JPH05505108A

JPH05505108A - 反応副生成物を酵素アッセイのための校正試薬として使用する方法

Info

Publication number: JPH05505108A
Application number: JP3506093A
Authority: JP
Inventors: グルイス，ケネス，ジェー; アモンス，ハリル，シー
Original assignee: バクスター、ダイアグノスティックス、インコーポレイテッド
Priority date: 1990-03-01
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1993-08-05
Also published as: CA2053868A1; WO1991013169A1; AU7493791A; EP0471062A1; EP0471062A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】反応副生成物を酵素アッセイのための校正試薬として使用する方法！ＪＩＱｊ１１１、　発明の分野アラニンアミノトランスフェラーゼ活性（以下ＡＬＴ）を測定する診断機器のための校正試薬としてピルビン酸を使用する方法９本方法に基づき、臨床上の重要性を有する他の酵素のための同様な校正方法を考案することができよう。

２、　先行技術の記述ＡＬＴのアッセイの最も普通の手段は、ピルビン酸生成物を、図１に示すように、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下ＬＤＨ）によ　−って触媒される反応と組み合わせた分光光度法的アッセイを用いる。ラクテートデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＨの同時に起こる酸化を伴ってピルビン酸の還元を触媒する。ＮＡＤＨが酸化されると、それは３４０ｎｍの吸収を失い、そして、もとのトランスアミナーゼの活性をモニターすることができるのはこの吸収の喪失による。この組合せ型アッセイは、組合せる酵素がＡＬＴに対し大過剰である限り、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の定量的測定として真正を維持する。それはＮＡＤＨの酸化の律速因子がＡＬＴがピルビン酸を生成する速度であるということを保証する。

ＡＬＴの活性をサンプル１Ｎあたり１分間あたりに生成されたピルビン酸のμｍｏｌｅ数により算出するためには、単位時間あたりの３４０　ｎｍの喋収変化を寞際に１分あたりにＮ　Ａ　Ｄ　Ｈが減少したμｍｏｌｅ数へと数学的に変換する。この計算は、吸光度単位数を濃度に関係づける３４０ｎｍにおけるＮＡＤＨのモル吸光定数を用いて達成される。ＮＡＤＨとピルビン酸との間の関係は図１に示すように１：１であるから、酸化された１μｍｏｌｅのＮＡＤＨは還元された１μｍｏｌｅのピルビン酸（ＡＬＴの作用により生成されつつあるピルビン酸）と等価である。この関係とサンプル希釈ファクターとを用いて、適当な単位でＡＬＴ活性を得ることができる。

アラニンアミノトランスフェラーゼを測定するために設計された自動化された診断機器は、反応ウェル中にＶ、薬とサンプルとを加えるための何らかのタイプのビペンティング方式を組み込んでいる。

この反応ウェルは光学的フローセルである場合もある。トランスアミナーゼ活性を計算する際には、ピペッタ−によって送り出される液量とその結果生ずるサンプル希釈ファクターは、この計算のために使用される方程式に組み込まれる。ピペッティングの誤差は、従って、トランスアミナーゼ活性計算の正確さに大きく影響する。このことから、ピペッティングの不正確さを考慮に入れた校正手順が望ましいことは明らかである。

機器の校正のための従来の方法は、関係波長において一定の吸光廣値を有する標準化された光学的フィルターの使用に依るものである。これは、機器が光学的に正確であり、吸光度単位数をＮＡＤＨのμｍｏｌｅ数に変換するためのモル吸光定数の使用が正当かつ正確なものであろうということを保証する。しかし、これは単に機器の光学的特性に向けられたものに過ぎず、ピペッティングエラーを修正するものではない。

吸光に基づく機器使用に加えて、活性の検出は螢光光廣計を使用しても行い得る。Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈが螢光性だからである。Ｂｒｏｏｋｓを高めはするが、それ番よ、螢光単位数をＮＡＤＨの濃度に関係づけるｆｌＩｉｌ的なモル吸光定数を有しない。この故に、アッセイを実施する際には常に、ＮＡＤＨ′ａ度に対する螢光単位数の標準曲線を作る必要がある。残念なことに、ＮＡＤＨ標準は適度に安定ではなく、頻繁な再標準化を嬰する。Ｌｏｗｒｙ　＆　Ｐａ５ｓｏｎｎｅａｕ、’Ａ　Ｆｌｅｘｉｂｌｅ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ”、Ｃｈａｐ　１．　ｐ３−２０．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｏｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７２）、このことは、ＮＡＤＨに基づく標準を、自動化された機器による臨床的診断用には実際的でないものにしている。

３、　発明の概要既知の分析的濃度のピルビン酸が、診断的アッセイにおける機器のための校正試薬として光学的フィルター又はＮＡＤＨに代わるものとして用いられる。この場合、関心のあるに法的アッセイは、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定である。ピルビン酸はサンプルと同様の方法でＡＬＴ試薬に加えられ、そして同時に起こるＮＡＤＨの酸化を伴って速やかに乳酸に変換される（図１）、ＮＡＤＨの酸化に対するピルビン酸のターンオーバーの化学量論は１：１であるから、この溶液とピルビン酸を含まないサンプルとの間の唆光度又は螢光単位数における差は、吸光度又は螢光をＮＡＤＨ濃度に関係づける正確な分析的測廖である。次いでこの間係はもとのＡＬＴの酵素活性を計算するのに用いられる。本発明の利点は、活性測定における弁の影響因子としてのピペッティングの不正確さの除去、正確な光学的校正の除去、及び螢光検出の場合においては、安定なピルビン酸標準による不安定な！’ＪＡＤＨ！！準の置換を含む本発明並びに他の目的及びその更なる特徴の一層の理解のために、添付の図面と組み合わせてなした本発明の以下の詳細な開示に言及する。ここに、図１は、アラニンアミノトランスフェラーゼの測定に関与する反応式を示す。

図２は、ピルビン酸校正試薬の安定性データを示す。

図３は、直接に又はピルビン酸校正試薬を以てした、螢光単位数をＮＡＤＨ２度に関係づける標準曲線間の比較を示す。

図４は、螢光モードにおけるＮＡＤＨ標準又はピルビン酸校正試薬の使用の同等性を、２週間に亘る勾配値（μＭあたりの螢光単位数）によって示す。

図５は、アスパルテートアミノトランスフェラーゼの測定における反応式の関与を示す。

図６は、ピルベートキナーゼ、クレアチンキナーゼ及びグリセロールキナーゼに係る反応式を示す。

−な−゛　の／通常のアッセイ方式（すなわち、試薬ピペンター中の同し試薬。

同し体積等）を用いて、もしサンプルに代えて既知の分析的量のピルビン酸塩を加えたとすれば、存在する高レベルのＬＤＨは、非常に短時間のうちに、ピルビン酸の全てを、従って、等量のＮＡＤＨを変換するであろう、ピルビン酸を含まないブランクとピルビン酸標準との吸光度差は、吸光度又は螢光単位数をＮＡＤＨの濃度に関係づける正確な分析的測度であろう。サンプルにおけると同じ方法でピルビン酸標準が試薬に加えられることから、ビペンティングの不正確さはもはやＡＬＴ活性計夏の正確さに負の影響を与えることはないであろう、加えて、このタイプの校正がＮＡＤＨのμｍｏｌｅ数を計算するためにモル吸光定数を使用することの必要をなくすることから（このことは、吸光度単位数をＮＡＤＨの μｍｏｌｅ数に今や関係づけるのがピルビン酸標準であるからそうなのである）、機器の正確な光学的校正は必要でない、螢光モードにおいても、しかしながら、ピルビン酸標準が機能するためには、２つの基準に合わなければならない、第１に、ピルビン酸の存在下でＬＤＨにより触媒される反応は、アッセイ条件下において相対的にす早く起こらなければならず、第２に、ピルビン酸標準溶液は、長期間に亘って分析的濃度が変化しないよう安定なものでなければならない。

この第２の基準は、ピルビン酸とα−ケト酸の安定性が、通常、誤差の原因たり得ることから、特に重要である。Ｒ，Ｖｏｎ　ＫｏｒＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、５１９　（１９６９）。

一般に、ピルビン酸校正標準は、酢酸ナトリウム３水和物、ナトリウムアジド及びピルビン酸ナトリウム及び水を固形物が溶解するまで混合し、そして最終混合物の至適ｐＨを約５．５としてｐＨを約４．０乃至６．０の間に調整することよりなる方法によって作られる。この校正標準は長期間安定である。

アンセイ溶液中におけるピルビン酸標準の１：２０の最終的な希釈は、記述したように決定的なものではないが、本ＡＬＴアッセイにおいて使用する比率に一致するということは注意すべきである。

他の製造業者の最終的な希釈は、１：１０乃至ｌ：１５であり、容易に置き換え可能であろう。２ｍＭのピルビン酸標準を以てすれば、ここに記述した反応混合物中に使用されている最初の０．１２５ｍＭのＮＡＤＨのうち約８０％が酸化されたＮＡＤＨにあたるであろう。これに関し重要なのは、最終的なピルビン酸濃度がＮＡＤＨ濃度を超人ないことである。もしこれが起こるようだと、ＮＡＤＨによる３　４０　ｎｍの吸収のすべてが消失し、更に吸光度差とＮＡＤＨ濃度との関係も消失してしまおう。

夫施阻−上この寞施例では、すべての研究のために用いられる材料及び機器の使用が、ピルビン酸校正標準の製造手順及びその分析的濃度の計算方法とともに、記述される。加えて、安定性及び反応速度の問題に同けられたデータ及び結果が提示される。

Ａ、　び　の酢酸ナトリウム３水和物及びナトリウムアジドはＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙより購入した。ピルビン酸ナトリウムはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより購入した。無菌濾過は、ｌＩ！、用、０．２μｍポアサイズのＮａｌｇｅｎｅ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ（Ｎａ　Ｉｇｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて行った。臨床化学分析器によるＡＬＴ活性測定とピルビン酸校正のための試薬は、Ｃｉｂａ−Ｃｏｒｎｉｎｇより購入した。自社製のＡＬＴ試薬（Ｐａｎｄｅｘ（登録商４１ｉ）ＡＬＴ試薬Ａ及びＢとを希釈サンプルとともに１：ｌ：２の比率に混合したものは、１２．５ｍＭのα−ケトゲルタール酸塩、０．１２５ｍＭのＮＡＤＨ，０，３０Ｍのし一アラニン。

１、　５単位／　ｍ　４２のＬＤＨ，及び３０ｍＭのトリスよりなり、ｐＨ７，８である）は、ピルビン酸校正試薬の濃度決定及び濃度の関数としてのＮＡＤＨの螢光の等個性試薬の双方のために使用した。すべての実験において及び試薬の調製のために使用した水は、自社の脱イオンシステムにより得、更にＭｉ　１１１ｐｏｒｅ、　Ｍｉ　Ｉ　Ｉ　ｉ−Ｑ　Ｗａｔｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍ精製器で精製した（ｍｉｌｌｉ−Ｑ水）。

安定性検討のための及びピルビン酸校正試薬濃度を決定するための分光的測定は、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄダイオード列分光光度計（モデル８４５２Ａ）／ＨＰ９０００シリーズ３００コンピューターを該製造業者のＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトフェアとともに使用して行った。アラニントランスアミナーゼ活性測定は、Ｇ１１ｆｏｒｄ　ＳＢＡ　３００自動臨床化学分析器を用いて行った。ＮＡＤＨ螢光をモニターするのに通したフィルターを備えたＰａｎｄｅｘ　（登録商標）螢光マイクロタイタープレートリーダーが、ＮＡＤＨとピルビン酸校正試薬との間の等個性を試験するのに使用された。

Ｂ、ピルビン　１　び２ｍＭ　の８１１２ｍＭの濃度且つ１Ｎの液量用には、０．６８０ｇ　（０，００５ｍｏｌｅｓ）の酢酸ナトリウム３水和物、０．２００ｇのナトリウムアンド、及び０．２２４ｇ　（０，００２ｍｏｌｅｓ）のピルビン酸ナトリウムを１１．のフラスコ中に秤量した。これに、９５０ｍ！！。

のｍ１ｌｌｉ−Ｑ水及び撹拌棒を加えた０次いで溶液を、固形物が溶解するまでマグネティノクスターラーで攪拌した。ｐＨをＩＮのＨＣｊ！で５．５±０．１に調整し、１．Ｏ２の最終液量とした。最終溶液を無菌濾過し、適当な液量に分割して２乃至８℃にて貯蔵した。１ｍＭの濃度の標準は、半量のピルビン酸ナトリウムをフラスコに加えることを除いては同一の方法で調製した。

ピルビン酸の実際の分析的濃度は、同時に起こるＮＡＤＨの酸化（化学量論上１：１）を伴う、ピルビン酸のラクテートデヒドロゲナーゼ依存性の乳酸へのターンオーバーによって決定した。これは、緩衝液ブランクとピルビン酸校正試薬との間のＡ、４゜、、、の差及びＮＡＤＨのモル吸光係数（６，２２ｍＭ−’ｃｍ −’）を用いて計算した。

３６０μ２のブランク緩衝液（３０ｍＭのトリス、０．０２％のナトリウムアジド、ｐＨ７，８）に、４０μ！のピルビン酸校正試薬を、続いて各２００μｊ！のＰａｎｄｅｘ　（登録商標）ＡＬＴ　Ａ及びＢ試薬を１．０ｍｊ２のセミミクロセル（層長１ｃｍ）中にて加えた。２５℃にて反応時間５分の後、３４０ｎｍにおける吸収を記録（分光光度計はブランク緩衝液で零合わせをした）した、３つの複製物の平均を吸光度値として受容した。この手順を、平均プランり値を得るために４０μｉのブランク緩衝液を用いてくり返した。

ピルビン酸校正ｖＳ薬の濃度は下記の弐を用いて計算した。

ピルビン酸校正試薬の濃度（ｍＭ）　−（平均Ａ　ｓａｏ＊ａブランク−平均Ａｊ、。７．校正試薬）×２０／６．２２下に示すのは計算例である。

平均Ａ　３４６　ｎ　ｍブランク−０，７９０，及び平均Ａ　３　ｍ。７．校正試薬＝０．１５９の場合、ピルビン酸濃ｆ（ｍＭ）＝　（０，７９０−０，１５９）ｘ２０／６．２２＝２．０３ｍＭＤ、　へ旦工試゛によるピルビン　ターンオーバーのｒＩＩ′ｉＡ１ｍｆｆｉのセル中に、３６０μＥのブランク緩衝液４０μ２のピルビン酸校正試薬（１又は２ｍＭ）、及び各２００μｊ２のＰａｎｄｅＸ（登録商標）ＡＬＴ　Ａ及びＢを順番に加えた。ブランクの測定　−のためには、４０μ！のブランク緩衝液をピルビン酸校正試薬の代りに用いた。全ての試薬を加えた後、２５°Ｃにて反応を進行させた。３４０　ｎｍの吸光度を、１．３及び９分後に測定した。各時点用には、４つのｉ製の平均をＡ　３　ａ。債として受容した。

表１は、ピルビン酸校正試薬１及び２ｍＭのブランクからのＡ　ｘ　ａ。差を時間の関数として与える。このデータは、いずれのピルビン酸校正試薬とも反応は最初の１分以内に９８％を超えて完了しており、３分までには１００％完了していることを示している。これは速やかな反応測度という基準を満足する。

（以下余白）表　１１　ｍ　Ｍピルビン酸　１　０．３１８１ｍＭピルビン酸　３　０．３２０１ｍＭピルビン酸　９　０．３２０２ｍＭピルビン酸　１　０．６２２２ｍＭピルビン酸　３　０．６２９２ｍＭピルビン酸　９　０．６２８ ΔＡ　３４６　＠　＠は、３４０ｎｍにおけるブランクとサンプル号光度値との間の差である。反応は実施例の部に概説した手順に従って行ったピルビン酸校正試薬（１及び２ｍＭ）を調製し、それらの分析的濃度を上述のようにして決定した。これらの溶液を次いで２乃至８°Ｃ９室温及び３７°Ｃにて貯蔵した。定期的に、これらの溶液のピルビン酸含量を再分析した。データは、２乃至８°Ｃ２室温では７６日間、そして３７℃では５６日間収集した。

図２は、約１及び２ｍＭの濃度のピルビン酸校正試薬の安定性データを示す。明らかなように、該検討期間の長さにあってはいずれの温度においてもピルビン酸のレベルに何らの損失もない。加えて、別の検討において、２ｍＭの校正試薬は２乃至８°Ｃに２００日間貯蔵した後もピルビン酸の含量に何らの損失も示さなかった。これらの結果は、ピルビン酸校正試薬の適当な安定性という第２の基準に適合する。

夫差圀−」実施例２は、ピルビン酸校正標準を使用するための手順はピペッティングの不正確さによる誤差の多くを除去するであろう、という仮説の検定を目的とした検討を詳述する。

Ａ、　且髪化１１刃」るピルビン　−　゛　」１１Ｇｉｌｆｏｒｄ　ＳＢＡ　３００自動は床化学分析器を、上記の反応を通して起こる吸光度差の変化よりＮＡＤＨの変換ファクターを計算するようプログラムした。これは、試薬ピペッタ− によって送り出される０、５ｒｒ＋ｊ！のＧ１１ｆｏｒｄ　ＡＬＴ試藁とともにサンプルピペッタ−によって送り出される５、１０．２０及び３０μ２のピルビン酸校正試薬を用いることによって行った。２５”Ｃにて５分の反応時間の後、３４０ｎｍの吸収を記録した。４つの復製の平均を吸光度値として受容した。変換ファクターを計算するための式を下に示す。

ピルビン酸校正試薬変換ファクター− ΔＡ　ｂ　Ｓ　ｙｓｏｎｍ　Ｘ全液量（ｍｆｆｉ）／μｍｏｆピルビン酸＝ｍＭ ”’ 下に示すのは計算例である。

５μ２の２．０５ｍＭピルビン酸校正試薬（０，０１０２５μｍｏｆ）プラス０．５ｍｌのＡＬＴ試薬より、平均ΔＡ　ｂ　５３４０１１１１＝０．１１６２の場合、変換ファクター＝０．１１６２Ｘ０．５０５１０．０１０２５＝５．７３ｍＭ− ’ 通常、機器の製造業者により指示されるように、ビベ、／トが正確にＪり出すとの仮定のちとにモル曙光係数のみがＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ変換ファクターとして使用されている。Ｇ１１ｆｏｒｄ　ＳＢＡ　３００によって使用されている値は６．３０ｍＭ−’である。

通常用いられている校正手順との比較としてピルビン酸校正試薬の性能を判定するために、３７°Ｃにて約８０単位／　ｍ　１の活性を有するＡＬＴ！準を、校正用と同しピペッティング方式及びＧ１１ｆｏｒｄ　ＡＬＴ試藁を用いてアッセイした。ブランクが与える背景速度は、Δ　ＡｂＳｉａ。０．から計算される活性がサンプル自身に存在するＡＬＴのみからくることとなるよう、各ピペッティング方式でのサンプル速度から引いた。次いで、実際の活性計算を、吸光係数の通常の使用によって又はピルビン酸校正試薬で決定したＮＡＤＨの変換ファクターによって行った。ＡＬＴ標準及びブランクは、３７°Ｃにて４つの複製を反応させた０反応カップにサンプルと試薬とを添加した後、続く４５秒の読み取り時間中に定常状態の速度論を保証するため、３分のラグタイムを用いた。

表２の左部分は、変換ファクターがサンプルのピペッティング液量の関数としてどのように変化し、そして現実にＳＢＡ　３００臨床化学分析器のピペッティングの正確さを示す指標であるかを示している。もしピペッティング液量が正確であったなら、計算される変換ファクターは各々等しく、報告されている係数６．２２ｍＭ−’に近いであろう（Ｇｒｌｆｏｒｄによって使用されている値は、表に示されるように、６．３０である）、これは、１０．２０及び３０μ２の液量については基本的に真正を保っているが、５μ２の設定は報告されている値から相当に外れている。ピルビン酸校正試薬が１常の光学的校正に対し理論上優れた結果を与えるのはこの状況においてである０表２の右部分は、８０単位／ｉ！ｍ１！について計算されたＡＬＴの値を示し、この結論を支持している。ピルビン酸校正試薬変換については、全てのピペッティング液量が殆ど正確に同一の単位／ｌ値を与える。このことは、ピルビン酸とＧ１１ｆｏｒｄの単位／Ａ計′Ｘ値の平均のｌｌｌ＋準偏差に明らかである。Ｇ１１ｆ。

ｒｄ計夏値が過度に低く、これに反してピルビン酸計算値が他の値との際立った一致を示している５ｕｆｆｉの液量のサンプルに注目すると特に目覚ましい。

５　６．３０　５．７２　７２．３　７９．６１０　６．３０　６．１６　７７．５　７９．２２０　６．３０　６．１２　７８．４　８０−７３０　６．３０　６．２６　８０．６　８１．１平均　７７．２　８０．２標準偏差　３．５　０．９＊　反応及び計算は、実施例の部における手順に従って行った。

！施■−ユ実施例３は、螢光分光光度計を校正する場合におけるピルビン酸校正手順とＮＡＤＨ標準曲線との間の等優性を検定するための検討である。

Ａ、　でのピルビン　−′″の螢光モードにあっては、モル吸光係数のような贅沢なものはないことから、螢光単位（ＡＦＵ）をＮＡＤＨＪｆｉ度に変換するにはＮＡＤＨに基づく校正試薬が必須である。マイクロタイターに基づくアッセイを用いて、４μでのピルビン酸校正試薬±３６μｌのブランク緩衝液又は４０μ！のブランク緩衝液を、各２０ｔｔＩ！、のＰａｎｄｅｘ（登録商標）ＡＬＴ試薬に加え全量８０μ２とした０反応は室温にて５分間行なわせ、その後でＡＦＵを記録した。この手順は、マイクロタイター螢光アッセイでの全液量が吸光度モードの測定の１／１０であるという点を除けば、本質的に校正試薬濃度決定のための上記のものと同しである。

性能比較には、Ｏ乃至１３５μＭの範囲の既知量のＮＡＤＨを用い、上記と同じ緩衝液組成と液量とを以て、ＡＦＵ対ＮＡｏＨ４１’ｌ！曲線を作成した。ＮＡＤＨに対するＡＦＵの及びピルビン酸校正試薬に対するＡＦＵの勾配を、次いで、′　等優性をみるために比較した。これは２週間に亘って行った。勾配を計算するための式は下に示す。

ピルビン酸校正試薬勾配＝（ＡＦＵブランク−ＡＦＵ校正試薬）×２０／μＭピルビン酸校正試薬下に示すのは、計算例である。

ＡＦＵブランク＝１３５００．ＡＦＵ校正試薬＝５０００及びピルビン酸校正試薬＝２０５０μＭの場合、勾配＝　（１３５００−５０００）ｘ２／２０５０＝８２．９図３は、螢光モードにおいて、ＮＡＤＨ［準又は２ｍＭのピルビン酸校正試薬のいずれかによって作られた勾配が本質的に等価であることを示している。この場合においては、ＮＡＤＨ標準曲線の勾配値が８４．５であるのに対し、ピルビン酸校正試薬では８１．１である。これら２つの手順の等優性は２遇間に亘って５回の異なる時に試験された。

図４に明らかなように、１０日口の除き、各試験時において双方の勾配値は互いの誤差範囲内にある。１０日口の＊離はピペッティング又はＮＡＤＨ標１！溶液の製造における誤差によるものと思われる。ここに実証された等優性は、螢光に基づくアッセイではピルビン酸標準がＮＡＤＨ標準に置き換えることができることを示している。

亥、１Ｌ−１アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（以下ＡＳＴ）は、心臓と肝臓の機能障害をモニターするのに臨床上重要であるが、前述のＡＬＴアッセイと非常によく似た方法でアッセイされる。ＡＳＴアッセイにおいては、図５に示すように、マレートデヒドロゲナーゼがＬＤＨに代わり、アスパラギン酸がアラニンに代わり、そしてオキザロ酢酸がピルビン酸塩に代わる。機器の校正試薬としてオキザロ酢酸がピルビン酸に代わるという類似の校正方法が考案さレルＡＬＴ及びＡＳＴのアッセイの間の類似性は、１又は２ｍＭ４度のオキザロ酢酸校正標準の調製がピルビン酸塩校正試薬のために実施例１に記述されたものと同一（０，００２又は０．００１ｍｍ。

ｌｅｓと与えるのに必要なオキザロ酢酸塩のグラム数が異なるということを除いて）であるようなものである。加えて、オキザロ酢酸校正試薬の分析的濃度の決定は、実施例１においてピルビン酸校正試薬用に記述されたのと同様の方法で行われよう、計算に用いられる数式は同しであろう０手順についての唯一の例外は、ＡＬＴ試薬に代えてＡＳＴ試薬とすることであろう。

１隻±−立Ａ、　Ｌ　Ｔは、ＬＤＨ活性と組み合わせることによってＮＡＤＨの還元により活性が測定される酵素の一例に過ぎない。臨床上重要性があり、やはりＮＡＤＨ／ＬＤＨの組合せを利用する他の酵素は、ピルヘートキナーゼ、クレアチンキナーゼ、及びグリセロールキナーゼである。後の２つの場合、ＮＡＤＨ／ＬＤＨの組合せは、ピルベートキナーゼを含むことによって拡張されている。これら３種の酵素のアッセイ方式は図６に示される。

実施例１に記述されたようなＡＬＴ用に製造されたピルビン酸校正試薬は、これら他の酵素をそれらの適当な試薬を用いてアッセイする際に校正試薬として等しく良好に働くであろう。

本発明は、上記具体例に特に言及して詳細にされた。しがし、変更および修正が、本発明の精神及び範囲から外れることなく可能であることは理解されるであろう。

へ＋ＩトＦＵ忠配へ　＝ −〇全くｚ八へさ十忠へ弄ベトピルベートキナーゼの反応式％式％自動化された酵素アッセイにおける校正試薬として反応副生成を使用する方法が記載される。特に、反応副生成物であるビルビ酸が、アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の測定のための機校正標準として使用される。この方法の使用は、ピペッティング・不正確からくる誤差をなくし、そして機器における関係波長から・小さな光学的逸脱を修正する。修正されないままである場合、ピノティングの誤差と光学的逸脱は酵素活性計算の正確さに負の影を与える。螢光モードにおいては、ピルビン酸標準による校正はた、不安定なＮＡＤＨ４１１１！の使用の必要をなくす。本発明のビル・ン酸校正標準は、標準的な安定性試験において安定であることが。

されている。この方法は、多くの他の自動化された酵素アッセイζ拡張することができる。アラニンアミノトランスフェラーゼのよに、他の酵素の活性計算の正確さは、この方法の使用により向上−るであろう。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．標準試薬及び校正標準としての酵素活性反応副生成物を用いて酵素活性を求めるためにサンプルをアッセイする方法であって、ａ）　既知量の前記反応副生成物を前記試薬に加えて溶液とし、ｂ）　前記反応副生成物と標準試薬との反応の結果生ずる吸光度又は螢光単位数の変化を測定し、ｃ）　前記溶液と前記副生成物を含有しないプランク溶液との間の吸光度又は螢光単位数の差を決定し、ｄ）　吸光度又は螢光単位数の前記差をＮＡＤＨの濃度に関係づけ、ｅ）　サンプルを前記標準試薬に加え、ｆ）　前記サンプル中の前記酵素活性の結果生ずる単位時間あたりの吸光度又は螢光単位数の変化を測定し、ｇ）　前記サンプル中の前記酵素活性の結果生ずる単位時間あたりのＮＡＤＨ濃度の変化を決定し、ｈ）　吸光度又は螢光単位数とＮＡＤＨ濃度との間の前記の関係を用いて、単位時間あたりのＮＡＤＨ濃度の変化に基づき前記サンプル中の酵素活性を決定することよりなる方法。
２．該酵素がトランスアミナーゼ酵素である請求項１の方法。
３．該酵素的副生成物がα−ケト酸である請求項１の方法。
４．標準試薬及び校正標準としてのピルビン酸塩を用いてアラニンアミノトランスフェラーゼ酵素活性を求めるためにサンプルをアッセイする方法であって、ａ）　既知量のピルビン酸塩を前記試薬に加えて溶液とし、ｂ）　ピルビン酸塩と標準試薬との反応の結果生ずる吸光度又は螢光単位数の変化を測定し、ｃ）　前記溶液とピルビン酸塩を含有しないプランク溶液との間の吸光度又は螢光単位数の差を決定し、ｄ）　吸光度又は螢光単位数の前記差をＮＡＤＨの濃度に関係づけ、ｅ）サンプルを前記標準試薬に加え、ｆ）　前記サンプル中の前記アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の結果生じる単位時間あたりの吸光度又は螢光単位数の変化を測定し、ｇ）　前記サンプル中の前記アラニンアミノトランスフェラーゼ活性の結果生ずる単位時間あたりのＮＡＤＨの濃度の変化を決定し、ｈ）　吸光度又は螢光単位数とＮＡＤＨ濃度との間の前記の関係を用いて、単位時間あたりのＮＡＤＨ濃度の変化に基づき前記サンプル中のアラニンアミノトランスフェラーゼ活性を決定することよりなる方法。
５．安定なピルビン酸校正標準であって、緩衝剤及びピルビン酸塩又はピルビン酸及び水をすべての固形物が溶解するまで混合し、該混合物のｐＨを約４．０乃至６．０の間に調整することよりなる方法によって製造される校正標準。
６．ｐＨが約５．５である請求項５の校正標準。
７．該標準が安定である請求項５の校正標準。
８．緩衝剤が酢酸ナトリウム及びナトリウムアジドである請求項５の校正標準。