JPH05505406A - 薬剤供給システムとしての機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞 - Google Patents

薬剤供給システムとしての機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 薬剤供給システムとしての 機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞本発明は請求の範囲第１項の上位概念 に記載の人工膜小胞（リポソーム）に関し、特にその表面に融合ペプチド分子及 びその他の細胞特異タンパク質を有する小胞に関する。本融合ペプチドは人工ペ プチド又は精製したペプチドの形であってもよく、又例えばインフルエンザウィ ルス、パラインフルエンザウィルス又はセムリキ森林熱ウィルスのようなエンベ ロープを有するウィルスのスパイク糖タンパク質分子、例えば赤血球凝集素の一 部であってもよい。細胞特異タンパク質はＩｇＧ−抗体、例えばＣＯ２抗体であ ってもよい。
ある薬剤を患者に投与した場合、薬剤は普通投与された部位からプラズマの範囲 に達しなければならないので、この投与の経路が薬剤の循環に於ける薬物動態学 的状況に対して重要な影響を及ぼし得る。例えば経口投与は便利ではあるが薬剤 の作用が遅れて始まり、又プラズマの最適の薬剤レベルが得られるかどうか必ず しも確かではない。これに対して静脈内注射は患者に痛みと不快感を与える代償 として、正確な循環レベルを直ちに達成することができる。しかし薬剤を直接体 組織の循環系統に注入した場合でも、投与された用量とターゲット部位の薬剤レ ベルとその持続との間の関係は決して簡単ではない。これらのパラメータは複雑 な、しばしば競合する経路網によって決まるので、そのため活性の薬剤分子がタ ーゲット部位に蓄積されるか、或いは薬剤が失活して排出される結果となる。
これらの経路では肝臓その他の組織に於けるバイオトランスフォーメーション、 腎臓又は胆汁からの排出、固定又は循環している細胞又は巨大分子と薬剤との結 合、及び膜壁を通しての薬剤の受動的又は仲介輸送が行われる（Ｃｒｅａｓｙ、 　Ｗ、Ａ、　（１９７９）：　Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎ　Ｈｕｍ ａｎｓ　（人体での薬剤の消費）、０ｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒ ｅｓｓ、　ＮｅｗＹｏｒｋ）。
最近接々のキャリヤや薬剤供給システムを用いて薬剤の分布と代謝に好影響を与 えようとする試みに多くの関心が寄せられてきた。
これらのシステムは次のパラメータの一つ又は幾つかを制御するためのものであ る（Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，Ｒ，（１９７５）、　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｐｈｙｓｉ ｏｌ、　Ｐｈａｒ−ｍａｃｏ　５６．６８３−６９０）： ａ）　ある特定の身体の範囲への薬剤の投入速度ｂ）　身体内の薬剤の分布と集 中 Ｃ）　薬剤の持続性又は代謝速度。
制御された薬剤供給システムは、Ｂａｎｇｋａｍらによって始めて発表されたリ ポソーム（Ｂａｎｇｋａｍ、　Ａ、Ｄ、、　５ｊａｎｄｉｓｈ、　Ｍ、Ｍ、、　 Ｗａｔｋｉｎｓ、　Ｊ。
Ｃ，（１９６５）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１３．２３８−２５２＞の 開発により大きく改善された。現在文献によれば特定の薬剤をリポソームに入れ て供給することにより極めて種々の利点か得られると言われているか、これらの 利点は大路次のような項目に分類できる：■、　リポソームは生体膜を通過でき 、普通は透過できない障壁を通しての薬剤の輸送を容易にする。特にリポソーム はカプセル入り配合物の細胞内への透過を容易にする。
２、　リポソームを特定の組織と作用するように構成して、薬剤の選択性を向上 し毒性を低減することか可能である。
３、　リポソームは薬剤の放出、分布、体組織の循環からの除去を調節して、薬 物動態学的状況を改善する。
４、　化学的、代謝的に不安定な薬剤の失活をリポソームにより防止できる。
カプセル入り配合物の方が無処理の物質に比べて少なくとも試験管内では改良さ れた性質を示すので、治療効果の期待される薬剤をこの方法で隔離し得る。しか し、化学療法へのこの新しい革新的手法に対する当初の期待はその後の実験結果 では残念ながら必ずしもその全てが満たされてはいない（Ｆｉｌｄｅｓ、　Ｆ、 Ｊ、Ｔ、　（１９８１）、　Ｌｉｐｏｓｏ−ｍｅｓ、　Ｆｒｏｍ　ｐｈｙｓｉｃ ａｌ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｔｏ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　ａｐｐｌｉｃａｔ ｉｏｎｓ。
（リポソーム、その物理的構造から治療への応用まで）　Ｋｎｉｇｈｔ　（ｍ者 ）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−１（ｏｌｌａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ 　Ｐｒｅｓｓ）。
特定のタンパク質を有するリポソームのターゲツティングによりベクターとして リポソームを使用した結果がよくなる筈であった。
リポソームに封入された物質を選択された器官又は組織に更に有効に供給するの がその目的であったならば、このようなターゲツティング技術は、望ましくない 部位でのリポソームの蓄積を避け（こうして毒性を低減し）、特定の細胞への供 給を最適化する（こうして所望の効果を高める）手段を講する必要があった。
いくつかの研究では、食細胞への供給を最適化するために、凝集した免疫グ０プ リンでリポソームを被覆する方法が用いられてきた（Ｉｓｍａｉｌ、　Ｇ、、　 Ｂｏｘｅｒ、　Ｌ、Ａ、、　Ｂａｃｈｎｅｒ、　Ｒ，Ｌ、（１９７９）、　Ｐｅ ｄｉａｔｒ。
Ｒｅｓ、、１３．　７６９−７７３；　Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、Ｍ、Ｃ，、Ｋ ｕｈｎ、Ｓ、Ｈ，、５ｃｈｉｅｒｅｎ。
Ｈ，、Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ、Ｇ、、）Ｉａｆｆｓｔｅｉｎ、Ｓ、（１９８０）： 　Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ−ｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　（リポソーム と免疫生物学）　（Ｔｏｍ、　Ｂ、Ｈ，、Ｓｉｘ、　Ｈ，Ｒ，編）２５５−２７ ０．　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ 　Ｃｏ、、　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
更に改良法として、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　＆　Ｎｅｅｒｕｎｊｕｎ　（１９ ７５）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍ＋ｓｕｎ、　６５．５３７−５４４によれ ば、リポソームのターゲツティングは細胞特異ＴｇＧ−抗体の会合により高めら れ、特殊の細胞株に対して作られたＩｇＧ−免疫グロブリンで会合したリポソー ムを異なる細胞株に与えると、リポソームの吸収が３倍から２５倍増大した。し かしこの使用された技術では、このようにターゲットされたリポソームが細胞膜 と融合できないため、薬剤を細胞に効果的に供給することか妨げられた（Ｌｅｓ ｅｒｍａｎ、　Ｌ、、　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、　Ｊ、Ｎ、、　Ｂｌｕ−ｍｅｎｔ ｈａｌ、　Ｒ，、５ｈａｒｒｏｖ　Ｓ、Ｏ，、Ｔｅｘｙ、　Ｗ、Ｄ、　（１９７ ９）、　Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏｌ。
１２２、５８５−５９１）。
薬剤供給システムを構築する上での大きな進歩は、ウィルスタンパク質を有する リポソームのターゲツティングであった。即ちリポソーム膜はインフルエンザウ ィルスからの赤血球凝集素のようなタンパク質で再構成された（Ａｌｍｅｉｄａ 、　Ｊ、Ｄ、、　Ｂｒａｎｄ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｅｄｗａｒｄｓ。
Ｄ、Ｃ，、Ｈｅａｔｈ、　Ｔ、Ｄ、　（１９７５）、　Ｌａｎｃｅｔ　２．８９ ９−９０１）。適当なウィルスタンパク質をリポソーム膜に取り込むことにより 、初期のウィルスと宿主細胞との相互作用の効果と特異性（吸収、浸透）とをリ ポソームキャリヤに付与することができる。例えば、センダイウィルススパイク タンパク質をリポソームの二重層に取り込めば、マウスＬ細胞によるジフテリア 毒素フラグメントＡの吸収が、フラグメントＡを含むスパイクなしのリポソーム と比較して少なくとも１００倍増加した（Ｕｅｈｉｄａ、　Ｔ、、　Ｋｉｍ、　 Ｊ、、　Ｙａｌｌａｉｘｕ＋ｓｉ、　Ｍ、、帽ｙａｈｅ、　Ｙ、、　０ｋａ−ｄ ａ、Ｙ、（１９７９）、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、８０．　１Ｏ−２０）。
上述の方法の主な欠点は、活性の充分なインフルエンザ赤血球凝集素融合ペプチ ドの欠如である。インフルエンザウィルスは膜融合によってその宿主細胞に透過 する。ウィルス粒子はまず細胞の表面に結合してから、取り込まれてエンドソー ム、リソソームに運ばれる。これらのオルガネラの酸性の環境がウィルス細胞膜 と宿主細胞膜との融合を活性化する。低いｐｌ−値での小胞と細胞との融合の利 点は、小胞の内容物が細胞の細胞質に取り込まれた後で放出される点にある（エ ンドソームのｐＨ−値は約５．２である）。この低いｐＨ−値で誘発されたイン フルエンザウィルス糖タンパク質の融合の発見を契機として、インフルエンザ赤 血球凝集素ターゲットリポソームにより有効な薬剤供給システムを開発しようと する多くの試みがなされた。
Ｋａｗａｓａｋｉら（Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋ｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ 　Ａｃｔａ　（１９８３）、　７３３．２８６−２９０）は卵黄中のインフルエ ンザ赤血球凝集素糖タンパク質の再構成された小胞、ホスファチジルコリン／ス ピンラベルしたホスファチジルコリン／コレステロール（モル比１．６　：　０ ．４　二１）を用いた。
タンパク質と脂質との比率（１：　４４及び１　：　１０５モル１モル）が適当 な標品は、表面に高密度のスパイクを有する直径１００−３００　ｎｍの小胞を 含んでいたが、しかし幾つかの欠点があった。
１）　高いコレステロール含有量と界面活性剤の残渣のため食細胞によるエンド サイト−シスが低下した。Ｋａｗａｓａｋｉらはその活性が僅か６６％と報告し ているが、その後に開発された、改良された試験方法によればその７分後の活性 は僅か１％（りである（下記の実施例１０参照）。これはＫａｗａｓａｋ　ｉら か使用したトリトンＸ−１００が一部赤血球凝集素と反応して透析により完全に は除去されないためと思われる。
２）融合反応に於けるウィルス膜成分の役割を詳しく検討するにはこれらの成分 を処理できなければならない。この目的にはウィルススパイクタンパク質を分離 し再構成して充分な生物学的融合活性を有する再構成されたウイロソームを作る 方法が必要である。Ｋａｗａ−ｓａｋｉらの努力にかかわらず、充分な生物学的 融合活性を示すインフルエンザウィルスのエンベロープの再構成は報告されてい ない。
３）　薬学的に活性の薬剤を含むターゲットされたリポソームを特定の細胞に結 合することを明示できなかった。
再構成ウィルスエンベロープを使用したその他の方法の多くは、づいている。オ クチルグルコシドのような臨界ミセル濃度の高い界面活性剤は透析により効果的 に除去し得る。オクチルグルコシドを使用した再構成に就いては、セムリキ森林 熱ウィルス（ＳＦＶ）　（Ｈｅ−Ｉｅｎｉｕｓ、　Ａ、、　５ａｒｖａｓ、　Ｍ 、、　Ｓｉｍｏｎｓ、　Ｋ、（１９８１）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１１８、２７−３５）、水胞性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）　（Ｅｉｄｅｌｍａｎ 、　０１．　Ｓｃｈｌｅ−ｇｅＬ　Ｒ，、Ｔｒａｌｋａ、　Ｔ、Ｓ、、　Ｂｌｕ ｍｅｎｔｈａｌ、　Ｒ，（１９８４）、　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｖ２５９、４ ６２２−４６２８）、インフルエンザウィルス（Ｈｕａｎｇ、　Ｒ，Ｔ、Ｃ，、 Ｗａ−ｈｏ、　Ｋ、、　Ｋｌｅｎｋ、　Ｈ，Ｄ、、　Ｒｏｕ、　Ｒ，（１９８０ ）、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０４．２９４−３０２）及びセンダイウィルス（Ｉ （ａｒｍｓｅｎ、　ｌＪ、Ｄ、、　Ｗｉｌｓｃｈｕｔ、　Ｊ、、　５ｃｈｅｒｐ ｈｏｆ。
Ｇ、、　Ｈｕｌｓｔａｅｒｔ、　Ｃ，、Ｈｏｅｋｓｔｒａ、　Ｄ、　（１９８５ ）、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。
１４９、５９１−５９９）に対しての報告がある。しかし正確に再構成されたウ イルスエンベロープはその全ての場合に作られなかった。例えばＳＦＶからのウ イロソームではタンパク質と脂質との比がウィルス膜とは異なっており、ＶＳｖ から作られたウイロソームは生物学的融合活性を示さなかった。
文献に記載されたもう一つの方法として、プロメラインを含むウィルス粒子から インフルエンザウィルススパイクを分離する方法があり、この方法で回収された 赤血球凝集素がリポソームに結合された（Ｄｏｍｅｓ、　Ｒ，、Ｈｅ１ｅｎｉｕ ｓ、　Ａ、、　Ｗｈｉｔｅ、　Ｊ、（１９８５）、　Ｊ、　ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ ｗ。
２６０　（５）　２９７３−２９８１）。この方法の主な欠点はプロメラインに よる切断のためにこのような小胞の生物学的活性か低下している点である。
従って本発明の課題は、特定の細胞、例えばマクロファージ、ヘルパー−Ｔ４− 細胞、脳細胞、その外の特定の器官の細胞に所望の薬剤又は薬学的に活性の物質 を輸送し、これらの細胞に十分付着し、ファゴサイトーシス又はエンドサイト− シスにより取り込まれて、所望の薬剤を　−エンドサイト−シスの直後に　−目 的の細胞の細胞質に供給し得るような小胞を提供することにある。
この技術的課題は、請求の範囲第１項の特徴部に記載のウィルス赤血球凝集素ウ イロソームの提供により解決される。本発明の特殊の実施態様と改良された小胞 は請求の範囲第２項〜第９項に記載しである。又そのような小胞を生産する方法 は請求の範囲第１０項と第１１項に、そのような小胞の使用は請求の範囲第１２ 項と第１３項に記した。（訳注：小胞の使用は第１４項と第１５項にも記しであ る。）即ち本発明は、エンドサイト−シスに最適のリポソームと生物学的に充分 活性の細胞特定標識とを含むウィルス赤血球凝集素ウィロソーム、好ましくはウ ィルス赤血球凝集素糖タンパク質又はその誘導体、或いは目的の細胞によるエン ドサイト−シスの直後に前記ウイロソームの融合を誘発し得る人工融合ペプチド を含むウィルス赤血球凝集素ウイロソームを提供する。
本発明の一つの実施態様では、特定のリポソームに吸着する適当な架橋剤と、エ ンドサイト−シス機構を誘発するために目的の細胞の応答可能のりセプターに向 けられた特定の抗体で、架橋剤と結合した後も尚生物学的に充分活性であるよう な抗体とを混合物の中で併用する。
この様な薬剤供給小胞の特徴は、これらの小胞がその表面で、活性の充分なウィ ルス糖タンパク質又はその誘導体と、目的の細胞に付着でき、ファゴサイトーシ ス又はエンドサイト−シスによりこれらの細胞に取り込まれ、前記小胞と内部の 細胞膜との即時の融合を誘発してウイロソームの内容物をこれらの細胞の細胞質 の中に放出することのできる、生物学的に活性の特定の抗体とを輸送する点にあ る。本発明の活性の充分な融合ペプチドにより、薬剤はファゴサイトーシスの直 後に放出されるので、薬剤がエンドサイトソームの中に不当に長く滞留して本発 明のウィルス赤血球凝集素小胞の中に含まれた薬学的物質が非特異的に分解する 可能性を避けることができる。ｐＨ５に於いて、小胞の表面のインフルエンザ融 合ペプチドは生のインフルエンザウィルスの場合と同じように活性化され、小胞 の内容物は、インフルエンザウィルスと放出された核タンパク質の場合と同じよ うに細胞質の中に放出される。
「リポソームＪというのは、界面活性剤の除去を制御して調製した中間の大きさ の二重膜のリン脂質で、界面活性剤の除去の際の始めに形成される小胞の大きさ は、使用した界面活性剤及びリン脂質によって、場合によっては界面活性剤の除 去方法とその速度によって左右される。
本発明は又ファゴサイトーシスに特に適した小胞を生産する方法に関する。この 方法は次の段階をから成る。
１）非イオン性界面活性剤に１種又は２種のリン脂質を溶解２）　ポリスチレン ビーズマイクロキャリヤ（メツシュサイズ（湿潤）２０−５０）により界面活性 剤を除去して小胞を形成３）界面活性剤の除去の間に所定の機械的運動を実施４ ）超音波処理により小胞の所望の直径（５０−１００ｎｓ）を達成もう一つの実 施態様では、本発明はそのリン脂質が重量で７０−９５％のホスファチジルコリ ンと５−３０％のその他のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンと から成る小胞に関する。コレステロールの含有量は１％未満が好ましい。
「融合ペプチド」とは融合ペプチドを含むウィルススパイク糖タンパク質のこと である。一つの実施態様では、本発明は機能性融合ペプチドを含有する、ウィル ス表面スパイクの赤血球凝集素三量体全体、又は１個の単量体、又は切断された サブユニットの一方又は両方、糖ペプチドＩＡＩとＨＡ２に関する。他の実施態 様では、本発明は分離された又は人工的に生産された融合ペプチドそれ自体に関 する。本発明の特に好ましい実施態様では、融合ペプチドを含むこれらのポリペ プチドはインフルエンザ赤血球凝集素、特にＡ−Ｈ，Ｎ、サブタイプの一つに関 する。
「架橋剤ｊとは、本発明により調製された小胞の表面に結合でき且つポリペプチ ドを結合できる有機のへテロ官能性分子のことである。本発明の好ましい実施態 様では、この分子はカルボキシル基とチオール基とを含む有機の二官能性分子、 特にスルホスクシンイミジル（Ｓ）−誘導体、例えばＳ−４−（ｐ−マレイミド フェニル）−酪酸、Ｓ−酢酸、Ｓ−Ｓ−２−（アジド−０−ニトロベンズアミド ）エチル−１，３゛−ジチオプロピオン酸、Ｓ−６−（４’−アジド−２′−二 トロフェニルアミノ）ヘキサン酸、５−（４−アジドフェニルジチオ）プロピオ ン酸、Ｓ−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−１，３′−ジチオプロピ オン酸、５−２−　（ビオチンアミド）−エチル−１，３−ジチオプロピオン酸 、Ｓ−６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸、Ｓ−３−（４−ヒドロキシフェニル ）プロピオン酸、５−（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸、Ｓ−４−（Ｎ− マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸、Ｓ−２，２，５，５−テ トラメチルピロリン−１−オキシル−）ＩＣ＋である。
「細胞特異Ｊタンパク質又は標識とは、小胞の表面で架橋剤に結合でき、細胞の レセプターと結合してエンドサイト−シス機構を誘発し得るタンパク質のことで ある。本発明の好ましい実施態様ではこの分子は細胞レセプター特異抗体、特に 単クローン性抗体に関する。
次に実施例と図面により本発明を説明する。
裏１史上 インフルエンザウィルスからの赤血球凝集素三量体中の機能的に活性の充分なウ ィルス融合ペプチドを有し、抗ウイルス薬剤としてデキストラン硫酸を含む、ホ スファチジルコリンの人工膜小胞の調製。
口上に本方法の原理を示す。円形枠は溶液又は懸濁液、角形枠は固体のペレット 又は沈殿である。一般には次の通りである＝２７００　ｍｇの固形分を含む融合 緩衝液ＦＢと４６　ｍｇのＨＡを含む赤血球凝集素懸濁液ＨＡと３１．１　μｍ ｏｌのウィルスリン脂質ＶＰＬとを混合し、超遠心ＵＣＩ　した。得られたペレ ットを融合緩衝液ＦＢと穏和な界面活性剤としてオクタエチレングリコールモノ ドデシル薬剤デキストラン硫酸ＤＳを加えて溶液Ｖとした。その間に、ホスファ チジルコリン（ＰＣ）溶液■を回転する丸底フラスコの中で真空乾燥し、フラス コの内面に薄いＰＣの層を形成した。この層に溶液■を加えて、層を溶解して溶 液■を作り、これをポリスチレンビーズマイクロキャリヤＰＢＭで３回処理して ＯＥＧを除き、溶液■とした。この溶液中に　−超音波処理ＵＳにより　−所望 の大きさの小胞ＶＥＳを形成した。得られた懸濁液■を食塩水Ｘで希釈して薬剤 懸濁液ＤＲを得た。
詳細には次の通りである・ 融合緩衝液（１）として、食塩７．９Ｂ／ｓｊ！、クエン酸三ナトリウムニ水和 物４．４ｔａｇ７ｍｌ、２−モルホリノエタンスルホン酸−水和物（ＭＥＳ）　 ２．１　＠ｇ／ｍｌ　、　Ｎ−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−２−エタン スルホン酸１．２ｍｇ／ｍｌを含む水溶液（ｐＨを］−Ｎ　ＮａＯＨで７．３に 調節）を調製した。
インフルエンザウィルス（株Ａ／　Ｓｈａｎｇｈａｉ　／　１６／　８９　（８ ３Ｎ２））を鶏卵の尿膜腔で培養し、５ｋｅｈｅｌと５ｃｈｉｌｄの方法（１９ ７１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４４、３９６−４０８）に従ってショ糖密度勾配法によ り２回超遠心して精製した。精製したインフルエンザピリオン懸濁液（ｎ）はイ ンフルエンザウィルス赤血球凝集素２６６μｇ７ｍ　ｌと全体で３１．１　μｍ ｏｌのウィルスリン脂質を含んでいた。その分析は次のように行った：ウイルス リン脂質をＦｏｌｃｈらの方法（Ｆｏｌｃｈ、　Ｊ、、　Ｌｅｅｓ、　Ｍ、。
５ｌｏａｎｅ、　Ｓ、Ｇ、Ｈ，（１９５７）、　Ｊ、　Ｒ４ａ１．　Ｃｈｅｔ　 ２２６．４９７−５０９）で抽出した。リン脂質を分析するために、下側の有機 相を蒸発し、残漬でリン酸塩の定量（Ｃｈｅｎ、、　Ｐ、Ｓ、、　Ｔｏｒｉｂａ ｒａ、　Ｔ、Ｙ、、　Ｗａｒｎｅｒ、　Ｈ，（１９５６）。
Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｆｆｉ、　２８．１７５６−１７５８＞を実施し、一方では 少量のクロロホルム・メタノールに溶解し、これを次のリン脂質のＴＬＣ−分析 に供した。シリカゲルプレート（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、クロロホルム・メタノ ール・酢酸・水（２５：１５・４：２；　ｖ／ｖ＃／ｖ）の溶剤系中で展開した 。
個々のリン脂質をヨードに晒して可視化し、そのＲＦ−値を基にして（標準試料 と比較して）同定した。タンパク質は改良Ｌｏｗｒｙ法（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　 Ｇ、Ｌ、　（１９７７）、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８３．３４６−３ ５６）により定量した。
溶液（ＩＩ）の全量１７３＋ｌを同じ量の前記融合緩衝液（Ｉ）と混合した。こ のインフルエンザウィルス希釈液を１０００００１（で１ｃ分超遠心した。
前記融合緩衝液中にオクタエチレングリコールモノドデシルエーテル（ＯＥＧ） 　５４　ｔａｇ／ｍｌ　（□　１００　ｕｎｏｌ／ｍｊ！　）を含む界面活性剤 溶液１５．３ｍＡにインフルエンザウィルスペレットを加えた。これは１８μｇ ・３３．３　ｔ＋＋ｓｏｌ　ＯＥＧ／μｇ赤血球凝集素に相当する。１ｃ分後に はペレットは完全に溶解した。その溶液をｔｏｏ　ｏｏｏ　ｇで１時間超遠心し た。乾燥した抗ウイルス薬剤デキストラン硫酸（Ｌｌｌｓｃｈｅｒ、　Ｍ、　＆ Ｇｌｕｃｋ、　Ｒ，、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４．３９−５ ０）　３０００　ｒｎｇを、可溶化しホスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ）をク ロロホルムとメタノールとの２：１混合溶液に１０　ｔａｇ７ｃａｌの濃度に溶 解した。この溶液■の２８ｍｊｌ’を回転蒸発器で真空下で注意して蒸発し、丸 底フラスコの内面に２８０　ｍｇの薄いリン脂質の層を形成した。
この丸底フラスコの中のリン脂質の層に溶液Ｖを加え、少なくとも１５分振盪し てホスファチジルコリンを完全に溶解した。得られた溶液■をメツシュサイズ（ 湿潤）　２５−５０のポリスチレンビーズマイクロキャリヤＰＢＭ　４．８　ｇ と共にガラス容器に移した。
この容器を、内容物が毎秒２回一端から他端へ動くように振盪した。１時間後懸 濁液を細いピペットで吸引して、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャ リヤ２．４ｇと共に新しい容器に移して、このカラムを３０分振盪した。この過 程を２回繰り返した。最後の過程で得られた溶液■をビーズから分離し、水浴に 固定して超音波処理装置！　（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ、　Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｅｕｒ ｏｐｅ　ＢＶ、周波数５０　ｋＨｚ±１０％）で処理した。１０秒間の超音波の 衝撃をそれぞれ１０秒の間隔を置いて２回繰り返して、直径約５Ｏ−１０Ｏｎ＠ の中間サイズの小胞を作った。次に最終の溶液■を生理的食塩水で１：１００に 希釈して溶液Ｘを得た。
遺Ｊ１他」− インフルエンザウィルスの赤血球凝集素三量体で吸着した抗ウイルス抗体薬剤と ＣＤＪ単クコクローン性抗体含む人工膜小胞の調製実施例１の方法を次のように 変更して小胞を調製した２１ｍ１当たりホスファチジルコリン１０　ｍｇの代わ りに９　＋Ｈとホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）　１　ｍｇとを 、クロロホルム・メタノールの２＝１混合液に溶解した。
実施例１の方法で赤血球凝集素小胞を調製してから、２ｍｌの水に溶かしたスル ホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドフェノール）−酪酸（ＳＭＰＢ）（ 架橋剤として）　２０　ａｌｇを溶液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪して から、小胞を１０００００　ｇで１０分間超遠心してペレットにした。
抗−Ｌｅｕ　３Ａ　（Ｂｅｃｔｏｎ　＆　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）　８　ｔｓｌを ペレットに加え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞれ数秒間注 意して振盪し、最後にこれを１０００００　ｇで１０分間超遠心して再度ペレッ トにした（結合しなかった抗体を除くため〉。このペレットを生理的食塩水１５ ００■ｌに再懸濁した。
皇ｌ拠主 実施例２を次のように変更して繰り返した：デキストラン硫酸の代わりにイミダ ゾルカルボキサミドとヒドロキシ尿素（８ｒｕｎｎｅｒ、　Ｎａｇｅｌは黒色腫 に対して薬学的に有効と記載。
５ｐｒｉｒ＋＋ｒｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、　２版、Ｉｎｔｅｒｎｉｓｔｉｓｃｈｅ 　Ｋｒｅｂｓｔｈｅｒａｐｉｅ　（癌の内科的治療）、　ｐ、　９３　（１９７ ９））とをそれぞれ１ｏｏｏ　ｓｇ　溶液■（実施例１参照）に加えた。架橋剤 を加え、更に実施例２のように処理してから、単クローン性抗体２．１　ｍｇ　 （Ｒ２４：　Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、　Ａ、Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ、　Ｓｃ、、　Ｖｏｌ、　８２．　ｐ、　１２４２に よる：又は０．５ＨＬ５５　＋　０．５１ｇ　Ｌ７２：　Ｉｒ１ｃ、　Ｒ，Ｓ、 　ｅｔ　ａｌ、、　Ｌａｎｃｅｔ　（１９８９）、　９．７８６−７８７による ）を小胞溶液ＶＥＳに加えて、ヒト１０００人分の用量の次の全組成物を得た： ４６　ｍｇ赤血球凝集素 ２５０　ｍｇホスファチジルコリン ３０　ｔａｇホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）２０　Ｂ架橋剤（ スルホ−ＳＭＰＢ） ＩＩ１ｇ単クローり性抗体 １０００　ｍｇイミダゾールカルボキサミド１０００　ｔａｇヒドロキシ尿素 この医薬は従来通りならば約５倍の量投与すべきであるから、上述の量はヒト２ ００人分の用量に過ぎない。
裏鬼史土 実施例２を次のように変更して繰り返した：デキストラン硫酸の代わりに次の医 薬の少なくとも１種をそれぞれ１０００　ｔａｇ溶液■（実施例１参照）に添加 したニアトリブラスチン、エンドキサン、フルオロウラシル（Ｂｒｕｎｎｅｒ、 　Ｎａｇｅｌ、　Ｉｎｔｅｒｎｉ−ｓｔｊｓｃｈｅ　Ｋｒｅｂｓｔｈｅｒａｐｉ ｅ　（癌の内科的治療）、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、２版、　９．３ ０９　（１９７９）による）、コルヒチン（ＳＩＧＭＡ）。
架橋剤を加え、更に実施例２のように処理してから、単クローン性抗体ＪＤＢＩ 　（Ｓｔｒｅｌｋａｕｓｋａｓ、　Ａ、Ｊ、、　Ｃａｎｃｅｒ−１ｓ＋５ｕｎｏ １．　ｌｍ５ｏｎｏｔｈｅｒ。
Ｖｏｌ、　２３．　ｐ、　３１．１９８６　ｉ：よる）２．１１１ｇを小胞溶ｇ ＬＶＥＳに加えて乳癌用医薬のヒｈ　１０００人分の用量の次の全組成物を得た ：４６１ｇ赤血球凝集票 ２５０■ｇホスファチジルコリン ３０−ｇホスファチジルエタノールアミン２０■ｇ架橋剤（スルホ−ＳＩＪＰＢ ）１　Ｂ単りローン性抗体 ｔｏｏｏ　ｍｇアドリブラスチン １０００　ｍｇエンドキサン １０００　ｍｇフルオロウラシル １ｍ 実施例１及び２を次のように変更して繰り返した：インフルエンザ赤血球凝集素 三量体の代わりに、融合ペプチドを含む単量体を使用した。融合ペプチドを含む 赤血球凝集素−２−単量体は、Ｓ−Ｈ結合をＤ４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ ．　Ｓｉｇｍａ）を用いて化学的還元により切断し、次にｐＨ　６でゲルクロマ トグラフィー（セファデックスＧ５０）により赤血球凝集素−１ペプチドから分 離して得られた。精製した赤血球凝集素−２−単量体懸濁液は融合ペプチドを含 めて単量体を１８０ｇｇ含有していた。
遺」１例」ユ 実施例２を次のように変更して繰り返した：インフルエンザ赤血球凝集素三量体 の代わりに、粗製の融合ペプチドを用いた。人工膜小胞の調製に使用したインフ ルエンザ融合ペプチドは化学的に合成した。［に挙げたアミノ酸配列の何れも使 用可能であるが、それぞれの配置の一方の端末に少なくとも１個、好ましくは３ 個のシスティン基の配置が融合活性に対して効果のあることが判明した。
これらの人工融合ペプチドの一つを有する溶液は、これを４μｇ／ｌａｌ含んで いた。
上記の融合ペプチドの一つを含む小胞は次のようにして調製された： ホスファチジルコリン９＠ｇ／ｌａ１とホスファチジルエタノールアミン１ｍｇ ／ｓｆとをクロロホルム・メタノールの２：１混合液に溶解し、この溶液の２８ ＋ａｊ！を回転蒸発器で真空下で注意して蒸発し、丸底フラスコの内面に薄いリ ン脂質の層を形成した。
デキストラン硫酸３ｇを、融合緩衝液１ｍｆ当たり１００μｍｏｌのオクタエチ レングリコールモノドデシルエーテルを含む界面活性剤溶液１５．３＠ｊ！に溶 解し、その溶液を丸底フラスコのリン脂質の層に加えた。少なくとも１５分振盪 してリン脂質の層を完全に溶解し、得られた溶液をメツシュサイズ（湿潤）２５ −５０のポリスチレンビーズマイクロキャリヤ４．８ｇと共にガラス容器に移し た。
この容器を、内容物が毎秒２回一端から他端へ動くように振盪した。１時間後懸 濁液を細いピペットで吸引して、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャ リヤ２．４ｇと共に新しい容器に移して、このカラムを３０分振盪した。この過 程を２回繰り返した。最後の過程で得られた溶液をビーズから分離し、水浴に固 定して超音波処理装置（Ｂｒａｎｓｏｎｉｃ．　Ｂｒａｎｓｏｎ　Ｅｕｒｏｐｅ 　ＢＶ．周波数５０　ｋＨｚ±１０％）で処理した。１０秒間の超音波の衝撃を それぞれ１０秒の間隔を置いて２回繰り返して、直径約５０−１００　ｎｍの中 間サイズの小胞を作った。
２０　ｔｓｇのスルホ−ＳＭＰＢ　（Ｐｉｅｒｃｅ）を含む２ｍｆの水を上記の 懸濁液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪してから、小胞を１００　０００　 ｇで１５分間超遠心してペレットにした。
人工融合ペプチドを含む溶液２ｍｌをペレットに加え、再懸濁した材料を室温で １時間の間５分毎にそれぞれ数秒間注意して振盪し、最後にこれを１００　００ ０　ｇで１０分間超遠心して再度ベレットにしたく結合しなかった融合ペプチド を除くため）。このペレットを生理的食塩水２００＠ｊ！に再懸濁した。
里１血１ 実施例６を次のように変更して繰り返した：人工融合ペプチド２μｇを含む溶液 ２ｍｌと抗−Ｌｅｕ　３Ａ　１００　μｇを含む溶液２ｃａｌとを小胞を含むペ レットに加え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞれ数秒間注意 して振盪し、最後にこれを１００　０００　ｇで１０分間超遠心して再度ペレッ トにしたく結合しなかった融合ペプチドと細胞特異ペプチドとを除くため）。こ のペレットを生理的食塩水２００ｍＡに再懸濁した。
ｌｌ医主 実施例１〜４による小胞をラブドウィルス、パラインフルエンザウィルス又はト ガウィルスからの融合ペプチド又は赤血球凝集素により調製した。
り糟密度勾配超遠心法により濃縮した。精製した狂犬病ウィルス懸濁液は２１０ ｇｇ／＠ｌの狂犬病ウィルス赤血球凝集素を含んでいた。
これを実施例１にならって更に処理した。
ｂ）　バラインフルエンザウィルス■型を鶏卵の尿膜腔で培養し、実施例１のよ うにショ糖密度勾配超遠心法により２回精製した。精製したパラインフルエンザ ピリオン懸濁液は２４５μｚ７ｍ　ｌのパラインフルエンザウィルス赤血球凝集 素を含んでいた。これを実施例１にならって更に処理した。
Ｃ）　風疹トガウィルスをヒトの二倍体細胞で作り、ａ）にならって精製した。
精製した風疹ウィルスピリオン懸濁液は２０５ｇｇｅｒｍ　ｌの風疹ウィルス赤 血球凝集素を含んでいた。これを実施例１にならって更に処理した。
遺」１例」− 抗ウイルス薬剤を実施例１によって調製した。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスを １４日間リボヌクレアーゼニ量体で、１０日間リン酸塩緩衝液（空試験）のみ、 デキストラン硫酸、又はリボヌクレアーゼニ量体（ＰＣＴ／ＵＳ９０１００１４ １の実施例１により調製）の３用量レベル、リポソーム中のデキストラン硫酸、 又はリポソーム中のりボヌクレアーゼニ量体（最後の二つは本発明の実施例１に より調製）の何れかで処置した。この処置は旧Ｖ−１□１１，の１００　ＴＣＩ Ｄｓ。によるウィルス感染と同時に始めた。ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスはウ ィルス感染後２週、４週、６週目にそのウィルス感染の程度（ウィルス分離、プ ロウィルス配列のＰＣＲ−検出）を調査した。本研究の結果を各処置グループ毎 にウィルスの分離されたマウスの百分率で示した：リン酸塩緩衝液（空試験）　 ８０％ リボヌクｌ／７一ゼニ量体　０．００１　ｍｇ／ｋｇ　９２　％リボヌクレアー ゼニ量体　０．１　ｍｇ／ｋｇ　３０　％リボヌクレアーゼニ量体１０．Ｏｒａ ｇ／ｋｇ　６３　％デキストラン硫酸１０　ｍｇ／ｋｇ　３３％リポソーム中の デキストラン硫酸１０　＠ｇ／ｋｇ　１４　％リポソーム中のりボヌクレアーゼ ニ量体　２５　％本研究の結果によれば、リボヌクレアーゼニ量体０．１　ｍｇ ／ｋｇ、デキストラン硫酸１０　ｍｇ／ｋｇ　、リボヌクレアーゼニ量体含有リ ポソーム、及びデキストラン硫酸含有リポソームは注射１２時間後にこれらの処 置したｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスの過半数を旧Ｖ−感染から保護した。
リボヌクレアーゼニ量体の１０．Ｏａｒｇ／ｋｇではよい結果が得られなかった が、これは用量レベルが高くなるとりボヌクレアーゼニ量体が免疫性を抑圧する ためと思われる。０．００１　ｍｇ／ｋｇではりボヌクレアーゼニ量体は保護効 果がなかった。しかし、本発明によるリポソームに入れたりボヌクレアーゼニ量 体では用量が高い場合でも効果率は６３％から２５％に改良された。リポソーム 中の最適の用量レベルの場合には更に高い効果が期待される。
実験の終わりでの機能の劣ったヒトＰＢＬ−移植片で処置したマウスを除外すれ ば、同じ結論が得られる。しかし、ヒト免疫グロブリンレベルとβグロブリンＰ ＣＲとの分析から、リボヌクレアーゼニ量体リポソーム又はデキストラン硫酸リ ポソームの処置の何れもがヒト細胞の生存を妨げるように思われる。ヒト機能に 基づ＜　ｈｕ−ＰＢＬ−５ＣＩＤマウスの除外により直接の抗ウイルス効果と免 疫調節活性とをある程度区別することができる。
災鳳拠用 Ｌｕ５ｃｈｅｒ　＆　Ｇｌｔｌｃｋ　（１９９０）　（Ａｎｔｔ−ｖｉｒａｌ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４．３９−５０）の報告した融合試験では、実施例１によ り調製した小胞とＫａｗａｓａｋｉらの方法で調製した再構成インフルエンザ小 胞とのモデル膜による融合活性が比較された。
ｍはＲ１８−１！識付きインフルエンザＡウィルスのＤＯＰＣ−コレステロール リポソームによる蛍光デケンチングの変化を示す。蛍光の増加は、Ｌｔｌｓｃｈ ｅｒ　＆　Ｇｌｔｉｃｋ　（上述）により算出したＦＩＩＱ％で示しである。
最初の融合速度は、融合が始まった時間零に於ける融合曲線の接線（図３の破線 ）からめた。曲線２がＫａｗａｓａｋｉらの方法で調製した小胞の融合活性度に 相当する。
ＦＩ６．２ ＦＩＧ、　３ 要約書 リポ脂質二重層小胞が少な（とも一種の薬学的に活性の薬剤を含み、その膜に細 胞特異標識を有し、これがＬｕｅｓｃｈｅｒ　＆　Ｇｌｕｅｃｋ、　Ａｎ−ｔｉ ｖｉｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１４．３９−５０の方法によって測定して少な くとも９０　％の生物学的活性を有する。前記膜のコレステロール含有量は重量 で好ましくは２ｘ未満であり、膜の界面活性剤含有量は好ましくは１　ｐｐｂ未 満である。前記小胞の直径は好ましくは約８０　ｎａ＋である。前記膜のリン脂 質は重量で７０〜９５％のホスファチジルコリンと好ましくは１０〜２０％のホ スファチジルエタノールアミンとを含むことができる。好ましくは６〜８ｘの架 橋剤、好ましくはスルホサクシンイミジル誘導体と少なくとも１種の細胞特異融 合ペプチドとが前記膜に結合している。該小胞はＡＩＤＳ及び癌腫に対する医薬 を調製するために使用される。
ｌ−−Ｎ、ＰＣＴ／εＰ　９２１０００８９

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. １．膜の上に細胞特異標識を有し、少なくとも一種の薬学的に活性の薬剤を含む リポ脂質二重層小胞に於いて、前記細胞特異標識がＬｕｅｓｃｈｅｒ　＆　Ｇｌ ｕｅｃｋ，　Ａｎｔｉｖｉｒａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１４，　３９−５０の方 法によって測定して少なくとも９０％の生物学的活性を有することを特徴とする 前記小胞。
  2. ２．前記膜のコレステロール含有量が重量で１０％未満、好ましくは２％未満及 び／又は膜の界面活性剤含有量が１０ｐｐｂ未満、好ましくは１ｐｐｂ未満であ ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の小胞。
  3. ３．前記小胞の直径が１００ｎｍ未満、好ましくは約８０ｎｍであることを特徴 とする請求の範囲第１項又は第２項記載の小胞。
  4. ４．前記細胞特異標識が少なくとも１種の−好ましくは単クローン性の−抗体を 含むことを特徴とする前記請求の範囲の何れか１項記載の小胞。
  5. ５．前記細胞特異標識が、赤血球凝集素三量体又は単量体、切断されたサブユニ ットの一方又は両方、糖ペプチドＨＡ１とＨＡ２、天然の原料から分離された触 合ペプチド、人工の「融合ペプチド」から成るグループから選択されることを特 徴とする前記請求の範囲の何れか１項記載の小胞。
  6. ６．前記赤血球凝集素が、インフルエンザウイルスから成るグループの少なくと も１種のメンバー、好ましくはＡ−Ｈ１Ｎ１サブタイプ、ラブドウイルス、パラ インフルエンザウイルス及びトガウイルスに由来することを特徴とする請求の範 囲第５項記載の小胞。
  7. ７．前記細胞特異標識が、アミノ酸配列の少なくとも一方の端末が少なくとも１ 個のシステイン基、好ましくは３個のシステイン基から形成されているアミノ酸 の配列の形の少なくとも１種の融合ペプチドを含むことを特徴とする請求の範囲 第１項乃至第３項の何れか１項記載の小胞。
  8. ８．前記リン脂質がインフルエンザウイルスから成るグループの少なくとも１種 のメンバー、好ましくはＡ−Ｈ１Ｎ１サブタイプ、ラブドウイルス、パラインフ ルエンザウイルス及びトガウイルスに由来し、且つ２〜１００倍、好ましくは５ 〜１５倍量のホスファチジルコリンと共存していることを特徴とする前記請求の 範囲の何れか１項記載の小胞。
  9. ９．次の点を特徴とする前記請求の範囲の何れか１項記載の小胞、−前記膜のリ ン脂質が重量で７０〜９５％のホスファチジルコリンと５〜３０％、好ましくは １０〜２０％のホスファチジルエタノールアミンとを含む、 −重量で５〜１０％、好ましくは６〜８％の架橋剤、好ましくはスルホサクシン イミジル誘導体と少なくとも１種の細胞特異融合ペプチドとが前記膜に結合して いる。
  10. １０．少なくとも１種の融合ペプチドを含み、非イオン性界面活性剤と超遠心法 によってウイルス株から分離された赤血球凝集素を細胞特異標識として膜の上に 有し、且つ少なくとも１種の薬学的に活性の薬剤を含むリン脂質二重層の小胞を 調製する方法に於いて、赤血球凝集素とは反応しない１種の非イオン性界面活性 剤、好ましくはオクタエチレングリコールモノドデシルエーテルを使用し、超遠 心の後で所望の活性薬剤を上澄みに加え、溶液を好ましくは２０〜５０のメッシ ュサイズ（湿潤）のポリスチレンビーズマイクロキャリヤで繰り返し処理して前 記界面活性剤を除去し、超音波処理により溶液中に所望の寸法の小胞を形成する ことを特徴とする前記小胞を調製する方法。
  11. １１．前記界面活性剤溶液の濃度が１０〜２５０μｍｏｌ、好ましくは８０〜１ ２０μｍｏｌであり、及び／又は界面活性剤１００ｍｇに対して１〜２ｇ、好ま しくは約１．５ｇのポリスチレンビーズマイクロキャリヤを加えて溶液から前記 界面活性剤を除去することを特徴とする請求の範囲第１０項記載の方法。
  12. １２．請求の範囲第１項乃至第９項の何れか１項記載の小胞又は請求の範囲第１ ０項又は第１１項記載の方法で調整された小胞のＡＩＤＳに対する医薬を調製す るための使用。
  13. １３．前記小胞が次の物質の内の少なくとも１種を含む、請求の範囲第１２項記 載の使用：デキストラン硫酸、リボヌクレアーゼ二量体、リゾチーム二量体。
  14. １４．請求の範囲第１項乃至第９項の何れか１項記載の小胞又は請求の範囲第１ ０項又は第１１項記載の方法で調製された小胞の癌腫に対する医薬を調製するた めの使用。
  15. １５．前記小胞が次の物質の内の少なくとも１種を含む、請求の範囲第１４項記 載の使用：イミダゾールカルボキサミド、ヒドロキシ尿素、アドリブラスチン、 エンドキサン、フルオロウラシル、コルヒチン。
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