JPH05505387A - ウィルス複製のポリペプチド阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ウィルス複製のポリペプチド阻害剤 ［技術分野］ 本発明は単純ヘルペスウィルス（Ｈｅｒｐｅｓ　Ｓｉｍｐｌｅｘ　Ｖｉｒｕｓ： 　ＨＳＶ）及び同様のウィルスの複製を阻害するポリペプチド、並びにかかるウ ィルスの感染に対する該ポリペプチドの治療的使用に関する。

［背景技術］ ＨＳＶはいくつかの血清型として存在し、そのうちＨＳＶ−１は風邪の炎症に関 連する臨床的に重要なＨＳＶである。ＨＳＶ−１は細胞核内で転写、複製される ＤＮＡウィルスである。多くの他のウィルスと同様に、遺伝子は様々な時期にｍ 　ＲＮ　、Ａに転写される。まず最初に転写されるある種の重要な遺伝子は即時 型初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ：　ＩＥ）または”　ａ−と呼ばれる 。その転写は、５′末端、または遺伝子の、Ａ　Ｔ　Ｇ開始コドンの上流に位置 するプロモーター配列により可能となる。プロモーターからさらに上流に、■Ｅ 遺伝子はコンセンサス（共通）配列：ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ　（ここでＲはプリン 、即ちＧまたはＡである）である特色あるヌクレオチド配列を有する。

ＨＳＶのＩＥ遺伝子は、Ｍ、　Ｅ、　Ｍ、　Ｃａｍｐｂｅｌｌ、　Ｊ、　ｆ、　 Ｐａ１ｆｒｅ）＋ａ＋ａｎおよびＣ，Ｍ、　Ｐｒｅｓｔ。

ｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　１８０． １−１９　（１９８４）により最初に”　Ｖｍｗ　５５”と同定されたウィルス 粒子成分によって誘導される。ＶＰ１６とも呼ばれるＶｍｗ　６５は、ウィルス 膜とキャプシドとの間に存在する外被タンパク質である。Ｖｍｗ　６５ｆｔ”　 トランス作用”或いは１　トランス活性”であると言われる。

この言葉は単にこれがウィルスＤＮＡに作用してこれを制御する可溶因子である ことを意味する。またＶｍｗ　５５はσ−トランス誘導因子またはａ−ＴＩＦと も呼ばれ、これはＶｍｗ　６５がウィルスＤＮＡに作用してＩＥ（σ）遺伝子の 転写を誘導することを意味する。

Ｍ、　Ｅ、　Ｍ、Ｃａｌ１ｌｐｂｅｌｌらの上記文献は、Ｖｍｗ　６５は直接ま たは間接に宿主細胞ポリペプチドを修飾することにより、ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ領 域にあるＤＮＡと結合するのであろうと記載している。Ｔ、　Ｍ、　Ｋｒ１ｓｔ ｉｅおよびＢ、Ｒｏｉｚｍａｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ ＳＡ、　８４．７１−７５　（１９８７）に始まるそれ以後の研究は、”シス− 作用部位”またはσ−トランス誘導シスー作用（α−ＴＩＣ）部位と呼ばれるＴ ＡＡＴＧＡＲＡＴ領域はＶｍｗ　６５に直接結合するのではなく、１またはそれ 以上の宿生細胞タンパク質と結合することを示した。多（の研究グループがＴＡ ＡＴＧＡＲＡＴ領域とＶｍｗ　６５との両方に結合する宿生細胞タンパク質を同 定してきた。

彼らは”ａ−ＨＩ”、”ＨＣ３”、”六量体−結合タンパク質“、”０ＴＦ−１ ”及び”ＴＡＡＴＧＡＲＡＴ認識因子”　（ＴＲＦ）などと様々に命名したが、 これらは恐らくすべて同じものである。本明細書ではＴＲＦという命名を用いる 。

当分野の現在の知識については、Ｃ，Ｉ、　Ａｃｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｊ、　 ｖｉｒｏｌｏｇｙ　６３．２２６０−２２６９（Ｍａｙ　１９８９）にまとめら れている。Ｖｍｗ　６５は細胞性タンパク質と関係することによってＩＥ遺伝子 を誘導し、Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　ＲＡ　Ｔを含むＤＮＡ配列と特異的に結合 することのできる、ＩＥＣまたはＴＲＦ、Ｃとして知られる複合体を形成する。

言い換えると、ＩＥ遺伝子誘導は、少なくともＶｍｗ　５５、ＴＲＦ及びＴＡＡ ＴＧＡＲＡＴ領域配列との、少な（とも三重複合体形成を含む。

この複合体形成を阻止して、それによってＨ３ＶのＩＥ遺伝子転写の誘導を阻止 することが望ましい。Ｃ，１，Ａｃｅらの上記文献は、Ｖｍｗ　６５及びＴＲＦ とのかかる複合体を形成する能力を欠くウィルス突然変異体は、低い感染多重度 （ＭＯＩ）では極めて少ししか複製を行わないことを示している。低ＭＯＩは臨 床的に遭遇するものである。従って、複合体形成をつかさどるＶｍｗ　６．）の 領域を同定する試みがなされた。そうすれば複合体形成に関してＶｍｗ　６５と 競合する短いポリペプチドを合成することが可能となろう。

Ｓ、　Ｊ、　Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｃ，Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ　ａｎｄ 　Ｓ、　Ｌ、　ｌｌｃＫｎｉｇｈｔ、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅ魔■撃盾垂高■獅煤 @各 ７１８−７２９　（１９８８）はＩＥ遺伝子転写誘導に対するアッセイ、及びＶ ｍＷ　６５欠失突然変異体が正常Ｖｍｗ　５５によるＩＥ転写誘導を阻害する能 力をアッセイすることにより、Ｖｍｗ６５の構造と機能を検討した。彼らは、も しも〜’ｍｗ６５のカルボキン末端が削除されると、該タンパク質はもはやＩＥ 転写を誘導しないことを示しているが、この削除タンパク質は正常Ｖｍｗ　６５ によるＩＥ誘導を阻害することができると報告している。Ｖｍｗ６５の各種削除 体を用いて、この阻害活性（即ち、両者を一緒にした場合における正常Ｖｍｗ　 ６５の阻害）のための境界は、Ｎ−末端では５６から７４の間のアミノ酸のうち のどこか、及びＣ−末端では３８０から３９３の間のアミノ酸のうちのどこかに あることを彼らは示した。彼らは競合的阻害活性は細胞内中間体との相互作用に よるという説を提案していたので、上記境界はこの細胞内中間体との相互作用に 対する境界であろうと主張している。ここで彼らのアッセイは遺伝子転写物、即 ち本質的に“最終生成物′を検出するものであったことに注意されたい。従って 、阻害作用は数多くの段階のどこでても、例えば細胞核にウィルスが輸送される ための飽和部位によっても実際には起こり得るのである。

Ｇ、　ＷｅｒｓｔｕｃｋおよびＪ、Ｐ、Ｃａｐｏｎｅ、　Ｇｅｎｅ　７５．２１ ３−２２４　（１９８９）もまた、Ｖｍｗ６５の転写誘導機能のためのアッセイ として、ＩＥプロモーター領域に結合するｃａｔ遺伝子の発現を測定することに より、Ｖｍｗ　６５の構造と機能を検討した。Ｖｍｗ　６５コーディング配列の １７８．２１５．３３５．３６９または４７１のアミノ酸位置に４ないしは５個 のアミノ酸を挿入したとき、或いは以下の領域・２６−１４０．２６−１７７． ２６−２４０．１４２−１７７．１７４−２４０．１７９−４１２．２４２−４ １２．３３１−４１２及び３３１−４７０アミノ酸のいずれかをＶｍｗ　６５か ら削除したときには、ＩＥ誘導活性が完全に失われることを彼らは発見した。さ らに、彼らはＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇらが用いたのと同様のアッセイにおいて、 Ｖｍｗ　６５の削除突然変位体が、正常Ｖｍｗ　５５のＩＥ誘導機能を競合的に 阻害する能力を試験した。３３１−４７０．３３１−４１２．２４２−４１２ま たは１８６−４９０を削除した突然変位体に競合的阻害が観察され、これはこの 競合的阻害活性の境界が１８６よりも前のアミノ酸にマツピングされることを示 唆する。ＷｅｒｓｔｒｕｃｋおよびＣａｐｏｎｅによる競合的阻害活性の境界マ ツピングがＴｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇらのマツピングと本質的に異なるということ は注目に値し、Ｖｍｗ　５５の構造を機能と関連させる試みのためにこの種のア ッセイを用いることの複雑さを示している。

８９）は、Ｖｍｗ６５の酸性Ｃ−末端ドメイン（４０３番目のアミノ酸からＣ− 末端まで）は複合体形成に必要ではないが、３１７−４０３番目のアミノ酸配列 中に複合体形成に必要な領域が存在することを直接示した。

的研究を行った。このグループは、少数の（通常４個）アミノ酸をコードするリ ンカ−をＶｍｗ　６５配列中の幾つかの位置のいずれに挿入しても、これら変性 タンパク質のＴＲＦとの複合体形成能を直接阻害することを示した。とりわけ、 ３７９番目のアミノ酸で挿入すると、複合体形成能を阻害する。また、彼らはＴ ＲＦと複合体を形成できないこれらの突然変異体は、ＩＥ発現を誘導てきないこ とも確認した。

［発明の開示コ 本発明者らは、ＴＲＦ、Ｃ（複合体）形成はＶｍｗ　６５のおよそ３６６または ３６７から３７３番目までのアミノ酸領域からなるか、或いはこれを含むポリペ プチドによって阻害されることを今や明らかにした。臨界領域の境界を絶対的な 正確さで定義することは今だなされていないし、この鎖のいずれかの末端で１ま たは２個のアミノ酸を省いてもよいかも知れないという可能性も排除できない。

しかしながら、最良の阻害を得るためには、むしろ該ポリペプチドをとりわけＣ −末端（３７３）でより長くしなければならない可能性の方が大きいだろう。３ ６０から３９０のアミノ酸、特に３６６または３６７から３８８．３８９または ３９０まてのアミノ酸からなるか、或いはこれを含むポリペプチドがとりわけ好 ましい。

適当なアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ○：１と同定される）は以下の通りであ る： Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 ＴｈｒＬｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｇ ｌｕ　ＧｌｙＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｓ ｐ　Ａｌａ　Ｐｒ。

その他の配列については、Ｓ、　Ｊ、　Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、 　、　Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　２゜７１８−７１９　（１９ ８８）　ｐＩ）、　７１９を参照されたい。

本発明にいくらかの限定を付して、本明細書で企図する短鎖ポリペプチドと上記 従来技術における実験の主題であるより長い配列とを容易に区別するために、本 発明のポリペプチドは４０アミノ酸よりも長くはなく、最も好ましくは３０より も長くはない。これらは純粋に任意に決めた数である。

本発明はポリペプチド自体とともに、その保存性修飾体、及びＶｍｗ６５一様タ ンパク質にその活性を依存するあらゆるウィルス、しかし、もちろん特に単純ヘ ルペスウィルス及びとりわけＨ５Ｖタイプ１の阻害剤としての使用法を含む。

本発明はさらに、本発明のポリペプチドに対する抗体、及びウィルス複製阻害剤 並びにその他の目的へのその使用をも含む。

［発明を実施するための最良の形態〕 本発明の中心的概念は、３６０−３７３のアミノ酸からなるポリペプチドがＨ３ ＶにおけるＩＥ遺伝子誘導の阻害剤であることの実験的証明に基づ匂この配列が Ｎ−末端で切断され、及び／またはＣ−末端で伸長されうるという概念は、他の 証拠に由来する。簡潔に言えば、Ｃ−末端に始まってＮ−末端側に向けて順次進 行する削除によって得られる、Ｖｍｗ　６５の削除突然変異体を用いて実験を行 った。そのような突然変異体の作製は、Ｖｍｗ　６５遺伝子をその３゛−末端か らＢａ１３１で順次切断し、すべての３つの読み取り枠に中止コドンを挿入し、 該遺伝子を発現させて、Ｖｍｗ　６５突然変異体を検出するためにＶｍｗ６５の Ｎ−末端エピトープに対する抗体を用いるウェスタンブロッティング法によって 発現生成物を試験することにより、おこなった。次いでＲ，Ｇｒｅａｖｅｓおよ びＰＯｏＨａｒｅ　（前出）に記載のＤＮＡ結合アッセイにより、これらの突然 変異体のＴＲＦ、Ｃ形成能を試験して、以下の結果を得た：削除部分　複合体形 成（ＴＲＦ、Ｃ） ３８９−Ｃ末端　形成する ３８５−Ｃ末端　極めて弱く形成するのみ３８１−Ｃ末端　形成しない さらに、およそ３６７から３８７までの２１アミノ酸の配列は、Ｂ、５ｕｂｔン パク質及びタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して、ψ２９　ＤＮＡ複製の開始の ための開始複合体の形成に関与する。このファージに関する最近の研究要約及本 発明のポリペプチドは、ペプチド分野における当業者に公知の慣用的合成法によ り調製することができる。ヒトにおけるＨ３Ｖ複製の阻害剤として使用するため には、典型的には１日０．１から１５ｍｇの範囲の投与量で、適当な不活性希釈 剤とともに非経口的に投与することができる。軟責またはクリームなどの局所投 与も可能である。

本発明はまた、ポリクローナル、モノクローナルまたは抗体操作法により作製さ れる、本発明のポリペプチドに対する抗体をも含む。かかる抗体はＶｍｗ　５５ を直接ブロックするため、治療的価値が大きく、またヘルペスウィルス感染のて Ｖｍｗ　６５を捕獲するのに用いることができ、Ｖｍｗ　６５の他のエピトープ に対する標識抗体を捕獲したＶｍｗ　６５の検出に用いる。本発明の抗体を作製 するには、Ｎ−末端にシスティン基を付着し、これによって−３Ｈ末端を提供す ることが便利である。これにより、抗体を高めるために（例えば）ウシ血清アル ブミンにポリペプチドを結合させることが可能となり、これは慣用法により固定 することができる。

本発明は特にヒト単純ヘルペスウィルスタイプ１及び２、並びにＶｍｗ　５５ま たは関連するアミノ酸領域（細胞因子と結合してＩＥ遺伝子発現を誘導する複合 体を形成するための領域）において十分相同なタンパク質に依存するヘルペスウ ィルスに対して適用できる。

以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

［実施例］ ＴＲ，Ｆ−Ｖｍｗ　５５複合体形成のペプチド阻害を示すための実験は以下のよ に従い、ＨｅＬａ細胞の核抽出物を調製した（これは細胞ＤＮＡ結合タンパク質 を含む抽出物を調製する定法である）。Ｖｍ、ｗ　５５アミノ酸からのポリペプ チドを上記した配列に従って、ＣａＩＱｂｒｉｄｇｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＵＫが契約により 合成した。３種の異なるポリペプチド（アミノ酸１１９−１３４　＋　１６０− １７６　：　３６０−３７３）の各積置（１００ｎｇ、５００ｎｇ。

１μｇ、２５μｇ、５μｇ）を含むリン酸緩衝溶液１ｇｌを、標準量のＨｅＬａ 細胞核抽出物（ポリペプチド２μｇに対して抽出物１μｍ）に加えた。２０℃で ３０分間インキュベーションした後、Ｐ、Ｏ’Ｈａｒｅ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭ ＢＯＪ、　７：４２３１−４２３８　（１９８８）に記載の方法で精製したＶｍ ｗ　６５タンパク質試料１μｌを、抽出物−ポリペプチド混合物に加えて、２５ ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，９，１ｍＭ　ＥＤＴ、へ、５ｍＭ　ＤＴＴ、　１０ ０ｍＭ　ＫＣｌ、０．　０５％　ＮＰ４０　１０％　グリセロール、及びサケ精 子ＤＮＡ　２μｇを含む緩衝溶液中でさらに５分間インキュベーションした。次 いでＨ３Ｖ−１の即時的初期　ＩＥＩＩＯＫ遺伝子のヌクレオチド−１７１から −１４９（ｍＲＮＡ転写位置から上流に向けて番号を付け、Ｔ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ 　Ａ　ＲＡ　Ｔ配列は−１６２から−１５４にある）を包囲する過剰量の３２ｐ で放射性標識したプローブを加えてさらに２５分間インキュベーションを続けた 。生成物を次いで４％非変性ポリアクリルアミドゲル上で２００ボルト、２時間 かけて分離した。これらの手法については、本質的に０°ＨａｒｅおよびＧｏｄ ｉｎｇ、Ｃｅ１ｌ婬：　４３５−４４５　（１９８８）に記載されている。どの ポリペプチドの濃度もゼロである場合には、オートラジオグラフィー上でゲルは 、放射性標識されたＴＲＦとＴＲＦ／Ｖｍｗ　６５複合体による高分子量のバン ドを示した。１１９−１３４及び１６０−１７６ポリペプチドを加えても、これ らのバンドのいずれの出現にも何ら影響を与えなかった。３６０−３７３ポリペ プチドの存在下では、その濃度が増加すると共に放射性標識したＴＲＦ／Ｖｍｗ 　６５バンドは弱くなり、５００ｎｇ及び１μｇでは検出されなかった。ＴＲＦ そのものを表す放射性（■）弁理士／代理人情報： （Ａ）名前：　Ｌｅｏｎａｒｄ　Ｍｉｔｃｈａｒｄ（Ｂ）登録番号：　２９００ ９ （Ｃ）参考／訴訟番号： （ＩＸ）電気通信データ。

（Ａ）電話：　（７０３）８７５−０４４０（Ｂ）ファクシミリ：　（７０３） ５２５−３４６８（Ｃ）テレックス　２００７９７　ＮＩＸＮ　ＵＲ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＤ　Ｎｏ、１に関する情報・（Ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ　３０アミノ酸 （Ｂ）タイプ：　アミノ酸 （ｎ）分子のタイプ：　タンパク質 （Ｖ）断片のタイプ：　内部断片 （Ｘ［）　配列記載：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（３）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・２ に関する情報：（Ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：　７アミノ酸 （Ｂ）タイプ・　アミノ酸 （ＩＩ）分子のタイプ：　タンパク質 （Ｖ）断片のタイプ：　内部断片 （Ｘ［）配列記［：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２国際調査報告

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｎ−末端からＣ−末端までの配列：【配列があります】（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：２と同定される）からなるか、或いはこれを含む、単純ヘルペスウィルスタ ンパク質Ｖｍｗ　６５の４０個までの連続アミノ酸よりなるポリペプチド、また はその保存的に修飾された変異体。
2. ２．３６０から３９０までの以下の配列：【配列があります】 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１と同定される）中のフランキングアミノ酸からなるか 、或いはこれを含む請求の範囲第１項記載のポリペプチド、またはその保存的に 修飾された変異体。
3. ３．細胞因子と複合体を形成して遺伝子転写の誘導を行うＶｍｗ　６５−様タン パク質を有するウィルスの阻害剤として用いる、請求の範囲第１項または第２項 記載のポリペプチド。
4. ４．単純ヘルペスウィルスタイプ１の阻害剤として用いる請求の範囲第３項記載 のポリペプチド。
5. ５．請求の範囲第１項または第２項記載のポリペプチドに対する抗体。