JPH05504890A - エリスロマイシン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エリスロマイシン誘導体 技術分野 本発明は新規のクラスのエリスロマイシン誘導体に関する。

特に、本発明は、６−エリスロマイシン化合物、その化合物類の抗生物質として の使用法、その翼部法に関する。

発明の背景 エリスロマイシン、特にエリスロマイシンＡは、臨床的に有用であり、グラム陽 性細菌５ｚｃｅ１＋ｏｐｏｌｙ＋ｐｏ＋１ｔＢ＋ｈ＋ＩＣ＋　（以前のＳｌ＋ｅ ｐｌｏｓ７ｅｅ＋　ｔ＋７ｔｈｒ＋ｗ＋　）によって生産される、広域スペクト ルの、マクロライド抗生物質である。しかしながら、エリスロマイシンの大きな 欠点は、酸安定性が低いことであって、このため、経口吸収が減少したり、不安 定なものとなることがある。

従来、たくさんのエリスロマイシンが化学的に合成されてきたが、これは、抗菌 活性を失うことなく酸安定性を改善しようという試みからであった。（ｉＳ＋− ９−ジヒドロエリスロマイシンＡ（９−ケト基の代わりに９−ヒドロキシ基を持 つ）のことが記載されている（ＶｉｌｅＹｔｔ　＋１．．１．Ａｍｅ＋、Ｃｈｅ ｔＳｏｃ、、７？：３６７６−３６７７　ｆ１９５５１１　。エリスロマイシル アミンとエリスロマイシン・オキシム、これらは、いずれもその９−ケト基が、 それぞれ、アミノ基またはオキシム基で置換されたものであるが、これらについ ても記載されている（ＧＢ　ｌ　１００５０４：　Ｍ＋＋＋７　ｃｌ　＋ｌ、。

Ｔ＊＋ｔＩｂｒｄｔｏ＋　Ｌ＋＋＋ｓ＋＋、２：１５７−１６０　［１９７０） ）　ｏ　この外にも、各覆エリスロマイシン・オキシム・エーテル類が同様に記 載されている（アメリカ特許３．’６Ｂ１．３２６　、３．８６９．４４５　、 　および、４、０６３．０！４　）。６−０−メチルエリスロマイシン（クラリ スロマイシン）　、６．　ＩＩ−ｄｉ−Ｇ−メチルエリスロマイシンＡが、アメ リカ特許４．７４３．５９３号に記載されている。

上記誘導体においては、酸安定性が改善されてはいるけれども、それらを生産す る合成法は、高価で、低い収量しか生まないことがある。さらに、開始原料（す なわち、エリスロマイシン）が酸に不安定であるため、さらに活性の高い誘導体 を合成しようとする試みが邪たげられる。

したがって、酸安定性の改善されたエリスロマイシン誘導体にたいして、さらに 、微生物的に生産され、それ故、前記の合成法の非能率を回避することができ、 または、少なくとも、合成誘導体の調製にもっと好都合な開始原料を提供できる 誘導体としての需要がある。

イシン、および、６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンを含む。これらは 、下記の構造式Ｉで表される。

ここに、ＲはＯＨとＨから選ばれ、Ｒ２，Ｒ３はＨとＣＨ。

からそれぞれ独立に選ばれる。本発明の化合物の中にはまた、生合成による中間 体３−α−ミカロシルー６−デオキシエリスロノライドＢおよび、式１の化合物 の、製薬的に受容可能な塩およびエステルも含まれる。

本発明の方法には、エリスロマイシン産生微生物を遺伝学的に修飾し、その微生 物を、本発明の化合物を生産する株に形質転換する、そのような遺伝学的修飾法 も含まれる。この微生物のゲノムは、エリスロマイシン生合成経路の中間体のＣ −６水酸化に不可欠の領域を遺伝的に修飾される。本発明のある特定の実施例に おいては、修飾される微生物のＤＮＡは、Ｓ＠ｒ７１ｈｒｔｓｔチトクロームＰ 　４５０モノオキシゲナーゼ系による、６−ジオキシエリスロノライドＢからエ リスロノライドＢへの水酸化を担当するゲノム領域である。

本発明の方法のある１側面によれば、エリスロマイシン産生微生物を、６−ジオ キシエリスロマイシン産生株に形質転換するのは、相同的組換え法によって、突 然変異誘発のプラスミドをＣ−６水酸化を担当する、その微生物のＤ　Ｎ　Ａの 一部に組み込むことによって達成される。この組み込みプラスミドは、その微生 物において安定に維持されるように、すなわち、形質転換細胞から、同様に形質 転換された子孫になるように構築されている。本発明のある特定の実施例におい ては、組み込みプラスミドは、Ｓ、ｓ＋７１ｂ＋！ｔＩにおけるチトクロームＰ 　４５Ｇモノオキシゲナーゼ系の動作に不可欠なりＮＡの一部に相同なりＮＡフ ラグメントを用いて構築した。

本発明の方法のさらにもう一つの側面によって、６−ジオキシエリスロマイシン 産生５ｅｒｙｌｈｒｔ＋を形質転換細胞を、高レベルのエリスロマイシンＡを生 産するように選択的に飼養されたもう一つのＳ、　ｔＢｔｈｔｔｅｔ株と遺伝学 的に交差させられる。この交差した子孫の中から、組換え微生物を選択した。す なわち、６−ジオキシエリスロマイシンを生産する能力を保持しておりながら、 元の度換種の場合よりも高い生産をもたらす組み換え微生物を選択する。

本発明の具体的な微生物は、Ｓ、ｔ４ｔｈ＋ｔ＜ｔの新規な株であり、このもの を窒素、炭素の同化性供給源を含む水性培養液中で培養すると、６−ジオキシエ リスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ１６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシ ンＡ、Ｂ、ＣおよびＤから選ばれた化合物を生産する。さらに望ましくは、本発 明の微生物は、エリスロマイシン高生産株と交差させたもので、本発明の化合物 の生産能力が強請されたものである。

図面の簡単な説明 本発明は、付属の図と関連させると、さらに理解しやすい。

第１図は、Ｓ、ｓＢ＋ｈ口！暑におけるエリスロマイシンへの生合成のための予 想代謝経路である。

第２図は、プラスミド　ｐＭＷ２７からプラスミドｐＭＷｓ６４２３を構築する 様を描いたフロー・ダイアグラムである。

１ｌＩ３１１！！Ｉは、Ｓ、　ｅＢｌｈ＋ｓｅｘにおいてＣ−６水酸化を担当す るｔａｒ遺伝子のＤＮＡ配列である。

第４図は、本発明の組み込みプラスミドにおいて認識配列（＋ｅｃｏｌａｉｌｉ ｏａ　ｔｔ％ｓｔｍｔ＠）として用いられる、５ｏ３ｂｐ　フラグメントのＤ　 Ｎ　Ａ配列である。

１５図は、プラスミドｐＭＷ５６−［１２３の制限地図である。

［６図は、相同的なりＮＡ配列を含むプラスミドｐＭＷｓ６−［１２３の組み込 みによってＳ、ｅＢｌｈ＋ｔｓｒ　［ＩＷｌｌＯを形質転換する模式図である。

１７図は、エリスロマイシン生合成遺伝子クラスターを含む、Ｓ、ｔＢＩｈｒｓ ｔｌのゲノム領域の染色体マツプである。

１８．９図は、それぞれ、６−ジオキシ−１５−ノルニリスロマインンＡ、Ｃの ５００Ｍ［ＩＨ’［１１１Ｍ１スペクトルである。

本発明の詳細な説明 本発明は、新規のエリスロマイシン誘導体、および、その製薬的に受容可能な塩 類、エステル類、また、同時に、それら化合物の抗生物質としての便Ｍ法、その ｌｌ製法を提供することである。本発明の化合物は、構造式Ｉで示される。

ここに、Ｒ１は、ＯＨおよびＨから選択され、Ｒ２，Ｒ３はそれぞれ独立にＨお よびＣＨ３から選択される。式！の化合物はまた、ここでは、下記の通り、６− ジオキシエリスロマイシンＡからり、および、６−ゾオキシーＩＳ−ノルエリス ロマイシンＡからＤとも呼ばれる。

Ｒｔ　Ｒ２Ｒ３ ６−ジオキシエリスロマイシンＡ　ＯＨＣＭ、　ＣＨ３６−ジオキシエリスロマ イシンＢ　ＨＣＨ３ＣＩ（。

６−ジオキシエリスロマイシンＣＯＨＨＣＨ。

６−ジオキシエリスロマイシンＤ　ＨＨＣＨ。

６−チオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＡＯＨＣＨ３Ｈ ６−チオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＢＣＨＨ ６−ゾオキシーＬ５−ノルエリスロマイシンＣＯＨＨＨ ６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＤＨＨ これらの化合物は、遺伝的に修飾されたエリスロマイシン産生微生物を培養し、 次に培養液からそれらを抽出することによって得ることができる。ここに述べる 本発明のある実施例では、用いる微生物は、細菌５ｘｃｃｂｓ＋Ｂｏｌｙ＋ｐｏ ｒ＊　！ｒｙｔｂ＋ｓｔｔである。

本発明はまた、前記化合物の生産法を提供する。これは、天然ないし野生種のエ リスロマイシン産生微生物を、所望の化合物を生産する変異種に形賀転換するこ とから成る。本発明のある実施例では、得られた形質転換体は、チトクロームＰ ４５０モノオキシゲナーゼ系を欠い−でいる。この系は、野生種のＳｉｃ＋ｈ＊ ＋Ｂｏｌｙ＋ｐｏ＋を微生物におけるエリスロマイシン生合成時の、Ｃ−６位置 での６−ジオキシエリスロノライドＢを水酸化するものである。エリスロマイシ ン生合成時路の、残りの段階は機能し続けているので、本発明の化合物がエリス ロマイシンＡからＤの代わりに生産されることになる。

本発明はまた、−例として、ｃ−６水酸化を中断する特定の方法を提供する。こ れは、プラスミドの相同的組換えによる、微生物ゲノムへの組み込みから成る。

組み込みプラスミドは、その微生物ゲノムのある一部にたいして相同なヌクレオ チド配列を含むように構築されている。本発明のある実施例においては、その相 同は、野生種微生物においてｃ−６位置における水酸化を担当する遺伝子のサブ セットに関するものである。プラスミドを、相同部位において組み込むと、遺伝 子は、二つの不完全な配列に分離される。すなわち、そのいずれも、ｃ−６水酸 化には適しない。したがって、この組み込みプラスミドが、その微生物ゲノム内 に安定に維持される限り、水酸化は中断される。

野生種微生物が高度のエリスロマイシンを生産するというのは考えられないこと であるから、同様に、そのような微生物の形質転換体も、商業的に有用な量の６ −ジオキシエリスロマイシンを生産するとは考えられない。したがって、本発明 はさらに、６−ジオキシエリスロマイシン産生株の発酵によって生産される収穫 を増すために、高生産性株をどのように用いたらよいか、その使用法についても 提供する。このような高生産性変異種は、市販のものを入手したり、野生微生物 を選択的に飼養して得ることができるが、これを、例えば、６−ジオキシエリス ロマイシン産生形質転換体と、または、別法として、それ自身と交差交配し、高 レベルの６−ジオキシエリスロマイシン産生株に形賀転換することができる。

本発明の方法の好ましい実施例では、野生覆Ｓ＊Ｃｃｈ１＋ｏｐｏｉｙ＋ｐｏｒ ｔ微生物の形質転換体を、エリスロマイシンの高生産株と遺伝学的に交差させる 。この交差による組み換えの子孫を、６〜デオキシエリスロマイシン生産能力、 ならびに、所望の化合物にたいする高度の生産能力に基づいて選択する。

野生種の形質転換体、組み換えの子孫のいずれも本発明の微生物を代表する。す なわち、６−ジオキシエリスロマイシンを生産するように遺伝学的に修飾された エリスロマイシン産生株であればいずれのものでも本発明の微生物に含まれる。

本発明の微生物は、下記の実施例にしたがって調整されるのであるが、この好ま しい具体例は、５ｓｃｃｈｓｒｏｐｏｌｌｓｐｏｒ＆＃ｒ７１ｂｒＪｅｉ　４１ ｆｆｉである。その形ｉ転換体の親よりも存意に大きい量の６−ジオキシエリス ロマイシンを生産する、その交差株（ｃｒｏＩＩｅｄ＋＋：ｌ１ｎ）は、ブダペ スト条約の条件に基づいて、Ａｇ＋１ｅｕ１１Ｉ暑ＩＲｓ＋１Ｉｔｔｂ　Ｃｕｒ ａｔｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　！ｆｏｇｈｏｒｎ　ＲＢｉｏｎｓｌ　１ｅ＋ ｔｓ＋ｃｈＣｅｎｔｉ、　Ｕ、Ｓ、Ｄｅｐｔ＋ｔｉｅａｔ　Ｏｆ＾ｇ＋ｉ＋ａｌ ｌｕ＋＋、１８１５　ｔｌｏｔｈｈｉマ＋＋＋ｉｔ７５ｌｒｔＮ、Ｐ＋ｏ＋ｉｒ 、１ｌｌｉｎｏｉ＋　６１６０４．　Ｕｎｉｔｅｄ　５１１１！＋に寄託されて おり、寄託番号ＮＲＲＬ　ｌＨ４３が与えられている。

本発明の方法は広くあらゆるエリスロマイシン産生微生物に応用可能であり、そ のような微生物について、ざっとしたリストを挙げると、５ｘｅｃｂｓｒｔｒｐ ｏＩＨＨｘ　＠　、　Ｈｒｅｐ＋ｏｍｌｃｅ＋Ｂｉ＋ｅｏｐｌｔｎｕ＋、１ｌｏ ｃ鳳＋ｄ口種、ＭＩｃｒｏｍｏｎｏｔｐｏｔｓ覆、Ａｒｔ）ｒｏｂ１＋ｔ＋＋種 、Ｓｊ！ｅｐｌｏｍ７ｃ＋＋　ＩｎｔｉｂｉｏｔｉＣｓがある。この内、５ｒｃ ｔｈｔＶｏｐｏｌｙ＋ｐｏ＋ｓ　ｔ＋７１ｈ＋ｔｅｔがもっとも好ましい。

Ｓ、　＋ｒ７ｔｈ＋ｔｅ＊によるエリスロマイシンの生合成においては、この化 合物は、図１に示した経路にしたがって形成されると考えられている。この経路 において、段階（１）と（２）は、プロピオニルと２−メチルマロニル・千オニ ステルから得られた、１４構成マクロラクトン　６−ジオキシエリスロノライド Ｂの集合体で、その後、それが水酸化されてエリスロノライドＢになる。段階（ ３）と（４）では、グルコースからデオキシ糖ミカロースとデソサミンを形成し 、さらに、それらをエリスロノライドＢに加えて、エリスロマイシンＤを形成す る。段階（５と（６）ｒは（まタハ、（６°）と（５°）　テハ）　、Ｃ−１２ の水酸化、Ｃ−３”Ｏ−メチル化が行なわれ、エリスロマイシンＡが生産される 。

Ｓ、　＜Ｂｌｈ＋ｔ＋１エリスロマイシン生合成において特定される、もっとも 初期の中間産物は、６−ジオキシエリスロノライドＢであり、これは、生合成経 路の次の段階で水酸化される。この水酸化は、チトクロームＰ−４５０モノオキ シゲナーゼ系によって触媒されるが、この系は、６−ヒドロキシラーゼと共同し て働く、２個のフラボタンパクと、１個の鉄・硫黄タンパク（エリスロマイシン ）を必要とする（５ｈｓｆｉ＜＊　ｓｌ　１１．。

１、Ｂｌｃｌｕｉｏｌ、、１７０：１５４８−１５５３　（１９ｇ８））。

エリスロマイシン生合成時に、Ｃ−６水酸化を中断すると、６−ジオキシエリス ロマイシンＡが、その生合成経路の他の６−デオキシ中間体と共に、形成される 。水酸化を中断する一つのやり方は、チトクロームＰ−４５０モノオキシゲナー ゼ系の動作に必要な細胞遺伝子を破壊することによって行なう。これは、そのよ うな遺伝子に、次のような組み込みプラスミドを挿入することで実現することが できる。すなわち、その微生物におい）　で安定に維持され、それによって、そ の微生物を、６−ジオキシエリスロマイシン産生突然変異種に震えてしまうよう なプラスミドである。その微生物のゲノムに組み込むことができ、かつ、それに よって６−ジオキシエリスロノライドの中断をもたらすことができるプラスミド であればどのようなものでも利用してよい。しかしながら、本発明の方法は、い かなる意味でも、６−ジオキシエリスロノライドの水酸化を欠く突然変異種をも たらす遺伝子破壊のみに限定されるものではない。ヒドロキシラーゼ系を破壊す るその他の方法、例えば、遺伝子交換（Ｈｅ１ｔ＋ｅｐｌｔＣ１■ｌ）　（これ には、特定の遺伝子配列の除去が含まれる）や、化学的、光線誘発による突然変 異などを用いて、所期の、遺伝学的に修飾された微生物を生産してもよい。

外来ＤＮＡをプラスミドに挿入し、組み込みプラスミドを形成するためには、こ の分野において、いくつかの方法が知られているが、本発明にそった好ましい方 法を、ｊＩｆ２１！Ｉに模式的に示し、下記の実施例に例示する。本発明の好ま しい実施例においては、次のような選択可能なりＮＡプラスミドが構築される。

すなわち、（ａ）その各々がＳ＋＋ｔｐｔｏｓ７ｃｅ＋中で機能する１複製決定 基を含むプラスミド９１１７０２のフラグメント、および、抗生物質チオストレ プトン（ｔｓｒ）に対する耐性を与えるＤＮＡのフラグメント、（ｂ）その各々 が、Ｅ、ｃｏｌｉ中で機能する、複製の機能的起源、および、抗生物質アンピシ リン（ｚａｐ）に対する耐性を与えるＤＮＡフラグメント、そのようなフラグメ ントを含むもの、（Ｃ）チトクロームｐ４５Ｇモノオキシゲナーゼ系の作動を司 る遺伝子の一部を含み、かつ、プラスミド組み込みにたいして２識配列（ｒ＠ｃ ｏｌｅｉｔｉｏｃ　＋ｅｑＩｌ＊口ｃりとして働くＳ、　ｅ＋ｙ＋ｈｒｔｚｔの ｔ　ｒｍＥ領域のＤ　Ｎ　Ａフラグメント。本発明を体現するプラスミドを含む Σｅｏｌｉの培養体、これをａＭＷ５６〜＋１２３と呼ぶが〜これも前記のよう に、＾１＋１ＣａＮａｒｓｌ　Ｒｔｔｔ＊ｒｔｈ　ＣｇｌｌｔｒｓＣｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎに寄託し、それには寄託番号１１１ＲＬ　Ｂ−１８６２８が与えられて いる。

特定の抗生物質耐性遺伝子と、上に特定した複製の機能的起源（ｆｕｎｃ＋１ｏ ｕｔｌ　ｏ＋ｉｌｉ＋＋＋　ｏｆ　＋ｔｐｌｉｃｓｌｉｏａ　）は、所期の組み 換えプラスミドの選択と複製を可能にする場合に限り必要である。

その他のマーカー、複製起源（ｏ＋ｉ（ｉ＋＋＋　ｏｆ　＋ｅｐｌｉｃｔ＋ｉｏ ｍ）も、実行可能な場合ならばどこでも、本発明の実施時に使用してよい。同様 に、組み換えプラスミドを、Ｃ−６水酸化に必要な微生物ゲノムの一部に組み込 むことを可能にし、それによフて、水酸化の中断をもたらす、そのような認識配 列であればどのようなものでも使用してよい。好ましい微生物Ｓ、　５ｒｙｆｈ ｒｔ＊ｔにおいては、認識配列は、第３図に示したヌクレオチド配列のサブセッ トを含むフラグメントであってもよい。すなわち、このものはＣ−６ヒドロキシ ラーゼをコードする５ｒ７Ｆ遺伝子と、隣接するフランキング配列を発現すると 考えられている。

下記の実施例で用いられる、機能性認識配ＦＩＪＣｔｒｐｔｒｓ口１ｇ＋ｔｅｏ Ｂｉｔｉｏａ　＋ｅＨｅｎＣｅ）を東４図に示す。この５ＯＵＰ　Ｓ＊ｗ３Ａ− ３ｓａ３Ａフラグメントは、実施例の方法により、コスミドａｌｌのＩＤｋｂ　 ）Ｉｉｎｄｌｌｌ−ＥｃｏＲ１フラグメントから得られる。

他にも、Ｓ、＊ｒｙｌｈ＋ｓ！＊ゲノムの他の場所に位置する配列が特定される こともあろう。そのような配列もまた、本発明の範囲の中にあるものと見なされ る。さらに、Ｃ−６水酸化を担当する微生物ゲノムの一部について、その配列が 決定された場合においては、本発明のプラスミドは、上記の例のように一部のゲ ノムの消化物を用いることなく、構築することができよう。上記の代わりに、認 識配列を新たに合成したり、また、必要な起源、耐性フラグメントと結合させて 、組み込みプラスミドを形成することができよう。

本発明の組み込みプラスミドは、Ｓ、　ｅｒ７ｉｈＩＣ墨や、その他の宿主菌株 と結合させて用いてもよい。このプラスミドが有用なのは、小さくて、融通性が あり、Ｓ、　＠ｔ７１ｈｒ１ｅｓやＥ、ｃｏｌｉを含む各種宿主菌株に挿入する ことができるからである。

この発明の組み込みプラスミドのある実施例を第５図の制限地図に示す。ここに ｐＭＷ５６−Ｈ２３と書かれているが、このプラスミドは、プラスミドｐｔｌｃ ｌＬ　ａｌ１７０２の結合によって形成された新規のプラスミドに挿入された、 藁４図の５１ｍ３Ａ−５ｓｉ３Ａフラグメントを含む。この５１１３Ａ配列は、 第５図においてプラスミドの下部に示した、特異なりｇｌ＋１部位に挿入される 。

本発明の代表的なプラスミドをエリスロマイシン産生宿主微生物に組み込むやり 方を第６図に模式的に示す。認識配列（ｌ！かけ部）は、Ｃ−６ヒドロキシラー ゼ酵素にたいする宿主遺伝子のサブセットと相同である。相同配列間における交 差による組み換えは、プラスミドの安定な組み込みをもたらし、かつ、エリスロ マイシン生合成時に６−水酸化の欠損を伴う。

本発明は、融通性に富むので、相同的組み換えによって、Ｓ、　ｅｒ７ｔｈｒ＊ ｔｔに組み込むことができ、それによって、チトクロームｐ４５Ｇモノオキシゲ ナーゼ系を欠く形質転換体を生み出すことのできるヌクレオチド配列であれば、 いかなるものでもそれを、上述したヌクレオチド配列に取って代えることができ る。

組み込みプラスミドの、選ばれた制限部位に認識配列として挿入されるＤＮＡ配 列は、チトクロームＰ４５Ｇモノオキシゲナーゼ系にたいする実際の構造遺伝子 の一部を含んでいなくともよいし、あるいは、そのような構造遺伝子のフラグメ ントしか含んでいなくともよい、ということを了解しなければならない。

エリスロマイシン生合成をコントロールするということが判明した制御遺伝子で あればいかなるものでも、それを、同様に、組換えプラスミド、または、その他 の突然変異誘発法を用いて破壊しても、本発明の範囲から逸脱することにはなら ない。

さらに、本発明は、製薬組成を与える。それは、本発明の化合物の治療有効量を 、製薬担体と混合させたものである。本発明の組成の治療有効量を投与すること によって、それを、人およびその他のは乳類患者における細菌性およびその他の 感染症の治療に役立てることができる。

本発明の化合物としては、式！の化合物の、製薬的に受容可鰻な塩およびエステ ルがあり、これらは、通例の調製法により製造することができる。本発明の塩と しては、有機カルボン酸（例えば、酒石酸、クエン酸、ステアリン駿、コノ１り 酸）、メタンスルフォン酸、アミノエタンスルフォン酸、アミノ酸（例えば、ア スパラギン酸、グルタミン酸）などのような有機酸と反応して形成されるものが ある。この塩は、式■の化合物を、対応する酸で処理することによって得ること ができる。上記化合物は、エリスロマイシンが以前に用いられていたように、人 および鴫乳頭患者における病原性感染の治療と予防に前動である。

本発明の化合物はまた、生合成中間産物３−α−ミカロシルー６−デオキシエリ スロノライドＢを含む。このものは、上に開示したものと同様に、それ以外にも 興味あるマクロライド類合成の反応物として役立つ可能性がある。

本発明の組成は、非経口注入、固体ないし液体形による経口投与、直腸投与など のために、本発明の化合物の治療有効量を、製薬的に受容可能な担体と処方する ことによって製造する。

「治療有効量」とは、この化合物が、病原性の細菌ないしその他の微生物感染を 、宵利な危険対利益割合（＋ｉ＋ｋｉｏ−ｂｔｎ＋ｌｉｌ＋ｓ＋ｉｏ　）で、治 療ないし予防するのに十分な量を意味する。ある咀者に単発ないし分割用量で与 える、１日当りの全用量は、例えば、１から　ＩＨ■／ｋｇの量であろうが、さ らに普遍的な場合を言えば、５から５０■／眩であろう。単位用量組成は、所期 の１日当り用量を形成するように、その分数を含んでいてもよい。

担体物置と結合して、単一用量形を形成することのできる活性成分量は、治療す る患者や、特定の投与法により変わることがある。さらに、本発明の化合物の有 効量は、処置ないし予防すべき特定の微生物、感染の度合、治療期間、患者の年 齢や体重、医学において既知の、同様の要因によって変わることがあることを了 知しなければならない。

非経口投与用の組成は、製薬的に受容可能な、滅菌した、水溶性ないし非水溶性 溶液、懸濁液または乳液であってもよい。

適当な非水性担体、希釈液、溶媒、またはビヒクルとしては、プロピレン・グリ コール、ポリエチレン・グリコール、オリーブ油のような植物油、オレイン酸エ チルのような注入可能な有機エステルがある。このような組成はまた、保存剤、 湿潤剤、乳化剤、拡散剤のような添加剤を含んでいてもよい。それらを、例えば 、細菌遮断性フィルターでろ過することによって、もしくは、滅菌剤を組成の中 に含めることによって、滅菌してもよい。この組成はまた、使用の直前に滅菌水 またはその他の滅菌性注射液に溶解することのできる、滅菌固体組成の形で製造 してもよい。

経口投与用の固相剤形としては、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、顆粒がある。こ のような固相剤形においては、活性化合物は、少なくとも一つの、蔗糖、ラクト ースないし澱粉のような不活性の希釈液と混合してもよい。このような剤形はま た、通常の慣行通り、ステアリン酸濶清剤のような、製薬的な添加物質を含んで いてもよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでい てもよい。固相の経口剤はまた、大腸性ないしその他のコーティングをかぶせて 謂整してもよい。

これによって、活性成分の放出をコントロールすることができる。

経口投与用の液相剤形としては、製薬的に受容可能な乳液、溶液、懸濁液、シロ ップ、エリキシールがある。これらは、水およびアルコールのような、この分野 で昔通に用いられる、不活性の、無毒の希釈液を含む。この組成はまた、湿潤剤 、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤のような添加剤を含んでいてもよい 。

ここに用いる「チトクロームＰ４５Ｇモノオキシゲネーゼ系」という用語は、共 同して作用し、Ｓ、ｔＢｌｈ目！１目上１て６−デオキシエリスロノライドＢの 水酸化を誘発する１詳のタンパク（２個のフラボタンパク、１個の鉄・硫黄タン パク（エリスロマイシン）とＣ−６ヒドロキシラーゼ酵素）を指す。

ここに用いる「プラスミド」という用語は、小円形のＤＮＡで、遺伝子ないし遺 伝子の部分を持ち、ある宿主微生物において独立に複製することのできるものを 指す。

ここに用いるＦエリスロマイシン生合成遺伝子クラスター」という用語は、エリ スロマイシン耐性を与える遺伝子の近傍に位置する、エリスロマイシンＡの生合 成に係わる遺伝子を指す。

ここに用いる「交差」という用語は、ある微生物の染色体と、あるプラスミドに 含まれる相同ＤＮＡの間で、遺伝子が、ＤＮＡ分節の切断と再結合を含む過程を 通じて、交換される一つのメカニズムを指す。

ここに用いる「相同的組み換え」という用語は、同一の、または、はぼ同一の配 列を含む、複数のＤＮＡＮ開鎖間相補的な塩基の組合せおよび交差を指す。

ここに用いるｒＥＣｏｌｉの複製起源ｆｏ＋１ｆｉｎ　ｏｆ　＋ｔｐｌｉＣｔｔ ｉａｎｌ　Ｊという用語は、Ｅ、ｃｏｌｉにおけるプラスミドないしその他のベ クターの複製を許容しコントロールし、および、維持するＤＮＡ配列を指す。

ここに用いる「ストレプトミセスの複製起源（８＋１Ｈｉｎ　ｏ！＋＊ｐｌｉｃ ｕｉｏｎ　）　Ｊという用語は、ストレプトミセスにおけるプラスミドないしそ の他のベクターの複製を許容しコントロールし、および、維持するＤＮＡ配列を 指す。

ここに用いる「制限フラグメント」という用語は、１個以上の制限酵素の作用に よって生じた直鎖Ｄ　Ｎ　Ａを指す。

ここに用いる「形賞転換」という用語は、ある受容微生物へＤＮＡを挿入し、そ れによって、遺伝型を変え、したがって、その微生物にある変化を引き起こす、 そのようなり　Ｎ　Ａの挿入を指す。

細菌株、プラスミド・ベクター、および、培養液本発明の下記の実施例を実行す るのに用いられたエリスロマイシン産生微生物は、Ｓ、５ＢｌｈｒＪ■の野生型 分派であって・以前の、　Ｓ＋ｒｓｕｏｍ７ｅｓ＋　ｅｎｌｂ＝ｔｕ＋　！ＨＩ Ｌ　２３０　（υＶ２２．Ｗｓｌｕｒ　ｓｌ＋１．、　１．Ｂ！ｃ＋ｓ＋ｉｏ１ ．、　１６４：４２５−４３３　ｆｌＨ５１１であった。組み込み変換を実行し た宿主株は、Ｓ、　＊＋Ｈｈ：＊ｅｓ　［ＩＷｌｌＯ（ｍ＊＋−４１５ｗ−１８ ＋ｉ！−６３）であった。９１１７０２分派を複製した宿主株は、５ｌｌｅｐｌ ｏ１７ｅｌｌ　１ｉＶｉｄ１ｎ＋　ＴＥ０１であり、これは、Ｊｏｈｎ　Ｉｍａ ！＋１ｎＮｉ＋Ｎｔ、　Ｎｏ＋ｖｉｃｈ、　Ｕ［から入手した。Ｅ＋Ｃｈ！＋＋ Ｃｈｉ＊　！ｏｌｉＥｔｌ来プラスミド用の宿主株は、Ｂｅ１ｈ＋ｓｄｔ　Ｒ＜ ＋ｓ＆＋Ｃｂ　Ｌｒｂｏ＋ｔｔｏ＋ｉｔ＋（ＢＲＬ）、Ｇ５１ｌｂ＠＋ｓｂｗｒ １．　ｉｌ＊＋７１■ｄから得たＥ、ｃｏｌｉ　ＤＢ５−　ａであった。

プラスミドｐＨ７０２（Ｋｔｔｓ　Ｎ　ｔｌ、、Ｉ］１ｃｒｏｂｉｏ１．、＋２ Ｌ２７０３−２７１４　（１９８３１＋は、Ｊｏｈｎ　ｌ＋ａｅｔ　Ｉａｔ＋ｉ ｔ−＋ｓから入手した。プラスミドｐａｃｕはＢＲＬから得た。ｅ＋ｍＥ遺伝子 を包含するＳ！ｒ７１ｈ＋ｓｓｓ野生型ＤＮＡを含むコスミド−ＩＩは、ＡＨｅ 目Ｌｔｂｏｒｓ＋ｏ＋ｉ＠ｓのり、ＫＮｓ、Ｊ、Ｔｉ＊ａ、Ｍ、５ｌｓｖ！ｔに よって与されたＯプラスミドｐＩＩｆ２７は、Ｓ！ｒ７ｊｈｒｔｓｓにおける組 み込み形賀転換用の多機能親ベクター（＊ｇＮｉ＋ｔａＣ＋１ｏａＪｌ　ｐｓｒ ｔｎ＋　ｔｓＣｔｏｒ　）であるが、これは、ｐ１７７Ｈとｐｎｃｌｇから次の ようにして構築した。

すなわち、ｐＵｃｌＢの［ｅｏＲ１部位を、ｐ＋＋７０２のＢｇｌ＋１部位に近 くなるような向きに、それぞれの−意のＩｐａ１部位（ｔａｉｌ＠にｐａｌ＋１ ｔｃ）で結合した。

Ｓ、　ｅＢｌｈ＋ｔｅｔは、５００　ｅｌ振とうフラスコに投じた、２％グリシ ン添加５０ｍ１トリブチイック・ソイ・ブロス（７ｒＹｐｌｉｃ　５ｏ７Ｂｏｏ ｔｈ　）　（ＴＳＢ、Ｓｉ（＋ｕ、Ｓｔ、、ｗｉｔ、ＭＯ）中で、３２℃で、液 体培養した。プロトプラストからのマイセリアの再生のため、または、一般的な 胞子形成液として、１２↑２寒天プレート（ｆｅｂｅ＋、ｓｊ　＊１．。

１９Ｎ）を用いた。５ｔｒＹｆｈ口１１形質転換体は、チオストレプトンを５４ ／ａｔ（液体培養）、または、１ｆｌ＃／ｍｌ（固体培養）で用いて選択した。

試薬、ならびに、一般的方法 市販の試薬を用いて、本発明の化合物、プラスミド、遺伝学的変種を製造した。

この中には、アンピシリン、制限酵素、丁４−ＤＮＡリガーゼ、牛小腸アルカリ ・フォスファターゼが含まれる。制限酵素と７４−ＤＮＡリガーゼは、制限条件 に関して、メーカーの指示に従って用いた。チオストレプトンは、Ｅ、ＬＳＨｉ ｂｂｌｏｄ　５ｏＩＩ１．ＰｒｉｍｃｔｌｏＩｌ、Ｎｅｖ　］ｅ＋＋！７から入 手した。

組み込みプラスミドの調製時、中間の宿主Ｅｃｏｌｉ　（Ｍｓａ口を口。

＋ｔ　ｚｌ、、　’１ｌｏｌｅ＋ｎｌ＊＋　Ｃ１ｏｎｉＢ、　Ａ　Ｌｒｂｏｒｘ ＋ｏｒｙＭｔ■＊ｌ’、　Ｃｏ１ｄＳｐａｉｎ１　ＦＩ＊ｒｂｏｔ、　Ｎ、　Ｔ 、　（１９ｇ２）］　の育成と形質転換については、標準法を用いた。ｊ、　＊ ｒｙｔｂｒｓｔ＊の最終的な形質転換は、下記に述べる、Ｗｅｂ！ｔ　ｅｔ　＊ １．、　Ｇｔ＊ｔ　６８：１ｌ７３−１８０（１９８＋　の変法を用いて前記は 、下記の実施例を参照することによってさらによく理解できる。しかし、これら の実施例は、本発明の実施に関する、非限定的な例示として与えられるものであ る。

実施例１　プラスミドｐＭＷ２７の構築プラスミドｐＭＷ２７は、組み換えＤＮ Ａ技術の標準法を用い、冨２図に模式的にその概観を示したやり方に従って構築 した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ由来のプラスミドｐ（ｌｃｌｇ　（Ｔｔａｉ＋ｃｋ−Ｐｅｒｒｏ Ｉｌ、　ｓｌ　ｓｌ、。

■旦、３３：１０３−１１９　（１９８５））を制限酵素［ｐｃｌで完全に消化 した。

得られた［ｐｍｌフラグメントを、これまたあらかじめＩｐａｌ　（にＭ＋！転 換した。次に、これを、アンピシリン存在下に培養し、組み換えプラスミドを持 つ宿主細胞を選択した。プラスミドＤＮＡを個々の形質転換体から単離し、マー カー制限部位（ｍｔ＋ｋ＜＋＋ｅｌｌｒｉｅ目ｏｅ　ｔｉｌりに関してその特徴 を明かにし、１５ｋｂ組み換えプラスミドｐＭＷ２７の形成を確かめた。

実施例２　Ｓ！！７ｔｈ＋＊＋ｔの＋＋ｍＥ領域のフラグメントの単離チトクロ ームｐ４５０モノオキシゲナーゼ系の活動を担当するＳ、　ｅ１７１ｈ＋ｌｅｌ ゲノムの一部を、走査遺伝子破壊法（＋ｃｓａａｉＢＨｅｎｔ　ｄｉｓｒｕｐｔ ｉｏｎ　）を用いて単離した。この方法は、Ｃｂｘ＋！＋！＋　ｓｌ、、　Ｇｓ ｆｉｅ　２６＋６７−７８　ｆ１９８３１に記載する突然変異性クローニング（ ｍａｔＮｉｏ＋ｕｌ　ｅｌｏｎｉａりをモデルとしたものである。この技術は、 Ｓ、　＋ｒ７１．ｈｒ＊ｓｔ染色体のｔｒｍＥ含有領域をプローブするに利用さ れた。

他の抗生物質産生微生物の場合と同様、エリスロマイシン生合成用の遺伝子は、 エリスロマイシン耐性を与える遺伝子ｔｔｍＥの周囲に集合していると考えられ ていた。この仮定を確かめるため、また、Ｃ−６水酸化を司るヌクレオチド配列 を単離するため、関心のある領域をカバーしている５、ｅｌ７ｔｈ＋ｔ＋ｔの染 色体から、クローンしたＤＮＡフラグメントを、制限酵素ＥｅｏＲ１，Ｈｉｍｄ ｌｌｌを用いて部分的に消化した。得られたＤ　Ｎ　Ａフラグメントを、ゲル電 気泳導によって分離し、Ｇ＋ｎ＊ＣＩ！１ｍ（Ｂｉｏｌｏｌ、　Ｌｓ　Ｉｏｌｌ ｔ、　ＣＡＩを用いたアガロース・ゲルから精製し、酵素５ｉａ３＾で部分的に 消化した。大きさが、約０．２−１．　Ｏｋｂの範囲にあるＤ　Ｎ　Ａフラグメ ントが得られ、これをまた、ゲル電気泳導によって分離し、Ｇ＋ｏ＋ｃｌ！■で 精製し、あらかじめＢｇｌｌ＋で消化したｐＭ１２７に結合させた。このｐＭ１ ２７消化物を、牛小腸アルカリ・フォスファターゼで前処理して、結合を促進し た。

次に、この結合組み換えプラスミドを用いて、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５−とＩ−１ ＊ｌ　（５−ｂｒｏｍｏ−４’−＋ｈ１ｏ＋ｏ−３’−１ｎｄｏ７１−β−Ｄ− Ｂｌｔｃ＋ｏ＋１ｄｅ）を添加したＬＢ寒天で培養し、挿入体含有プラスミドを 持つ形質転換体を選択した。この変換種は、元のＥｃｏ２１−Ｂｉｎｄｌｌｌ　 ＤＮＡ配列の放射標識フラグメントをプローブとして用い、コロニー・プロット ＋　ハイブリダイゼーシツン（Ｍ＊ｎ目＋ｉ＋、　ｅｌ　＊１．、１９８２）に より特定した。次に、挿入体含有プラスミドを、組み込みにブトン１０■／ｍｌ を与えて選択し、胞子を収集し、グリセロール中で結合させた。組み込み形質転 換体は、（ａ）結合−次形賞転換体の胞子（ｃｏｓｂｉ＋ｓｄ　ｐｒｉｍｔｒ７ 　ｔｒｔａ＋ｆｏ＋ｍｔａ＋　＋ｐｏ＋ｅ＋）の一部をＲ２Ｔ２にプレートし、 胞子育成野を収集し、Ｒ２Ｔ２プラスチオストレプトン上に再度プレートし、単 一コロニーをめるか、または、（ｂ）結合−次形質転換体の胞子の一部を、Ｒ２ 丁２プラスチオストレプトン上で単一コロニー精製を２・３度経過させて単離し た。

プラスミド挿入の位置を調べるために、染色体ＤＮＡを、組み込みによって形質 転換した株と、親株から調製した。そのＤＮＡを、挿入が行なわれた領域をカバ ーするＤＮＡフラグメントでプローブするサザーン分析で比較した。相同的組み 換えによる組み込みは、親ＤＮＡにおけるバンドの消失と、形質転換体ＤＮＡに おける、２個の新しい接合バンドの出現をもって特定した。

得られたライブラリーは、約３５０個のクローンから成り、これは、上記のサザ ーン・プロットと制限分析により、大きさ０．４から１．ｏｋｂのＤＮＡフラグ メントを含むことが判明した。

このフラグメントは、Ｓ、ｅ＋７ｔｈ＋ｔｓｓ染色体の１ｏｋｂｌｌ域と相同で あることが判明したが、これは、第７図の染色体マツプでは、ｅＢｃｌ　と５ｒ ｙｃＩＩ遺伝子の間に収まっている。Ｃ−６水酸化を担当する遺伝子、これは後 にｒＢｒと名付けられたが、これは、＜ｒｌＨとｔｒｌＧ遺伝子の間に位置する ことが判明した。

実施例３　プラスミドｐＭＷ５６−Ｈ２３の構築本発明を体現する組み込みプラ スミドは、′Ｍ２図の模式的概念図によって、プラスミドｐＭＷ２７から調整し た。Ｓ、　５Ｂｔｂｒｔｅｓのｅ＋ｍＥ遺伝子領域と約３０ｋｂのフランキング ＤＮＡを含むコスミドｐ１１を、制限酵素［１ｉａｄｌｌｌと　ＥｔｏＲｌによ って完全に消化した。

消化産物から、ＩＱＨのＤ　Ｎ　Ａフラグメントを単離した。これは、！ｔｍＥ のＨｉｎｄｌ１１部位およびｓ！ｍＥの下流配列から、５ｒ７Ｇ遺伝子を越えて 、最初のＥ＋ｏＲ１部位に至るまでの領域を含む（Ｗ！ｂ＋＋　ｅ＋Ａ１．、　 １９８９）　（第５図参照）。標準法を用い（Ｍ１０目ｌｉｔ　ｔｔ　＊１．。

１９ｇ２＋　、この１ｏｋｂ　ＤＮＡフラグメントを、５ｓｉ３Ａで部分的に消 化した。　０４から１．ｏｋｂの間のＤＮＡフラグメントを、調製用アガロース °ゲル（ｐ＋ｔｐｓ＋ｕｉｖｅ　ＨｔｔｏＩｔ　Ｉｅｌ　）を用いて分離し、Ｇ ｓ＋＋ｓｔｌ＠■（Ｂｉｏｌｏｌ、Ｌ＊Ｊｏｌｌｔ、Ｃ＾）で単離した。このＤ ＮＡフラグメントを、あらかじめ制限酵素Ｂｇｌｌ＋によって分断し、アルカリ ・フォスファターゼ（牛小腸）で処理したｐＭＷ２７に結合させた。

９１１Ｗ５６−１１２３と名付けたあるプラスミドを、その後の調査のために選 択した。選択は、興味ある化合物を生産する形質転換体をもたらすことができる かどうかという、その能力にもとづいて行なった。化合物は、薄層クロマトグラ フィー（ＴＬＣ）によって特定した。プラスミドｐＭＶ５６−［１２３は、Ｓ、 　＊ｒ７＋ｋｔＩｓｓ染色体のｓＢＦ領域由来の、５Ｎｂｐ　［ｌＮＡフラグメ ントを含むことが判明した。これは、付属図の第４ｍに示されている。プラスミ ドｐＭＷ５６−Ｈ２３をさらに分析することによって、制限部位の構築と、プラ スミド、ＭＷ４６−１１２３の機能的マツプ（ｆｔ口ｔｌｉｏｃｘｌ鳳畠９）が 得られた。これを纂５図に示す。

本発明の、６−ジオキシエリスロマイシン産生微生物の一例を、Ｓ、　＋Ｂｔｈ 口！１細胞を、前の実施例の組み換えプラスミドで形質転換することによって調 製した。形質転換は、Ｓ、　ｅＢｌｂｒ１１プロトプラストを下記の方法に従っ て用ｔ１て実行した。滅菌条件下、５０１の培養液で、３個の、５ｔＣｅｈｓｒ ｏｐｏｌｙ＋ｐｏ＋ｔ　！Ｂｌｋ＋１＠ｔ　ＩＩＷ　１１０　（ｆｉｂｅｒ　ｓ ｌ　ｔ！、。

１、ＢｓＮｅ＋ｉｏ１　、１６４：４２５−４３３　（１９８５１１の培養体を 、ト＋Ｊブチイック・ソイ・ブロス（Ｔ＋７ｐｔｉｃ　Ｓｅ２　Ｂｒｏｔｈ　） 　（ＴＳＢ；　５１１ｍ５．Ｓｌ。

Ｌｏｗ目１Ｍ０）プラス２％グリシン中で、振とうしながら、３２℃で、それぞ れ、３．４．５日育成した。次に、これらを、２５ｍ１の１０．３％蔗糖中で別 々に洗浄した。洗浄した細胞を２−５■／ｍｌライリゾームを含む２５ｍ１のＰ ＴＩ＜ツファー中に懸濁させ、その後、その懸濁液を合わせ、３０℃で、大部分 の菌糸フラグメントが球形プロトプラストに転換するまで、３Ｇ−６０分インキ ュベートした。（１リットル水溶液当りのＰＴバッファー　１００ｚ！！糖、５ 、ＯＩｌｇ　Ｍｇ　Ｃｌ　２．　Ｈ２Ｏ，０，２５πに２Ｓｏ４，２ｍｌの痕跡 元素（ＥｌａｐＷｅｅｄ　ｔｌｌ、、Ｍｔｌｈｏｄ＋　Ｍ■■１．１９８Ｓｌ、 および、蒸留水で、滅菌後で、かつ、使用時に、２５ｍｌＬＭ　Ｃａ　Ｃｌ　２ 　２Ｈ２０および１００ｍ１０．２５Ｍ　ＴＥＳ　（ｐＨ７，２）を添加したも の。）このプロトプラストを１度洗浄し、１０ｍ１のＰＴＩくツファーに懸濁し た。この懸濁液１ｍｌ中のプロトプラストを、軽−１遺心で収集しく　１００Ｏ ｔπ、５分）、ＰＴ上清を傾斜除去した後に残った液にそっと再懸濁した。形質 転換は、約５ｕ１（５Ｒ）のプラスミドｐＭＷ５６−［３と　０５ｍ１の２５％ ＰＥＧ　（ポリエチレン・グリコール、１Ｈ３３５Ｇ、ｓＢｓ＊、ｓｌ　Ｌｏｔ 口１Ｍ０）を、このプロトプラスト懸濁液に添加することによって行なった。プ ロトプラストを洗浄し、０５−１．０　ｍｌのＰＴバッファー中に再懸濁した。

形質転換プロトプラストの！０ＯＩ１１容量を、Ｒ２Ｔ２再生寒天（Ｗ＜ｂ＜ｒ 　ｓｔ　１１．、　１９０）２５ｍｌ上にプレートした。このプレートを３２℃ で一晩インキニペートシ、　１ｏｏｋ／ｍｌチオストレプトンを含む、２．５ｍ ｌの栄養軟寒天（ＩｏＮ　ｎｕ目１１１１為ｔｔ）（０，３％ｂ＊ｃｌｏ−Ｂ鳳 ＋、０．８％栄養ブロス）を上層し、３２℃で、形質転換体が出現し、胞子形成 するまで再度インキュベートした。純粋な組み込み形質転換体を単離するために 、−次形質転換体の胞子を集め、ｌＯＲ／ｍｌチオストレプトンを含む１２７２ 寒天上で２回条痕接種し、単一コロニーを収集した。得られたコロニーを通例に ならって培養し、折本発明の、６−ジオキシエリスロマイシン産生微生物の好ま しい例は、上記形質転換体Ｓ、５ｒ７ｆｋ＋ｔｅ１［ＩＷｌｌｏ：：ｐＭＷ５１ ｉ−［１２３と、高レベルのエリスロマイシンＡを生産することが知られている もう一つの株との間で遺伝的交差を行なうことによって調製した。この交差は下 記のようにして実行した。この二つの親株（２０％グリセロールに１０’胞子／ ｍｌで懸濁）それぞれの胞子懸濁液を、等しい割合で混合し、混合物の　Ｏ，１ ｍ１分液を、Ｅ２ＯＡ寒天液にプレートした。（１リツトルの水溶液につきＥ２ ＯＡ培養液＝５４ｂｒｅ＋ｏ−＋ｏｙｔｏｎ（５１可溶性澱粉５３１Ｃａ　ＣＯ ｓＩ２・１ｇＭＯＰ５．２０１Ｍ糖）このプレートを、胞子形成が見られるまで （５−７日）、３２℃でインキュベートした。得られた胞子を収集し、２０％グ リセロールで、１０８胞子／ｍｌとなるよう懸濁し、１ｏＡｌｙ／ｍｌのチオス トレプトンを含むＡＶｉ１Ｍ培地にプレートし、組み換え種を形成した。（１リ ットル水溶液当りのＡＶＭＭ培地：１ｇＫ　ＰＨＯ，１ｔＫＨＰＯ４，Ｏ，ｌｔ ＭｇＳＯ４，ｔＧ■Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４，Ｓｔアスパラギンで、これに、滅菌後、 ２０ｍ１の５０％グルコース、チアミン、リボフラビン、パントテン駿ニコチン 駿およびピリドキシンそれぞれ０．５ｇ、葉駿、ビオチンおよびビタミント１２ それぞれＯ，ｅＳ■。） ６−ジオキシエリスロマイシンを生産する子孫は、チオストレプトン存在下に＾ ＶＩＩＭ培地で生育できる、その能力に基づいて選択した。いくつかの組み換え 種を単離し、’　Ｔ　Ｌ　Ｃを用いて、それらが高度の、６−ジオキシエリスロ マイシン生産性をもつかどうかスクリーニングした。４１１と名付けたある単離 種は、本発明の化合物を、親の形質転換体から得られるものよりも、有意に高い レベルで生産することが判明した。

を、この微生物の、Ｅ２ＯＡ寒天培地傾斜標本から取り出し、５００璽ｌのエー レンマイヤー振とうフラスコ中の、５０ｍ１のＥ２９Ｆ培養液に加えた。（１リ ットル水溶液当りの　Ｅ２９培養液：２２ｇ大豆粉、１５ｇ　：Ｉ−ン・スター チ、３ｔ　ＣａＣ０、Ｓｔ　ＭｇＳＯ４゜Ｈ０１１５■Ｆ　ｅ　Ｓ　Ｏ４、７Ｈ Ｑ　Ｏおよび５０ｍ１大豆油。）次に第１段階培養物を、３２℃で４８時間振と うしながらインキュベートした。インキュページシン後、第１段階培養物の１ｍ １分液を用いて、これもＥ２９Ｆ培養液を含む、５０秒段階発酵フラスコに接種 した。次に、この培養物を、３２℃で、５日間振とうしなから、育成した。

５日目、培養物を合わせ、培養液から、細胞を遠心によって分離した。その培養 液を、４ＮＮｒＯ［Ｉ溶液でｐｆｌｌＧに調整し、等量の詐駿エチルで処理し、 本発明の化合物を抽出した。

実施例７　化合物の単離 本発明の化合物のいくつかは、下記の方法により単離した。

１１５０ｍｌの全発酵液から、酢酸エチル抽出物を、前例で述べたようにして調 製したのであるが、これをｐＨ９に調整し、濃縮して油状物を得た。この濃縮物 を、それぞれ１５０ｍ１のへブタンとメタノールの間で分配し、下方のメタノー ル層を、１．７４ｇの残金が得られるまで濃縮した。この残金を、セファデック スＬｌ！−２０カラム（３，２ｔｘ　ｘ　７５ｅ＋ｍ　）上でクロマトグラフに かけた。このカラムは、クロロフォルム、ヘプタン、エタノールの混合物（１０ ：１０１、容量／容量／容量）であらかじめ膨潤し、同じ溶媒でローディングし 、溶出した。１０ｍ１分画を収集し、シリカ・ゲル・ブレーｈ　（Ｍｅ＋ｃｋ　 ［ｉｔ＋ｓ１１！１６０Ｆ２５４）上でＴＬＣを用いて分析した。このプレート には、イソプロピル・エーテル、メタノール、濃水酸化アンモニウム（１５０ニ ア０・４．容量／容量／容量）の溶媒系を満たした。エタノール：硫酸（１９： 　Ｉ、容量／容量）に溶解したアニスψ５ヒト５％を噴霧した後、このプレート を加熱して乾燥させたプレート上にスポットが見られた。分画番号３０−３２が 、エリスロマイシンＡのものと相似のＲ【を持つマゼンタ色のスポットを呈した 。エリスロマイシンＡのＲ，は、約０．２５から約０．６の間を変動している。

この分画を合わせ、濃縮し残金を得た。これを以後残金Ａ（３８■）と呼ぶ。そ れに続く分画番号Ｎ−３８を濃縮し、残金を得た。これを以後残金Ｂ（７７，５ ■）と呼ぶ。

残金Ａは、四塩化炭素、メタノール、０．ＯＩＭリン酸カリウム水溶液バッファ ーｐ［！？、ｏ　（１：ｌ：１１　から成る溶媒系を用い、下記の条件下に、Ｉ ｆｏ　Ｃｏ１１　ＰＩＩｌｅｔ這心器で二つの部分に分けてクロマトグラフにか けた。上層展開用、尾端入力用、８００ｒｌｌ−で約３１１／分の流速、約６０ ％の固定相の保持率。１１１ｍ１分画を収集した。展開槽の突き抜けは、分画１ ２で見られた。この分画についてその生物活性を定量した。このため、ＨＢｈ７ １ｏｃｏｃｃｗ＋＊＊＋ｅ＊＊　６５３８Ｆを植え付けたｐＨ８のプレート上で 、寒天ディスク拡散定量を行い、上記のようにＴＬＣで測定した。相似の分画を 合わせ、濃縮し、塩化メチレンと希釈塩化アンモニウム（ｐ［ｌり）の聞で分配 した。塩化メチレン相を濃縮し、固体の残金を得た。分画番号３２から４２は、 合計９■の白色面体をもたらした。

これは後に６−ジオキシエリスロマイシンＣと特定された。分画１００から　１ ３５は合計１３．４■の白色固体をもたらした。これは後に６−ジオキシエリス トマイシンＡと特定された。

残金Ｂを、同一条件下に、Ｉｌｏ　Ｃａ１ｌ　Ｐｌｓａｅ！遠心器でクロマトグ ラフにかけた。分画番号ｔｏ−Ｉｓは、１．Ｂ■の６−ジオキシ−１５−ノルエ リスロマイシンＣ（第１２図に示すＰＭＲスペクトルを持つ）をもたらし、一方 、分画３２−４０は　４２■の６−ジオキシエリスロマイシンＣをもたらし、分 １１ｇ１２５−１３５は、１０．１■の６−ジオキシエリスロマイシンＡをもた らした。

実施例８　その他の化合物の単離 Ｓ、ｅＢＩｈ＋＋＋＊　４１２の新しい培養体を、実施例６の方法にしたかって 育成した。ただし、１２５倍にさらに濃縮した形のＥＨＦ培養液を用いた。すな わち、フラスコ当り、Ｓｏｍｌではなく、４０ｍ１を用いた。育成後、培養体を 合わせ、酢酸エチルで抽出した。

酢酸エチル分画を濃縮し、残金を得たＮ、７１ｓ）。この残金を、ｎ−ヘプタン 、クロロホルムおよびエタノール（Ｉｌｌ：ｔｏ：１　、容量／容量／容量）を パブクし、同波で溶出したセファデックスＬＨ−２０（６５Ｘ　５３）カラムで クロマトグラフにかけた。分画を、実施例７に記載したように分析した。初期分 画を合わせ、白色、ガラス状の残金ＮＯ■を得た。これを以後残金Ｃと呼ぶ。後 期の分画を合わせ、もう一つの白色、ガラス状の残金を得た。これを以後残金り と呼ぶ。

残金Ｃを、四塩化炭素、メタノールおよび０．０１Ｍリン酸カリウム水溶液バッ ファー、ｐＨ７，ｏ　（１：Ｉ：Ｉ、容量／容量／容量）の溶媒系を用い、下記 の条件下に、Ｎｏ　Ｃ＋＋ｉｌ　Ｐｌ■ｃｆ遠心器でクロマトグラフにかけた。

すなわち、下層展開槽、尾端入力用、８００ｒｐｍで５ｍｌ／分の流速で、１０ ｍ１分画を収集した。約１０＋ｓＪの分画をそれぞれＴＬＣで分析し、その結果 にしたがって合わせた。

分画番号６を濃縮し、６−ジオキシエリスロマイシンＢ（２Ｌ４■）を得た。分 画番号８．９を結合、濃縮し、６−ジオキシ−１５−ノルニリスロマインンＢ（ ２１，４■）を得た。

残金りを、メタノールを用い、セファデックスＬＨ−２０カラムでクロマトグラ フにかけた。分画を収集し、ＴＬＣで分析した。

切期の分画を合わせ、光沢性の残金を得た。これを、四塩化炭素、メタノールお よび０．０５Ｍリン酸カリウム水溶液バッファー、ｐＨ６，０の溶媒系（１：　 Ｉ　：　１．容量／容量／容量）を用い、Ｉｌｏ　Ｃｏ１１ｐＨｎｅｔ遠心器に てクロマトグラフにかけた。下層を展開槽とし、尾端から頭部への移動方式（＋ ｘｉｌ　ｔｏ　ｋｔｔｄ　ｍｏｄｅ　）である。

約１０ｍ１の分画を収集した。分画はＴＬ、Ｃで分析し、その結果にしたがって 合わせた。分画４６−５８を合わせ、濃縮し、６−ジオキシエリスロマイシンＤ 　（２６，２ｍｒ）を得た。

実施例９　その他の化合物の単離 前の実施例の方法により、酢酸エチルを用いて、本発明の、高生産組み換え交差 の培養体から、発酵ブロス総体＋２ＱＬｍｌを抽出した。この酢酸エチル分画を 濃縮して、油状の残金を得た。

これを、２００ｔｌのｎ−へブタンと　２００ｍ１のメタノールの間に分配した 。メタノール相を濃縮し、油状の残金Ｎ、９８ｔ）を得た。

この残金の２０ｇ標本を、あらかじめ、クロロホルム、ヘプタンおよびエタノー ル（１０：１０・１．容量／容量／容量）の混合物で膨潤させ、同一溶媒でロー ディングし、溶出したセファデックスＬ［ｌ−２０カラムでクロマトグラフにか けた。分画（それぞれ約１０ｍ１）を収集し、実施例７のように分析した。分画 ７Ｇ−１６０は、白色、ガラス状の固体３５０■を与えた。これを以後残金Ｅと 呼ぶ。

残金Ｅを、四塩化炭素、メタノールおよび０．０１Ｍリン酸カリウム水溶液バッ ファー、ｐＨ７，０（１：ｌ：１．容量／容量／容量）から成る溶媒系を用い、 下記の条件下で、ｌｔａ　Ｃｏ１１　Ｐｌｓａｓ＋遠心器でクロマトグラフにか けた。上層、展開槽、尾端入力用、８ＧＯｒｐｍ、約３ｍｌ／分の流速、約８０ ％の固定相保持率。ｌ０ｍ１分画を収集した。分画を、実施例７に記載する通り に、ＴＬＣで分析し、結果にしたがって合わせた。合わせた分画は、水酸化アン モニウム濃縮水溶液でｐＨ９に謂整し、蔓容量の塩化メチレンによって２回抽出 した。この塩化メチレン抽出物を、水で１回洗い、次に濃縮して、下記の生成物 を、透明ガラス状の固体として得た。分画３ｇ−４０は、３．２■の６−ジオキ シエリスロマイシンＣを与え、分１ｉ４８−５Ｇは、　１９■の６−ゾオキシー １５−ノルエリスロマイシンへを与え、分画７５−８０は、０９■の６−ジオキ シ−１５−ノルエリスロマイシンＤを与え、分１１９５−１２１は、３８■の６ −ジオキシエリスロマイシンＡを与えた。

実施例１０６−ジオキシエリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃおよびり。

及び、６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＢおよびＤの特性 前述の実施例で単離された化合物を、高解像度高速原子発射（ｋｉｔｈ　＋ｚｓ ｏｌ［ｉａｎ　ＦｔＮ＾ｌｏｇ　１ｏｓｂＩｒ＊！ｇｔ）　（Ｆ　Ａ　Ｂ　）質 量分光分析、プロトンＮＭＲおよび１３ｃｍＮＭＲを用いて特定した。

６−ジオキシエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤｌ及び、６−チオキシ−１５ −ノルエリスロマイシンＢおよびＤについて、１３Ｃ１腸子磁気共鳴化学シフト ・データを含む測定結果を表にまとめ、これを、それぞれ、Ｍ２．３表に掲げた 。炭素、陽子磁気共鳴のアサインは、２０１１１１１の結果で支持された。６− ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＡとＣにたいする陽子Ｎ　Ｍ　Ｒスペク トラムは表にせず、そ れぞれ箪８．９図に示した。

上記化合物については、赤外吸収スペクトラムや旋光度も得られており、それは 下記のように要約される。

６−ジオキシエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤにたいする旋光度は、それぞ れ、［ａｌ　−５４，８（ｃ　Ｏ，５゜ＣＨＣｌ　３　）　−フ４ｊ　（ｃ　１ ．２　、　ＣＨＣ１３）　、　−４１０（ｃｌ、Ｇ、ｃ）ＩＣＩ　）および−７ ７−９（ｃ　Ｉｊ　、ＣＨＣ１３）である。６−ジオキシ−１５−ノルエリスロ マイシンＢおよびＤ　にたいする旋光度は、それぞれ、［ａ　］　−Ｈ，Ｉ　（ ｃ　１．１゜ＣＨＣｌ３）および−８３，３（ｃ　Ｏ，４，ＣＨＣ１ｓ　）であ る。

６−ジオキシエリスロマイシン人にたいする赤外分光分析（ＩＲ）データは、Ｃ ＤＣｌ、溶液において下記の値（ａｍ−１）を示す。すなわち、３７０Ｇ、　３ ５５０．３４５０広い肩、１７２８強大、＋７０５゜１６８５肩、１６００弱小 。ＣＤＣｌ３における６−ジオキシエリスロマイシンＢ、Ｄでは、３６８０弱小 、３５４０広範、１７２１１７０２強大：ＣＤＣｌ、における６−ジオキシエリ スロマイシンＣでは、３７６０、３５２０強大・広範、１７２ｊ強大、１７１１ ５．１０５肩、１６０１１弱小；ＣＤＣｌ３における６−ジオキシエリスロマイ シンＤでは、溶液３ＮＯ，３５７０強大−広範、１７！Ｌ　１７Ｈ強大；ＣＤＣ ｌ３１．：　おける６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＤでは、３６３ ０゜３５１０強大・広範、１７２５．１７０２強大・広範。

宵１表 化合物　ｍ／＋　計算上の化学式　計算分子量＋零 魔　１　ｏｇ、７コ　Ｃ３７Ｈ６８Ｎ　Ｏ１２ｎｇ、４７４１１１１ｗ　２　７ ０２．４７８５　、Ｃ３７Ｈ６８Ｎ　Ｏ、■　７０２．４７９２寧 ！＆１３　７０４．７５　Ｃ３６Ｈ６６Ｎ　Ｏ１２７０４，４５８５！１ｃ４　 ６Ｎ、４６５０　Ｃ３，Ｈ，、Ｎｏ、、　０１４６３６！＆Ｌ５　Ｈ１４６ＨＣ ３，Ｈ，６Ｎｏ、１　６８１４６３６嵐６　山、４４３９　Ｃ３５Ｈ，４ＮｏＩ １６７４．４４７９ｋｌ−６−ジオキシエリスロマイシンＡ魔２禦６−ジオキシ エリスロマイシンＢ魔！−６−ジオキシエリスロマイシンＣ瀬４聰６−ジオキシ エリスロマイシンＤ魔５富６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＢ磁６ハ ６−デオキシー１５〜ノルエリスロマイシンＤ＊＝低解像度測定 第２表 ６−ジオキシエリスロマイシンＡ−０，６−ジオキシ−１５−ノルニリスロマイ シニンＢ、Ｄに対する１３ｃの化学シフト一覧Δ　１１　Ω　Ｑ　五　Ｅ ｌ　１７６．１３　１７７．４　１７６．５　１７７．１　ニア７．０　１７６ ．７２　４５．０　４５．０　４５．２　４５．０　４４．７　４４．９３　７ ８．４　Ｂｏ、２　８１．２　Ｂ２．８　７９．２　８２．１４　４４．２　４ ３．３　４４．０　４４．０　４３．４　ｊ３．２５　８３．４　Ｂ４．２　８ ４，２　８４．９　Ｂ４．０　８４．８６　コ５．１　３６．７　３５．２　３ ６．７　３５．７　３６．１７　３４．４　３４．３　３４．２　３４．２　３ ４．３　３４．２８　４５．７　４５．１　４５．８　４５．１　４５．２　４ ５．３９　２２０．１　２１６．８　２２０．０　２１６．７　２１７．４　２ １７．２１０　３８．９　４１．６　３８，７　４１．５　４１．１　４１．２ １１　６９．６　７０．１　６９，５　７０．１　７０．３　７０．５１２　７ ５．０　４０．５　７４．９　４０．６　４１．タ　４２．０１３　７７．６　 ７６．０　７６．４　７６．４　７０．４　７０．６１４　２１．１　２５，４ 　２０．９　２５．４　１１！、１　１８．コ１５　１１．０　１０．５　１０ ．９　１０．５　−　−２０１３　１５．０　１５．Ｉ　Ｌ５．４　１５．３　 １４．２　１４．６４０！３　９．５　９．４　９．７　９．７　９．５　９． ７６０１３　１８．７　１９．９　１Ｂ、７　２０．０　１９．５　１９．８８ ０１３　１７．４　１６．７　１７．４　１６．７　１６．７　１６．８１００ ＋３　１１．０　７．８　１０．９　７．７　７．９　７．８１２０１３　１６ ．１　９．０　１６．１　９．１　８．６　Ｂ、１１’　１０４．１　１０４． ２　１０４．９　１０５．０　１０４．２　１０５．０ＶＣ，７７ＯＳ　？ｃ、 ５　７０．５　７０．６　７０．（３”　６５，６　６５．６　６５．７　６５ ．８　６５．７　６５．７４°　２８．６　２９．１　２８．４　２８，５　２ ８，８　２８．５Ｆ＝６−ジオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＤ第　３　表 ＰＭＲ割当 プロトン Δ　Ｂ　ＣＱ　ＥＬＥ ２　２．８０　２．８６　２．８３　２．９０　２．７Ｂ　２．８２３　３．６ ５　３．６４　３．７０　３．７１　３．６８　３．７鴫４　１．６０　１．７ ２　１．６０　１．フ４　１．７６　１．７６５　３．４ｇ　３．４４　コ、４ ２　３．４０　３．４Ｂ　３．４２６　１．３ｇ　１．５４　１．３３　１．５ ３　１．ｓｓ　°　１．５３７ａ　１．６９　１８１　１．６Ｂ　１．８１　１ ＪＯ１，ＢＯフｂ　１．ｓ３　１．２６　１．５７　１．３０　１．３２　１． コ５８　２．６３　２．６０　２．６２　２．６１　２．６１　２．６２１０　 ３．０７　２．８４　３，０６　２．ｇ５　２．９０　２．９０１１　３．４０ 　３，５４　３，３４　３．５２　３．５５　３．５１１２　−’−−−　１． ６９　−−−−　１．７１　１．６０　１．６コ１３　４、り３　５．１５　４ ，９４　５．１７　５，４０　５．４４１４ａ　１．９３　１，７６　１，９３ 　１．７Ｂ　１．２７　１．２９１４ｂ　１．５０　１，４８　１．５０　１． ４９　−−−−　−−−−１５　０．８９　０．９０　０，８８　０．９１　− −−−　−一−−２ＣＨ３Ｌ、１９　１．１９　１．２２　１．２２　１．１８ 　１２１４ＣＨ３１，１７１，１７１，１３１，１４１，１７１，１５６ＣＨ： ｌ　１．１７　１．２１　Ｌ、１Ｂ　１．２４　１２１１．２３８ＣＨ３１，１ Ｂ　１．１３　１１９　１．１７　１，１５　１．１６１０Ｃ）’３　１．１５ 　１，０１　１．１６　１，０２　１．００　１．０２１２ｃＨ３１，１００， ８３１，１００，８４０，８６０，８７１’　４．２３　４，２０　４，１７　 ４，１７　４，２１　４．ｌ［１２’　３．２５　３，２４　３．２２　３．２ １　３，２３　３．２０３’　２．４８　２，５６　２．４６　２．４Ｂ　２． ５２　２．５０４’ａ　１２５　１．２８　１，２５　１，２５　１．２６　１ ．２６４’ｅ　１．Ｓ７Ｌ、７２　：、、６ε　１，５７　＋　Ｃｎ　ｊ　Ｃ０ ５’　３．４６　３．４６　３，４９　３，４８　３，４６　３．４８６’　１ ２４　１．２３　１，２４　１．２コ　１．２コ　１．２コＮ（ＣＭ３１２　２ ．２９　２．’３４　２．２８　２．２８　２，３０　２．２９１”　４．８８ 　４，８３　５，０３　４．９９　４，８１　４．９８２”ａ　１．５５　１． ５５　１，８３　１，８６　１．５４　１８４２”ｅ　２．３６　’２，３６　 ２．２０　２．２０　２．３３　２．１９４”　３．００　２．９９　２．９８ 　２．９８　２，９７　２．９８５１＋　３．９２　３．９３　３．７６　３． ７Ｂ　３．８９　３．７７６”　１．２８　１．２７　１，３４　１．３４　１ ，２６　１．３４Ｆ＝６−チオキシ−１５−ノルエリスロマイシンＤ＊ａ＋＊＋ ＋　６−ジオキシエリスロマイシンＡの酸安定性本発明の化合物の一つについて 、その相対的酸安定性を、エリスロマイシンのものと比べた。１１８■の６−ジ オキシエリスロマイシンへを、クエン酸溶液（ｐＨ，２）中に懸濁し、３７℃で 、８　時間数Ｉ　Ｌ　タ。分液ヲ、２．　５．１０．２０分、ｌ　２．３，４゜ ５．６．８時開ニ］［り出した。各分岐を、７．５８　Ｈ４０Ｈｔ’　ｐＨ９， ６に謂整して、分解を押し止め、その後、塩化メチレンで抽出した。

エリスロマイシンＡＩＧ、５■を同様にクエン８溶８　（ｐＨ２，ｌｌ　）に懸 濁し、３７℃で１ｏ分間放置した。分液を、２，５．１０分に取り出した。各分 岐を、７．５１１　ＮＨ４０Ｈ７−１１整して、分解を押し止め、その後塩化メ チレンで抽出した。

６−ジオキシエリスロマイシンＡ１および、エリスロマイシンＡからの塩化メチ ル抽出物を、実施例７に記載する通りに、ＴＬＣで分析Ｌｆ＝。ＴＬＣ＠果カラ 、ｐＨ２，２テ、２分後、エリスロマイシンＡではその１０％未満しか残らなか ったが、６−ゾオキシエリスロマインンＡでは、ｐＨ２，２に４時間暴露した後 も、その５０％以上が残ることが判明した。８時間後でも、６−ジオキシエリス ロマイシンへの約４０％が分解せず残ることが認められた。これにより、本発明 の化合物は、エリスロマイシンＡ自体よりも、確かに酸安定性が向上したことが 実証された。

実施例１２　抗菌活性 ６−ジオキシエリスロマイシンＡ、ＢおよびＣ，６−ジオキシ−１５−ノルニリ スロマインン已について、その抗菌活性を、脳心臓還流ブロス０＋ｗｉｅ　ｈｕ 口ｉｎ［ｍ＋ｉｏｃ　ｂ！ｏｔｈ　）による標準寒天プレート希釈法を用いて贋 べた。エリスロマイシンＡをコントロールとして用いた。最小抑制濃度（Ｍ　Ｉ 　Ｃ）で表した結果を、下の表４．５に示す。

第　４　表 抗菌スペクトルＭＴＣ値（ｓｅｔ／ｍｌ１人＝エリスロマイシンＡ ｄＡ＝６−ジオキシエリスロマイシンＡｄｃ＝６−ジオキシエリスロマイシンＣ 纂５表 抗菌スペクトルＭＩＣ値（麿ｔｔ／ｒａＪ）＾＝ニリスロマイシンＡ Ｂ−エリスロマイシンＢ ｄＢ−６−ジオキシエリスロマイシンＢｄｎＢ＝６−ジオキシ−１５−ノルニリ スロマイシンＢ実施例１３　生体内抗菌活性 ６−デオ牛シエリスロマイシンＡの生体内抗菌活性を、急性マウス予防テスト（ Ｃｔｃｕｔ　ｍａｔｔｅ　Ｂｒｎｃ＋ｉｏｎ　ｔｔｓｔ）を用いて測定した。マ ウスの死亡率により、ＥＤＳＯ値を算出した。すなわち、接種体チャレンジによ る死亡にたいして、試験動物の５０％を予防するのに必要な薬物投与量を計算し た。

急性マウス予防テストは、Ｆ＊＋＊ｔａｄ＠ｓ、ｓ＋　ｓｌ、　（Ａｆｉｔｉｗ ｉＣｒｏｂＡ１ｅ＋＋＋　Ｃｈ！ｍｏｊｈ＋、２９：２０１−２０８　（１ＮＢ ））の記載にしたがって、体重２０−２５ｇの雌性ＣＦ’−１マウスについて行 なった。マウスに、細菌懸濁液を、ＬＤ５０反応を引き起こす濃度の　１０１１ 倍濃度７、腹腔内に注入した。感染１．５時間後に、６−ジオキシエリスロマイ シンＡ１または、エリスロマイシンＡを経口投与した。注入６日目の、累積死亡 率にたいする有効投与量の中央値を、刈り込みロジフト解析（Ｈｉｓｓｅｄ　ｌ ＋（ｉｔ　ｔａ＊ｌｙ＋ｉ＋）（Ｈ１ｍｉｌ＋ｏａ、　ｔｌ　ｔｌ、　、　Ｅｎ ｙｉｒｏａ、　Ｓｃｉ、　ＴｔＣｈａａｌ、　ＩＩニア１４−７１９　（１９７ ７））を用いて計算した。この分析の結果は、下の表に示しであるが、これから 、ゲラ歯口の、ＳＬ＋ｐｌｒｌｏｃｏｃｔｉおよびＨｒ！ｐ＋ｏｃａｃｃｉ感染 にたいして、６−ジオキシエリスロマイシンＡは、経口投与すると、エリストマ イシンＡと同程度に有効であることが判明第　６　表 生体内活性（５０％生存率を与える用量、■／ｋｇで表す）Ｌ二逗已二ニ ブｑピキネート　＋２−メチル・ＩＩ＋５ネート　（１：６）に リスロマイシン　Ω ニリ入ロマイシンＡ ニニコと二２ ブチ入ミド　ＭＷ　５（、−１−１２３９県Ｌ：工しＬユ ＧＧＡＴＣＣＣＧＡＴ　ＣＧＴＧＴ　ＣＧＧＡＧ　ＧＡＡＧ入　ＧＧＣＣＡ　Ａ ＧＴＣに　ＣＧＣＣＧ　ＣＣＣＣＧ　ＡＧＧＡＧＣＴＧＣＴ　ＧＧＴＧＣＴＧＣ ＣＣＴＧＧＡＴ　ＣＴＡＣＣＧＣＧＡＣＧＧＧＴｒ　ＣＧ）ＣＧ　ＡＡＣＧＣＧ ＡＧＣＡＧＧＡＧＴ　ＴＣＣＴＣＧＣＴＧＧ　ＣＧＧＣＧ　ＧＡＡＡＧ　ＣＴＧ ＡＴ　Ｃττｃｃ　ＣＣＣＴＡ　ＣＣＣＣＧ　ＡＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＴＡｒＧ 　ＡＣ（ＪＩＣＣのＴＣＣＣＣＩＬ？　Ｃ？ＣＧＡ入ｋｌ；ＣＧλＣテＣＣＴＴ ＣＣＡ　Ｃ（ＪＣＧＧＴＧＣＧ　ＣＴ’ＴＣＣＴＣにＧＣ（ＡＧＧＡ　ＧＣＣＧ Ｔ　ＣＧＣＴＧ　ＧＴＣ入ＣＣα×テλ：１ＣＧＡＧＧＣαＡＡＧＧ　ＣＣＧＣ Ｇ　ＣＴＧＭ；　ｃ５Ｎ：ＣＴＣＧＧＧ　ＣＴαＡＧ　０ＬＧＣＧ　入ＣＣ（Ｊ 　入献−λＧＡＡＧＴλｃｅｃｃ　Ｇｃｃｍ　ｃｃｘｃｃ　’ｒｅαＩＱ　ｆｆ ｃｃｃ　ＣＣＧＡＴ　ｋｃｃ丁ＣＧＧ丁ＴＴ　ＣＣＣＣＧ　ルズｉにＣＴＣＧＧ 　ωＱＣτλ＝テｃ　Ｇｃｃ入Ｃ口υにλ−χｔＣ入ＣＣ入Ｇ　ＣＧＡＣＣＣＧ ＣＣＧ入ＣＣＣλＣＡＣＣ（：　ＧＧＣＴＧ　ＣＧＣＡＡα：？ＧＧ　ＴＧＴＣ Ｇ　ＣＡＧＧＡ　Ｇ？”ｌ’ｃＡ　ＣＣＧ？Ｃα；ＣＣＧ　ＣＧＴＧＧ　工人Ｇ ＧＣＧ　ＡＴＣＧＧ　ＧＣＣＣＣＧＣ（ｆｆｃ　ＧＡＧＣＡ　αＡＴＣＡ　ＣＣ ＧＣＧ　ＧＡＧＣ丁　ＧＣＴＣＧ　ＡＣＧＡＧＧ’ｒＧＧＧ　ＣＧＡＣＴ　ＣＣ ＧＧＣＧＴＣＧＴ　ＣにＪＬＣＩ　ＴＣＩ；ＴＣＱＡＣＣＧ　ＣττＣＧＣにλ ＣＧＣＣＧＴＧＣＣＣＡＴＯＡＧ　ＧＴＣＡＴ　ＧＴＧＣＧ　ＡＧＣＴＧ　ＣＴ ＣＧＧ　ＣＧＴＣＧ　ｈｃＧ）ｂＧＣＡＧＧＡ　ＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧ　Ｔ？Ｃ ＧＧ　ＧＣＣＧＴ　ＣＣＡＧＧ　テＣＧＧｋ　αＡＴＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＡ 　ＣＣＣＧＧ　λＧＣＧＧＧＣＣＣＡ　ＡＣＡＧＣＧＣＧＧＧ口ＬＧＧＣＣＧＣ ＣＡ　ＧＧＧＡＧ　ＧＴＣｒ　ＣＡＡＣ？τ口Ｌ’！’ＣしＣＴＣＣＡ　ｆｉＣ ＣＴＧＧ　？ＣＧＭ；　ＣＧＣＣＧ　ＣＣＧＣＡ　ＣＣＧＡＧ　ＣＣＣＧＧ　Ｃ ＧＡＣＧ　）ＪズテＧＣτ２ＣαニＧＣＴＧ）−ＴＣＡＧＧＧ？　ＣＣＡＧＧ　 ＡＣＱ入ＣＱ入τＱ入　ＣにＧＴＣＧｉｌ：ＣτＣ入ＧＣＧＣＣＣＡＧＧ　入Ｇ ＣτＧ入ＣＣ？Ｃ（Ｊ？（Ｇ　ＣＧＣＴＧ　ＧＴＧＣＴ　ＧＣＴＧＣＴＣＧＧＧ 　ＧＧＴττ　ＣＣＡＧＧ　ＣＧＴＣＧ　ＧＴＧ入ＧＣＣＴＣＡ　ＴＣＧＧＧ　 ＡＴＣＧＧ　ＧＴＣｒ　λｃｃτＧ　ＧＴＣＧＴ　ＣＡＣＣＣＡＣＣＣＧ　ＣＪ 、ＣＣｋ　ＧＣＴＣＧＣＧＣＴＧ　ＧＴＧＣＧ　ＧＣＧＧＧ　ＡＣＣＣＧτＣＧ ＧＣＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＧＣＣＧＴ　ＣＣＡＧＧ　ｋＧｋＴｃ　二コユ′Ｔ　 叡　−・　− Ｌ江＝已Ｌ１ ３、□ニシニヒ三二止慶匣土二−二土 ＴＣ Ｌ■コ譚二五 動 Ｌ区＝＝二五 ６−　＋’ｊ’ｆ’ｙ　−’！；−／ルニリスロマイシンＡのりηＭ（−ｊｚ　 ７＝トンＮＭ尺λｄクトｌ）Ｌ：＝工ニュ ６−　＝”ｔ＋４／−ｒｓ−／ルニリスロマイシン　Ｃの夕００　ＭＨｚ　７’ ロトンＮ品尺スΔ６り５ｗＥＦＪ 新規の６−ジオキシエリスロマイシン誘導体を開示した。同時に、その調製法、 抗感染剤としての使用法についても開示した。本発明の化合物としては、６−ジ オキシエリスロマイシン、６−ジオキシ−１ｓ−ノルエリスロマイシンがあり、 これらは、構造式（１）で表され、ここに、ＲはＯＨ，ｌ！−Ｈから、Ｒ２とＲ ３は、それぞれ独立にＨとＣＨ３から選ばれたものである。

同時に、上記の化合物の、製薬的に受容可能な塩およびエステルも含まれる。さ らに、本発明の化合物を生産するように遺伝学的に修飾された微生物、また、そ のような微生物の調製法も国際調査報告 Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ｐｃ丁／［１５９１１０２６００ｆＦｏｒｍ　２ １０１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記の式を持つ化合物、 ▲数式、化学式、表等があります▼ ここに、Ｒ１は、ＯＨおよびＨから、Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立にＨおよびＣ Ｈ３から選ばれたもの、もしくは、製薬的に受容可能な、前記化合物の塩または エステル。 ２．３−α−ミカロシル−６−デオキシエリスロノライドＢ３．下記の式を持つ 化合物を含む徴生物の発酵分離物、▲数式、化学式、表等があります▼ ここに、Ｒ１は、ＯＨおよびＨから、Ｒ２とＲ３は、それぞれ独立にＨおよびＣ Ｈ３から選ばれたもの。 ４．請求項３の発酵分離物であって、ここに、その微生物が、サッカロポリスボ ラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属の一員であるもの。 ５．エリスロマイシン産生微生物のゲノムの一部と相同なヌクレオチド配列を含 む、組み換えＤＮＡプラスミドであって、ここに、そのプラスミドはその徴生物 ゲノムに組み込み、かつ、安定に維持することができ、そのため、その徴生物が 、エリスロマイシン生合成時にＣ−６水酸化を欠く徴生物に形質転換される、前 記プラスミド。 ６．請求項５のＤＮＡプラスミドであって、ここに、宿主微生物がサッカロポリ スポラ（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属の一員である前記プラスミド 。 ７．請求項５のＤＮＡプラスミドであって、ここに、そのプラスミドがｐＭＷ５ ６−Ｒ２３である前記プラスミド。 ８．エリスロマイシン産生微生物の形質転換体であって、ここに、その形質転換 体がエリスロマイシン生合成時にＣ−６水酸化を欠き、かつ、６−デオキシエリ スロマイシンを生産することができる、前記形質転換体。 ９．請求項８の形質転換体であって、ここに、Ｃ−６水酸化の欠損が、あるＤＮ Ａプラスミドの、その微生物への安定な組み込みによるものである、前記形質転 換体。 １０．サッカロポリスポラエリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＯＷ１１０：：ｐＭＷ５６−Ｒ２３の特定的特徴をすべて 備えた微生物。 １１．請求項１の化合物を生産する方法であって、エリスロマイシン産生徴生物 において、エリスロマイシン生合成時に、Ｃ−６位置での６−デオキシエリスロ ノライドＢの水酸化を中断することから成る前記方法。 １２．請求項１１の方法であって、ここに、微生物が、サッカロポリスポラ（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）属の一員である、前記方法。