JPH05504132A - 活性化されたリンパ球の除去 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 活性化されたリンパ球の除去 哺乳動物の場合の免疫系の本質的な要素は、Ｔ−リンパ球およびＢ−リンパ球で ある。この特異的な受容体は、その発生の間に抗原に対して形成され、したがっ て全てのこの種のリンパ球は、その寿命の残りのために唯１つの抗原に対して特 異性を得る。記憶細胞を含めて静止リンパ球（小リンパ球）は、体組織およびリ ンパ器官ならびに体液によって循環し、したがって抗原の発生に関連して体を監 視する。特異的抗原が発生した場合には、抗原によって誘発されたリンパ球の増 殖は、活性化された大リンパ球の形成下に行なわれる。また、この増殖は、試験 管内でリンパ系細胞を特異的抗原と一緒に培養することによって示すこともでき る。また、同じ系を用いて、炭水化物からなる特異的細胞表面決定基を結合しか つ架橋する分裂促進因子レシチン、即ち蛋白質はリンパ系細胞を同様に刺激する ことを示すこともできる。最後に、抗原によるかまたは分裂促進因子によるリン パ球の活性化は、リンパ球を成熟させてリンパ芽球に変える。実験的に、リンパ 球の分裂促進因子による刺激は、例えばヒトを起源にする場合ならびに動物を起 源にする場合に、Ｔ−細胞の際にはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびコン カナバリンＡ　（Ｃｏｎ）によって触発されることができ、Ｂ−細胞の際には、 リボ多糖（ＬＰＳ）によって触発されることができる。

従って、−次免疫応答は、それぞれ抗原または分裂促進因子に特異的なリンパ球 の刺激の結果であり、したがってこの特異的リンパ球は、静止状態から活性化状 態に移行し、大リンパ球になり、この大リンパ球は、増殖し、かつエフェクター 細胞（例えば、細胞毒性機能もしくは別の機能を有するＴ−細胞または成熟Ｂ− 細胞から形成される抗体形成血漿細胞）または記憶細胞と区別される。更に、静 上記憶細胞の活性化によって、二次免疫応答が触発され、この二次免疫応答は、 再びエフェクター細胞および記憶細胞を惹起する。

更に、−次または二次の免疫応答によって、望ましい後続現象ならびに望ましく ない後続現象が生じる。

多くの場合に望ましくない後続現象には、例えば移植に対する反撥、アレルギー 性反応等が属する。一般的に、この後続現象は、外部抗原によって惹起された既 得の免疫的疾病または現象と呼ばれる。

静止リンパ球の性質を不利に変えることなしに、選択的に活性化されたリンパ球 を除去することができるであろう場合には、それによって一般に、外部抗原によ り惹起される既得の免疫的疾病を阻止することができる。こうして、例えばアレ ルギー性反応ならびに移植に対する反撥を阻止することができる。

従って、本発明の課題は、静止リンパ球を損なうことなく、殊に抗原もしくは分 裂促進因子による刺激可能性に関連して静止リンパ球に不利な影響を及ぼすこと なしに活性化された特異的リンパ球を除去することができる１つの薬剤を提供す ることである。

この課題は、哺乳動物の場合に抗原または分裂促進因子により活性化されたリン パ球を除去するために、以下ＥＴ１８０ＣＨ３と呼ばれる２−メチル−１−才ク タデシルグリセロ−（３）−ホスホコリンの使用によって解決されるかまたは抗 原または分裂促進因子により活性化されたリンパ球を除去するための医薬品を製 造するためにＥＴ１８０ＣＨ３の使用によって解決される。

ＥＴ１８０ＣＨ３およびその製造は、公知である。

更に、ＥＴ１８０ＣＨ３を、腫瘍（ドイツ連邦共和国特許出願公開第２６１９６ ８６号明細書（Ａｌ））および多発性硬化症（ドイツ連邦共和国特許出願公開第 ３５３０７６７号明細書（Ａｌ））に抗する薬剤として使用することができるこ とは、公知である。本発明によって示されるように、活性化されたリンパ球の特 異的除去は、そのことから導き出すことはできなかった。本発明は、ＥＴ１８０ ＣＨ３が選択的に抗原または分裂促進因子によって活性化されたリンパ球を除去 するという認識に基づく。しかし、ＥＴ１８０ＣＨ３の作用がより長くとも静止 リンパ球に不利な影響を及ぼさず、かつ事後の抗原または分裂促進因子による刺 激を可能にする。殊に、ＥＴ１８０ＣＨ３の使用がより長くとも生体内での免疫 反応に対して決して不利な影響を発揮せず、しかもＢ−細胞反応ならびにＴ−細 胞反応のために決して不利な影響を発揮しないことが見い出された。

従って、本発明による新規の適用法により、選択的に活性化された大リンパ球を 除去し、ひいてはこのリンパ球によって触発された免疫反応を抑制することがで きる。同時に静止リンパ球は不利な影響を及ぼさないので、免疫系の作用は、本 発明による薬剤によってそれ自体損なわれることはない。このことは、これまで に公知の免疫抑制剤と比較して１つの本質的な利点であり、この利点により、常 に全免疫系に影響が及ぼされかつそれによって別の抗原および分裂促進因子と比 較して生物体の防御能力は決定的に弱められた。

ＥＴ１８０ＣＨ３の有効投与量は、投与方法に依存する。一般に、ヒトに投与す る場合には、経口投与で毎日１人当たり１０〜１０００ｍｇの用量が使用される 。例えば、作用物質をミルクのような適当な担持剤中に溶解することによって実 施可能である前記適用方法の場合には、特に毎日１人当たり３０〜３００ｍｇが 使用される。注入による投与の場合には、この用量は、なお明らかに上昇させる ことができる。局所投与の場合には、常法で使用された作用物質濃度がこの場合 にも当てはまる。

次の例により本発明を図面と関連付けて詳説する。

各図面は、次のことを表わす。

第１Ａ図は、細胞活性剤を添加した際のリンパ球活性の尺度としての３Ｈ−チミ ジンの組込みを表わし、第１Ｂ図は、１日目にＥＴ１８０ＣＨ３を添加した際の 細胞活性剤の影響下でのリンパ球による３Ｈ−チミジンの組込みを表わし、 第１Ｃ図は、２日目にＥＴ１８０ＣＨ３を添加した際のｒＢと同様の表示を表わ し、 第１ＩＡ図は、刺激されたリンパ球中への３Ｈ−チミジンの組込みを表わし、第 １１Ｂ図は、第１１Ａ図と同様の表示を表わすが、しかしＥＴ１８０ＣＨ３を投 与した後に初めて細胞を刺激した際にＥＴ１８０ＣＨ３を添加した場合の表示を 表わし、 第１ＩＣ図は、刺激もなくＥＴ１８０ＣＨ３の添加もない対照の場合の結果を表 わし、 第１ＩＩＡ図は、特異的抗体によって生産される細胞の生成に対するＥＴ１８０ ＣＨ３の影響を示し、第１１１Ｂ図は、ＥＴ１８０ＣＨ３により前処理した場合 およびＥＴ１８０ＣＨ３による前処理なしの場合のＴ−リンパ球によるチミジン の組込みを示し、第１１１０図は、Ｂ−リンパ球の場合の第１１１Ｂ図と同様の 結果を示す。

例１ Ｂａ１ｂ　Ｃのマウスの肺臓細胞からＴ−リンパ球をナイロンウールに通すこと によって単離した。引続き、このＴ−リンパ球をポリクロナ細胞ニー細抱活性剤 Ｃｏｎ　Ａまたは抗−ＣＤ３−抗体を有する培地中で活性化するかまたは対照の ためにＢ−細胞活性剤ＬＰＳを有する培地中で活性化した。それぞれ培地の半分 に１日後または２日後にＥＴ１８０ＣＨ３（１０μｇ　／　ｍ　］　）を添加し た。別の半分は、対照として使用した。３日目の培養日に全培地に３Ｈ−チミジ ンを添加し、その組込みを４日目に測定した。

第１Ａ図は、Ｃａｎ　Ａまたは抗−ＣＤ３−抗体を用いてポリクロナール活性化 した後に高められた３Ｈ−チミジン組込みの形の細胞の予想すべき刺激を示す。

Ｂ−細胞分裂促進因子ＬＰＳの添加後に僅かな勾配の上昇は、なお残りのＢ−リ ンパ球が培地中に存在していたことを意味する。この全ての活性化の結果は、１ 日目のＥＴ１８０ＣＨ３の培地への添加（第１Ｂ図参照）によって完全に抑制さ れ、２日目の添加（第１Ｃ図）によってなお同様に完全に抑制された。

このことから、ＥＴ１８０ＣＨ３は、試験管内でマウスのＴ−リンパ球およびＢ −リンパ球の増殖を実際に完全に阻止することが判明する。利用された活性剤は 、約２４時間後に第１の細胞分布を生じ、したがってＥＴ１８０ＣＨ３は、この 時点で添加され、また第１のＳ−期への細胞の侵入を阻止することができる。

しかし、またＥＴ１８０ＣＨ３の添加により４８時間後になお殆ど完全な抑制が 生じるので、この結果、既に増殖された細胞であってもＥＴ１８０ＣＨ３に対し て著しく敏感であることが証明された。

例２ リンパ球の集団から活性化された細胞および増殖された細胞のみを特異的に除去 し、その代わりに静止する場所を開けて置（ようにＥ　Ｔ　１８０　ＣＨ’３を 適当な濃度で利用することができるか否かを確認するために、次の試験を実施し た・　ナイロンウールを通して精製されたＢａ１ｂ　Ｃ７ウス（Ｈ−２’）のＴ −リンパ球をＣ５７Ｂ１６マウス（Ｈ−２’）の肺臓細胞と一緒に“混合リンパ 球反応”の範囲内で共培養した。

培地ノ半分に３日目（７）ＥＴ１８０ＣＨ３（１０μｇ／ｍ＋）を添加し、別の 半分を対照として使用した。もう１つの対照細胞は、専らＥＴ１８０ＣＨ３なし にＢａ１ｂ　ＣＴ−リンパ球から成り立っていた。培養の７日後に、全細胞をＥ Ｔ１８０ＣＨ３の除去のために洗浄し、かつ再びＣ５７Ｂ１６マウスの細胞もし くはＣＢＡマウス（Ｈ−２’）の細胞を用いる培養の際にポリクロナールニー細 胞活性剤Ｃｏｎ　Ａもしくは抗ＣＤ３抗体またはＢ−細胞分裂促進因子ＬＰＳで 刺激した。更に、３日後に３Ｈ−チミジンを添加し、かつその組込みを数日後に 測定した。

第１ＩＡ図は、ＥＴ１８０ＣＨ３なしの対照を用いた結果を示す。この場合には 、この培地も他の添加剤なしに既にチミジンの比較的に高いバックグランドの組 込みを示し、この組込みにより刺激後の他の増大を遮蔽することに注目すること ができる。この場合には、唯１つＣｏｎ　Ａが組込みの重要な増大を生じた。

第ＦＩＢ図ニハ、ＥＴ　１８０ＣＨ３（７）添加量ヲ有スる培地の結果が示され ている。この場合、非特異的バックグランドの値は、完全に消失し、それという のも非特異的に増殖する細胞は除去されているからであった。また、Ｃ５７Ｂ１ ６細胞で再刺激された培地は、もはや３Ｈ−チミンン組込みを示さなかった。し かしよび特にＣｏｎ　Ａおよび抗ＣＤ３抗体に対する極めて良好な反応は、注目 すべきものである。ＬＰＳは全く刺激を生じなかった。それというのも、Ｂ−リ ンパ球は培養の進行中に死滅してしまったからである。

第１１Ｃ図は、ＥＴ１８０ＣＨ３なしで全く刺激されていない対照を用いた結果 を示す。Ｃｏｎ　Ａをも用いた重要な刺激の結果の欠陥は、刺激されてないマウ スのリンパ球が９日の培養期間の間に劣悪な状態で放置されたことによって解明 することができる。

この結果は、特異的に同種抗原、この場合にはＣ５７Ｂ１６マウスのＨ−２″に よって増殖のために活性化されたＴ−リンパ球がＥＴ−１８の存在下に完全に除 去されたことを示す。しかし、これとは異なり、静止状態で変わらない別の抗原 特異性のＴ−リンパ球は、そのままであるだけでなく、事後になお極めて良好に 増殖のために活性化可能であった。このことは、ＣＢＡ、Ｃｏｎ　Ａおよび抗Ｃ Ｄ３抗体に対する反応によって証明された。全く刺激されてないリン／（球（第 １１Ｃ図）がＥＴ１８０ＣＨ３なしでももはや刺激不可能であることは、ＥＴ１ ８０ＣＨ３が静止細胞を概して損なわないことを示す。

即ち、この試験は、ＥＴ１８０ＣＨ３により抗原−特異的に活性化されたＴ−細 胞クローンを選択的に除去することができるが、しかし別の抗原特異性のＴ−細 胞はそれに該当せず、かつ十分に反応性のままであることを示す。

例３ Ｃ５７ｂ１６マウスをそれぞれ古典的なキャリヤー−ハプテン−抗原ＴＮＰ−Ｋ ＬＨ（トリニトロフェニル鍵穴リンビットヘモシアニン）１００μｇで免疫処置 した。８週間の後、この動物は、それぞれＴＮＰ−ＫＬＨ３０μｇの二次免疫注 射を受けた。それと同時におよび更に毎日、全部で５日間、動物の一部に毎日動 物１匹当たりミルク中のＥＴ１８０Ｃ８３１ｍｇを胃ゾンデを用いて与え、別の 動物には、ＥＴ１８０ＣＨ３なしのミルクを与えた。二次免疫注射後もしくは第 １のＥ　Ｔ　１８０　ＣＨ３の投与後１週間を経てから、動物の膵臓を取り出し た。ＥＴ１８０ＣＨ３を有する免疫化されてない動物の膵臓およびＥ　Ｔ　１８ ０　ＣＨ３を有しない免疫化されてない動物の膵臓は、対照として使用した。

１ｇＭ種またはＩｇＧ種の抗−ＴＮＰ＝特異的抗体を生産するＢ−リンパ球の検 出のために、膵臓細胞の一部を用いて直接的および間接的に溶血プラーク試験を 実施した。

第１１１Ａ図は、特異的抗体を生産する細胞の生成は生体内でＥＴ１８０ＣＨ３ によって影響を及ぼされなかったことを示す。このデータの特異性は、免疫処置 されていない動物の場合にバックグランド値に相当する抗体を生産する小数の細 胞によって示される。

この結果は、ＥＴ１８０ＣＨ３が抗原を与えた後に特異的抗体を生産するＢ−燐 ばきゅうによって測定された、−次または二次体液性免疫反応に対して生体内で 抑制作用を発揮しないことを示す。

上記の膵臓細胞の他の一部を試験管内で培養し、かつＫＬＨ（Ｔ−リンパ球の再 刺激）もしくはコンカナバリンＡ（一般のＴ−細胞分裂促進因子）またはＴＮＰ −ＫＬＨ（Ｂ−リンパ球の再刺激）もしくは５ＲＢＣ（試験管内でのＢ−リンパ 球の一次刺激のためのヒツジ赤血球）を添加した。

Ｔ−細胞反応を３Ｈ−チミジン組込みによる増殖試験で測定し、Ｂ−細胞反応を 溶血プラーク試験で測定した。

第１１１Ｂ図は、左側が生体内でのＥＴ１８０ＣＨ３の前処理なしの動物の場合 、右側が生体内でのＥＴ１８０ＣＨ３の前処理をした動物の場合のＫ　Ｌ　Ｈに よって再刺激されかつＣｏｎ　Ａによって活性化されたＴ−リンパ球のチミジン の組込みを示す。このことは、ＫＬＨによる再刺激が用量に依存しかつ特異的で あることを示す。ＥＴ１８０ＣＨ３を用いる動物の生体内での前処理は、Ｔ−細 胞の再刺激もしくは分裂促進因子の刺激に対して何らの不利な効果も示さなかっ た第１１１Ｃ図は、Ｂ−リンパ球を用いた場合の結果を示す、ＴＮＰ−ＫＬＨを 用いての再刺激は特異的であり、ならびに５ＲＢＣを用いての一次刺激も特異的 である。この場合にも、ＥＴ１８０ＣＨ３で前処理された動物の細胞は、少なく とも対照の動物の場合と同様に良好に反応する。従って、静止Ｔ−細胞ならびに 静止Ｂ−細胞は、ＥＴ１８０ＣＨ３の投与後であっても刺激可能性を維持したま まである。

第１図 工）Ｂａｌｂ／［ｔ＋・・・・−・リ　ＥＴ１８　４”４１１４Ｉ＠応する刺激 □チミジンの組込み 第■図 Ｉｕｌ中７１週間後”　２．４　Ｘ　１０’　０．Ｉ　Ｘ　１０’　１．３　Ｘ 　１０’活性化された細胞 全細胞の全体数　−１０’　−１０’　−１０’第１Ａ図 ＥＴ　１Ｂ　−生体内試験 試験トプラーク試験（即座）　抗原・ＴＮＰ−ＫＬＨ前免疫処置した　免疫処置 してな一１ 第１８図 第１Ｃ図 ＩＩＩ）　Ｂｗａ胞ノ再刺激−７日後のプラーク試験全部で３ｍ］の試験　生体 内処理の効果なしく５χＩｍｇ　ＥＴＩｌｉ経口）要　約　書 ２−メチル−１−オクタデシルグリセロー（３）−ホスホコリンは、哺乳動物の 場合に抗原または分裂促進因子により活性化されたリンパ球を除去するために好 適である。

国際調査報告 ｍ、ＭｕａＲＩｌ　Ａｌｅｌｌｕｌｌｌ、軸。　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０２２３ ３ＳＡ　４２４８０

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の場合に抗原または分裂促進因子により活性化されたリンパ球を除 去するための２−メチル−１−オクタデシルグリセロ−（３）−ホスホコリンの 使用。
2. ２．抗原または分裂促進因子により活性化されたリンパ球を除去するための医薬 品の製造のためのＥＴ１８ＯＣＨ３の使用。