカリ 金属硫酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、遷移金属硫酸塩あるいは濃硫酸と反応さ せ、その分光光度吸収を決定する工程：（ｂ）上記臨床試験サンプルの少なくと も一部をチュガーエフ試薬及び硫酸デキストランあるいはアルカリ金属過塩素酸 塩と反応させ、その分光光度吸収を決定する工程； の少なくとも１つの工程を行うことにより形成される請求項２７記載の臨床検出 方法。 ２９．呈色反応生成物は、チュガーエフ反応生成物を形成する試験サンプルに以 下の成分（１）塩化アセチル、それから（２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項２８記載の臨床検出方法。 ３０．アルカリ金属硫酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、遷移金属硫酸塩、濃硫酸 、硫酸デキストランあるいはアルカリ金属過塩素酸塩が試験サンプルに添加され る前に、該試験サンプルに塩化アセチルが添加される請求項２９記載の臨床検出 方法。 ３１．工程（ａ）及び（ｂ）の両方が行われる請求項２８記載の臨床検出方法。 ３２．上記アルカリ金属硫酸塩は硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、及び硫酸カリ ウムからなる群から選択され、上記遷移金属硫酸塩は硫酸スカンジウム、硫酸チ タン、硫酸クロム、硫酸マンガン、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛、硫酸銅、及び硫酸 カルシウムからなる群から選択され、 上記アルカリ金属過塩素酸塩は過塩素酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、及び過 塩素酸カリウムからなる群から選択される請求項２８記載の臨床検出方法。 ３３．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールレベル及び少なくとも１つ のコレステロールリポたんぱくサブ分画のレベルを決定する臨床検出方法におい て、該方法は、（ａ）上記臨床試験サンプルの少なくとも一部とチュガーエフ試 薬混合物とを反応させ、その結果生じる反応混合物の分光光度吸収を測定する過 程と；過程（ｂ）と（ｃ）の少なくとも１つを行う過程からなる方法であり、該 過程（ｂ）と（ｃ）は、（ｂ）上記臨床試験サンプルの少なくとも一部をチュガ ーエフ試薬と、及びアルカリ金属硫酸塩あるいはアルカリ土類金属硫酸塩あるい は遷移金属硫酸塩あるいは濃硫酸と反応させ、形成された反応混合物の分光光度 吸収を決定する過程であり、（ｃ）上記臨床試験サンプルの少なくとも一部をチ ュがーエフ試薬と、及び硫酸デキストランあるいはアルカリ金属過塩素酸塩と反 応させ、形成された反応混合物の分光光度吸収を決定する過程である臨床検出方 法。 ３４．チュガーエフ試薬は試験サンプルに以下の成分（１）塩化アセチル、それ から （２）塩化亜鉛と氷酢酸 を連続して添加することにより形成される請求項３３記載の臨床検出方法。 ３５．アルカリ金属硫酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、遷移金属硫酸塩、濃硫酸 、硫酸デキストランあるいはアルカリ金属過塩素酸塩が試験サンプルに添加され る前に、該試験サンプルに塩化アセチルが添加される請求項３４記載の臨床検出 方法。 ３６．（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の過程がそれぞれ行われる請求項３３記載の臨 床検出方法。 ３７．（ａ）上記臨床試験サンプルの一部とチュガーエフ試薬混合物とを反応さ せ、その結果生じる反応混合物の分光光度吸収を測定する過程と；過程（ｂ）あ るいは（ｃ）を行う過程からなる方法であり、該過程（ｂ）と（ｃ）は、 （ｂ）反応混合物にアルカリ金属硫酸塩あるいはアルカリ土類金属硫酸塩あるい は遷移金属硫酸塩あるいは濃硫酸を添加し、それから新しく形成された反応混合 物の分光光度吸収を決定する過程であり（ｃ）反応混合物に硫酸デキストランあ るいはアルカリ金属過塩素酸塩を添加し、それから新しく形成された反応混合物 の分光光度吸収を決定する過程である請求項３３記載の臨床検出方法。 ３８、（ａ）及び（ｂ）の過程が行われる請求項３７記載の臨床検出方法。 ３９．（ａ）及び（ｃ）の過程が行われる請求項３７記載の臨床検出方法。 ４０．上記アルカリ金属硫酸塩は硫酸リチウム、硫酸ナトリウム、及び硫酸カリ ウムからなる群から選択され、上記遷移金属硫酸塩は硫酸スカンジウム、硫酸チ タン、硫酸クロム、硫酸マンガン、硫酸ニッケル、硫酸亜鉛、硫酸銅、及び硫酸 カルシウムからなる群から選択され、 上記アルカリ金属過塩素酸塩は過塩素酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、及び過 塩素酸カリウムからなる群から選択される請求項３３記載の臨床検出方法。 ４１．臨床試験サンプル中のコレステロールの量を決定する臨床検出方法におい て、該方法は、 （ａ）コレステロールと光学活性な呈色チュガーエフ反応生成物を形成する過程 と； （ｂ）第１の波長、あるいは代わりに第１及び第２の波長におけるＣＤ吸収によ り試験サンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を決定する過程と； （ｃ）第３の波長におけるＣＤ吸収により上記サンプル中に存在するＬＤＬ＋Ｖ ＬＤＬコレステロールの量を決定する過程と；（ｄ）試験サンプル中に存在する 総コレステロールの量を決定する過程とからなる臨床検出方法。 ４２．臨床試験サンプル中に存在するコレステロールの量を決定する臨床検出方 法において、該方法は、（ａ）コレステロールと光学活性な呈色チュガーエフ反 応生成物を形成する過程と； （ｂ）一定の波長における分光光度吸収により試験サンプル中に存在する総コレ ステロールの量を決定する過程と；（ｃ）同じ波長におけるＣＤ吸収により試験 サンプル中に存在するＶＬＤＬ＋ＬＤＬコレステロールの量を決定する過程と； （ｄ）試験サンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を決定する過程とか らなる臨床検出方法。 ４３．試験サンプル中のコレステロールの量を決定する臨床検出方法において、 該方法は、 （ａ）コレステロールと光学活性な呈色チュガーエフ反応生成物を形成する過程 と； （ｂ）第１の波長、あるいは代わりに第１及び第２の波長におけるＣＤ吸収によ り試験サンプル中のＨＤＬコレステロールの量を決定する過程と； （ｃ）第３の波長におけるＣＤ吸収により試験サンプル中に存在するＬＤＬ＋Ｖ ＬＤＬコレステロールの量を同時に決定する過程と；（ｄ）第３の波長における 分光光度吸収により試験サンプル中に存在する総コレステロールの量を決定する 過程とからなる臨床検出方法。 ４４．試験サンプル中のコレステロールの量を決定する検出機器において、該機 器は、 第１の波長、あるいは代わりに第１及び第２の波長におけるＣＤ吸収により試験 サンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を決定する手段と； 第３の波長におけるＣＤ吸収により上記試験サンプル中に存在するＬＤＬ＋ＶＬ ＤＬコレステロールの量を決定する手段と；試験サンプル中に存在する総コレス テロールの量を決定する手段とからなる検出機器。 ４５．試験サンプル中の総コレステロールの量は計算あるいはコンピュータによ り決定される請求項４４記載の検出機器。 ４６．試験サンプル中の総コレステロールの量は第３の波長における分光光度吸 収により決定される請求項４４記載の検出機器。 ４７．試験サンプル中のコレステロールの量を測定する検出機器において、該機 器は、 一定の波長における分光光度吸収により試験サンプル中に存在する総コレステロ ールの量を決定する手段と；同じ波長におけるＣＤ吸収により試験サンプル中に 存在するＶＬＤＬ−ＣとＬＤＬ−Ｃコレステロールの量を測定する手段と；試験 サンプル中に存在するＨＤＬコレステロールの量を決定する手段とからなる検出 機器。 ４８．サンプル中のＨＤＬコレステロールの量は計算あるいはコンピュータによ り決定される請求項４７記載の検出機器。 ４９．サンプル中のＨＤＬコレステロールの量はＣＤ吸収により決定される請求 項４７記載の検出機器。 ５０．試験サンプル中のコレステロールレベルを測定するための分光光度検出機 器において、該機器は、第１の波長で試験サンプル中のＴＣの量を直接決定する 分光光度吸収手段と； 第２の波長で試験サンプル中のＨＤＬ−Ｃの量を直接決定する分光光度吸収手段 と； 試験サンプル中のＬＤＬ−ＣとＬＤＬ−Ｃの結合量を計算するための手段とから なる検出機器。 ５１．さらに、第３の波長で試験サンプル中のＶＬＤＬ−Ｃの量を直接決定する ための分光光度吸収手段と；試験サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を計算又は演算す る手段とを備える請求項５０記載の分光光度検出器。