JPH05504673A - ヒト・アポリポ蛋白質ａｉおよびａｉ―ミラノの酵母での発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ）　ヒト・アポリポ蛋白質Ａ【およびＡＩ−ミラノの酵母での発現本発明は、ア ポリポ蛋白質ＡＩおよびアポリボ蛋白質ＡＩ−ミラノ（Ｍｉｌａｎｏ）　（Ａｐ ｏ−ＡＩおよびＡｐｏ−ＡＩ−Ｍ）の酵母株での発現、および該アポリポ蛋白質 を有効成分として含有してなるアテローム性動脈硬化症および心血管疾患用の医 薬組成物に関する。

高濃度の血清コレステロールと冠心臓疾患（ＣＨＤ）の発生との間の明確な関係 は、疫学的かつある期間にわたる研究に基づき、繰り返し確認されてきた。しか して、血漿中コレステロールの輸送の複雑な機構の明確化により、ＣＨＤの危険 性を決定するにおいて、循環リポ蛋白質の選択的機能を認識せしめた。

事実、４種の循環リポ蛋白：キロミクロン（ＣＭ）、超低密度（ＶＬＤＬ）　、 低密度（ＬＤＬ）８ＪＣび高密度ＣＨＬＤ）！Ｊポ蛋白質がある。これらのうち 、ＣＭは腸管脂肪吸収の短寿命産物を構成する一方、ＶＬＤＬおよび特にＬＤＬ はコレステロールの組織への、また動脈壁への輸送を担っている。対照的に、Ｈ ＤＬはコレステロールの末梢組織からの除去に亘接関係しており、「逆コレステ ロール輸送Ｊ　（ＲＣＴ）として公知の機構によって、それを肝臓または他のリ ポ蛋白質いずれかに戻す。

ＨＤＬの「保護的」役割は多数の研究で確認されてきた［ミラーら（Ｍｉｌｌｅ ｒ　ｅｔ　ａｌ）、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）、ｉ　：　９６５　９６８゜１ ９７７；ワイ不ら（Ｗｈａｙｎｅ　ｅｔ　ａｌ）、アテロスクレロシス（Ａｔｈ ｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）　３９：４１１−４１９．　１９８１］　−これら において、高濃度のＬＤＬ、それよりは低い濃度のＶＬＤＬは心血管の危険性の 増大に明らかに関係しているようである。

ＨＤＬの保護的機構の研究のうち最近興味あるものは、アポリポ蛋白質Ａ　Ｉ　 （Ａｐｏ　Ａｌ）に、即ちＨＤＬの主要成分に焦点を当ててきた。事実、Ａｐｏ 　Ａｌの血漿中濃度はＣＨＤの危険および冠損傷の存在とは負の相関性を有する 「マチェイコら（Ｍａｃｉｅｊｋｏ　ｅｔ　ａｌ）、ニュー・イングランド・ジ ャーナル・オプ・メディシン（Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、）、３０９　：　３８ ５−３８９．１９８３　；セドリス（Ｓｅｄｌｉ５　ａｔａｌ）、サーキュレイ ンヨン（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）、　７３　：　９７８　９８４　。

１９８６］　。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験は、Ａｐｏ　ＡＩとレシチンとの複合体が培養した動脈平 滑筋細胞からの遊離コレステロールの流出を促進できることを示している【ステ ィンら（Ｓｔｅｌｎ　ｅｔ　ａｌ）、ビオシミ力・工・ビオフィジ力・アクタ（ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、）、　３８０　：　１０８〜１ １８．１９７５］。この機構により、ＨＤＬはこれらの細胞の増殖を低減化させ ることもできる［ヨンダら（Ｙｏｓｈｉｄａ　ｅｔ　ａｌ）、エクスペリメンタ ル・アンド・モレキュラー・バンロジー（Ｅｘｐ、Ｍｏｌ。

Ｐａｔｈｏｌ、）、４１　：２５８２６６．１９８４］より最近になって、実験 動物中へのＨＤＬのＡｐｏ　ＡＩの注入は重要な生化学的変化を起こし、また、 アテローム性動脈硬化症損傷の程度および重症度を減少させることが示された。

マチェイコおよびマ才（Ｍａｃｉｅｊｋｏ　ａｎｄ　Ｍａｏ）　［アーテリオス クレロシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、　２　：　４０７ａ、ｌ　 ９８２］　、２の連続的研究におけるバディモンら（Ｂａｄｉｍｏｎ　ｅｔ　ａ ｌ）　［カルディオバスキュラ−６デイジーズ（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ 　Ｄｉｓｅａｓｅ）、Ｉ　９８３　、アブストラクト（Ａｂｓ、）　８１　；ア ーテリオスクレロシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）。

７：５２２ａ、１９８７］は、ＡｐＯＡｌまたはＨＬＤいずれかを注射すること によって（ｄ−１，０６３−１，３２５ｇ／ｍ＜１）、アテローム性動脈硬化症 損傷におけるコレステロールエステル含有量を５８．４％だけ減少させつつ、コ レステロール供与ウサギにおける該損傷の程度を著しく減少させることができる （−４５％）ことをＦ！Ａ瞭に示した。また、ＨＤＬの注入は、動脈損傷を早々 に生じる遺伝性高コレステロール血症をもつワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）・ウ サギの血漿リボ蛋白質組成を顕著に変化させることができるのが示され得た。こ れらにおいて、ＨＤＬ注入は保護的ＨＤＬおよびアテローム成形性ＬＤＬの間の 比を２倍以上とできる。

さらに、動物モデルにおいて動脈疾患を改蓄するＨＤＬの可能性は、Ａｐｏ　Ａ ｌはかなりのフィブリン溶解活性を呈し得るという観察によってさらに刺激され たＣサクら（Ｓａｋｕ　ｅｔ　ａｌ）、トロンボランス・リサーチズ（Ｔｈｒｏ ｍｂ、　Ｒｅｓ、）、　３９　：　１−８．　１９８５］。

ロッ不ンベルゲル（Ｒｏｎｎｅｂｅｒｇｅｒ）　［（第１Ｏ回国際薬理学会議議 事録、シトニー、１９８７．９９０頁］は、抽出Ａｐｏ　Ａｌはピーグル犬およ びマカクザルにおいてフィブリン溶解をかなり増大させることができるのを明瞭 に示した。同様の活性はｉｎ　ｖｉｔｒｏにてヒト血漿で観察できる。本著者は Ａｐｏ　Ａｌ処理動物における脂質の沈積および動脈環形成の減少を確認できた 。

血漿Ａｐｏ　ＡＩは２４３債のアミノ酸の単一ポリペプチド鎖であり、その−次 配列は公知であるＦプリューワーら（Ｂｒｅｗｅｒ　ｅｔ　ａｌ）。

バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミューニケイシ１ン ズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏ＋＋＋＋ａｕｎ、）、　 ８０　：　６２３６３０．１９７８］　、Ａｐｏ　ＡＩは細胞中で２６７個のア ミノ厳罰前駆体として合成される。このプレプロアポリポ蛋白質はまず１８個の Ｎ−末端残基を細胞内で失い；さらに６債のアミノ酸の喪失が、特異的プロテア ーゼの活性によって、血漿および／またはリンパ液中で起こる。

Ａｐｏ　Ａ１分子の主要な構造上の特徴は１１個または２２個のアミノ酸の繰返 単位の存在であると信じられ、両親媒性へりノクス立体配座で存在すると推定さ れているＥセグレストら（Ｓｅｇｒｅｓｔ　ｅｔａｌ）、　ＦＥＢＳＬｅｔｔ、 、　３８　：　２４７２５３．　ｌ　９７４］　。この構造により、Ａｐｏ　Ａ ｒの主要な生物学的活性、すなわち脂質結合およびレシチンコレステロールアシ ルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化が可能となる。ＨＤＬの他の機能、 すなわち細胞との相互作用およびこれらからのコレステロールの除去はアポリポ 蛋白質の明確な特徴とは関連がない。

アポリボ蛋白質、１１−ミラノ（Ａｐｏ　ＡＩ−Ｍ）はヒトＡｐ。

Ａｌの最初に記載された分子変種である［フランチェシニら（Ｆｒａｎｃｅｄｓ ｈｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスゲインａ７ 　（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、１ｎｖｅｓｔ、）、　６６　：　８９２−９００．１９８０ １゜それはＡｒｇ１７３のＣｙｓでの置換によって特徴付けられる［バアイスグ ラベールら（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・パイｒ ｏジカルーヶコストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｓｍ、）、　２５８　：　２５０ ８−２５１３，１９８３］。突然変異体アポ蛋白質は常染色体優勢特性として伝 達され、８世代のキャリアーが同定されている［グアラントリら（Ｇｕａｌａｎ ｄｒｉ　ｅｔ　ａｌ）、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒ、　−２７−ジｚ４ テイクス（Ａｍ、Ｊ、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、）、３７　：　１０８３−１０９７ ，１９８４］。

ＡｐｏＡＩＭのキャリアー状態はＨＤＬ−コレステロールの顕著な減少によって 特徴付けられる。これにも拘わらず、患者は動脈疾患の危険の増大を示さないよ うであり、事実、系統樹の実験によると、これらの患者はアテローム性動脈硬化 症から「保護」されているようである。

キャリアーにおけるＡｐｏＡＩ−Ｍの可能な保護効果の機構は、あるα−ヘリッ クスを喪失しかつ疎水性残基の暴露が増大した、突然変異体アポリボ蛋白質の構 造中の修飾のためらしい［７ランチエシニら（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ　ｅｔ 　ａｔ）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、 ）、２６０　：　１６３２１６３５．１９８５］。

多重σ−ヘリックスの緻密な構造の喪失は、通常のＡＩと比較して、分子の柔軟 性の増大をもたらし、これにより脂質とかなり容易に会合する。さらに、アポリ ポ蛋白質／脂質複合体はより変性し易く、かくして、脂質の伝達もまた当該突然 変異体の場合には改善されることが示唆される。

ＡｐｏＡＩ−Ｍのもう１つの非常に特別な特徴は、両方の場合において、Ｃｙｓ 残基の存在のため、それ自身でダイマーを形成し、Ａｐｏ　Ａ■と複合体を形成 するその能力である。ダイマーおよび複合体の循環系における存在は、おそらく キャリアーにおけるこれらの排泄半減期の遅延の原因となるものであり、最近臨 床的研究で記載されている［ブレツブら（Ｇｒｅｇｇ　ａｔ　ａｔ）、　ヒト・ アポリポ蛋白質突然変異体についてのＮＡＴＯＡＲＷ：表現型発現に対する遺伝 子構造から（ＮＡＴＯＡＲＷ　ｏｎ　Ｈｕｍａｎ　Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｓｉ ｎ　Ｍｕｔａｎｔｓ：ＦｒｏｍＧｅｎｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　Ｐｈｅｎ ｏｔｙｐｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、リモネン拳ニス・シイ（Ｌｉｍｏｎｅ 　Ｓ−Ｇ、）、１９８８］−修飾されたアポリポ蛋白質粒子はかくして循環系に 非常に長時間残存し、かくして、通常のＡ１粒子に比し、良好なその動脈保護活 性を呈する。

アポリボ蛋白質およびそのＡＩ−Ｍ突然変異体の治療への使用は、該アポリポ蛋 白質を十分量かつ適当な剤型で調製できる方法がないため限定されている。

血漿分別物からアポリボ蛋白質ＡＩおよび特にＡＩミラノ（ＡＩ−Ｍ）を生産す る困難はかなりのものである［７ランチエシニら（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ　 ｅｔ　ａｌ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、ＣｈｅＩｌｌ、）、２６０：１６３２１　１６３２５゜１９８５］。さらに 、回避するのが必須である感染病原での汚染および出発物質の入手可能性のごと く、血漿分別産物に伴う一連の危険がある。

ＤＮＡ組換え技術よりヒトＡｐｏ　Ａｌを産生しようとするいくつかの試みがな されてさた。欧州特許出願公開０２６７７０３号には、イー・コリ（Ｅ、ｃｐｌ 　ｉ）からのＡｐｏ　Ａｌの調製が記載されている。該プロセスはキメラポリペ プチドを記載しており、そこでは、該Ａｐｏ　Ａ１部位がベータガラクトシダー ゼのＮ−末端アミノ酸残基、蛋白質Ａのｌまたはそれ以上のｒｇＧ結合ドメイン 、またはヒトＡｐｏ　Ａｌのｐｒｏ配列に結合している。

前記方法は、イー・コリ（Ｅ、ｃｐｌｉ）は形質転換生物として用いられている という事実により欠点がある。発現された産物は成熟ヒトＡｐｏ　Ａｌではなく 、異種起源の実質的配列を含む。さらに、産物は細胞から分泌されず、イー・コ ’Ｊ　（Ｅ、ｃｐｌｉ）宿主生物の細胞内に蓄積し、かくして、発現産物の酵素 的分解の危険性が高まる。

補乳動物ポリペプチドの発現についてのより匣利な系は真核生物細胞らしく、真 核生物、特に酵母で外来性遺伝子を発現させようとするいつくかの試みがなされ ている。インターフェロンの酵母での発現は欧州特許出願公開００６００５７号 に記載されており、酵母には異種の蛋白質の酵母での発現および分泌は欧州特許 出願公開００８８６３２．０１１６２０１および０１２３５４４号に記載されて いる。

本発明の目的は、正確な折りたたみ構造と天然のヒト・アポＡ１の性質、すなわ ち、構造的特徴、脂質結合性、ならびにフィブリン溶解およびし／チン：コレス テロールアンルトランスフエラーゼ（ＬＣＡＴ）の活性化［マーレイ（Ｍａｈ　 １ｅｙ）ら、ジャーナル・オブ・リピンド・リサーチ（Ｊ、Ｌｉｐｉｄ、Ｒｅｓ 、）　、２５巻、１２７７〜１２９４頁、１９８４年］を有し、酵母内において 高収率で生成されるアポＡｒおよびアポ、ｌ−Ｍを提供することにある。

本発明では、Ａｐｏ　ＡＩおよびＡｐｏＡｒ−Ｍをコードする遺伝子に、成熟タ ンパクについての遺伝子の上流側に融合させた酵母が認識可能な分泌およびプロ セッシングシグナルをコードするＤＮＡ配列を設けた。特に、最後の残基がＨｉ ｓＧｌｙＳａｒＬｅｕ−ＡｓｐＬｙｓＡｒｇである修飾ＭＦα１リーダー配列を 用いた。

この修飾ＭＦａｌリーダーにおいて、プロセッシングシグナルは二塩基配列Ｌｙ ｓ−Ａｒｇであったが、この配列を次いでＡｐ。

Ａ１遺伝子の５′末端に融合する。リーダー配列がすべての構築物において切断 される、即ち、すべてのＡＩ）ＯＡＩおよびＡｐ。

Ａｌ−Ｍポリペプチドの上流側にある二塩基配列Ｌｙｓ−Ａｒｇで切断が起こる ことが判明した。

本発明は、Ａｐｏ　ＡＩおよびＡｐｏＡＩ−Ｍを酵母内で生産する方法を提供す る。この方法によれば、Ａｐｏ　ＡＩおよびＡｐ。

ＡＩ−Ｍタンパクをコードす仝ＤＮＡ配列よりなる発現ベクターで形質転換され た酵母株が適切な培地中で培養され、この培地からＡｐｏ　Ａ１８よびＡｐｏＡ ｒ−Ｍ分子が回収される。

かかる形質転換酵母株を培養すると、高収率のＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏＡＩ− Ｍが培養プロスから単離される。

発現産物を単離し、Ａｐｏ　Ａｌ免疫応答物質を精製し、微少配列分析法により 特徴付けを行った。このポリペプチドは天然Ａｐ。

Ａｌと同じ特性を有することが判明した。

本発明の発現ベクターは、酵母宿主内で安定に維持するための複製系と、Ａｐｏ 　ＡｌまたはＡｐｏＡＩ−ＭをコードするＤＮＡ配列と、プロモーターおよびタ ーミネータ−配列よりなる。

発現ベクターは、所望の産物をフードするＤＮＡ配列の上流側に、発現産物を酵 母の分泌経路へ向かわせ、この発現産物を増殖培地中に分泌することを確実にす るプレ領域を含んでいてもよい。このプレ領域は、天然に存在する／グナルまた はリーダーペプチドあるいは分泌を与える合成配列でありうるが、一般的には、 分泌の間に゛所望の産物から切断され、成熟産物を培養ブロスがら単離されるよ う準備できた状態とする。

酵母に良く適合するリーダー配列は酵母ＭＦａｌリーダー配列であるＣクルシャ ン・ジェイ（Ｘｕｒｊａｎ、ｊ、）およびヘルスコビッッ・アイ（Ｈｅｒｓｋｏ ｙｉｔｓ、１．）　、セル（９旦）、３０巻、９３３−９４６頁、１９８２年コ 。

発現ベクターは、宿主微生物内で複製し得るまたは宿主染色体内に組み込まれ得 るプラスミドであってもよい。使用するベクターは、各々が選択的な切断部位に より分離される、所望ＤＮＡ配列の反復コピーの発現をコードし得るものでよい 。

所望ＤＮＡ配列の発現は、宿主生物内において所望産物の発現をもたらすように 、所望産物をコードするＤＮＡ配列に対して正確に位置付けられているプロモー ター配列の制御下にある。好ましくは、酵母宿主に固有の遺伝子に由来するプロ モーター、例えばＴＰＩ（トリオーゼホスフエートイソメラーゼ）遺伝子のプロ モーターまたはＭＦａｌ−プロモーターが用いられる。

所望産物についてのＤＮＡ配列には、転写ターミネータ−配列、好ましくは酵母 宿主に固有の遺伝子に由来するターミネータ−配列、例えばＴＰＩ遺伝子または ＭＦａｌ遺伝子のターミネータ−が続く。

本発明は、以前にクローン化されたＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐ。

Ａｌ−Ｍ配列［ンヤープ・シー・アール（Ｓｈａｒｐｅ　ＣＲ）　、シトリ・エ イ（Ｓｉｄｏｌｉ　Ａ）　、シェリー・シー・ニス（Ｓｈｅｌｌｅｙ　ＣＳ）　 、ルセロ・エム−エイ（Ｌｕｃｅｒｏ　ＭＡ）　、ショルダース・シー・シー（ ５ｈｏｕ　１ｄｅｒｓＣＣ）Ｓよびバラル・エフ・イー（Ｂａｒａｌｌｅ　ＦＥ ）　、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、） 、１２巻、３９１７〜３９３２頁、（１９８４年）］を、Ａｐｏ　Ａｌの唯一の Ｎｃｏｒ部位にクローン化された４６ヌクレオチドの化学的に合成されたアダプ ターを用いて酵母での分泌向きにする操作についても述べる。

ＡｐｏＡｉＭ突然変異は、キャリアー由来の突然変異Ａｐ。

ＡＴ−Ｍ遺伝子を部分的にクローン化し、その一部を野性型配列に置き換えるこ とにより生じさせた。

図面においてニ ー図１はＭＦａｌリーダー配列末端部および成熟Ａｐｏ　Ａｌアミノ末端配列を 含む４６ヌクレオチド・アダプターの配列を示す。

−図２はｐＵＣ８からのプラスミドｐＵＣ／ＡＦ−ＡＩの構築を示す。

−図３は図２のプラスミドから出発するｐＵＣ／ＡＦ−ＡＩ−Ｍの構築を示す。

一図４はｐＹＥＳから、および図２と＠３のプラスミドから出発する発現ベクタ ーｐＹＥｓ／ＡＩおよびｐ　ＹＥ　Ｓ／Ａ　Ｉ　−Ｍの調製を示す。

ＡｐｏＡＩ８よびＡｐｏＡＩ−Ｍ配列の構築Ａｐｏ　Ａｌ配列は我々が以前Ｉこ 述べたｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローン［シャープ（Ｓｈａｒｐｅ）ら、ヌクレイツク・ アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ略を用いて、シグナルペプチドおよ びプロペプチドをコーｃＨ−，ｔ、、る配列を取り出し、修飾した。

元のｃＤＮＡ配列（プラスミドｐＡＩＡ）由来のＮｃｏｌ−ＢａｍＨ１断片を、 ＭＦａｌリーダー配列の末端部および成熟アポＡｌのアミノ末端配列を含む化学 合成断片ＨＩｎｄｍ−ＮｃｏＩ（図１）、およびＨｉｎｄｌｌｌ−ＢａｍＨＩ消 化ｐＵＣ８（図２を参照）で同時に結んだ。このクローンをｐＵＣ／ＡＦ−ＡＩ と名付ける。

ＡｐｏＡＩ−Ｍ配列は、ＡｐｏＡＩ−Ｍキャリアー由来の遺伝子の一部をクロー ン化することにより得た。使用した方法は以下の通りであった： ａ）標準的な方法［クンケル・エル・エム（Ｋｕｎｋｅｌ　ＬＭ）　、Ｘ　ミス ・ケイ・デ（−（Ｓａ＋ｔｔｈ　ＫＤ）　ｓポイヤー−ニス・エイチ（Ｂｏｙｅ ｒＳＨ）　、ボルガオンカール・ディー・ニス（Ｂｏｒｇａｏｎｋａｒ　ＤＳ） 、ウォッチエル・ニス・ニス（Ｗａｔｃｈｅｌ　ＳＳ）　、ミラー・ビー・ジェ イ（Ｍｉｌｌｅｒ　ＢＪ）　、ペルグ・ダブリュー・アール（Ｂｅｒｇ　ＷＲ） 、ジ１−ンズ・エイチ・ダブリュー（Ｊｏｎｅｓ　ＨＷ）およびラリ−・ジェイ ・エム（Ｒａｒｙ　ＪＭ）　、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンス・オブ・ジ・ユナイテッド・スティソ・オブ・アメリカ（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、１２４５〜１２４９頁、１ ９７７年］に従って、末梢血白血球細胞からＤＮＡを調製した。

ｂ）ヌクレオチドｌ７９２および２２４０間の断片（ｖ！Ｊ３を参照）［ンヨル ダース・シー・シー（Ｓｈｏｕｌｄｅｒｓ　ＣＣ）　、ロンブリット・エイ・ア ール（Ｉｒｏｎｂｌｉｈｔｔ　ＡＲ）、ムンロー・ビー−ニス（Ｍｕｎｒ。

ＢＳ）およびエフ・イー・バラル（Ｆ、Ｅ、Ｂａｒａｌｌｅ）　、ヌクレイツク ・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１１巻、２８２７ 〜２８３７頁、１９８３年］を、キャリアーから調製されたＡｐｏＡＩ−Ｍゲノ ムＤＮＡに関する酵素反応において、以下の配列： ５′−ＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＧＡＴＧＡＧＣＡＡ−３’、ヌクレオチド１７９ ２の５°末端部、 ５″−ＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡ−３’　；ヌクレオチド２２ ４０の５°末端部 を育する２つの合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるポリメラーゼ 鎖反応法［ＰＣＲ，サイキ・アール・ケイ（Ｓａｉｋｉ　ＲＫ）　、ゲルファン ト・ディー・エイチ（Ｇｅｌｆａｎｄ　ＤＨ）、ストソフェル・ニス（Ｓｔｏｆ ｆｅｌ　Ｓ）　、シャルフ・ニス（ＳｃｈａｒｆＳ）、ヒグチ・アール（Ｈｉｇ ｕｃｈｉ　Ｒ）およびホーン・ジー・ティ（Ｈｏｒｎ　ＧＴ）　、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９巻、４８７〜４９１頁、１９８８年１として知られて いる増幅法により生成Ｃ）この断片をＸｈｏＩ［および５ｔｕＩ消化に付し、得 られた産物をｐＵｃ／ＡＦ−ＡＩ由来のＨｉｎｄｌｌＩ−ＸｈｏｌＩおよびＳｔ ｕｌ−ＢａｍＨＩ断片で結んで、ｐＵＣ−８ＢａｍＨＩ−Ｈ４ｎｄ■線状化ベク ターとした。

得られたクローンをｐＵＣ／ＡＩＭと名付ける。

プラスミドの構築 ヒト・Ａｐｏ　ＡｒおよびＡｐｏＡＩ−Ｍをコードする遺伝子を、ＴＰＩプロモ ーター（Ｔ　Ｐ　Ｉ　、）［ティー・アルバー（Ｔ、ＡＩｂｅｒ）および・ジー ・カワサキ（Ｇ、Ｘａｗａｓａｋｉ）、ジャーナル・オプ・モレキュラー・アン ド・アプライド・ジェ不テ（−／クス（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅ ｔ、）、１巻、４１９〜４３４頁、１９８２年１をコードする断片、ＭＦαｌリ ーダー配列［ジエイ・クルキアン（Ｊ、Ｋｕｒｋｉａｎ）およびアイ・ヘルスコ ビンツ（１，Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）　％セル（Ｃｅｌｌ）　、３０巻、９３３ 〜９４３頁、■９８２年］、８よびニス・セレビ／アエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓ　 １ａｅ）のＴＰＩに由来する転写終結配列ＴＰ１．と結合させた。

これらの断片は、Ａｐｏ　ＡＩをコードする遺伝子の高い転写率を確実にする配 列を提供し、また、Ａｐｏ　ＡｒおよびＡｐｏ　Ａｌ−Ｍポリペプチドの分泌経 路うの局在化およびその結果としての増殖培地への分泌を行うことができるプレ 配列を提供する。

さらに、発現プラスミドは、酵母の２μ複製起点および選択可能なマーカーＬＥ Ｕ２を有する。

酵母におけるａ因子のｉｎ　ｖｉｖｏｌｇ、熱化の間に、ＭＦα１リーダーペプ チドの最後（Ｃ末端）の６個のアミノ酸（Ｌｙ　ｓ−Ａ　ｒ　ｇ−Ｇ　ｌ　ｕ− Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｕ−Ａ　Ｉ　ａ）が、Ｌｙｓ−Ａｒｇ配列を認識するエン ドペプチダーゼおよびＧｌｕ−Ａｌａ残基を衆去するアミノジペグチダーゼ〔シ ュリアス・ディー（Ｊｕｌｉｕｓ　Ｄ）　、ブレアー・エル（ＢｌａｉｒＬ）、 ブレイク−エイ（Ｂｒａｋｅ　Ａ）、スプランギュー・ジー（Ｓｐｒａｎｇｕｅ Ｇ）およびトーナー・ジエイ（Ｔｈｏｒｎｅｒ　Ｊ）　、セル（蝕旦）、３２巻 、８３９〜８５２頁、１９８３年１を引き続いて作用させることにより、α因子 の前駆体から除去される。酵母アミノジペプチダーゼの必要性をなくすために、 ＭＦａｌリーダーのＣ末端Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａをコードする配列を 、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異誘発法により除去した。

図４に示す如く、ｐＵｃ／ＡＦ−ＡＩおよびｐＵＣ／ＡＦ−ＡＩ−Ｍに由来する Ｈｉｎｄｌ［［ＢａｍＨＩ断片をＨＩｎｄｍ−ＢａｍＨＩ線状化ｐＹＥＳベクタ ーにクローン化した。酵母を形質転換し、Ａｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏＡＩ−Ｍ遺 伝子を発現させるために得たプラスミドを各々ｐＹＥｓ／ＡＩおよびｐＹＥＳ／ ＡｉＭと呼ぶ。

形質転換 前記のごとく調製したプラスミドを、グルコース上での増殖について選択するこ とにより、ＴＰＩ遺伝子に欠失を有するニス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉ ｓｉａｅ）株に形質転換した。かかる株は、通常、単独炭素源としてのグルコー ス上では増殖できず、−ガラクトースラクテート培地上では非常にゆっくり増殖 する。この欠陥はトリオースホスフェートイソメラーゼ遺伝子の変異に起因し、 この変異はこの遺伝子の主要部分の欠失およびニス・セレビシアエ（Ｓ、ｃｅｒ ｅｖｉｓｉａｅ）ＬＥＵ２遺伝子との置換により得られる。この増殖欠陥のため 、ＴＰＩについてコードする遺伝子を含むプラスミドが厳密に選択される。

Ａｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏ　Ａｌ〜Ｍ前駆体の酵母での発現アポリボ蛋白質につ いてコードするプラスミドを含む酵母株を、ＹＰＤ培地［シェルマン・エフ（Ｓ ｈｅｒｍａｎ、Ｆ、）ら、「酵母遺伝学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）　Ｊ　、コールド・スプリング＋ハーバー争ラ ボラトリ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、 １９８１年〕上年増上させた。各棟に対して、２つの、それぞれ２リツトルのバ ッフル付きフラスコ中、１リツトル培養物を、６００ｎｍにおけるＯＤが約１５ に達するまで（約４８時間）、３０℃にて振盪した。遠心分離した後、さらに分 析するために、上溝を取り出した。

Ａｐｏ　ＡＩおよびＡｐｏＡＩ−Ｍ培養液の精製培養液を１５．ＯＯＯｒｐｍで ３０分間遠心分離し、上清を０．１５ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍ　リン酸カリウム 緩衝液、０．０５％ＥＤＴＡ、ｐＨ７，４（緩衝液Ａ）に対して透析した。

トリグリセリドに富む粒子（ＴＧＲＰ）を、４℃での超遠心分離洗浄により、市 販のリン脂質−トリグリセリド乳化液から単離し、緩衝液Ａに再懸濁した。培養 液からの上溝をＴＧＲＰと共に、３７℃にて６０分間、穏やかに撹拌しながらイ ンキュベートし、氷−水浴中に浸漬することにより、インキュベーションを停止 した。２７゜０００ｒｐｍ、３５分間、４０℃の超遠心分離により、ＴＧＲＰを 再び単離し、ジエチルエーテル：エタノール３州で脱脂質化した。

沈澱した蛋白質を低速遠心分離により集め、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ）　Ｓ−２００カラムおよび／または抗アポＡｌ−セファロース（５ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　）カラムに通した。

組換えアポリボ蛋白質の構造的特徴付は組換えＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏＡＩ− Ｍの構造的特徴は、アミノ酸分析法および蛋白質微少配列決定法により試験し、 アポリボ蛋白質調製物の純度を確認した。二次構造は円偏光二色性により分析し 、組換えアポリポ蛋白質が正確に折りたたまれていることが示された：ａ°ヘリ ックス含量は、抽出アポＡｔに対する４９％含量と同様に、組換えＡｐｏ　Ａｌ およびＡｐｏＡＩ−Ｍについて、それぞれ５２％および４３％と計算された。か くして、組換えＡＩ−Ｍは、抽出Ａｐｏ　ＡＩ　［７ランセスチーニ（Ｆｒａｎ ｃｅｓｃｈｉｎｉ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ（Ｊ、 Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅ■、）、２６０＠、１６３２１−１６３２５頁、１９８５年 ］と同様に、正常ＡＩに比べてσヘリックス含量が低い。

組換えＡｐｏＡＩ−Ｍ対Ａｐｏ　Ａｌの生物学的評価すべての実験報告は、ニス ・セレヴイジアエ（Ｓ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　カら得たＡｐｏ　Ａｌおよび ＡｐｏＡＩ−Ｍを、血漿から抽出したヒトＡｐｏ　Ａｌと比較することにより行 った。ヒトＡｐｏ　ＡｌはヒトＨＤＬよりｔ！ｉ製し、分収用超遠心分離により 分離した。単離したＨＤＬ画分の脱脂化後、Ａｐｏ　Ａｌをゲル濾過およびイオ ン交換クロマトグラフィーにより分離した［ベーカ−（Ｂ　ａｋｅｒ）ら、バイ オケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　、１２　：　３８６６−３８７ １゜プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を促進する、すなわち、フィブリン 溶解を開始させる試薬が、心筋梗塞の治療において増大する関心を獲得しつつあ る［マツフェルおよびブラウンヮルド（Ｌａｆｆｅｌｌ　ａｎｄＢｒａｕｎｗａ ｌｄ）　、ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディスン（Ｎ、Ｅｎｇｌ 、Ｊ、Ｍｅｄ、）、　３１１　：　７１０−７１７　、　ｌ　９８４］、以前の データは、Ａｐｏ　Ａｌがｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｊこてフィブリン溶解を活性化し 得ることを示している［サク（Ｓ　ａｋｕ）ら、トロンボシス・リサーチ（Ｔｈ ｒｏｍｂ、Ｒｅｓ、）、　３９　：　ｌ　８　、ｌ　９８５］。

ウロキナーゼ活性の増強または抑制を測定するために、実験は、フィブリン平板 法により実施した「グラスーグリーンワルト（Ｇｌａｓ−Ｇｒｅｅｎｗａｌｔ） ら、ジャーナル・才ブ・ラボラトリ−・アンド・クリニカル・メゾイス７　（Ｊ 　、Ｌａｂ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｅｄ、）　、ｌ　０４　：　９６２−９７６．１９８ ４］　。

６　ｍ　ｌ容量中、終濃度０．１％のウシ（プラスミノーゲンに富む）フィブリ ノゲン溶液を、ウシ・トロンビン溶液（２ＯＮＩＨユニット／ｍ１）０．２ｍｌ で凝固させた。トリス緩衝液で希釈した組換えＡｐｏ　ＡｌおよびＡｐｏ　ＡＩ 　Ｍ（１０および５００ｐ／ｇの間の濃度）を速やかにウロキナーゼ（ｆ−ｃ、 ３．３ｃＡＴ　Ｕ／ｍｌ）と混合し、フィブリン平板に適用した。これらを３７ ℃にて１７時間インキュベートした。溶解領域の測定により、両蛋白質が、最高 試験用量で、ＡＩ）ＯＡｌの場合（抽出Ａｐｏ　Ａｌでは、５９．７％と６６． ２％であるのに対して：サクら、トロンボシス・リサーチ、３９：ｌ−８，１９ ８５）、各々、６４．０％および６７．９％までの、ＡｐｏＡＩ−Ｍの場合、９ ６．７％および１１２．１％までのウロキナーゼ溶解領域を有意に増加させるこ とが示された（表１）。従って、この系において、ＡｐｏＡＩ−ＭはＡｐｏ　Ａ Ｉよりも有意に優れているようである。

培養マクロ７アージか゛らのコレステロールの除去いわゆる、　［逆コレステロ ール輸送Ｊ　（ＲＣＴ）、すなわち、コレステロールの組織からの血漿への輸送 は、受容体リボ蛋白質として作用するＨＤＬによって調節されると考えられてい る（ブロムセット・ジェイ（Ｇｌｏｍｓｅｔ　Ｊ　、）　、アドブ・インド・メ ト（Ａｄｖ、　Ｉ　ｎｔ。

Ｍｅｄ、）、２５：９１−１１６．１９８０）、Ａｐｏ　ＡｌがＨＤＬの除去能 の１因と考えられているので、実験は３Ｈ−コレステロールで平衡化したｌ−７ ７４マウス・マクロファージで実施した。単層を、「最小必頂培地」、溶媒抽出 脱脂子ウシ血清タンパク質、卵ホスファチジルコリン（Ｐ　Ｃ）およびエステル 化コレステロールと共にインキュベートした［ロスプラト（Ｒｏｔｈｂｌａｔ） ら、イン・ビ）ｏ　（Ｉｎｖｉｔｒｏ）、１２　：　５５４−５５７，１９７６ ］　ｏ　”Ｈ：＋レスチロールで４８時間平衡化させ、その後、放射能活性培地 を除去し、細胞を十分に洗浄し、５ｍｇ／ｍｌの脱脂子ウシ血清タンパク質を補 足した新鮮な培地を加えた。−夜インキユベートした後、該細胞を再度十分に洗 浄し、３５ｍｍの平坦な皿中、各受容体粒子２ｍ１を加えた、ＨＥＰＥＳ−緩衝 ウィリアムス培地Ｅ　（ＷｉｌｌｉａｍｓＭｅｄｉｕｍ　Ｅ）と共にインキュベ ートした。最初の６時間においては９０分毎に、次いで３時間毎に、合計２４時 間の間、インキュベート培ｊｌ！！Ｑ、１ｍ１部を採取し、計数して細胞によっ て放出された標識コレステロール量を測定した［ロスプラトおよびフィリップス （ＲｏｔｈｂｌａｔＪよびＰｈ１ｌｌｉｐｓ）　、ジャーナル・オブ・バイオロ ジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２５０　：　４７７５ 　４７Ｂ２．１９ｇ２］　。

組換えＡｐｏ　ＡｌまたはＡｐｏＡＩ−Ｍを含有するプロテオリポソームを、マ ツトスおよびジョナス（ＭａｔｓおよびＪ　ｏｎａｓ）　［ジャーナル・オブ・ バイオロジカル・ケミストリー、２５７：４５３５−４５４０．１９８２］　Ｊ 二より記載されているごとく、コール酸塩（ｃｈｏｌａｔｅ）透析方法に従って 、卵ＰＣで調製した。混合物は、一般に、１０ｍＭトリス／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／ １ｍＭ　ＮａＮ１／１５０ｍＭ　ＮａＣＩ　（ｐＨ８，０）中、アポリポ蛋白質 ／リン脂質／コール酸塩（買置比率１／２．５／１．５−２．５）よりなるもの であった。

アポリポ蛋白質／リン脂質粒子をサイズ分けするために、０．１５Ｍ　ＮａＣＩ ｌｏ、０２％ＥＤＴＡ、ｐＨ７で溶出するセファ０−ス（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ） ＣＬ／４Ｂ　（１，５Ｘ８０ｃｍカラム）上のゲル濾過を行った。ピーク画分を 超濾過セル（アミコン・モデル５２（Ａｌｌｉｃｏｎ　ｍｏｄｅ＋　５２）上に て濃縮した。Ａｐｏ　ＡｒまたはＡｐ。

Ａｌ−Ｍ含有の粒子の化学組成および分子の顕微鏡特性を測定することによって は、有意な差異を見い出せなかった。細胞コレステロールの除去能を評価するた めに、２種の異なる濃度のアポリボ蛋白質成分（５０および１００μｇ／ｍＩ、 すなわち、１５０および３００μｇのＰＣ／ｍｌ培地の濃度に相当する）を該細 胞に加えた。

これらの実験条件下、コレステロールの一方向性流動（ｆ　１ｕｘ）は無細胞コ レステロール濃度に関して１次的であるため、種々の条件においてコレステロー ル流出（ｅｆｆｌｕｘ）の半減期（ｔ１′りを算出することかでさる。

表２に示すごとく、アポリポ蛋白質のリポソーム中両濃度にて、Ｊ−７７４細胞 からの遊離コレステロールの流出は、Ａｐｏ　Ａｌに比較し、ＡｐｏＡＩ−Ｍで はかなり速かった。再度、組換えおよび抽出Ａｐｏ　Ａｌ　（ｔ””：　１７． ９±３．２）の間で差異を検出することはでさなかつに。

アテローム性動脈硬化症退行のｉｎ　ｖｉｖｏ研究本実験では、抽出Ａｐｏ　Ａ ｌおよび組換えＡｐｏＡＩ−Ｍの４週間連続注入が、２力月間の０．５％富コレ ステロール飼料で確立したウサギでの動脈障害を減少させる能力を評価した。２ ５匹のニュージランド系（Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ）雄のウサギ（初期体重２． ２−２゜５ｋｇ）に０．５％富コレステロール飼料を２カ月間与えた。この時点 で４匹の動物を殺した。その大動脈は、４５．３±７．６％のアテローム性動脈 硬化症障害を包含することを示した。この時点で、動物を各群７匹の３群に分け た。群ｌには無九理の標準無コレステロール飼料を与えた。群２には、耳の静脈 に連結し、皮下注入するアルゼット１製のミニポンプ（Ａｌｚｅｔ”　Ｍｉｎｉ ｐｕｍｐ）を用い、Ａｐ。

ＡＩを連続的に注入した。群３は、ＡｐｏＡＩ−Ｍで同様に処理した。合計日蛋 白質用量は、２種のアポリポ蛋白質の各々につき７ｍｇ／ウサギであった。

処理の４週間後、大動脈の脂肪障害の程度および大動脈の脂質含量を共に３群で 評価した。データ（表３）により、ＡｐｏＡＩで３０％以上の障害の退行、およ びＡｐｏＡＩ−Ｍで６０％以上の退行が示され、これは両群における動脈コレス テロールおよびコレステリルエステル合計の非常に有意な減少に対応し、Ａｐｏ ＡＩ−Ｍは通常のＡｐｏ　Ａｒに比べてかなり効果的である。

報告した知見により、ｉｎ　ｖｉｖｏ条件［バジモン（Ｂ　ａｄｉｍｏｎ）ら、 アーテリオスクレロシス（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）　、　７　：　 ５２２　ａ　。

１９８７］でＡｐＯＡＩの顕著な活性が確認され、恐らくはその物理化学特性の ため、ＡｐｏＡＩ−Ｍが、通常のヒトＡＩ４こ比し、アテローム性動脈硬化症障 害の退行を誘発するのに効果的であることが示される。

硫 １ト ？Ｊｃｏ工　Ｈｉｎｄ　エエエ　Ｎｅｏ　工ＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＴＴＧＧＡＴ ＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＴＧｃＺＨｉｓＧｌ ｙＳｅｒＬｅｕＡｓｐＬｙｓＡｒｑｋＳｐＧ１ｕＰｒｏＰｒｏＧ１ｎｓｅｒＰｒ ｏτ疼ＭＰ　ＯＬ　ｌ　ｌ　Ａｐｏ　ＡＩ　アミノ末端Ｆ工Ｇ、　１ ＮＣｏ） ＰＣＲ増幅　ｘｖＮｈ　Ｈｉｎｄ　Ｉｌ１国際調査報告 、□９１．ユ、１．ゆ。２Ｐ口／ＥＰ　９０１００６１７１シ呻−鵠Ｃ＾鈴−− ―絢　ＰＣＴ／ＥＰ　９０１００６１７国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．形質転換すべき酵母の自己由来プロモーター配列、ＡｐｏＡＩまたはＡｐｏ 　ＡＩ−ＭをコードするＤＮＡ配列、培地中への発現産物の分泌を誘導し得るリ ーダーペプチドをコードする配列、形質転換すべき酵母の自己由来転写ターミネ ーター配列よりなることを特徴とする形質転換酵母でアポリポ蛋白質ＡＩおよび アポリポ蛋白質ＡＩ−Ｍ（ミラノ（Ｍｉｌａｎｏ））を発現できる発現ベクター 。
2. ２．該リーダー配列が、【配列があります】残基をコードする修飾されたＭＦａ ｌリーダー配列である請求項１記載の発現ベクター。
3. ３．プラスミドｐＵＣ８に由来するものである、Ａｐｏ　ＡＩまたはＡｐｏ　Ａ Ｉ−Ｍを発現できる請求項１または２記載の発現ベクター。
4. ４．プラスミドｐＹＥＳ／ＡＩおよびｐＹＥＳ／ＡＩ−Ｍよりなる前記いずれか １の請求項記載の発現ベクター。
5. ５．以下の配列： 【配列があります】 を有する【配列があります】残基をコードする合成ＤＮＡ。
6. ６． ａ）式 【配列があります】 【配列があります】 の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＡｐｏ　ＡＩをコードする ＤＮＡのヌクレオチド１７４９および２２４０の間の断片を増幅し、 ｂ）ａ）で得られた断片を制限酵素Ｘｈｏ　ＩＩおよびＳｔｕＩで消化し、 ｃ）ｂ）で得られた断片を断片１〜１７９１および２２４１〜２３９６で結ぶこ とによって得られるアポリポ蛋白質ＡＩ−ミラノをコードするＤＮＡ配列。
7. ７．請求項１〜５記載の発現ベクターで形質転換した宿主酵母。
8. ８．菌株サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ）である請求項７記載の宿主酵母。
9. ９．請求項７または８記載の形質転換宿主酵母の培養から得ることができる蛋白 質。
10. １０．請求項７記載の蛋白質および医薬上許容される担体を有効成分として含有 してなる医薬組成物。