JPH05504560A - ほ乳類サイトカイン、ｉｌ―１１ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 は乳類サイトカイン、ＩＬ−１１ 本発明は、免疫および造血系細胞の機能を刺激する新規サイトカイン、およびこ の因子を得る方法および組換え遺伝子工学技術によるその製法に関するものであ るっ 発明の背景 免疫系の細胞間にシグナルを送達する調節蛋白質の増殖性の一部が同定された。

これらの調節分子はサイトカインとして知られている。サイトカイン類の多くは 、造血および免疫系細胞の生長および発達、並びに生物活性を制御することが見 出されている。これらの調節分子には、コロニー刺激因子（例、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、 Ｇ−Ｃ５Ｆ。

Ｍ−Ｃ３ＦおよびマルチＣ３Ｆまたはインターロイキン−３）、インターロイキ ン１（ＩＬ−１ないしＩＬ−９）、インターフェロン類（アルファ、ベータおよ びガンマ）、腫よう壊死９子（アルファおよびベータ）、エリスロポイエチン、 マクロファージ阻止蛋白質、腫よう増殖因子および白血病阻止因子（ＬＩＦ）が 全て含まれる。これらのサイトカインは、骨髄、末梢血、飽充肝臓、および他の リンパまたは造血器官からの標的細胞による広い範囲の生物活性を呈する。

例えば、Ｆ、ＲバークウィルおよびＦ、パーク、「イミュノロジー・トウディ」 、１０（９）：２９９（１９８９）、Ｇ、ウォングおよびＳクラーク、「イミュ ノロンー・トウディ」、９（５）：　１３７（１９８８）並びにＳ、Ｃクラーク およびＲカーメン、「サイエンス」、２３６：１２２９−１２３７（１９８７） 参照。

ある種のサイトカイン類の生化学的および生物学的同定および特性検定は、天然 供給源、例えば血液および尿から入手され得る少量の天然因子により阻害された 。最近、サイトカイン類の多くは、分子クローン化され、異種的に発現され、均 一に精製された。これらの精製因子の幾つかは、ＧＭ−Ｃ８Ｆ、　Ｍ−Ｃ３Ｆ、 Ｇ−Ｃ８Ｆ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、Ｉ　Ｌ−３、Ｉ　Ｌ−６、ＩＬ−７、ＴＮＦ 、インターフェロン類およびエリスロポイエチンを含め、インビボ造血および免 疫系に対して調節作用を示すことが見出されている。

当業界では依然として、免疫応答性および造血細胞の発達を刺激または促進し、 医薬用途に適した、天然供給源から精製されるかまたは別法により均一形態で製 造される追加的蛋白質が要望されている。

発明の要旨 一態様において、本発明は、実質的に他のは乳類蛋白質を含まない、ＩＬ−１１ と呼ばれる新規は乳類サイトカインを提供する。この蛋白質は、組換え遺伝子工 学技術により製造され得る。また、それは、因子を自然にまたは他の因子により 誘導されて産生ずる細胞供給源から精製され得る。また、ＩＬ−１１は、化学技 術または上記で列挙した技術の組み合わせにより合成され得る。

活性を示す成熟は乳類ＩＬ−１１は、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルア ミド・ゲル電気泳動においてＩ　Ｌ−１１ｃＤＮ、Ａ　トランスフェクションＣ Ｏ３−１細胞から誘導された３３８メチオニン標識上清液を分析することにより 測定すると、約２０ｋｄの見かけ上の分子量を特徴とする、約１７８アミノ酸蛋 白質である。成熟蛋白質について計夏された分子量もまた約２０ｋｄである。

この発明のＩＬ−１１蛋白質は様々な検定で生物活性を表し、様々な造血および 免疫機能の一般的刺激因子としてのその役割を示している。この発明のＩＬ−１ １蛋白質は、ＩＬ−６依存性マウス・プラズマサイトーマ・セルライン、Ｔ１１ ６５において増殖活性を示す。またＩＬ−１１は、予備検定においてＢ細胞の成 熟を直接的または間接的に刺激する能力を立証した。具体的には、ＩＬ−１１は 、Ｂ細胞のＴ細胞依存的発達を刺激すると考えられている。さらにそれは、血小 板生成細胞の増殖を刺激する検定でＩＬ−３との相乗作用を示すが、他の系列に も同様に作用し得る。

本発明の別の態様は、は乳類Ｉ　Ｌ−１１蛋白質の発現をコードするＤＮＡ配列 である。このＤＮＡ配列は、上述されているは乳類ＩＬ−１１蛋白質の発現をコ ードする単離されたＤＮＡ配列を含み得る。活性ＩＬ−１１をコードするＤＮＡ 配列は、第１表と同一または実質的に同一のヌクレオチド配列またはそのフラグ メントを含むことを特徴とする。このＤＮＡ配列は、ＩＬ−１１暗号化配列に近 接する５°および３°は乳層非暗号化配列を含み得る。また、Ｄ　Ｎ　Ａ配列は 、アミノ末端シグナルペプチドをコードし得る。第１表は、これらの非暗号化５ °および３゛近接配列並びに霊長動物セルラインＰＵ３４から単離され、ＣＯ５ −１細胞で発現されたは乳類ＩＬ−１１のシグナル配列を示している。

しかしながら、この発明のＤＮＡ配列は、これらの近接またはシグナル配列の幾 つかまたは全部を除外し得るものと理解される。さらに、生物活性は乳類ＩＬ− １１蛋白質をコードする本発明のＤＮＡ配列はまた、表１の単離されたＤＮＡ配 列と、適当な条件下でハイブリダイゼーシヨンし得るか、または前記条件下でハ イブリダイゼーションし得るが遺伝子コードの縮重については除外したＤＮＡを 含み得る。すなわち、この発明のＤＮＡ配列は、対立遺伝子的改変、種改変また は意図的な修飾に基づいた非暗号化配列、シグナル配列または暗号化配列におけ る修飾を包含または含有し得る。

また、本発明は、ベクターＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子およびは乳類ＩＬ−１ １をコードするＤＮＡ配列を提供する。ＤＮ、４分子は、選択された宿主細胞に おいてＴＬ−１１の復製および発現を指図し得る調節配列を機能し得る形で随伴 したＩＬ−１１ＤＮＡを提供する。また、本発明は、組換えＩＬ−１１蛋白質の 発現に使用される、前記ＤＮＡ分子により形質転換された宿主細胞を提供する。

本発明のＤＮＡ分子および形質転換細胞は、別の態様、すなわち組換えは乳類Ｉ Ｌ−１１蛋白質またはそのペプチドフラグメントの新規製造方法で使用される。

この方法において、蛋白質発現を制御し得る適当な調節または発現制御配列を機 能し得る形で随伴したＩＬ−１１蛋白質またはそのフラグメントの発現をコード するＤＮＡ配列（または上記組換えＤＮＡ分子）により形質転換されたセルライ ンは、組換えＤ　Ｎ　Ａの発現を可能にする適当な条件下で培養される。

次いで、この発現されたＩＬ−１１蛋白質を、適当な慣用的手段により客玉細胞 または培養培地から採取する。この主張されている方法は、蛋白質発現用宿主細 胞として若干の既知細胞を使用し得る。

現時点でＩＬ−１１の製造に好ましいでルラインは、は乳類セルラインおよび細 菌細胞である。

この発明の別の態様は、は乳類ＩＬ−１１またはその１種もしくはそれ以上の生 物活性ペプチドフラグメントの治療有効量を含む医薬組成物を提供する。これら の蛋白質またはペプチドフラグメントは、医薬的に許容し得る賦形剤により製剤 化され得る。これらの医薬組成物は、造血細胞の数または活性レベルの欠乏を特 徴とする疾患状態の処置方法において、単独または他の適当な薬剤と組み合わせ た形で使用され得る。ＩＬ−１１を含む医薬組成物はまた、免疫系の疾患、例え ば免疫不全症の処置に使用され得る。

ＩＬ−１１含有組成物は、ＩＬ−３と相乗作用した状態で血小板生成細胞の生長 および分化を刺激するのに使用され得る。追加的な使用領域には、血小板形成、 後天的な化学療法または骨髄関連血小板減少症がある。また、ＩＬ−１１は、エ フェクター分子として作用することにより、他のサイトカインの機能を改善する と思われる。

ＩＬ−１１組成物はまた、Ｂ細胞の産生または機能を直接的または間接的に刺激 するのに有用であり得る。すなわち、ＩＬ−１１組成物は、癌治療、感染症の処 置、創傷治癒の促進および免疫系全般の刺激に使用され得る。ＩＬ−１１はまた 、ある種の抗原、特にワクチンに対する免疫応答を強化するのに使用され得る。

従って、この発明のさらに別の態様は、患者に対し、適当な医薬用担体と共にＩ Ｌ−１１またはそのペプチド・フラグメントの治療有効量を投与することによる 、これらおよび／または池の病的状態の処１方法である。これらの治療方法は、 ＩＬ−１１またはそのペプチドフラグメントと同時またはそれに続いて少なくと も１種の他のサイトカイン、ヘマトポイエチン、インターロイキン、成長因子ま たは抗体の有効量を投与することを含み得る。

本発明のさらに別の態様は、は乳類ＩＬ−１１またはそのペプチドを指向した抗 体である。従って、この態様の一部として、本発明は、前記の抗体を分泌し得る セルラインおよびそれらの製造方法を主張している。

本発明の他の態様および利点は、さらに後記の本発明の好ましい態様の詳細な記 載中に記載されている。

図面の簡鳳な記載 箪１図は、不ズミ・ブラークー形成検定における、ｐＣＩＲ６−トランスフェク ションｃｏｓ−１細胞条件培地によるネズミＮＰ−反応性Ｂ細胞の発達の向上性 を描いた図である。

第２図は、ネズミ・フィブリン・クロット検定における、ｐｃＩＲ６−ドランス フエクンフンｃｏｓ−１細胞条件培地によるＩ　Ｌ−３依存性ネズミ血小板生成 細胞コロニーの発達の向上性を描いた図である。

発明の詳細な記載 本発明は、他のは乳類蛋白質および蛋白質様物質の随伴を実質的に含まない形態 での、生物活性は乳類サイトカイン、ＩＬ−１１を提供する。この蛋白質は、治 療適用に有用な純粋活性ＩＬ−１１の大量生産を可能にする組換え技術により製 造され得る。別法として、この蛋白質は、それを分泌または発現するは乳類セル ラインから精製された均一蛋白質として入手され得る。さらにＩＬ−１１または その活性フラグメントは、化学的に合成され得る。

は乳類ＩＬ−１１は、最初、長期培養中に健康なマヵークサルから得られた骨髄 細胞を置き、それらをレトロウィルスＵ１９−５で感染させることにより生長さ せた霊長動物セルラインから単離された［ドクター・ロジャー・コーン、タフツ ・メディカル・スクール］。

適当な抗生物質とのインキニベーシフン後、ＰＵ３４と命名された生きたセルラ インを、その生長特性に関して選択し、エシェリヒア・コリで発現させたＩＬ− １アルフアにより誘導した。条件培地は、Ｉ　Ｌ−６に対する中和性抗体の存在 下、Ｉ　Ｌ−６依存性マウス・プラズマサイトーマ細胞を用いた増殖検定におい て活性を示した。例えばＧ、Ｇ　ウォング等、「サイエンス」、２２８：８１０ −８１５（１９８５）、ＹＣ，ヤング等、「セル」、４７：３−１０（１９８６ ）、およびＡ、Ｅ　ナーメン等、「ネイチャー」、３３３：５７１−５７３（１ ９８８）に既に記載されている発現クローニング方法に従い、ＩＬ−１−刺激（ ２４時間２μ／ｍ１ｌＬ−１）ＰＵ３４細胞ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリー を製造した。

は乳類細胞、例えばＣ０８−１細胞においてｃＤＮＡ挿入体の発現を可能にする 発現ベクター中にライブラリーを構築した。２００−５００ｃＤＮ、Ａクローン のプールから製造された５μｇのＤ　Ｎ　ＡでＣＯ３−１細胞をトランスフェク ションすることにより、ライブラリーのスクリーニングを行った。Ｔ１１６５検 定で活性に関して上清液を検定することにより、ＩＬ−１１活性を発現するｃＤ ＮＡクローンが同定された。

Ｔ１１６５活性を有する単離クローンは、ｐＰ’Ｕ３４−ＴＲＡ（ｐＣＩＲ６と も呼ばれる）と命名され、配列決定された。表１は、■Ｌ−１１ポリペプチドの 霊長動物およびヒト・クローンの両方のＣＤＮＡ配列およびアミノ酸配列（１文 字コード）を示す。霊長動物配列における１−７２１位のヌクレオチド配列は、 ｐｃＩＲ６がら得られた。残りのヌクレオチド７２１−１１０２は、ｐｃＩＲ６ とのハイブリダイゼーションにより単離された第２霊長動物ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから 配列決定された。ＩＬ−１１のプラズマサイトーマ刺激活性をコードするヒトｃ ＤＮ、Ａは、ｐＰＵ３４−ＴＲ，Ａ（ｐｃＩＲ６）からの挿入体との直接ハイブ リダイゼーションにより、ヒト肺セルラインＭＲＣ５［シャコブス等、「ネイチ ャー」、２２７：４３（１９７０）により記載コから製造されたｃＤＮＡライブ ラリーから単離された。ヒトＩ　Ｌ−１１ヌクレオチド配列から見出される差異 は、表１において１長動物配列の上に示されており、アミノ酸配列に生じた変化 は霊長動物配列における適当なアミノ酸の下に示されている。

霊長動物ヌクレオチド配列は１１００塩基対を含む。霊長動物配列は、７２１基 対の５′非暗号化配列を含む。また、表１の配列は、４３】塩基の３゛非暗化配 列を示す。同じ（ヒト・ヌクレオチド配列は、５９７ヌクレオチドの単一の長い 転写解読枠を含んでいた。

霊長動物およびヒト配列は、両方とも、第１表の霊長動物ヌクレオチド７３位か ら始まる非プロセシング１９９アミノ酸ポリペプチドを予測させる単一の長い転 写解読枠を特徴とする。霊長動物およびヒト・クローンの両方から得られたＩＬ −１１の予測されたアミノ酸配列における（１）位Ｍｅｔから（２１）位、へ１ ａまでの最初の２１アミノ酸は、慣用的は乳類分泌リーダー配列［Ｄ　ベールマ ン等、「ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー」、１６７・３９１− ４０９（１９８３）］と類似した疎水性アミノ酸の範囲を含む。成熟ＩＬ−１１ 蛋白質のＮ−末端（表１の下線部）は、アミノ酸配列ＰＲＯ−ＧＬＹ−ＰＲＯ− ＰＲＯ−ＰＲＯ−ＧＬＹにより構成される。まず、この蛋白質は、ヌクレオチド ３１３４−１３５間が蛋白質加水分解的に開裂された１９９アミノ酸の前駆体と して合成され、アミノ酸２２−２３位の配列Ｐｒｏ−Ｇｌｙから始まり、ヌクレ オチド６７１−６７２位のＴＧＡ終止コドンのアミノ酸１９９位の後で終わる成 熟１７８アミノ酸ポリペプチドが得られる。成熟蛋白質の計賞された分子質量は 、Ｉ　Ｌ−１１ｃＤＮＡ　トランスフェクションＣ０８−１細胞から誘導された 上清液の５ＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）により現れた新規蛋白賃帯の見かけ上の 分子量と完全に対応しており、両場合とも約２０ｋｄである。

第１表 霊長動物およびヒトＩＬ−１１配列、５°−３′ヒトおよび霊長動物配列間の差 異は、霊長動物ヌクレオチド配列上方の塩基および霊長動物アミノ酸配列下方の アミノ酸により示されている。

ＧＧＧＡＡＧＧＴＧＧ　ＡＡＧＧＧ’ＩＴＭＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴ ＧＣＣＣＣ４ＯＮ　ｔａｒｍｉｎａｌ　ｍａｔｕｒｅ Ｃ ＴＧＡ　ＣＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＣＩＴＣＣ７ ０２ｎｄ ＧＣＣＴＴＡＴＴＴＡ　ＴＡＣＴｒＡＴＴＴＡ　ＴＴＴＣＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧ ＧＴＧＧＧＣ８６２ＴＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣＣＧＡＧＧＡＧＧＡ　ＧＧＧＡＧＣ ＴＧＧＧ　ＧＴＣＣＣＧＧＡＴＴ　９０２ＡＧＡＡＣＡＡＧＧＡ　ＡＴＴＡＡＡ ＴＧＴＧ　ＴＣＡＴＡＣＡＴＡＡ　ＡＡλＩＩＡＡＡＡ　１１００ＩＬ−１１ｃ ＤＮＡのヌクレオチド配列を、ジエンバンクに記録されたヌクレオチド配列と比 較した。他の蛋白質の公表されたＤＮＡ配列とのヌクレオチド配列の重要な類似 性は、全く見出されなかった。ＩＬ−１１のリーダー配列およびガンマ・インタ ーフェロンおよびＩＬ−６の前記配列間からは、軽い相同性しか見出されなかっ た。ＩＬ−１１の暗号化配列および他の公表されたポリペプチド配列間からは、 重要な相同性は全く見出されなかった。

さらに、実施例１１でさらに詳細に記載されている通り、ＩＬ−１１は、始原細 胞のＩＬ−３依存性増殖の相乗的因子である。相乗作用の成果は、幹細胞のＧ０ 期間の短縮である。少なくとも一つの培養システムにおいて、ＩＬ−１１は、Ｉ Ｌ−６と同様、血小板生成細胞コロニー形成の促進においてＩＬ−３と相乗的に 作用する［ＳＲ，バウル等、「プロシーディンゲス・オン・ザ・ナショナル・ア カデミ−・オン・サイエンンーズ・オン・ザ・ユナイテッド・ステーブ・オン・ アメリカ」、８７・７５１２−７５１６（１９９０）］。

すなわち、ＩＬ−１１、並びにＧ−Ｃ５ＦおよびＩＬ−６は、初期および後期造 血リネッジと相互作用すると思われる。しかしながら、同じく上記の相乗的因子 であるＩＬ−６とは対照的に、ＩＬ−１ｌは、貯蔵された芽細胞の二次培養物に おいてマクロファージ増殖のみを優先的に刺激する。すなわち、ＩＬ−１１は、 他の既知リンホカイン類、因子および蛋白質とは異なると思われる。ＩＬ−１１ はまた、リンパ様り不ノン内でのある役割を演じる場合に関与し、その結果、防 御系の多重アームを刺激する。すなわち、ＩＬ−１１は、実験および臨床目的の 両方に関する幹細胞の操作に有用であると予測される。

この配列によりコードされるは乳類ＩＬ−１１の生物活性は、適当な発現制御配 列の制御下、クローン化配列によりトランスフェクションされたは乳類細胞によ り産生された機能的ポリペプチドから検出された。表１に記録された通りプラス ミドｐＰＵ３４−ＴＲ，Ａ（ｐＣＩＲ６）におけるクローン化された霊長動物配 列は、１９８９年１１月１４日付けでメリーランド、ロックビル、バークローン −ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴ ＣＣナンバー６８１７２として寄託された。ヌクレオチドおよびアミノ酸レベル の両方で霊長動物配列からの修飾により表１に示されたクローン化されたヒト配 列は、１９９０年３月３０日付けでメリーランド、ロックビル、バークローン・ ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡ　Ｔ 　ＣＣナンバー６８２８４として寄託された。

ＩＬ−１１ポリペプチドは、下記の通り、Ｔ１１６５検定において活性を示す。

初めの試験において、ＩＬ−１１は、１：５００程度の高い最終希釈率でも、標 準ネズミひ臓細胞プラーク形成検定において免疫グロブリン分泌性Ｂ細胞の形成 を顕著に向上させることが見出された。このシステムでは、ひ臓の正常な細胞構 成成分から成る状況において特異的免疫原、４−ヒドロキシ−３−ニトロフェニ ル−アセチル修飾ウマ赤血球細胞（ＮＰ−ＨＲＢＣ）に応答する培養中における Ｂ細胞の発達が測定される。ひ核細胞培養物からのＴ細胞の”ｒｈｙ１補体によ る消耗の結果、応答が完全に廃棄され、ＮＰ一応答性Ｂ細胞の増加は、霊長動物 ＩＬ−１１の存在下でも、少なくとも部分的にＴ細胞の存在に左右されることが 立証された。従って、Ｂ細胞ミトゲン、例えばリポ多糖類はＴ細胞の非存在下で ＮＰ−特異的プラーク形成細胞の形成を刺激するため、ＩＬ−１１の活性は、直 接的Ｂ細胞有糸分裂促進作用に帰属し得ない。すなわち、ＩＬ−１１は、Ｔおよ びＢリンパ球の増殖、分化および活性化を調整し得る。

様々な造血培養システムにおけるＩＬ−１１の作用の分析により、血小板生成細 胞の発達に対する著しい作用が証明された。標的としてネズミ骨髄細胞を用いた 場合、ＩＬ−１１は単独ではほとんど効果を示さないが、ＩＬ−３により助けら れると血小板生成細胞コロニー形成を３倍促進した。ＩＬ−３およびＩＬ−１１ によるＣＦＵ−Ｍｅｇ形成は、陽性対照として使用される形成不能性イヌ血清の 場合を凌いでいた。

また、本発明により提供されるＩＬ−１１ポリペプチドには、表１の組換えＴＬ −１１の配列と類似しているが、自然にまたは意図して工学的に修飾が加えられ た配列によりコードされる因子が含まれる。すなわち、本発明はまた、他の霊長 動物蛋白質をコードし、Ｉ　Ｌ−１１ポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配 列の随伴を欠く、これらの新規ＤＮＡ配列を包含する。これらのＤＮＡ配列には 、上記で示したＤＮＡ配列およびそのフラグメントと同一または実質的に同一の 配列、および厳密なハイブリダイゼーション条件［Ｔマニアチス等、「モレキュ ラー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）」、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２）３８７−３８９頁参照］下で表１のＤ ＮＡ配列とハイブリダイゼーションする配列が含まれる。上記の厳密な−ハイブ リダイゼーション条件の一例は、６５℃で４ＸＳＳＣ，次いで６５℃で１時間０ ．ｌＸ５ＳＣ中で洗浄を行うハイブリダイゼーションである。

別法として、厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は、４２℃で５０％ホル ムアミド、４ＸＳＳＣである。

リラックスなハイブリダイゼーション条件下でＩＬ−１１またはその活性フラグ メントに対する配列とハイブリダイズし、発現に際してＩＬ−１１の生物学的特 性をもつＩＬ−１１ペプチドをコード化するＤＮＡ配列は、また新規なＩＬ−１ １ポリペプチドをコード化している。このような非ストリンジエントハイプリダ イゼーンフン条件の例は、４ＸＳＳＣ５０℃または４２℃で３０−４０％ホルム アミドを用いるハイブリダイゼーションである。例えば、ＩＬ−１１配列と顕著 な相同性をもつ領域を共有しＩＬ−１１の生物学的性質の１種以上をもつ蛋白質 をコード化するＤＮＡ配列は、たとえそのＤ　Ｎ　Ａが第１表のＩＬ−１１配列 またはＩＬ−１１活性をもつペプチドをコード化するそのフラグメントとストリ ンジェントにハイブリダイズしなくとも、明らかにＩＬ−１１ポリペプチドをコ ード化している。

同様に、ＩＬ−１１ポリペプチドをコード化するが遺伝子コードの縮重によりコ ドン配列が異なるＤＮＡ配列もまたこの発明に含まれる。ＩＬ−１１蛋白配列お よびＩＬ−１１の生物活性を示すペプチドフラグメントをコード化するＤＮＡ配 列におけるアレル性変異体並びにその類似体または誘導体もまたこの発明に含ま れる。点突然変異またはそれがコード化するポリペプチドの生物活性、半減期も しくは産生のようなＩＬ−１１蛋白質のある種の特性を増強する修飾導入により 起こったＩＬ−１１ＤＮＡ配列のその他の変異体もこの発明に含まれる。

組換え体技術における上記ｃＤＮＡ配列の使用に加えて、この発明のＩＬ−１１ ポリペプチドはまた既知の慣用化学合成により製造することができる。合成的手 段によりこの発明のポリペプチドを構築する方法は当業者に知られている。合成 構築されたＩＬ−１１ポリペプチド配列または第１表のアミノ酸残基連続配列を 複製しまたは部分的に複製するフラグメントもまたこの発明の一部をなす。この 合成槽５１Ｌ−１１ポリペプチド配列は、天然ＩＬ−１１ポリペプチドと１次、 ２次または３次構造的および立体的特性を共有するため、ＩＬ−１１の生物特性 を共通して有し得る。すなわち、これらは天然の精製Ｉ　Ｌ−１１ポリペプチド の生物学的に活性なまたは免疫学的な代替物として治療および免疫学的方法に使 用し得る。

ＩＬ−１１またはその活性フラグメントの蛋白質、ペプチドまたはＤＮＡ配列に おける修飾は、公知技術を用いて当業者が行なうことができる。ＩＬ−１１配列 において関心がもたれる修飾には、コード配列中の１種以上の選択アミノ酸の置 換、挿入または欠失が含まれる。このような買換、挿入または欠失の変異誘発技 術は当業者に周知である。［例えば、米国特許第４５１８５８４号参照。］この 明細書に記載するＩＬ−１１ポリペプチド配列のその他の特異的変異は、例えば １種以上のグリコノル化部位の挿入を含み得る。

アスパラギン結合グリコリル化認識部位をアミノ酸の欠失、置換または付加によ りペプチド配列に、またはヌクレオチドのそれらによりＤ　Ｎ　Ａ配列に、挿入 し得る。このような変化は、〇−結合炭水化物の付加により修飾される分子の任 意の部位または分子中の他の部位になし得る。このような変化したヌクレオチド またはペプチドの発現により、その部位がグリコノル化され得、薬理学的または 生物学的性質が変化または改善され得る変異体を産生する。

ＩＬ−１１の活性全体またはその一部を保持すると期待されるその他のＩＬ−１ １配列の類似体および誘導体も、この明細書の開示を与えられた当業者は容易に 作ることができる。このような修飾の１つは、ＩＬ−１１配列に存在するりジン 残基へのポリエチレングリコール（Ｐ　Ｅ　Ｇ）の結合、または１個以上のりジ ン残基もしくはＰＥＧもしくはＰＥＧ誘導体と反応する他のアミノ酸残基を配列 中に挿入してＰＥ０部分の結合を可能にすることである。このような修飾はこの 発明に含まれると考えられる。

この発明はまたＩＬ−１１またはその活性フラグメントの製造法を提供する。こ の発明の方法の１つは、発現ベクターにＩＬ−１１ポリペプチドコード化ｃＤＮ Ａを導入してＩＬ−１１発現システムを作ることを含む。選択した宿主細胞をベ クターで形質転換し培養する。それ故、この発明の方法は、既知の調節配列の制 御下にＩＬ−１１ポリペプチドまたはそのフラグメントの発現をコード化するＤ ＮＡ配列で形質転換した適当な細胞またはセルラインを培養することを含む。発 現された因子を当業者に公知の適当な手段により培地（または細胞内発現の場合 細胞）から採取し、分離し、精製する。

この方法に適する細胞またはセルラインは、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ ＣＨＯ）または３Ｔ３細胞のような哺乳類細胞であり得る。適当な哺乳類宿主細 胞および形質転換法、培養法、増幅法、スクリーニング法および生成物の産生、 精製法の選択は当技術において知られている。例えばゲチングおよびサムプルツ ク、ネイチャー２９３巻６２０−６２５頁（１９８１年）、またはカウフマン等 、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー５巻（７号）１７５０−１７ ５９頁（１９８５年）またはハウリー等、米国特許第４４１９４４６号参照。そ の他の適当な哺乳類セルラインはさるのｃＯ８−１セルラインおよびｃｖ−１セ ルラインである。哺乳類宿主細胞の別の例は、特に、形質転換セルラインを含め た霊長類セルラインおよびげっ歯頚セルラインを含む。正常な２倍体細胞、−次 組織のインビトロ培養で得られる細胞株、および−次作植体もまた適当である。

候補細胞は、選択遺伝子において遺伝子型として欠乏しているか、または優勢に 作用する選択遺伝子を含み得る。その他の適当な哺乳類細胞としては、ヒーラ（ Ｈｉｌａ）、マウスＬ−９２９細胞、スイス系由来の３Ｔ３、Ｂａ１ｂ−ｃもし くはＮＩＨ７ウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスターセルラインを含むが、これら に限定されるものではない。

同様に宿主細胞として有用でこの発明に適当な宿主細胞は細菌細胞である。例え ば、エシェリキア・コリの種々の株（例えばＨＢｌｏｌおよびＭＣ１０６１）は バイオテクノロン−分野で宿主細胞として知られている。バチルス・サブチリス 、シュードモナス、その他の桿菌の種々の株等もこの方法で使用し得る。

当業者に公知の酵母細胞の種々の株がこの発明のポリペプチドの発現用宿主細胞 として入手できる。さらに、所望ならば、昆虫細胞もこの発明の宿主細胞として 使用できる。例えば、ミラー等、ジェネティック・エンジニアリング８巻２７７ −２９８頁（ブレナム・プレス、１９８６年）およびその引用文献参照。

この発明はまた、新規ＩＬ−１１ポリペプチドの発現に用いる組換え体ＤＮＡ分 子またはベクターを提供する。これらのベクターは、この発明のＩＬ−１１ポリ ペプチドをコード化する新規単離ＤＮＡ配列を含有する。別法として、上記のよ うな修飾配列をとり込んだベクターもこの発明の態様であり、ＩＬ−１１ポリペ プチドの生産に有用である。この方法で用いるベクターはまた、この発明の配列 をコード化するＤＮＡと機能可能に結合し宿主細胞中で複製および発現を指示し 得る選択した調節配列を含み得る。

下記の実施例で用いたベクターはｐＸＭ［Ｙ、Ｃ，ヤング等、セル４７巻３−１ ０頁（１９８６年）コである。この明細書に記載する哺乳類細胞発現ベクターは 、当業者に周知の技術により合成することができる。ベクターの成分、例えばレ プリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーター等は、公知の方法により天 然源から得られまたは合成できる。カウフマン等、ジャーナル・オン・モレキュ ラー・バイオコノ−１５９巻５１１−５２１頁（１９８２年）およびカウフマン 、プロン−ディンゲス・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシ ズ・ニーニスエイ８２巻６８９−６９３頁（１９８５年）。別法として、ベクタ ーＤＮＡは、ラレバピローマウイルスゲノム［ラッキー等、セル３６巻３９１− ４０１頁（１９８４年）］の全部または一部を含み得、また安定なエピソーム要 素としてＣ１２７マウス細胞のようなセルライン中にとり込むことができる。

適当な宿主細胞に対するこれらのベクターによる形質転換はＩＬ−１１ポリペプ チドの発現をもたらす。

数々の型が哺乳類、昆虫、酵母、真菌および細菌発現について当技術で知られる その他の適当な発現ベクターもまたこの目的に用いることができる。

細胞源から均質になるまで精製され、または組換え体もしくは合成で製造された ＩＬ−１１は免疫不全または障害の処置のための医薬製剤または処方に使用する ことができる。ＩＬ−１１はまた、造血始原細胞または幹細胞の不全または関連 障害の処置に使用することができる。ＩＬ−１１組成物は、がんおよびその他の 疾患、放射線もしくは薬剤への露出から生ずる病理学的状態であって例えば白血 病、細菌もしくはウィルス感染、貧血、Ｂ細胞もしくはＴ細胞欠乏（骨髄移植後 の免疫細胞または造血細胞欠乏を含む）の処置に使用することができる。Ｉ　Ｌ −１１はまた、種々のワクチンに対する免疫応答を増強し、長期持続性で効果が 大きな免疫を作り出すために用いることができる。前述のように、ＩＬ−１１組 成物はＢ細胞および巨核球の分化刺激に使用することができる。ＩＬ−１１ポリ ペプチド組成物によるこのような疾患状態の治療処置は、現在入手できる薬剤に よる処置で起る望ましくない副作用を回避するものである。

この発明のポリペプチドは、単独で、または他のサイトカイン類、ヘマトポイエ チン類、インターロイキン類、成長因子類または抗体と組合わせて、上記症状の 処置に用いることができる。

この発明はまた、上述の症状の処置用治療法および組成物を提供する。このよう な組成物は、この発明のＩＬ−１１ポリペプチドの治療的有効量を、医薬として 許容される担体と混合して含有する。

この組成物は非経口的に全身投与し得る。別法として、組成物は静脈内投与でき る。所望ならば、組成物は皮下または局所、例えば傷害部位に適用できる。全身 投与の場合、この発明の治療用組成物は発熱性物質不含有の非経口投与上許容さ れる水溶液である。このような医薬として許容されｐＨ１等張性、安定性等に必 要な注意を払った蛋白質溶液の製造法は当技術の範囲内にある。

上述の状態の処置方法に用いる用量、用法は、薬剤の作用を修飾する種々の要因 、例えば患者の症状、体重、性別および食事、感染の重度、投与時期およびその 他の臨床的因子を考慮して担当医師により定められる。一般に、１日用量はポリ ペプチド１−１０００＋ｌ１ｇまたはポリペプチド５０−５０００単位（１単位 はＴ１１６５アツセイで最高の５０％の刺激をもたらすポリペプチド濃度）（体 重１ｋｇ当り）の範囲内である。

この発明の治療法および組成物はまた、他のひと因子との同時投与を含み得る。

この用途のためのサイトカインまたはへマトボイエチンの例としては、公知の因 子であるＩＬ−１〜Ｉ　Ｌ−９、ＧＭ−ＣＳＦｌＭ−Ｃ３ＦＳＭＩＦ、Ｍｅｇ− Ｃ３Ｆ、インターフエＯン類、ＴＮＦおよびエリスロポイエチンが含まれる。Ｉ Ｌ−１１療法に関与するに特に望ましい候補品は、ＩＬ−３およびＩＬ−６を含 み得る。Ｂ細胞成長因子、Ｂ細胞分化因子または好酸球分化因子類のような成長 因子もまたＩＬ−１１との同時投与に有用であることがわかった。上記の用量は 治療用組成物の追加的成分と相殺するように調整することができる。処置される 患者の経過は慣用手段により監視することができる。

これらの新規ポリペプチドの他の用途は、インビトロまたはインビボ診断および 治療法用の標準的方法による抗体の発生である。このような抗体には、公知方法 で製造したモノクローナルおよびポリクローナル抗体、並びにキメラ抗体または 「組換え体」抗体が含まれる。またこの発明により、選択した哺乳類に抗原とし てＩＬ−１１またはそのフラグメントを与え、その後その動物細胞を公知技術に よりある種のかん細胞と融合させて不死化細胞を作ることにより生ずるセルライ ンが提供される。このようなセルラインの生成およびこの発明の哺乳類のＩ　Ｌ −１１ポリペプチドの全部または一部に対する抗体の生成に用いる方法もまたこ の発明に包含される。

この発明の抗体は、例えば抗体を検出可能な標識または標識系と結合させること により、インビボおよびインビトロ診断法に用いることができる。別法として、 これらの抗体は、例えば当業者に公知のある種の毒性または治療用化合物または その一部分と結合させることにより、インビボおよびインビトロの治療目的に用 いることができる。

以下に示す実施例は、この発明のクローニング、哺乳類ＩＬ−１１の発現および 製造、並びに他の方法および製品を例示的に記述するものである。これらの実施 例は説明を目的とするもので、この発明の範囲を限定するものではない。

実施例１−ｍＲＮＡの単離およびｃＤＮＡライブラリーの構築霊長類セルライン 、ｐＵ３４を成長させると、実施例７のＴｌ１６５検定においてＩＬ−５に対す る中和抗体の存在下、有意な活性を生じるのが見出された。ＰＵ−３４間質セル ラインは、両方向性欠損形質転換レトロウィルスベクター（ａ　ｄｅｆｅｃｔｉ ｖｅ　ａｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｒｅｔｒｏｖｉｒａ ｌ　ｖｅｃｔｏｒ）で不死化することにより、長期間の霊長類骨髄培養より得ら れた。Ｕ１９レトロウィルスプラスミドは以前に報告されたように構築し［Ｐ、 Ｓ　シャットら、ンヤーナル・イン・ピロロジ−５９巻７４６−７５０頁（１９ ８６伍）］、ＳＶ４０ラーノＴ抗原配列およびＧ４１８−耐性をコードしモロネ イ・ネズミ白血病つィルス末肩反復配列から離れて発現するネオ−ホスホトラン スフェラーゼ配列を含有する。両方向性産生クローンは、パンケージング・セル ラインψＡＭ［Ｒ，コーンら、プロノーディング・イン・ナショナル・アカデミ −・イン・サイエンス・イン・ン・ユナイテソド・ステーク・イン・アメリカ８ １巻６３４９−６３５３頁（１９８４年）コをψ２Ｕ１９−５［Ｐ、Ｓ　シャッ ト、上記で引用］からのエコトロピック・ウィルスの収穫物で感染させ、続いて ０．７５ｎ／１１１のＧ４１８中で選別することにより産生じた。

１個のクローンψＡＭＵ１９−ＢＬは、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞で検定した場合、５ Ｘ１０３　Ｇ４１８−耐性ＣＦＵ／ｍＡの力価の組換えＳＶ４０ウィルスを産生 ずる。長期骨髄培養物（ＬＴＭＣ）は常法で完成され、１０％ウノ胎仔血清、１ ０％ウマ血清、ｌｏＣＩ位／Ｉｌｌべ二ンリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプ トマイシン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セント・ルイス・ミズーリー州） 完全長期培養培地を補充したイスコツ改変ドゥルベッコ培地（ＩＭＯＭ）中で維 持した。

ＬＴＭＣ付着層は、完成後７および１０日にψ、ＡＭＵ１９−ＢＬウィルス貯蔵 物２ＩＩｌで、８μｇ／Ｉｌｌポリブレーン（アルドリッヒ・ケミカル・カンパ ニー・インコーポレーテイソド、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）の存在下 ３３℃で２．５時間感染させた。感染後最初の３日間は、培養物をＱ、５ｗｇ／ ｍ１Ｇ４１８中で選別した。感染後１４日に６４１８耐性コロニーをとり、マル チウェルプレート（コーニンルグラスウエア、コーニング、ニューヨーク）に広 げた。

ＰＵ−３４と称する１個のセルラインのならし培地を長期培養物中の始原細胞を 保持する能力に基づいて広範に分析した。このセｌレラインは多分化能ヒトおよ び霊長類始原細胞を、培養中３週間まで維持する能力があることを示した。ＩＬ −６、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−Ｃ３Ｆ、Ｇ−Ｃ３ＦおよびＬＩＦ／ＨＩＬ ＤＡを含む既知の成長因子活性に加え、ＩＬ−１−の刺激したＰＵ−３４ならし 培地は、Ｔ１１６５ネズミ・ブラスマ細胞腫セルラインの増殖を刺激する能力が あることが判明したが、これは通常Ｉ　Ｌ−６に反応する［Ｒ，Ｐ、ノールダン ら、上記で引用コのだが、ヒトＩＬ−６に対する中和抗血清の存在下でさえも反 応する。この生物検定は、ＰＵ−３４から得られたｃＤＮＡライブラリーの発現 クローニングの間に用いられた。生物検定についての詳細は以下の実施例７で記 載する。

ＰＵ−３４細胞のｃＤＮＡライブラリーは以下のようｔ；調製した。

ＰＵ−３４細胞をＩＬＩ−αで、２単位／ｍｌの濃度で２４時間刺激した。ポリ アデニル化ＲＮＡ（ポリＡ＋ＲＮＡ）を常法によりこれらの細胞から調製した。

全ＲＮＡをチルブラインら、バイオケミストＩＪ−１８巻５２９４−５２９９頁 （１９７９年）の方法に準じて、刺激したｐＵ３４細胞から抽出した。ｍＲＮＡ は、オリゴ（ｄＴ）−セルロース・クロマトグラフィーにより調製した［Ｈ，ア ビブら、ブロン−ディング・イン・ナショナル・アカデミ−・イン・サイエンス ・イン・ジ・ユナイテッド・ステーク・イン・アメリカ６９巻１４０８−１４１ ２頁（１９７２年）］。

ｍＲＮＡを５μｇ用いて、ウォングら、（上記で引用）により報告されたように 、ＤＮＡポリメラーゼ■で、および２木目の鎖の反応においてはＲＮＡアーゼＨ で［Ｔ、マニアナイスら、上記で引用］、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。Ｃｏ５− １細胞発現ベクターｐＸＭＣＹ、Ｃ。

ヤングら、セル４７巻３−１Ｏ頁（１９８６年）〕を独特なＸｈｏ　Ｉ部位で直 線化し、同等モル量のセミ−Ｘｈｏ　Ｉ適合ｃＤＮＡに連結した。連結反応を用 いてエンエリキア・コリ形質転換能細胞（ＨＢ１０１株）に形質転換し［Ｙ、Ｃ ，ヤングら、上記で引用コ、約５０００００個のアンピンリン耐性コロニーのラ イブラリーを得た。

実施例２−ＤＮＡの調製およびＣｏ５−１細胞のトランスフェクションＧＧ、ウ イングら（上記で引用）により以前に報告された発現クローニング系を用いて、 以下のようなＩＬ−１１活性をコード化するｃＤＮ、Ａを単離した。

細菌性コロニーをニトロセルロース膜上に写した。各膜からコロニーをＬ−ブロ ース中にかきとり、プラスミドＤＮＡを前述の方法［Ｊ、Ａメイヤーズら、ジャ ーナル・オン・バクチリオルジ−１２７巻１５２９−１５３６頁（１９７６年） 〕により単離した。各々（７）Ｊｌ初のＤ　Ｎ　Ａ試料を２００−５００コロニ ーのプールから調製した。

各プラスミドＤ　Ｎ　Ａの５μｇを用いて、０．１ｍＭクロロキンを添加したジ エチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ）試験計画によりＣｏ５−１細胞 をトランスフェクトした［Ｌ、Ｍソンパイラ、ンクら、プロノーディング・オン ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンス・オン・ジ・ユナイテッド・ステ ーブ・オン・アメリカ７８巻７５７５−７５７８頁（１９８１年）およびＨ，ル ースマンら、タクル、アンッズ・レス・１１巻１２９５−１３０８頁（１９８３ 年）；Ｙ、　ｃ、ヤングら、上記で引用コ。トランスフェクトしたＣｏ５−１細 胞の培養上清を、トランスフェクション後７２時間に収穫し、Ｔ１１６５刺激剤 活性を検定した（実施例７参照）。

ふるい分けした３１７回のプールのうち、検出可能な量のＩＬ−６（抗ＩＬ−６ 抗体で中和することにより測定）を含有し、Ｔ１１６５検定において抗ＩＬ−５ 抗体の存在下に活性が残存する２個の陽性プールからのプラスミドＤＮＡを、Ｃ ｏ５−１細胞中に再びトランスフェクトし、トランスフェクトした上清をＴ１１ ６５検定において活性を再びふるい分けした。このような活性を有する１個のプ ールを選別し、含有するクローンの数がより少な（なるようにさらに分割した。

この群から、検定においてプールを全て集めたものよりも高い活性を示すプール を選別した。このプールから個々のクローンを取り出した。これらのＤＮＡを調 製し、トランスフェクトし、トランスフェクトした上清をＴ１１６５検定におい て活性を試験した。２個の陽性のクローンを固定した。１個はＩＬ−６活性を発 現し、もう１個は抗ＩＬ−６抗体により中和されない活性を発現した。

この後者のプールをさらに分割し、択一的にｐｃＩＲ６かまたはｐＰＬ：３４− ＴＲＡと称する、新規なＴ１１６５増殖活性をコードする嵐−の陽性プラスミド が得られるまでトランスフェクノヨンを繰り返した。このクローンを実施例７の 検定において再び試験した。

ｐＣＩＲ６−トランスフェクトしたＣｏ５−１細胞のならし培地の活性をもまた 、その他のサイトカイン、例えばネズミおよびヒト■Ｌ−６、並びにネズミＧＭ −Ｃ５Ｆと比較した。ならし培地はＴ１１６５細胞による測定可能な３Ｈ−チミ ジンの取り込みを、最終的に１：１０００まで希釈した時でさえ刺激した。至適 濃度では、新規なサイトカインは基底値の１００倍以上の取り込みを助けた。

このｃＤＮＡの挿入物を、シデオキシ鎖終結法により、超螺旋鋳型上で合成オリ ゴヌクレオチドブライマーを用いて配列決定した。

［Ｆサンガーら、プロノーディング・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サ イエンス・オン・ジ・ユナイテッド・ステーブ・オン・アメリカ７４巻５４６３ −５４６７頁（１９７７年）］。表工に示すｐＣＩＲ６のｃＤＮＡのヌクレオチ ド配列は予想される１９９アミノ酸ポリペプチドをコードする５９７ヌクレオチ ドの単一の長い転写解読枠を含有する。１７−２０個の疎水性アミノ酸の広がり が推定上の開始コドンに直ぐ近接して存在し、これは通常のタンパク分泌性先導 配列に類似している。

初期ｃＤＮＡクローンであるｐｃＩＲ６は不完全であることが判明したが、さら にｃＤＮＡを分析し、この転写物がサイトカイン遺伝子発現の重要な制御要素で あると考えられるＲＮＡ不安定配列、ＡＴＴＴＡの多重コピーを有する約４２０ 塩基対の３′非コ一ド化配列を含有することが明らかになった（Ｇ、シャクら、 セル４６巻６５９−６６７頁（１９８６年）］。

実施例３−タンパク分析 ｐＰＵ３４−ＴＲ，ＡのｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドをパルス標識 化実験を用いて同定した。クロロキンで誘導後４８時間に、ＩＬ−１１クローン の組み換えＤＮＡでトランスフェクトしたＣｏ５−１細胞の培養上清を除去し、 細胞を１．Ｏｎ／＋７１ＤＭＥＭ中の０、５４Ｃｉ［”Ｓ］メチオニンで、３７ ℃で４時間パルス標識化した。

放射線標識した上清の試料１０μｍを回収し、ラエムリ緩衝液系で１２％ゲルの １５％５ＤＳ−ＰＡＧＥ［Ｕ、に、ラエムリ、ネイチャー２２７巻６８０−６８ ５頁（１９７０年）］に供した。電気泳動後、ゲルを蛍光光度性増強溶液（エン ノ＼ンス、ニュー・インブランド・ニューフレア、ボストン、マサチューセッツ 州）中に浸し、乾燥し、Ｘ線フィルムに１露した。

５ｓＳ−メチオニン標識化ｐｃＩＲ１６−トランスフェクトしたＣＯ５−１細胞 のならし培地の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 分析により、約１８０個のアミノ酸分泌タンパクに予想される分子量に合致する 偽トランスフェクトした対照には存在しない、主に２０キロダルトンの種が存在 することが示された。

この大きさの予測および発現タンパクの異質性の欠如は、アスｌ＜ラギン結合炭 水化物の添加するためのコンセンサス配列（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／　５ｅｒ）Ｒ ，Ｊ　、ウィンツラー、「ホルモナル・プロテインズ・アンド・ペブタイスセ」 リー、Ｃ，Ｈ，！（アカデミツク・プレス・ニューヨーク）１頁〜（１９７３年 ）〕が存在しないことに一致する。成熟タンパクの予期されるアミノ酸配列には システィン残基は含まれず、これはその他の任意のサイトカイン遺伝子では見ら れない様相である。

実施例４−ＩＬ−１１を発現するヒト・セルライン２個のヒト・セルラインを、 少なくとも１種のＩＬ−１１の源泉として同定した。具体的には、ヒト肺線維芽 細胞セルライン、ＭＲＣ−５［アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション より受け入れ番号Ａ丁ＣＣＣＣＬ　１７１で入手可能コを、１単位／ｍｌの組み 換えヒトＩＬ−１−アルファ（ジエネティックス・インスティテユート、インコ ーホレーテッド）および１０−’Ｍフォルボール１２−１３ジブチレート（シグ マ）で誘導して、Ｔ１１６５検定で試験した。誘導したならし培地が、Ｉ　Ｌ− ６の飽和量より大きなカウント７分を呈する、すなわちＰＵ３４の誘導ならし培 地により呈するのと類似の活性が観察された。ＩＬ−１１が存在すれば低ＩＬ− ６信号を増強するであろうということは注目されている。さらに、以下に詳細に 記載するように、このセルラインのノーザン・プロットにより、ＩＬ−１１のメ ツセージが存在することが示される。

さらに、ヒト栄養芽層セルライン、ＴＰＡ３０−１（ＡＴＣＣより、受は入れ番 号ＣＲＬ１５８３で入手可能）もまた、ノーザン・プロットにおいてＩＬ−１１ メツセージの存在を誘導しないことが示される。

その他のＩＬ−１１のヒト源泉もまた、本発明の教示により入手でき、容易に同 定できる。

実施例５−ＲＮＡ分析 Ａ、ＰＵ３４ 細菌性ＩＬ−１アルファ誘導ＰＵ３４細胞の全細胞性ＲＮＡ５μｇを、２．２Ｍ ホルムアルデヒド含有１．２％アガロースゲルを通して電気泳動じた［Ｈ，レー ラッハら、バイオケミストリー１６巻４７４３頁（１９７７年）］。］ホルムア ルデヒドー変性ＲＮを報告されカット州）に移し［Ｅ、Ｍ、サザーン、ジャーナ ル・オン・モレキュラー・バイオロジー９８巻５０３−５１４頁（１９７５年） ］、３２ｐ標識化ｃＤＮＡプローブでプローブした。

ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡプローブはベクターからｃＤＮＡ挿入物をＸｈｏＩで制限酵素で 開裂することにより作り、プライマーとして無作為なオリゴヌクレオチドを用い て、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片の存在下３２Ｐ−ｄＣＴＰで挿入物を標 識化したｍＡ、　Ｐ、フェイルベルブら、アナリティカル・バイオケミストリー １３２巻６−１３頁（１９８３年）コ。ナイロン膜を６５℃で４時間予めハイブ リダイズし、４ＸＳＳＣ１０，５％ＳＤＳ　５Ｘデンハート溶液および１００　 μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液中６５℃で １６時間、”Ｐ　−ｄＣＴ　Ｐ標識化ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブでハイブリダイズ した。その他の用いたプローブには、ヒト（ｒｈ）ＩＬ−１α、ｒｈｌＬ−２、 ｒｈＩＬ−３、ｒｈＩＬ−４、ｒｈＩＬ−５、ｒｈｌＬ−６、ｒｈＩＬ−７、ｒ ｈＩＬ９、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＭ−ＣＳＦＳＬＩＦ／ＨＩＬＤＡおよび霊長 ｇｌＩＬ−１１がある。

ハイブリダイゼーションの後、膜を２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで６５℃で３０ 分間、次に０．２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで６５℃で３０分間の２回洗浄した 。ついで膜を乾燥し、−７０℃でカルシウム・タングステート・インテンシファ イング・スクリーンの存在下Ｘ線フィルムに適用した。

このノーザン・プロット分析により、ＰＵ３４　ｍＲＮＡが約２゜５キロベース および約１．５キロベースの大きさのメツセージを有し、ｐｃＩＲ６ブローブで ハイブリダイズされる２重のＩＬ−１１転写物を含有することが示された。上記 表工のｃＤＮＡ配列の大きさは、より小さなメツセージとよく相関する。この違 いは、さらにｃＤＮＡクローンを単離および分析することにより示されるように 、別々にスプライシングして大きな転写物中さらに３°非コ一ド化配列を生じる 結果である。ＰＵ３４細胞による２個の転写物の存在は、ＩＬ−１α誘導がない 場合は明白な転写物がないので、ＩＬ−１α制御されるようである。

レクチン刺激ヒト末梢血リンパ球からまたはヒト胎盤からのヒトＴセルラインＣ ＩＯ−ＭＪ２［レアリーら、ブラッド６９巻９５３頁（１９８７年）］、Ｃ５− ＭＪ２［アリアら、サイエンス２２３巻１０８６頁（１９８４年）コおよびＭｏ ［ゴルデら、プロシーディング・ポン・ナショナル・アカデミ−・ポン・サイエ ンス・ポン・ジ・ユナイテッド・ステーゾ・ポン・アメリカ７７巻５９３頁（１ ９８０年）〕からのｍＲＮＡ調製物中、ＲＮＡプロット分析により同定される転 写物はない。従って、唯一同定されるＩＬ−１１の源泉は、開光組織由来の付着 細胞である。

Ｂ、ＭＲＣ−５ ヒト胎児肺線維芽細胞セルライン（ＭＲＣ−５）は、ヤコブスら、ネイチャー２ ２７巻４３頁（１９７０年）に報告されるように、５０ｎｇ／ｍＡの酢酸フォル バール・ミリステート（ＰＭＡ）および１重位／ｒｇｉのＩＬ−１αで刺激後、 両方の転写物を発現することが見出された。

上記でＰＵ３４ＲＮＡに関して記載されるように、２種の転写物は、このセルラ インにおいて、約２．５キロベースおよび約１．５キロベースの同一の大きさの メツセージで同定された。ＭＲＣ−５セルラインから単離されるヒトｃＤＮＡ配 列の分析により、霊長類およびヒトのコード化部域は、ヌクレオチドレベルで約 ９５％の同一性を共有することが示された。

Ｃ，ＴＰＡ３０−１ ヒト５Ｖ４０−形質転換栄養芽層セルライン、ＴＰＡ３０−１に関して、同じプ ローブを用い、同じ方法を実施した場合、大きな約２．３キロベースのＩＬ−１ １メツセージのみが同定された。

実施例６−ＤＮＡ配列分析 ｐＰＵ３４−ＴＲＡのｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を、報告されるよう に［Ｇ、　Ｇ、ウイングら、およびｙ、ｃ、ヤングら、上記で引用コ、Ｂａ１３ １ヌクレアーゼ消化による重複断片の順序をもった組の生成およびＭ１３ベクタ ーへのサブクローニングにより決定した［Ｍ、ポンクツら、プロシーディング・ ポン・ナショナル・アカデミ−・ポン・サイエンス・ポン・ジ・ユナイテッド・ ステーゾ・オブ・アメリカ７９巻４２９８−４３０２頁（１９８２年）：および Ｊ、メッンングら、ジーン、１９巻２６９−２７６頁（１９８２年）〕。

１本鎖末鎖Ａを調製し、ヌクレオチド配列をジデオキシヌクレオチド鎖終結法に より決定した［Ｆ、サンガーら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ ミ−・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・ステー７・オブ・アメリカ 、７４巻５４６３−５４６７頁（１９７７年）］。このヌクレオチド配列は上記 表工に示す。

実施例７−検定における生物学的活性 Ａ、Ｔ１１６５増殖検定 Ｔ１１６５１Ｌ−６依存性ネズミプラスマ細胞腫細胞ＥＲ，Ｐ。

ノルダンら、サイエンス２３３巻５６６頁（１９８６年）：ドクター・ノルダン 、ナショナル・インスティテユーツ・オブ・ヘルスより入手コは１０％加熱不活 化ウシつ仔血清、２ｍＭグルタミン、１００単位／ｌ１１７′ペニノリン、１０ ０μｇ／ｌａｒストレプトマイシン（全てギブコ、グランド・アイランド、ニュ ーユーク）５ｘｌＯ”Ｍベーター・メルカプトエタノール（ノグマ・ケミカル・ カンパニー、セント・ルイス、ミズーリー州）を補充し、およびＣＨＯ細胞で産 生させた１０−２０単位／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−５（ジエネティックス・イ ンスティテユート・インコーホレーテッド）を補充したＲＰＭＩ中で通常どおり 成長させる。２−４日経過後、細胞を培養から取り出し、洗浄して残留ＩＬ−６ を除去し、７．５Ｘ１０’−ＩＸＩＯ５セル／ｍｌの濃度で再懸濁する。

検定試料（ＰＵ３４ならし培地かまたはｐｃＩＲ６−トランスフェクトしたＣｏ ｓ細胞ならし培地）を９６ウエルマイクロタイタープレート上、ＩＬ−５不含培 養培地１００μｍで２検体ずつ連続希釈する。次に上記細胞懸濁液を各ウェルに 加え、プレートを３７℃で２−３日間恒温培養する：ｓＨ−チミジンの０５μＣ ｉ［デュポント、ウィルミントン、デルウェア州］を検定の最後の６時間、各ウ ェルに加える。細胞をＧＦＣ型Ｃ型紙濾紙ＫＢ）上に収穫し、水およびエタノー ルで洗浄し、乾燥する。濾紙を次にンンチレーンフン用液中に浸し、ＬＫＢ平面 シンチレーションカウンターで計数する。３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖 を測定する。

ＰＵ３４細胞から誘導したならし培地は、ＩＬ−６の飽和量よりも多いＴ１１６ ５細胞の増殖を引き起こし、これは別の因子の存在を示唆している。ヒトＩＬ− ６に対する抗体の存在下で検定した場合、低いが有意な活性がならし培地に残存 する。非常に低量のＩＬ−６を含有するＩＬ−１誘導ＰＵ３４のならし培地の分 画化試料をもまたヒトＩＬ−６に対する抗体の存在下および不在下で検定し、そ の結果は、程度は低いが単独で増殖でき、低量のＩＬ−６とで相乗する能力があ る因子の存在が示唆された。

ＰＵ３４ライブラリーのトランスフェクノヨンからのＣｏｓ細胞上清もまた、単 独およびヒトＩＬ−６に対する抗体＋至適量的のネズミＩＬ−６のカクテルの存 在下、活性を検定した。抗体はＰＵ３４細胞により産生される霊長類Ｉ　Ｌ−６ を中和できるが、ネズミＩＬ−６を中和することができない。従って相乗因子は ライブラリーに存在するＰＵ３４　ＩＬ−６からの干渉をうけることなくふるい 分けできる。

表Ｉの成熟Ｉ　Ｌ−１１タンパクは、この検定において、１００希釈単位／ｌａ ｌの最大活性の半分であるという特徴がある。

Ｂ、Ｂセルプラーク形成検定 Ｂセルプラーク形成検定を、Ｒ，Ｍオハラら、ジャーナル・オブ・イムノロジ− １４１巻２９３５−２８４２頁（１９８８年）に報告されている方法に薯じてＩ Ｌ−１０発現Ｃｏｓ細胞に関して実施した。

ネズミブラーク形成検定は、本来のＣ５７Ｂ１／６マウスからの７゜５ｘｌＯ’ 膵臓細胞を３Ｘ１０’　４−ヒドロキシ−３−二トロフェニルーアセチル改変ウ マ赤血球（ＮＰ−ＨＲＢＣ）と共に０．７５ｍＡ’の５％ウン胎仔血清を補充し たミソ／エル−ダントン培地［Ｒ，Ｉ。

ミツシェルら、ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・メディシン１２６巻４ ２３−４４２頁（１９６７年）〕中、試験試料（ＩＬ−１１含有Ｃｏｓ細胞なら し培地）と共に、または伴なわずに５日間恒温培養することにより実施した。Ｎ Ｐ−共役ウマ赤血球（Ｈ−ＲＢＣ）またはヒツジ赤血球（Ｓ−ＲＢＣ）を、以前 に報告されたように［Ｐ。

Ｂ、ハウスマンら、ジャーナル・オブ・イムノロジ−１３４巻１３８８−１３９ ６頁（１９８３年）コ、ＩＩＩＩＩのバックしたＨ−ＲＢＣまたは５−ＲＢＣ（ コロラド・セリューム・カンパニー、デンバー、コロラド州）と共に、ジメチル ホルムアミド（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイス、ミズーリー州） 中、１０肩９のＮＰ−サクシンイミド（ケンブリッジ・バイオケミカル、インコ ーポレーテイソド、ケンブリッジ、英国）を反応させることにより調製した。

これらの培養物に、５％ウシ胎仔血清を含有するが試験試料（ならし培地）を含 まない補充用培地を、毎日さらに０．１ａＡ供給した。

ＮＰ−反応性Ｂセルは、ドレ／サーら、「ハンドブック・イン・エクスベリメン タル・イムノロシーＪ（Ｄ、Ｗ、ワイヤー、ブラックウェル、オックスフォード ）、２７１頁（１９７３年）に報告されるようにＮＰ−共役−ヒツジＲＢＣプラ ーク検定を用いて培養期間の最後に同定し、ＩＬ−１１含有ならし培地で支持さ れる培養物から得られるプラークの数を培地のみを補充した培養物から得られる プラークの数を、培地のみを補充した培養物から得られるプラークの数と比較下 ることにより、叉応工を算出した。典型的な実験では、外来性因子の欠如した基 底反応では、プレートした７、５Ｘ１０’セルあたり、６００ＯＮＰ−特異性プ ラーク形成細胞を産生じた。

このような検定の結果を図１に示す。対照反応のパーセントは、ＮＰ−ＨＲＢＣ で刺激し、ｐｃＩＲ６−トランスフェクトしたＣｏ５−１細胞ならし培地の規定 の希釈により支持される本来の牌細胞の５日間の培養中のＮＰ−反応性Ｂセルの 成長の増強を、培地のみを補充した対照培養物と比較する。Ｃｏｓ産生哺乳動物 ＩＬ−１１は、この検定においてプラーク形成単位／培養物が２　１／２−３倍 に増強され、このことは、ＩＬ−１１がＢセル刺激および分化に直接的に働くか 、またはＴセル刺激に間接的に働き、Ｂセルの反応に影響を及ぼすその他のサイ トカインを分泌する。

Ｃ，ネズミ・フィブリン・クロット検定Ｃｏｓ細胞産生唾乳動物ＴＬ−１１もま た、巨核球コロニー形成検定においてＳ、クリアら、エクスブ、ヘマトール、１ ５巻８９６−９０１頁（１９８７年）に報告されるように実質的に行い、および ２％仔ウシ皿清を添加して改変した方法で、活性を試験した。簡単に記載すると 、ネズミコロニー形成単位巨核球（ＣＦＵ　−Ｍｅｇ）検定は、２．５Ｘ１０’ ネズミ骨髄細胞を２０％ウシ胎仔血清を補充したＩＭＤＭの０．４ｍｌ中、６ウ 工ル皿にプレートして実施した。クロット形成は０．２５１９フイブリノーゲン および０．２５単位のスロンビン（シグマ・ケミカル・カンパニー、セントルイ ス、モンタナ州）を３７℃で添加することにより開始した。種々に希釈した試験 試料をフィブリンクロットに加え、続いて培養物を３７℃で６日間、恒温培養し た。クロットをＳ、クリヤら、上記で引用、およびＡ、十ケフら、プロシーディ ング・オブ・ザ・ソサイエティー、フォー・エクスベリメンタル・バイオロジー ・アンド・メチ４２２１５１巻５８７−５９０頁（１９７６年）に報告されるよ うに、２５％ゲルタールアルデヒドで固定し、０．５ｕ／ｍｌのアチセルチオコ リン・ヨーダイトで染色した。陽性のコロニー（巨核球のみを含有）は直接検鏡 して数えた。コロニーの数は２検体ずつ評価した。

図２に結果を示す。コロニー数は、（１）イヌ無形成貧血血清の１１０希釈：（ ２）１５０１１位／ｍｌのネズミＩＬ−３；（３）刺激剤なし；および（４）１ ：１０もしくは（５）１：５０希釈のｐＣＩＲ６−トランスフェクトしたＣｏ５ −１細胞ならし培地のみ、または（６）１：１０もしくは（７）１：５０希釈の １５０単位／ｒａｌのネズミＴＬ−３を補充したｐｃＩＲ６−）ランスフエクト したＣｏ５−１細胞ならし培地により支持されるマウス骨髄細胞の６日間培養物 中の巨核球コロニー（アセチルコリンエステラーゼが陽性細胞）の全数を表す。

ＩＬ−１１をこの検定で単独で試験した場合、反応はほとんど検出されなかった 。しかしながら、この検定ではＴＬ−１１を組み換え不ズミＩＬ−３の存在下試 験した場合、検定結果は、ＩＬ−１１およびＩＬ−３の組み合わせによりこの検 定において巨核球細胞の産生および成熟を有意に刺激することを示した。この検 定は、哺乳動物ＩＬ−１１が巨核球の成長の刺激において、ＩＬ−３と相乗効果 を有することが示された。

実施例８−ヒトＩＬ−１１の獲得 ヒトＩＬ−１１のクローン化配列を得るために、上記実施例５においてヒトＩＬ −１１ｍＲＮＡとハイブリダイズしたＰＵ３４ＩＬ−１１ｃＤＮＡを用いて、前 述のヒト肺線維芽細胞セルライン、ＭＲＣ−５から調製したｃＤＮＡライブラリ ーをふるい分けした。このライブラリーからの組み換え体をプレートし、２連の ニトロセルロース・レプリカーゼをプレートから作る。これらのレプリカーゼは 機会的プライミング標識化法［Ａ、Ｐフエインベルグ、上記で引用コを用いて３ ２Ｐ−ｄＣＴＰで標識化した哺乳動物のＩＬ−１１ｃＤＮＡと共に、標準的なハ イブリダイゼーション溶液（４×５ＳＣ）中６５℃で一晩ハイブリダイズした。

次に膜を０．２ＸＳＳＣで、同温で、放射活性の基底値が特異的なハイブリッド 介在配列の検出を可能にする値まで低下するまで洗浄した。重複膜上で哺乳動物 のＩＬ−１１プローブにハイブリダイズするのが見出されたコロニーを取り、プ ラスミドＤ　Ｎ　Ａの調製に用いた。

ヒトＩＬ−１１の全配列は、ＰＵ３４セルラインから哺乳動物■Ｌ−１１を単離 するための前述の方法と同様の方法に準じて決定した。ヒト配列もまた表Ｉに示 す。ヒト配列ヌクレオチドが霊長類の配列と異なる場合は、表Ｉでヒトヌクレオ チドを霊長類のヌクレオチド配列の上に記す。

別法として、オリゴヌクレオチドを、サブクローニングの目的で適当な制限部位 を有する表Ｉの配列、およびＩＬ−１１のヒトＤＮＡ配列を得るために用いられ るポリメラーゼ連鎖反応から構築してもよい。例えば以下のオリゴヌクレオチド が合成される・５°オリゴヌクレオチド、５°Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　ＣＣＡ 　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　ＣＴＧＴＧＴＴＴＧＣＣＧ３’ ３°オリゴヌクレオチド：５’ＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＴ ＴＣＡＧＣ３’ 次にこれらのオリゴヌクレオチドをＭＲＣ−５またはＴＰＡ３０−１のｃＤＮＡ ライブラリーにおけるポリメラーゼ連鎖反応に用い、そこからヒトＩＬ−１１の ＤＮＡ配列を得る。ＰＣＲ法は、現在当業界で標準的な方法に準じて実施する。

得られたＰＣＲ産生物を次に適当に消化したｐＸＭ、またはその他の発現ベクタ ーにサブクローン化する。上記のオリゴヌクレオチドに関しては、ｐＸＭベクタ ーサブクローニングするためにＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ［で消化する。

ヒトＩＬ−１１の配列を得るための第３の方法としては、プローブとして表■の 配列を用いてヒトゲノムライブラリーをふるい分けする方法がある。

実施例９−組みかえＩＬ−１１の発現 ヒト因子を含む組み換え哺乳動物ＩＬ−１１を産生ずるために、それをコード化 するｃ　Ｄ　Ｎ　、Ａを適当な発現ベクターに移す。この発現ベクターは標１的 な分子生物学的技術にょる哺乳動物、昆虫、酵母、菌類および細菌類の発現用に 非零に多くの型が当業界で公知である。例えばＹ、Ｃ，ヤニｚクラ、セル４７巻 ３−１０頁（１９８６年）を参照されたい。

哺乳動物のＩＬ−１１に関して以前に報告されているように、ヒトＩＬ−１，１ のｃＤＮＡは標準的な技法を用いて合成され、発現ベクター、ｐＸＭでクローン 化される（ヤングら、上記で引用）。このベクターは哺乳動物細胞、例えばＣｏ ５−１細胞でｃＤＮＡ挿入物の発現を可能にする。ｐＸＭはＳＶ４０エンハンサ −１主要アデノウィルス後期プロモーター、３部分先導配列、および小さなハイ ブリッド介在配列、ＤＨＦＲコード化配列、ＳＶ４０後期メツセージポリＡ添加 部位並びにアデノウィルスＶａＩ遺伝子を含有する。このベクターをエンドヌク レアーゼ酵素ＸｈｏＩで直線化し、相補的な付着末端を生じる合成オリゴヌクレ オチドを添加して予め改変したＩＬｌｌ　ＣＩ）ＮＡの同等モル量に連結するこ とができる。このようなオリゴヌクレオチドは市販により入手できる［コラボラ ティブ・リサーチ・レキシントン、マサチューセッツ州〕。

ＣＨＯ細胞中でサイトカインをよく発現することが認められているもう１つのベ クターは、ｐＥＭｃ２Ｂ１である。このベクターはアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、ロックビル、メリーランド州（米国）に受け 入れ番号ＡＴＣＣ４０３４８で寄託されているｐＭＴ２ｐｃから誘導できる。Ｄ ＮＡは、プラスミドをＰｓｔＩで消化することにより直線化する。次にＤＮＡを Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてプラントする。オリゴヌクレオチド５゜Ｔ　Ｇ 　ＣＡ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　Ａ　Ｇ　ＣＣＴ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＣＴ　ＣＧ　 Ａ　３　’を次にＤＮＡに連結し、５°末端にＰｓｔＩ部位を再生し、ＤＨＦＲ ｃＤＮＡのＡＴＧの前にＥｃｏＲＩ部位およびＸｈｏＩ部位をつけ加える。この プラスミドをｐＭＴ２１と称する。ｐＭＴ２１を、プラスミドを２個の隣接する クローニング部位で開裂するＥｃｏＲ４およびＸｈｏＩで切断する。５０８塩基 対のＥ　Ｍ　ＣＶ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＴａｑαＩでｐＭＴ２ＥＣＡ Ｔ、′ＬＳ　Ｋ　ジフングら、ジャーナル・オブ・ピロロノー６３巻１６．５１ −１６６０頁（１９８９年）］から切断した。６８ヌクレオチドの長さの１対の オリゴヌクレオチドを合成し、ＡＴＧまでＥＭＣＶ配列を重複させた。ＡＴＧを ＡＴＴに変え、Ｃを１個加え、３′末端でＸｈｏＩ部位を作る。Ｔａｑα１部位 は５゛末端に位置する。オリゴヌクレオチドの配列は５’　ＣＧ　、Ａ　Ｇ　Ｇ 　Ｔ　Ｔ　、Ａ　Ａ　、Ａ、、Ａ　Ａ　、Ａ　ＣＧ　Ｔ　ＣＴ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｃ ＣＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＡＡＡＡ 　Ａ　ＣＡ　ＣＧ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ｃ３’およびこれらの相補的鎖であった。

ｐＭＴ　２１　ＥｃｏＲＩからＸｈｏＩまでの断片をＥＭＣＶ　ＥｃｏＲＩから ＴａｑαＩまでの断片およびＴａｑαＩ／ＸｈｏＩオリゴヌクレオチドに連結し 、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を産生じた。このベクターはＳＶ４０の複製開始点お よびエンハンサ−、アデノウィルス主要後期プロモーター、アデノウィルス３部 分先導配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ ポリアデニル化信号およびアデノウィルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラ クタマーゼマーカー、並びにＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞中望ましいｃＤＮ、Ａ を高量発現させるのに適当な関係で含有する。ＥＭＣ２Ｂ１ベクターはエンドヌ クレアーゼ酵素ＥｃｏＲＩで直線化し、続いて発現を構築するＥｃｏＲＩ相補的 末端を生じる合成オリゴヌクレオチドを加えることにより予め改変したＩＬ−１ １をコードするＣＤ　Ｎ　Ａに同等モル量で別々に連結する。

ＴＬ−１１を含有する望ましいベクターを次に、通常の遺伝子工学の技術により 適当な宿主細胞に導入する。標準的な技法を用いて形質転換した細胞を培養し、 発現したＩＬ−１１を回収し、培養培地から精製する。

Ａ　哺乳動物細胞の発現 哺乳動物の宿主細胞中にＩＬ−１１ポリペプチドの発現を得るために、ＩＬ−１ １ＤＮＡ配列を含有するｐＸＭベクターを実施例２に記載のとおりＣｏｓ細胞に トランスフェクトする。トランスフェクトしたＣｏｓ細胞のならし培地は、Ｔ１ １６５検定で測定されるＩＬ−１１生物学的活性を含有する。同様にＩＬ−１１ のＣＤＮＡを含有するｐＥＭＣ−２Ｂ１の構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェク トする。

当業者はまた、例えば各々のプラスミドからのＩＬ−１１のＤＮＡ配列をＸｈｏ Ｉで挿入し、周知の組み換え遺伝子工業の技術並びにｐＪＬ３およびｐＪＬ４［ ゴーフら、エンボ、ジエイ、４巻６４５−６５３頁（１９８５年）］およびｐＭ Ｔ２（ｐＭＴ２−ＶＷＦ、ＡＴＣＣ＃６７１２２で出発；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／Ｕ Ｓ８７１０００３３参照）のようなその他の既知ベクターを用いて、ｐＸＭ／Ｉ Ｌ−１１ベクターに匹敵するその他の哺乳動物発現ベクターを構築することもで きる。

これらのベクターを適当な宿主細胞に形質転換することにより、結果的にＩＬ− １１ポリペプチドを発現させることができる。Ｃｏｓ細胞以外の哺乳動物宿主細 胞も、ＩＬ−１１の発現に用いることができる。例えば、共に通常の方法により ベクターＤＮＡを安定して完成させ、完成したベクターＤＮＡを続いて増幅させ るのが好ましく、そのために選り抜きの哺乳動物宿主細胞としてＣＨ○細胞を用 いることができる。

一変ベクターおよび宿主細胞を選択し形質転換すると、標準的な免疫学的なまた は酵素検定により、安定した形質転換体を、ＩＬ−１１の発現に関してふるい分 ける。ＩＬ−１１ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの存在は、標 準的な方法、例えばサザーンまたはノーザンブロッティングにより検出できる。

発現ベクターＤＮＡを適当な宿主細胞に導入後数日間、ポリペプチドをコードす るＤＮＡの一過性の発現は、培養培地のタンパクの活性または免疫学的検定、例 えばＴ１１６５検定により、選別せずに測定される。

Ｂ、細菌性発現系 同様に、当業者はコード化配列をフランキングするあらゆる哺乳動物の制御配列 を排除し、細菌の配列を挿入して細菌性ベクターを作ることによりＩＬ−１１の 配列を操作し、細菌細胞により本発明のＩＬ−１１ポリペプチドを細胞内または 細胞外に発現させることができる。

因子をコード化するＤＮＡはさらに、細菌性の発現のための種々コドンを含有す るように改変でき、これは当業界で公知である。成熟ＩＬ−１１配列（表工で２ １−１９９アミノ酸をコードするヌクレオチド）は、分泌性リーダーポリペプチ ドをコードするヌクレオチド配列に効果的に枠内で結合し、成熟した種々タンパ クの細菌性発現、分泌および加工を可能にするのが好ましく、これも当業界で公 知である。次に細菌宿主細胞で発現される化合物を全て既知の方法により回収し 、精製し、並びに／または物理化学的、生化学的および／もしくは臨床パラメー ターに関して特性化できる。

別法として、Ｉ　Ｌ−１１はエシェリキア・コリ中に細胞質タンパクとして発現 させてもよい。この場合、分子は塩酸グアニジンで完全に変性した後、必ず再び 折りたたまなければならないようであるが、この方法も当業界で公知である。現 在のところエシェリキア・コリにおいて、ＩＬ−１１を発現させる好ましい方法 では、ヒトＩＬ−１１配列の最初の３１コドンを除去する。次に以下の配列：Ａ ＴＧ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＣＣＡ　ＧＧＴ　ＣＣＡＣＣＴ　ＣＧ Ａ　ＧＴＴ を成熟ヒトＩＬ−１１のコドン３２に付ける。

Ｃ昆虫または酵母細胞の発現 昆虫細胞で発現させるために昆虫ベクターを構築する［例えば発行欧州特許出願 第１５５４７６号に記載された方法を参照されたいコために同様の操作を行うこ とができる。酵母細胞により本発明のタンパクを細胞内または細胞外に発現させ るために、酵母制御配列を用いて酵母ベクターをも構築できる。［例えば、発行 ＰＣＴ出願ＷＯ第８６１０　Ｏ６３９号オヨヒ欧州特許出１ｉＥＰｉｌ　２３２ ８９号に記載されている方法を参照されたい。コ実施例１Ｏ−ＩＬ−１１を高貴 発現するＣＨ○セルラインの構築哺乳動物から本発明のＩＬ−１１ポリペプチド の高量を産生する１つの方法には、異種のＩＬ−１１遺伝子の多重コピーを含有 する細胞の構築が含まれる。カウフマン・アンド・シャープ、ジャーナル・オブ ・モレキュラー・バイオロジー、上記（１９８２年）の方法に準じて異種遺伝子 を増幅可能なマーカー例えば、増加した遺伝子コピーを含有する細胞をメソトレ キセート（ＭＴＸ）の濃度上昇中に伸長用に選別できるためのジヒドロホレート ・リダクターゼ（ＤＨＦＲ）に結合できる。この方法は多種細胞型で用いること ができる。

別法として、ＩＬ−１１ｃＤＮ、Ａおよび薬剤耐性選別遺伝子（例えばＤＨＦＲ ）を同じベクターに導入することができる。この方法で好ましいベクターはｐＥ ＭＣ２Ｂ１である。

例えば、その他のプラスミド配列と有効に関連し、それのおよびＤＨＦＲ発現プ ラスミドｐＡｄＡ２ｂＳＶ（Ａ）３［カウフマン・アンド・シャープ・モル・セ ル・ビオール、３巻９号１５９８−１６０８頁（１９８３年）］の発現を可能に するＩＬ−１１遺伝子含有ｐＸＭベクターは、リン酸カルシウム共沈およびトラ ンスフェクションによりＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−Ｂ　Ｉ　Ｉに同時 導入できる。

別法として、その他のプラスミド配列と有効に関連し、それの発、現を可能にす るＩ　Ｌ−１１遺伝子含有ｐＥＭＣ−２８１ベクターを、唄形質体融合およびト ランスフェクションによりＤ　ＨＰ　Ｒ−欠損ＣＨＯ細胞に導入する。ＩＬ−１ １遺伝子およびＤＨＦＲマーカー遺伝子は共に、ＩＬ−９をｐＥＭＣ２Ｂ１に導 入した場合に効果的に発現する。ＩＬ−１１遺伝子を前述のとおりｐＭＴ２に導 入でき、その結果できたベクターはｐＸＭ／ＩＬ−１１およびｐＡｄＡ２６ＳＶ （Ａ）３の代わりに用いることができる。

ＤＨＦＲＨＦ形質転換体は、透析ウシ胎仔血清を有するアルファー培地中の成長 から選択する。形質転換体を生物検定、免疫検定またはＲＮ　Ａブロッティング によりＩＬ−９の発現に関して検査し、続いて陽性プールを選択して、カウフマ ンら、モル　セル、ビオ−ルミ巻１７５０頁（１９８３年）に報告されるように 、ＭＴＸの濃度上昇中（逐次的に０．０２．０．２．１０および５μＭ　ＭＴＸ ）に成長を増幅させる。増幅した系列をクローニングし、生物学的に活性ｔＩＬ −１１ポリペプチド発現をＴ１１６５検定により監視する。

ＩＬ−１１ポリペプチド発現はＭＴＸ耐性の水準の増強と共に増加することが予 想される。

前述の任意の発現系において、結果的に得られたセルラインは適当な薬剤を選別 することによりさらに増幅でき、結果的に得られたセルラインを再びクローニン グし、発現量を本明細書で記載したＴ１１６５検定を用いて評価できる。

ＩＬ−１１発現ＣＨＯセルラインは血清不含培地中成長するように適合させるこ とができる。レクチン親和クロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣＦＰＬＣ等のよう な技術を含む当業界でよく用いられる方法を用いて、セルラインのならし培地か ら、同一のＩＬ−１１が単離できる。

実施例■−初期ネズミ始原細胞培養中の増殖に対するＩＬ−１１の作用 メチルセルローズ細胞培養物を３５ｍｍラックス懸濁培養皿（＃５２２１Ｒ，ヌ ンク、インコーホレイテッド、ネイバービル、ＩＬ）中で確ユした。

５−フルオロウラシル（５−ＦＵＸアトリア・ラボラトリーズ、コロンビア、Ｏ Ｈ）を、１０〜１５週令雌ＢＤＦ、マウス（ＡＲＳスブラーク・ドーリ−、イン ディアナポリス、ＩＮ）に尾静脈から１５０■ｑ／ｋｑ体重を静脈注射により投 与した（ラダら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー、１１７：３０ ８〜３１８（１９８３）およびＧ、Ｓ、ホジソンら、ネイチャー、２８１＋３８ １〜３８２（１９７９））。三匹のマウスから集めた大腿または膵臓から単一の 細胞懸濁液を調製した。低密度（＜１０７７）Ｉｌ核細胞を４００ｇ。

にて遠心分離後、フィゴルーバクの界面から集めた。これらの細胞をプラスチッ ク型皿に一夜付看させた後、非付着単核（骨髄および膵臓）細胞を５−ＦＵ注射 後、各２日および５日に採取した。

培養物１ｍｌは、正常マウスの骨髄細胞２Ｘ１０’個、５−ＦＵ−処理マウスの 骨髄細胞５Ｘ１０’個または膵臓細胞ｌＸｌ０’個、α−培地（フロー・ラボラ トリーズ、インコボレイテッド、マツクリーン、ＶＡ）、１．２％１５００ｃｐ ｓメチルセルローズ（フィッシャーサイエンチフィク・コーポレーション、ノル クロス、ＧＡ）、３０％胎子牛血清（ＦＣ３Ｘハイクロン・ラボラトリーズ、イ ンコーホレイテッド、ロガン、ＵＴ）、１％脱イオン化フラクション・Ｖ・ラン 血清アルブミン（ＢＳ、Ａ）（ングマ・ケミカル・コーポレーション、セントル イス、ＭＯ）、Ｉ　Ｘ１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノール（イーストマン・ オーガニック・ケミカルズ、ロチニスター、ＮＹ）および造血因子を含有した。

皿を３７℃にて５％ＣＯ２を通気した加湿雰囲気中でインキュベートした。血小 板生成細胞を除いて、細胞５０個以上からなるコロニーをインキュベーション後 の所定の日に倒立顕微鏡で計数した。４個以上の血小板生成細胞が含まれるとき は血小板生成細胞を計数した。コロニーの型の省略記号を下記に記載する・ＧＭ 、顆粒球／マクロファージ；Ｍａｓｔ、乳房細胞コロニー：Ｅ、赤血球バースト 、Ｍ１血小板生成細胞コロニー；ＧＥＭＭ、顆粒球／マクロファージ／血小板生 成細胞コロニー［Ｔ、ナカタら、ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー 、１１１：２３９−２４６（１９８２）］；ＧＭＭ、顆粒球／赤血球／マクロフ ァージ／血小板生成細胞コロニー［Ｔ　ナカタら、止揚：およびＡ、　Ａ、　フ ォーザーら、ブラッド、５２　：１２４３−１２４８　（１９７８）　］　；お よびＢ１、芽球細胞コロニー［Ｔ、ナカタら、プロノーディング・オブ・す／ヨ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、７９：３８４３−３８４７（１９８２） ；およびＴ、スダら、止揚］。

芽球細胞（ｂｌａｓｔ　ｃｅｌｌ）の造血能力を未分化細胞コロニー再平板培養 により測定した。インキュベーション５〜１５日間に、５０〜１５０個の細胞を 含む個々の芽球細胞コロニーをエソベンドルフピペソトで取り上げ、ヒト尿エリ スロポイエチン（Ｅｌ））［１１ｇ当り３７０Ｕの活性、カワキタ・マコト博士 より入手、熊本医科大学、熊本、日本１２Ｕ／ｍｌ、ＷＥＨＩ−３ＩＩＢ胞の１ ％濃纏（Ｘ　２０）培養物上清を含む二次メチルセルローズ培養物中に再平板培 養した。

芽球細胞はまた、観察されたＩＬ−１１の効果が直接的であるのか、または他の 因子によるものかを調査するための造血細胞の純粋標的集団として用いた。組換 え不ズミＩＬ−３の１０００／＋＊１の存在下、５−ＦＵ後４日の膵臓細胞１０ ０万個を培養した。遺伝子工学的に高い力価（約３００００　Ｕ／ｍｌ）まで、 ネズミＩＬ−３を産生するように計画されたチャイニーズ・ハムスター卵巣（Ｃ ＨＯ）細胞によって調製された。培養８日目に、各芽球細胞コロニー（５０〜１ ５０個の細胞）を培養物から取り上げ、集め、培地で２度洗浄し、種々の因子の 組合わせを含む各二次培養物中に再平板培養した。

４　Ｘ　１０’Ｕ／ｗｑ蛋白の比活性を有する組換えヒトＩＬ−６をエシェリキ ア・コリ中に発現させた。ネズミ形質細胞腫−刺激活性をコード化したｃＤＮＡ で形質導入されたＣＯ５−１細胞により馴化された培地（ＣＭ）あった。Ｃｓ、 　Ｒ，ポールら、プロン−ディング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンス、Ｕ　Ｓ　Ａ印刷中（１９９０）］ Ａ、正常マウスの骨髄細胞からのコロニー形成正常骨髄細胞からのコロニー形成 をＩＬ−１１により維持した。

Ｅｐ２Ｕ／ｍｌの存在下または不存在下で、ＩＬ−１１は投与量−依存的にコロ ニーを生じさせた。１：１００稀釈のＩ　Ｌ−１１は最大のコロニー形成を維持 した。しかしながら、ＩＬ−１１とのインキュベーン３２８日目または１６日目 に検出されたコロニーの総数は、Ｉ　Ｌ−３との培養物中よりも顕著に低かった 。ＩＬ−１１＝含有培養物中に見られたコロニーは０Ｍ型が優勢であったが、数 種の多系統（ＧＭＭおよびＧＥＭＭ）コロニーも観察された。１１００稀釈のＩ Ｌ−１１は、インキュベーン３２１６日目に３個の芽球細胞コロニーの形成を維 持した。

８．５−ＦＵ−処理マウスの骨髄細胞からのコロニー形成ＴＬ−１１、ＩＬ−６ 、ＩＬ−３、鳳独および各種組合わせの存在下で確ユされた培養物中１３０ｇｇ ／ｋｇの５−ＦＵ　ＣＴスダら、上掲およびＧ、Ｓ　ホンソンら、止揚コの注射 後２日目に採取された骨髄細胞からのコロニー形成を検討し、ＩＬ−１１が初期 の始原細胞の増殖の維持においてＩＬ−３と相乗的に働くかどうかを調べた。

最終稀釈１：１００および１：１０００のＩＬ−１１の、Ｉ　Ｌ−３の最適濃度 への添加はコロニー形成を顕著に増強した。特に、ＩＬ−１１の１：１００稀釈 およびＩＬ−３の存在下で、コロニー形成の動態は各種因子により維持される動 態に比較すると促進された。

コロニー形成の時間的経過および維持されたコロニーの総数はＩＬ−６およびＩ Ｌ−３の組合わせで観察されたのと類似している。１．１００稀釈中のＩＬ−１ １単独は長期のインキュベーション後わずかなコロニー形成を維持した。これら の結果はＩＬ−１１が初期の始原細胞のＩＬ−３依存性増殖を促進することを示 している。各相乗的因子の作用に関連する５−ＦＵ後２日の骨髄細胞からのコロ ニー形成の動力学に対するＩＬ−４１およびＩＬ−６の組合わせの効果を別に検 討した。ＩＬ−６およびＩＬ−１１はＩＬ−３依存性コロニー形成を顕著に促進 した。しかしながら、Ｉ　Ｌ−６および■Ｌ−１１の組合わせの効果は個別の効 果と異ならなかった。

Ｃ，５−ＦＵ投与後４日の膵臓細胞からの芽球細胞のコロニー発達の連続的観察 各種芽球細胞コロニーの成長率を培養図研究法により連続的にプロットした。結 果は、ＩＬ−１１の相乗的効果は幹細胞が休眠状態にある時期中に減少し、成長 率がこれらの培養系で統計学的に異ならないから、ＩＬ−６またはＧ−Ｃ５Ｆで 観察された効果と非常に類似した作用をもたらすことを示した。

Ｄ。芽球細胞コロニーの再平板培養能力の比較１−１１およびＩＬ−６に対応す る芽球細胞コロニーの増殖能力を再平板培養実験により検討した。すでに報告さ れたように７Ｋ。

イケブチら、ブラッド、７２・２００７−２０１４（１９８８）］、各芽球細胞 コロニーのうちに、二次再平板培養効率中に顕著な変化が見られた。しかし、３ 種の異なる一次培養条件で生長させた芽球細胞コロニーの再平板培養効率には顕 著な差はなかった。

先の報告１Ｋ　イケブチら、止揚コと同様に、二次コロニー中の二次ＧＥ〜ＩＭ コロニーの百分業および未分化細胞胚芽細胞コロニー当りの二次ＧＥＭＭコロニ ーの発生Ｉは、Ｉ　Ｌ−３単独を含ζ培養物中に見られる一次未分化細胞コロニ ーよりも、ＩＬ−１１またはＩＬ−６を含む培養物中に確認された一次未分化細 胞コロニーからの方が著しく高かった。これらのパラメーターは、ＩＬ−１１＋ ＩＬ−３を含む培養物およびＩＬ−６＋ＩＬ−３を含む培養物間に顕著な差はな かった。

これらの結果はＩＬ−１１およびＩ　Ｌ−６の相乗的活性が類似しており、二次 ＯＥＭＭコロニーの発生率の増加が、芽球細胞コロニー形成中の幹細胞のＧ１期 間の短縮によるかもしれないことを示す［Ｋ、イケブチら、止揚〕。

Ｅ、集めた芽球細胞の再平板培養の検討ＩＬ−３により維持された初期段階の培 養物からの芽球細胞を集めて得られた標的細胞をＧＭ−ロニー形成に対するＩＬ −１１およびＩＬ−６の直接的効果を比較するために用いた。集めた芽球細胞は 間質細胞を欠き、非常に高い平板培養効率を示した。

ＴＬ−３を含む培地で確認された細胞５０〜１５０個を含む芽球細胞を取り、集 め、Ｅｐ２Ｕ／ｍ＋の存在中、Ｉ　Ｌ−１１、Ｉ　Ｌ−６、またはＩＬ−３を含 む二次培地に再平板培養する。これらのデータは芽球細胞の少なくとも７０％が 造血始原細胞であることを示す。

ＩＬ−３とＥｐの組合せが種々の単一系統および多系統のコロニー形成を維持し たが、ＩＬ−１１およびＥｐはマクロファージコロニーのみの産生を維持した。

ＩＬ−６およびＥｐの組合せほぼ同数数の純粋マクロファージコロニーだけでな く、好中球／マクロファー／のコロニーの形成も維持した。ＩＬ−１１により維 持されたマクロファー／コロニーはＩ　Ｌ−６により維持されたマクロファージ コロニーより小さかった。

これらの結果は、ＩＬ−１１とＩＬ−６が異なる始原細胞サブセットを除いて重 複して相互に作用すること、および優先的にマクロファージ始原細胞群を維持す ることを示した。

Ｆ、ＩＬ−１１の相乗作用効果に対する抗ＩＬ−６抗体中和効果ＩＬ−１１とＩ Ｌ−６間の直接コロニー維持活性がＣｏｓ細胞ＣＭのそのものの性質の結果でな かったことを確認するために、Ｃ０５−由来ＩＬ−６を阻害することで知られる 抗ＩＬ−６抗体の中和を、休止始原細胞からのＩＬ３−依存増殖に対するＩＬ− １１およびＩＬ−５の相乗効果の検討に用いた。

ＩＬ−６またはＩＬ−１１の存在中および抗体の不在中で、５ＦＵ投与後５日の 膵臓細胞からのコロニーの発達は８日月のコロニー数により示されるように顕著 に促進された。抗ＩＬ−５抗体が存在したとき、ＩＬ−５の相乗効果を完全に消 失したが、ＩＬ−１１の効果は消失しなかった。抗体の効果は１６日まで持続し た。これらの結果は、Ｃｏｓ細胞ＣＭ中の明白な相乗効果がＩＬ−５により仲介 されるという可能性を全く退けた。

ＩＬ−１１ｃＤＮＡを形質導入されたＣｏｓ細胞の馴化培地（ＣＭ）は、培養中 の多効能性始原細胞の１−３−依存増殖を促進することが判明し、活性は独自に ＩＬ−５に関連した。促進の機構は休止幹細胞のＧ３期間の短縮と思われる。

前述の記載はこの発明の現在の好ましい実施態様を詳述したものである。この発 明の実施において多数の修飾および変更が当技術の熟練者に考えられることと思 われる。そのような修飾および変更もまたこの発明の範囲に含まれる。

Ｆ／６／ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成４年５月２２日　麿

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. （１）実質的に他の蛋白質様物質の随伴を欠くほ乳類ＩＬ−１１。
2. （２）第１表のアミノ酸＃２１−アミノ酸＃１９９のアミノ酸配列と同じかまた は実質的に同じ配列またはその生物活性フラグメントを含む、請求項１記載の因 子。
3. （３）ヒト配列を含む、請求項２記載の因子。
4. （４）第１表に示されたＤＮＡ配列と同じかまたは実質的に同じＤＮＡ配列、そ のフラグメントまたはそこにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列の全部または一部 によりコードされる、請求項１記載の因子。
5. （５）下記特性： １）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけろ還元条件下での見かけ上の分子量が約２０ｋｄ、 ２）計算された分子量が約２０ｋｄ、 ３）Ｔ１１６５検定における生物活性、４）ＩＬ−３の存在下での血小板生成細 胞コロニー形成検定における生物活性、 ５）Ｂ細胞プラーク形成検定における生物活性のうちの一つまたはそれ以上を有 する、請求項１記載の因子。
6. （６）ＩＬ−１１の複製および発現を指図し得る発現制御配列を機能し得る形で 随伴したＩＬ−１１ポリペプチドの発現をコードするＤＮＡ配列により形質転換 された細胞を培養し、ＩＬ−１１蛋白質をその条件培地から回収することにより 製造される、請求項１記載の因子。
7. （７）ＤＮＡ配列が、表１のＤＮＡ配列と同じかまたは実質的に同じＤＮＡ配列 、そのフラグメントまたはそこにハイブリダイズし得るＤＮＡ配列を含む、請求 項５記載の因子。
8. （８）ヒトＩＬ−１１である、請求項１記載の因子。
9. （９）ＩＬ−１１の複製および発現を指図し得る発現制御配列を機能し得る形で 随伴した、ＩＬ−１１またはそのフラグメントの発現をコードするｃＤＮＡ配列 により形質転換されたセルラインを培養することを含む、ＩＬ−１１またはその フラグメントの製造方法。
10. （１０）ＩＬ−１１をコードし、第１表に示されたヌクレオチド塩基配列と同じ かまたは実質的に同じＤＮＡ配列、そのフラグメントまたはそこにハイブリダイ ズし得るＤＮＡ配列の全部または一部を含むＤＮＡ配列。
11. （１１）発現制御配列を機能し得る形で随伴した請求項１０記載のＤＮＡ配列に より形質転換された細胞。
12. （１２）ほ乳類または細菌細胞を含む、請求項１１記載の細胞。
13. （１３）請求項１０記載のＤＮＡ配列を含むプラスミド・ベクター。
14. （１４）医薬的に有効な賦形剤中にＩＬ−１１またはその生物活性フラグメント の治療有効量を含む医薬組成物。
15. （１５）さらに追加的なサイトカイン、ヘマトポイエチン、生長因子または抗体 の治療有効量を含む、請求項１４記載の組成物。
16. （１６）サイトカインが、ＩＬ−１ないしＩＬ−９、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ 、Ｍ−ＣＳＦ、インターフェロン類、Ｍｅｇ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＬＩＦ、ＴＮＦ およびエリスロポイエチンから成る群から選択される、請求項１５記載の組成物 。
17. （１７）サイトカインがＩＬ−３またはＩＬ−６である、請求項１６記載の組成 物。
18. （１８）患者にＩＬ−１１またはそのフラグメントの有効量を投与することを含 む、免疫系を刺激するか、またはそれに関連した疾患を処置する方法。
19. （１９）さらに、ＩＬ−１１と同時またはそれに続いて少なくとも１種のヘマト ポイエチン、サイトカイン、生長因子または抗体の有効量を投与することを含む 、請求項１８記載の方法。
20. （２０）ヘマトポイエチンがＩＬ−３またはＩＬ−６である、請求項１９記載の 方法。
21. （２１）患者にＩＬ−１１またはそのフラグメントの有効量を投与することを含 む、造血系を刺激するかまたはそれに関連した疾患を処置する方法。
22. （２２）さらに、ＩＬ−１１と同時またはそれに続いて少なくとも１種のヘマト ポイエチン、サイトカイン、生長因子または抗体の有効量を投与することを含む 、請求項２１記載の方法。
23. （２３）ヘマトポイエチンがＩＬ−３またはＩＬ−６である、請求項２２記載の 方法。
24. （２４）ＩＬ−６の非存在下でのＴ１１６５検定において生物活性を有する均一 ほ乳類ＩＬ−１１。