JPH05506367A

JPH05506367A - 脂肪アシルレダクターゼ

Info

Publication number: JPH05506367A
Application number: JP92507071A
Authority: JP
Inventors: メッツ，ジェイムズ　ジョージ; ポラード，マイケル　ロマン
Original assignee: カルジーン，インコーポレイティド
Priority date: 1991-02-22
Filing date: 1992-02-21
Publication date: 1993-09-22

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】脂肪アシルレダクターゼ本出願は、１９９１年１１月２０日出願のＵＳＳＮ　０７／７９６．２５６の一部継続出願であり、そして、１９９１年２月２２日出願のＵＳＳＮ　０７／６５９．９７５の一部継続出願である１９９１年９月２７日出願のＵＳＳＮ　０７／７６７、２５１の一部継続出願である。

技術分野本発明は、植物酵素、そのような酵素の精製・獲得方法、それに関連するアミノ酸および核酸配列、並びにそのような組成物の利用方法に関する。

脂肪酸は約４〜２４個の炭素の炭化水素鎖を有する有機酸である。

鎖長、二重結合の存在、数および位置が互いに異なる多種多様な脂肪酸が知られている。細胞内では、脂肪酸は典型的には共有結合形態において存在し、カルボキシル部分は脂肪アシル基と呼ばれる。

それらの分子の鎖長および飽和度はしばしば式ＣＸ：Ｙによって表される。ここで“Ｘ″は炭素の数を表しそして“Ｙ″は二重結合の数を表す。脂肪アシル分子の炭素鎖は常に偶数の炭素を含むので、炭素鎖長を表すのに式“Ｃｘｔ”を使うこともある。

脂肪アシル基は多くの脂質の主成分であり、それらの長い無極性の炭化水素鎖がそれらの脂質分子の水不溶性の原因である。他の因子への脂肪アシル基の共有結合の種類は異なることができる。例えば、生合成反応では、それらは、特定の酵素反応に応じて、チオエステル結合を介してアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）または補酵素Ａ　（ＣｏＡ）に共存結合することができる。ワックスでは、脂肪アシル基はエステル結合を介して脂肪アルコールに結合し、そしてトリアジルグリセロールはエステル結合を介してグリセロール分子に結合した３個のアシル基を有する。

主として長鎖（１６または１８個の炭素を有する）脂肪アシル基から成るトリアジルグリセロールとして脂質を貯蔵する多数の植物が研究されている。非常に長鎖（２０〜２４個の炭素を有する）の単不飽和脂肪アシル基はＣＩ８：ＩからのアシルＣｏＡ伸長過程によって形成され、多数の植物種子、特にアブラナ科（Ｃｒｕｃｉｆｅｒｅａｅ　）に属する植物種子中に見出される。ホホバとして良く知られているツゲ科のＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓは、多量の液体ワックスを生産し種子貯蔵脂質として貯蔵する能力の点で高等植物（種子植物）の中でもユニークである。それらの単純ワックス化合物は、非常に長鎖のモノエン酸脂肪アシル基とアルコールとの酸素エステルである。

幾つかの植物種により他の型のワックスも生産される。植物表皮または角度ワックスの合成、並びに細菌、例えばアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ　）　ＣＦｉｘｔｅｒら　（１９８６）　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１３２：３１４７−３１５７　）およびミクロコツカス（Ｌｌｏｙｄ　（１９８７）　Ｍｉｃｔｏｂｉｏｓ　５２：２９−３７３によるワックス合成、および単細胞緑色藻類であるミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ　）によるワックス合成は公知である。しかしながら、それらのワックスの組成および生合成経路はホホバ種子ワックスとは異なる。

例えばミドリムシの貯蔵ワックスの形成では、アルコール部分が脂肪アシルＣｏＡレダクターゼにより触媒される脂肪アシル化合物のＮＡＤＨ依存性還元によって形成されることが証明されている。ホホバ種子では、その反応はＮＡＤＰＨ依存性である。非常に長鎖の脂肪アシルＣｏＡから対応するアルコールへの還元は単一酵素に依存すると仮定されており、該酵素の活性は発育中のホホバ種子からの粗抽出物において観察されている（Ｐｏｌｌａｒｄら（１９７９）　Ｌｉｐｉｄｓ　１４：６５１−６６２；Ｗｕら（１９８１）　Ｌｉｐｉｄｓ　１６：８９７−９０２３　、また、植物内皮ワックスの形成について、比較により、２段階過程が報告されている（Ｋｏｌａｔｔｕ−ｋｕｄｙ　（１９８０）　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　（Ｓｔｕｍｐｆ、　Ｐ、に、およびＣｏｎｎ、　Ｅ、Ｅ、編）、第４巻、　５７１−６４５頁）　。ＮＡＤＨ依存性レダクターゼの作用により脂肪アシルＣｏＡが遊離アルデヒドに変換され、次いでＮＡＤＰＨ依存性脂肪アルデヒドレダクターゼの作用によりアルコールが形成される。

植物中でのワックスエステルの形成を担う酵素のこれ以上の特徴付けは、酵素活性に関係するポリペプチドの同定をもたらすプロトコールが無いことにより妨害されている。従って、植物脂肪アシルレダクターゼタンパク質の更なる研究によって、レダクターゼポリペプチドを同定することができる精製プロトコールを考案することが望ましい。それらの方法を確立することにより、十分な量の脂肪アシルレダクターゼタンパク質を獲得することができ、該タンパク質のアミノ酸配列を決定することができ、そして／または脂肪アシルレダクターゼに特異的な抗体を獲得することができる。得られたアミノ酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術において、またはｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーのスクリーニングに有用である。あるいは、脂肪アシルレダクターゼタンパク質を発現するクローンを同定するため発現ライブラリーをスクリーニングするのに該抗体を用いることができる。こうして得られたクローンを分析し、その結果、植物脂肪アシルレダクターゼに相当する核酸配列を同定することができる。

発育中のホホバ胚からの無細胞ホモジネートはＮＡＤＰＨ依存性脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ活性を有すると報告された。この活性は分画遠心分離によって形成される浮遊ワックス層にあるとされた（Ｐｏ１１ａｒｄら（１９７９）前掲：Ｗｕら（１９８１）前掲）。

幾つかのレダクターゼタンパク質の既知のジヌクレオチド結合折り畳みにおける機能性残基の保存は、Ｋａｒｐｌｕｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ　（１９９１）２５１：　６Ｏ−６６）により報告されている。

脂肪アシルＣｏＡレダクターゼ活性を有するミドリム２１９９０年４月２２〜２４日、　Ｌａｓ　Ｃｒｕｃｅｓ、　ＮＭからの概要〕により報告されている。

ホホバレダクターゼタンパク質の３００倍精製はＰｕ５ｈｎｉｋら（ＴｈｅＲｉｖｅｒｓｉｄｅ、　Ｃａ、からの概要〕により報告されている。

図面の簡単な説明図１．ホホバ脂肪アシルレダクターゼの核酸配列および翻訳アミノ酸配列が提供される。

発明の要約本発明により、部分精製された脂肪アシルレダクターゼタンパク質が提供され、前記タンパク質は脂肪アシル基質からの脂肪アルコールの形成において活性である。本発明のレダクターゼは、アシルＣｏＡおよびアシルＡＣＰを含む様々な脂肪アシル基質に関して活性であることができる。それらの基質の炭素鎖長は異なることができるが、与えられたレダクターゼは特定の鎖長のアシル基質に対して優先性を示すか、または炭素鎖長について広範囲を有するアシル基質に関して活性であることができる。

一般に、本発明のレダクターゼは、少な（とも、１６〜２４炭素の鎖長（炭素鎖長は式“Ｃｔｘ”により表すことができ、“Ｘ”は８〜１２の数である）を有するアシル基質に対して活性であるが、他のアシル基質についても試験し、更なる活性を発見することもできる。加えて、本発明のレダクターゼタンパク質が得られれば、下記に更に詳述されるような操作も可能である。それらの操作は、他の関連するレダクターゼの製造または発見をもたらし得る。

第一の観点によれば、本発明は、脂肪アシルレダクターゼ酵素活性を表すタンパク質調製物に関し、例えば種子植物タンパク質調製物に関する。そのような調製物は、ホホバ胚芽を分画してミクロソーム膜調製物を生成せしめ、この膜調製物からレダクターゼタンパク質を可溶化し、そしてクロマトグラフィ一方法によって更に精製することにより製造される。ホホバレダクターゼは非常に長鎖のアシルＣｏＡ基質を好むが、他のアシル基質に関する活性も観察され、そしてＮＡＤＰＨ依存性であることが示されている。

それらの手順により、ポリアクリルアミドゲル上で二重線バンドとして移動しそして約５４　ｋＯと約５２　ｋＤの見かけ分子量を存する２種の主要なポリペプチドを含む、部分精製されたレダクターゼ調製物が得られる。よって、種子植物源からの精製を通してアシルレダクターゼを獲得する方法、並びにそれらのレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列を得る方法が提供される。

本発明の別の観点では、本発明のレダクターゼに関係づけられる核酸配列に関する。本発明のレダクターゼタンパク質のアミノ酸配列からそれらの配列を同定および獲得することができる方法が記載される。別のレダクターゼ配列の単離の際の、並びに宿主細胞中でのレダクターゼ配列配列の転写用および／またはレダクタ−セタンバク質の発現用の組換え構成物における、前記構造遺伝子配列の利用が記載される。レダクターゼタンパク質に関係する別の核酸配列の利用、例えば５′および３′非コード領域の利用も検討される。

本発明の更に別の観点は、本発明の組換え構成物を含存する細胞に関する。特に、ホホバレダクターゼが好む基質を含む細胞、例えばアブラナ科植物の胚の細胞に関する。

その上、本発明の組換え構成物からの発現の結果として本発明のレダクターゼタンパク質を含有する細胞にも関し、そして宿主細胞中でのレダクターゼの生産方法か提供される。従って、宿主細胞中での該タンパク質の発現の結果として回収されるレダクターゼタンパク質も本発明に関係する。更に、本発明のレダクターゼがそのような宿主細胞中での脂肪アルコールの生産において利用され得ることは認識されよう。

発明の詳細な説明本発明の脂肪アシルレダクターゼは、脂肪アシル基から対応するアルコールへの還元を触媒する活性がある、アミノ酸の任意配列、例えばタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド断片を包含する。

脂肪アシル基とは、キャリヤー、例えばＡＣＰまたは補酵素Ａに共有結合した任意の脂肪アシル基を意味する。

この酵素反応は２段階で行われ得る４を予還元を伴うので、脂肪アシル基からアルコールへの還元には別の酵素が要求されることもあり、要求されないこともある。第一段階では、アシル基がアルデヒドに変換され、これが次いで対応するアルコールに還元されるだろう。よって、本発明のレダクターゼは、アシルからアルコールへの４電子還元全体を通して活性であってもよく、またはアルデヒドへの還元のみを触媒し、第二の酵素によりアルデヒドがアルコールに還元されてもよい。これまでに得られた証拠は、単一酵素がアルコールへのアシルＣｏＡの完全還元を行うことを示す。本発明の脂肪アシルレダクターゼは以後［アシルレダクターゼ」または「レダクターゼ」とも呼ばれる。

本発明は、脂肪アシル基をアルコールに変換する種子植物脂肪アシルレダクターゼに関する。より詳しくは、本発明はＮＡＤＰＨ依存性レダクターゼに関する。

加えて、本発明の植物脂肪アシルレダクターゼは脂肪アシルＣｏＡと脂肪アシルＡＣＰ分子の両方に対して活性を有することができ、観察される活性は利用可能な基質に依存するだろう。しかしながら、脂肪酸シンセターゼ（ＦＡＳ）アシルＣｏＡ伸長過程の操作には、非常に長鎖のアシルＣｏＡ基質に対する優先活性が所望される。

本発明により、種子植物脂肪アシルレダクターゼタンパク質が組込み型膜タンパク質であることが決定づけられた。一般に、膜関連タンパク質は、それらが可溶化される時に、即ちそれらが正常に機能する膜環境から分離される時に酵素活性を損失する傾向があるため、精製が困難である。しかし、まだ酵素活性を保持している可溶化された種子植物脂肪アシルレダクターゼを得ることは、膜結合タンパク質では不可能であるような様々な利用を可能にし得る。

例えば、精製または部分精製されたアシルレダクターゼタンパク質が一端得られれば、それを固定化しそしてリアクター系において使って、還元ピリジンヌクレオチド再生系の存在下で脂肪アルコールを調製することができる。更に、レダクターゼタンパク質の研究が部位特異的突然変異誘発研究に至り、それの触媒特性の更なる特徴づけおよび改善またはそのアシル基質特異性の変更を行うことができる。基質特異性が変更されたレダクターゼは、他のＦＡＳ酵素と合同した用途を見出すことができる。例えば、中Ｍ（ＣＩ２〜Ｃ１４）を好む植物チオエステラーゼ（米国特許出願第０７／６６２．００７号を参照のこと）および適当なアシルトランスフェラーゼを変更レダクターゼと共同して使用して中鎖アルコールを製造することができ、次いで該アルコールを脂肪酸にエステル化してエステルを得ることができる。

膜結合タンパク質を処理する時の他の考慮すべき重要な要因は、タンパク質と膜との結合の程度である。膜周辺タンパク質または膜組込み型タンパク質が知られている。周辺タンパク質は、典型的には性質が幾分親水性であり、弱くのみ膜に結合しており容易に可溶化される。反対に、膜組込み型タンパク質は、脂質膜中に埋没した高疎水性領域を有し、それらが酵素活性を保持するためには脂質と結合していなければならないことがしばしばある。

組込み型膜タンパク質を可溶化するのに使われている技術は、適当な膜画分の調製物への界面活性剤または有機溶媒の添加を含む。

所望のタンパク質がまだ機能的活性（これは特定の酵素アッセイを使って測定することができる）を保持すると仮定すれば、次いで他の常用の精製技術、例えば沈澱、イオン交換、ゲル濾過およびアフィニティークロマトグラフィーを使うことができる。

典型的には、可溶化されたタンパク質調製物を得るための第一段階として、アシルレダクターゼ活性を含む種子植物組織のミクロソーム膜調製調製物が所望される。標準的なミクロソーム膜調製は、完全細胞、核および可溶性タンパク質を含まない膜画分を与える無細胞ホモシネ−）　（ＣＦＨ）の分画遠心分離を使う。

〔例えば、Ｍｏｏｒ６ら（１９８７）　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、　３７−７２頁、　ＦｉｎａｌａｙおよびＥｖａｎｓ編を参照のこと。〕油脂種子では、最初の遠心分離段階が典型的にはベレット、上溝および浮遊脂肪層を与え、次いで上清を更に遠心分離することによりミクロソーム膜を回収することができる。

１９９１年２月２２日出願の同時係属ＵＳＳＮ第０７／６５９．９７５号において、アシルレダクターゼタンパク質を含む膜画分がＣＦＨ中のものに関して良好なレダクターゼ活性回収率で得られるプロトコールが記載されている。この方法の重要な段階は、ホホバ胚からの種皮の除去であった。というのは、種皮は酵素学的測定を妨害する因子を含むことがわかっているからである。この方法はプロトコールの最初の部分の間に高塩溶液を使用し、その段階を下記に記載し、後の実施例においても一層詳細に記載する。

ホホバ胚試料から粉末を製造し、粉末を高塩（３Ｍ　ＮａＣ１）ショ糖（０，３Ｍ）溶液中で胚２０　ｇあたり溶液８０−の割合でホモジナイズすることによりホモジネートを調製する。次いでこのホモジネートを濾過し、ｉｏｏ、ｏｏｏ　ｘｇで約１時間遠心し、ベレット、上溝および浮遊脂肪層を得る。脂肪層を除去し、上溝を回収し、１００［ＯＭ　ＨＥＰＥＳ　（１）Ｈ７，５）、　２ｍＭ　ＤＴＴおよび０．５ｄ　ＥＤＴＡを含むＩＭ　ＮａＣｌ溶液に対して透析する。

透析物を次いで１００．０００　Ｘｇでまたは好ましくは２００．０００　Ｘｇで約１時間遠心分離し、アシルＣｏＡレダクターゼ活性を有するミクロソーム膜を含んで成るベレットＤＰ２を得る。

ミクロソーム膜調製物中のまたは更なる精製手順の間のアシルレダクターゼ活性の更なる特徴付けは、アシルレダクターゼに対する最適化された特異的アッセイを開発することにより容易になるだろう。例えば、ホホバでは、基質として非常に長鎖のアシルＣｏＡ分子を使用しそして高塩（０，２Ｍ〜０．５Ｍ　ＮａＣ１）条件下で行われるアッセイが使われる。高塩は検出可能なアシルＣｏＡレダクターゼ活性を有意に増加させることが判明した。このアッセイは実施例１において詳細に記載する。

更なる酵素特徴付けおよび精製の他の重要な段階は、生来の脂質二重層膜環境から分離されているが測定可能なレダクターゼ酵素活性の実質量を保持している可溶化されたレダクターゼタンパク質を得ることである。脂質二重層からの組込み型膜タンパク質の脱離は、少数ケースでは有機溶媒も使われているが、典型的には水性溶液中で両親媒性界面活性剤を使って成し遂げられる。イオン性と非イオン性の両方の多数の様々な界面活性剤が利用可能であり、それらの解離効果、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）　、酵素活性および更なる精製に対する効果、並びに溶液からの除去の容易さにおいて異なる。多種多用の界面活性剤および膜タンパク質の可溶化方法が当業者に公知であり、そしてＮｅｕｇｅｂａｕｅｒ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、（１９９０）　１８２：　２３９−２５３）およびＨｊｅｌｍｉｌａｎｄ　（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　（１９９０）　１８２：　２５３−２６４）により概説されている。

しばしば、膜タンパク質を可溶化するのに使われる界面活性剤は所望のタンパク質の酵素活性を阻害することが認められる。幾つかの界面活性剤を広域特性を示すホホバアシルレダクターゼの可溶化について試験したが、いずれも阻害性であることがわかった。しかしながら、レダクターゼ活性の見かけの界面活性剤阻害は該酵素の不可逆阻害以外の何らかの作用のせいであるかもしれないので、ＣＨＡＰＳによる阻害の可逆性を調べた。

ＣＭＣより高い濃度で界面活性剤ＣＨＡＰＳ　（３−（（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート）による強力な阻害が認められたが、酵素を氷上でＣＨＡＰＳに暴露し、次いでＣＭＣ値またはそれ未満のＣＨＡＰＳ濃度に戻した時、レダクターゼ活性の完全な回復が得られた。よって、レダクターゼは界面活性剤ＣＨＡＰＳにより不可逆的に阻害されるのではない。ミクロソーム膜調製物からのレダクターゼ活性の約８５％を与える、界面活性剤ＣＨＡＰＳを使ってホホバアシルレダクターゼ活性を可溶化するプロトコールが考案された。この方法は実施例２に詳細に記載される。同様に、他の界面活性剤による見かけのレダクターゼ阻害の可逆性の研究を行って、ホホバアシルレダクターゼ活性または他の候補となるレダクターゼの可溶化のための他の存眉な界面活性剤を同定することができる。

可溶化されたアシルレダクターゼタンパク質が得られたら、該酵素を基質特異性、補因子の要求性および可能な活性阻害剤について特徴づけるために更なる実験を行えることは理解されよう。例えば、本発明のホホバアシルレダクターゼはＡＣＰおよびＣｏＡ基質を含む広範囲の基質を持つことが発見された。例えば、少なくとも１６個の炭素を有するアシルＣｏ基質に対する活性、並びに少なくとも１８個の炭素を存するアシルＣｏＡ基質に対する活性が観察される。（Ｃ１５） −１５−テトラコセノイルーＣｏＡ　（Ｃ２４：１）に対する優先的活性が観察される。

例えば、固定化された反応性色素上でのクロマトグラフィーにより、タンパク質調製物中の候補となる植物アシルレダクターゼタンパク質を更に濃縮することができる。多数のそのような反応性色素母材が既知であり、例えば本発明において使われるＣ１ｂａｃｒｏｎ　ＢｌｕｅＦ３ＧＡ　（ブルーＡ）がそうである。本発明により、約０．２Ｍ　ＮａＣ１、より好ましくは０．５Ｍ　ＮａＣ１またはより好ましくは０．４Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液中で負荷させると、ホホバアシルレダクターゼ活性はそのようなカラムに結合する一方、他のタンパク質の約８５％以上は素通りするかまたはその後の洗浄により除去されることが証明される。更に、約１．ＯＭ　Ｎａ１ｌを含む緩衝液中でのブルームカラムからの溶出によりホホバアシル活性を回収できることが実証される。

アシルレダクターゼ活性は更に、ブルームカラムからの濃縮されたタンパク質調製物を、サイズ排除母材が充填されたカラム（しばしばゲル濾過カラムとも呼ばれる）に適用することにより、更に精製される。このサイズ排除カラムは未変性レダクターゼ酵素のサイズの評価値も提供する。特に、更に精製されたホホバアシルレダクターゼ画分を得るのに、狭域サイズ分別用カラム母材、例えばＵｌｔｒａｇｅｌ　ＡｃＡ３４または５ｅｐｈａｃｒｙｌ　５１００が有用である。特に着目されるのは、１つの主ピーク中に、サイズ排除カラムまたはその同等物に負荷したレダクターゼ活性の約４０〜６０％以上の回収率を得るために使うことができる方法および緩衝液である。

サイズ排除カラムからアフィニティーカラムへのレダクターゼ活性の適用はレダクターゼタンパク質の更なる精製をもたらす。例えば、活性画分を約０．　ＩＭ　ＮａＣ１中でバルミトイルＣｏＡアガロースカラムに適用することができる。

次いで１５ｍＭ　ＮＡＤＰＨ（ホホバからのレダクターゼ酵素の補因子）を有する緩衝液を用いて、レダクターゼ活性のほぼ７０％を溶出せしめることができる。

精製の間に、アシルレダクターゼ活性を含む画分を他の技術、例えば５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびその後の染色、にかけることができる。こうして、レダクターゼ活性を有するそれらの画分中の主要なポリペプチドバンドを同定することができる。

例えば、バルミトイルＣｏＡアガロースカラムから部分精製されたホホバレダクターゼ調製物では、約５３　ｋＤのポリペプチドを表す２本のバンド、より詳しくは５４　ｋＤと５２　ｋＤの見かけ分子量を有するポリペプチドを表す２本のバンドが同定され、これは該調製物中のタンパク質の９５％以上を占める。更に種々のマーカーを使った５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、それらのレダクターゼタンパク質の見かけ分子量がより正確には５４　ｋＤと５６　ｋＤ、または約５５　ｋＤとして定義され得ることを指摘する。

生来のレダクターゼ酵素の見かけのサイズはサイズ排除クロマトグラフィーにより評価すると約４９　ｋＤであるので、それらのバンドは１つのレダクターゼ酵素の２つの異なるサブユニットを表すものではないらしい。むしろ、レダクターゼ活性はそれらのポリペプチドの一方または両方に関係づけられる。アニオン交換、色素カラム、ヘキサノイル−ＣｏＡアフィニティーカラム、ゲル濾過、ヘパリンカラムおよび千オール相互作用クロマトグラフィーを包含する試験により追加の情報を得ることはできなかった。

この精製に使用するホホバ種子はホホバ植物の多様な集団から収集されるので、それらのポリペプチドは同一酵素の密接に関連する変種、すなわちイソ酵素を表すであろう。２つのポリペプチドのトリプシン消化およびアミノ酸配列分析を使って、５４および５２　ｋＤバンドを更に特徴づけることができる。

実質的に精製されたレダクターゼタンパク質の回収は現在様々な方法を使って行うことができる。例えば、ポリアクリルアミドゲルを泳動し、タンパク質を膜支持体、例えばニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）に移行することができる。次いて、同定されたタンパク質を含むそれらの膜の切片を、他のタンパク質を実質的に含まないようにして得ることができる。当業界で既知であり下記の実施例にも記載される技術を使って、膜からタンパク質を回収し、それらのアミノ酸配列を決定するために更に操作することができる。

例えば、全タンパク質からＮ末端アミノ酸領域を配列決定することにより、または化学的臭化シアン消化によってもしくはプロテアーゼを使った酵素的開裂によって所望のタンパク質の断片を調製することにより、アミノ酸配列を決定することができる。使用することができるプロテアーゼの例としては、エンドプロテイナーゼ１ｙｓｃ。

ｇｌｕｃ、　ＡｓｐＮおよびトリプシンが挙げられる。こうして得られた断片を、当業者によく知られた方法に従って、精製しそして配列決定することができる。

５４　ｋＤおよび５２　ｋＤの候補ポリペプチドの更なる特徴づけ、例えば、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）中ての各タンパク質の発現、およびその後のレダクターゼ活性の確認は有用である。他の技術としては、候補タンパク質に特異的な抗体を調製しそしてタンパク質調製物中のレダクターゼ活性を阻害することを証明する免疫学的アッセイを挙げることができる。

更に、アシルレダクターゼ活性に関連づけられたタンパク質について決定されたアミノ酸配列由来の核酸配列を単離し、アシルレダクターゼタンパク質の同一性を確かめ、そして原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞中での該配列の転写および／または該タンパク質の発現に備えることが望ましい。例えば、該タンパク質が原核生物、例えば大腸菌中で高レベルで生産されたならば、細胞膜中への挿入のために破壊性であるかまたは毒性でさえあるかもしれない。従って、弱いプロモーターを使った低レベル発現が望ましいだろう。あるいは、膜挿入の原因となり得るリーダーペプチドが発見されたならば、成熟レダクターゼタンパク質をコードするそれらの核酸配列のみを含む構成物を調製してもよい。こうして、レダクターゼタンパク質を大腸菌細胞中で生産することができる。大腸菌中でレダクターゼ活性が検出されない場合、例えば該タンパク質が膜二重層中に挿入されないかもしれない場合には、大腸菌細胞中のレダクターゼタンパク質の存在は、他の手段により、例えば抗体調製物を使って、確かめることができる。

アシルレダクターゼは膜結合タンパク質であるため、レダクターゼ活性を確かめるために植物細胞中で候補のタンパク質を発現せしめることは望ましいかもしれない。一時的発現のための植物組織のエレクトロポレーションまたは衝撃がこの目的に有用である。最終的には、レダクターゼ酵素により認識される基質を生産する植物、例えばアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）属のメンバー、中でのレダクターゼタンパク質の安定な発現が所望される。こうして、医薬品、化粧品、洗剤、プラスチックおよび潤滑油における用途を有するアシルアルコール生成物を得ることができる。

本発明のレダクターゼ核酸はゲノムまたはｃＤＮＡであることができ、モしてｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーからまたは単離された植物ＤＮＡから直接単離することができる。一度タンパク質が単離されそして／または該タンパク質のアミノ酸配列が得られれば、遺伝子配列の単離方法は当業者に公知である。

例えば、単離されたタンパク質に対して抗体を惹起せしめ、それを使って発現ライブラリーをスクリーニングし、こうして植物アシルレダクターゼタンパク質またはその抗原性断片を生産するクローンを同定することができる。あるいは、アミノ酸配列からオリゴヌクレオチドを合成し、それを核酸配列の単離に利用することができる。オリゴヌクレオチドは核酸断片を製造するＰＣＲにおいて有用であり、次いでｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。別のアプローチでは、オリゴヌクレオチドを使ってノーザンまたはサザンプロットを直接分析し、該オリゴヌクレオチドを使ってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする際の有用なプローブおよびハイブリダイゼーション条件を同定することができる。

本発明のアシルレダクターゼ核酸配列は、ホホバアシルＣｏＡレダクターゼタンパク質に相当するもの、並びにホホバタンパク質配列または核酸配列から得ることができる配列を包含する。［相当する）とは、ホホバアシルレダクターゼタンパク質またはその部分をコードするもの、ホホバ膜中でのレダクターゼの転写または転写と翻訳（発現）を指令する前記コード配列の５′または３′に見つかる調節配列、ｃＤＮＡ中に存在しないイントロン配列、並びに小胞体膜中への挿入に必要とされ得るが成熟のまたはプロセシングされたアシルレダクターゼ酵素中には見つからない前駆体レダクターゼタンパク質のリーダーまたはシグナルペプチドを包含する、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列を意味する。

ホホバ配列またはタンパク質から「得ることができる」配列とは、ホホバアシルレダクターゼアミノ酸配列から合成することができる所望の脂肪酸レダクターゼタンパク質に関係する任意の核酸配列、あるいは、異なる生物において同定されそしてホホバレダクターゼ核酸配列またはホホバレダクターゼタンパク質に対して調製された抗体をプローブとして使って単離された任意の核酸配列を意味する。

こうして、ホホバ配列を使って核酸ハイブリダイゼーションまたは抗原学的方法のいずれかにより所望の生物から単離された別のアシルレダクターゼの配列を、更に別のアシルレダクターゼを単離するのにも同様に使うことができる。ホホバレダクターゼによって単離された種子植物レダクターゼから派生するそのようなレダクターゼも同様に、ここでは「得ることができるＪと見なされる。

核酸配列の単離のために、当業者に公知である技術とプラスミドまたはウィルスベクターを使ってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを調製することができる。

所望の配列についてスクリーニングするのに利用できる有用な核酸ハイブリダイゼーションおよび免疫学的方法は当業者に公知であり、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）に与えられている。

典型的には、核酸プローブの使用から得ることができる配列は、標的配列と着目のアシルレダクターゼ酵素をコードする与えられた配列との間で６０〜７０％の配列同一性を示すだろう。しかしながら、５０〜６０％はどの低い配列同一性を有する長い配列も得ることができる。核酸プローブは核酸配列の長い断片であるか、またはより短いオリゴヌクレオチドプローブであってもよい。長い核酸断片をプローブとして使用する時（約１００　ｂｐより大きい）、プローブとして使用した配列からの２０〜５０％の偏差（即ち５０〜８０％の配列相同性）を有する標的試料から配列を得るために、低い緊縮性でスクリーニングすることができる。オリゴヌクレオチドプローブは、アシルレダクターゼ酵素をコードする完全な核酸配列よりも相当短くてよいが、少なくとも約１０、好ましくは少なくとも約１５、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであるべきである。長い領域に対して短い領域が使われる時、より高度の配列同一性が所望される。よって、アミノ酸配列同一性が高い酵素活性部位を同定し、相同遺伝子を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計することが望ましい。

与えられた配列とのハイブリダイゼーションにより関連遺伝子が単離できるかどうかを決定するために、典型的には放射能を使って該配列を標識して検出を可能にする。他の方法も利用できる。標識したプローブをハイブリダイゼーション溶液に添加し、ノーザンもしくはサザンプロットのいずれかである所望の核酸を含むフィルター（相同性について所望の源をスクリーニングするため）、またはスクリーニングしようとするｃＤＮＡもしくはゲノムクローンを含むフィルターと共にインキュベートする。ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、着目の配列への該プローブのハイブリダイゼーションを最適化するように変更することができる。低い温度と高い塩濃度は、より遠縁の関連配列のハイブリダイゼーションを考慮に入れる（低緊縮性）。低緊縮性条件下でのバックグラウンドハイブリダイゼーションが問題となる場合、特異的にハイブリダイズする配列の検出を改善するために、ハイブリダイゼーションまたは洗浄段階における温度を上げることができ、そして／または塩濃度を下げることができる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度は、Ｂｅ１ｚら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ！ｏｇｙ　（１９８３）胆虹２６６−２８５：ｌにおいて論じられたようにプローブの推定融解温度に基づいて調整することができる。

有用なプローブ並びに適当なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を上記のようにして同定した後、標識した配列および最適条件を使ってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングする。まず、該ライブラリーを固形寒天培地上に塗抹し、ＤＮＡを適当な膜、通常はニトロセルロースまたはナイロンフィルターに上昇移行させる。次いで上記の通りそれらのフィルターを陣識プローブとハイブリダイズせしめ、洗浄し、関連配列を含むクローンを同定する。

免疫学的スクリーニングのためには、精製タンパク質をウサギまたはマウスに注入することによりホホバアシルレダクターゼに対する抗体を調製することができる。そのような抗体調製方法は当業者に公知である。モノクローナルまたはポリクローナル抗体のいずれも生産することができるが、典型的にはポリクローナル抗体が遺伝子の単離に一層有用である。

所望の植物種をスクリーニングするために、ウェスタン分析を行って、ホホバレダクターゼに対する抗体と交差反応する関連タンパク質が所望の植物種の粗抽出物中に存在することを決定づける。これは、膜、通常はニトロセルロース膜上への植物抽出タンパク質の固定化、電気泳動、および抗体とのインキュベーションにより達成される。ニトロセルロースフィルター上の抗体／タンパク質複合体の検出のためには様々な系が利用可能であり、そのようなものとしては、該抗体の放射能標識および第二抗体／酵素接合体系が上げられる。幾つかの利用可能な系は０ｂｅｒｆｅｌｄｅｒ　（Ｆｏｃｕｓ　（１９８９）　ＢＲＬ几ｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｊｅｓ、Ｉｎｃ、　１１：１−５）により記載されている。交差反応性が観察されたら、所望の植物種を表す発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、関連タンパク質をコードする遺伝子を単離する。発現ライブラリーは、Ｍａｎｉａｔｉｓら（前掲）により記載されたようにして、λｇｔｌｌを含む様々な市販のベクター中に作製することができる。

ＤＮＡハイブリダイゼーションまたは免疫スクリーニング技術を使って上記の如く同定したクローンを次いで精製し、ＤＮＡを単離し、既知技術を使って分析する。こうして、クローンが関連のアシルレダクターゼタンパク質をコードすることを確かめる。ホホバレダクターゼを使ったのと同じ方法でそれらのレダクターゼを使って他の種子植物脂肪アシルレダクターゼを得ることができる。

部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲＯ探準技探合技術て本発明のアシルレダクターゼ核酸配列を変更することができ、または合、成核酸配列を製造する際に配列の変更を行うことができることは当業者により認識されるだろう。それらの変更された配列もまた、本発明のアシルレダクターゼ核酸配列と見なされる。例えば、核酸配列が同一アミノ酸配列をコードするようにコドンのゆらぎ部分を変更することができ、あるいは、保存性アミノ酸置換が生じるようにコドンを変更することができる。どちらの場合でも、ペプチドまたはタンパク質は所望の酵素活性を維持しており、従って本発明の一部と見なされる。

本発明のアシルレダクターゼ酵素の核酸配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡから誘導されるＤＮＡまたはＲＮＡ配列であるか、あるいは全部または一部分合成してもよい。遺伝子配列は、例えば、適当な源からゲノムＤＮＡを単離し、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って着目の配列を増幅しクローニングすることにより、クローニングすることができる。あるいは、特に植物優先配列を提供することが望ましい場合、遺伝子配列を完全にまたは一部分合成することができる。所望の構造遺伝子の全部または一部（レダクターゼタンパク質をコードする遺伝子の部分）を、特定の宿主が好むコドンを使って合成することができる。宿主が好むコドンは、例えば、所望の宿主種牛で発現されるタンパク質中で最も頻繁に使われるコドンから、決定することができる。

アシルレダクターゼタンパク質に関係する核酸配列は、多数の用途を見出すだろう。例えば、組換え構成物を調製することができ、この組換え構成物はプローブとして使うことができ、または宿主細胞中でのアシルレダクターゼタンパク質の発現に備えるだろう。意図する用途に依存して、構成物はレダクターゼ全体またはその部分をコードする配列を含むことができる。例えば、該レダクターゼの重要領域、例えば活性部位を同定することができる。所望のレダクターゼ活性に必要なアミノ酸をコードするレダクターゼ配列の部分のみを含む別の構成物を調製することもできる。

アシルレダクターゼタンパク質の好む基質を含む宿主細胞中での発現は、対応する脂肪アシル基質からの脂肪アシルアルコールの生産に備えることができる。レダクターゼタンパク質の発現に有用な系としては、原核細胞、例えば大腸菌、酵母細胞、および植物細胞が挙げられ、維管束植物および非維管束植物の細胞が望ましい宿主である。こうして、レダクターゼタンパク質を生産せしめることができる。加えて、コード配列の部位特異的突然変異誘発を使って、レダクターゼタンパク質の反応性に対する特定の突然変異の影響を調べることができる。

更に、アシルレダクターゼコード配列またはその断片の相補的配列の転写に備えてアンチセンス構成物を調製することができる。こうして、標的宿主生物中で生産されるレダクターゼタンパク質の量を減少させることができる。

本発明のアシルレダクターゼをコードするＤＮＡ配列は、様々な方法で外来ＤＮＡ配列と組み合わせることができる。「外来ＪＤＮＡ配列とは、天然にはレダクターゼに連結して見出されない任意のＤＮＡ配列を意味し、そのようなものとしては、天然には一緒に連結して見つからない同一生物からのＤＮＡ配列の組合せが挙げられる。例えば、本発明のレダクターゼ配列にシグナルペプチドをコードする配列を連結せしめることが望ましい。こうして、脂肪アシル基質、特に脂肪アシルＡＣＰが利用可能である葉緑体に該レダクターゼを差し向けることができる。

本発明のアシルレダクターゼをコードするＤＮＡ配列は、通常該レダクターゼに結合している遺伝子配列の全部または一部と共同して使うことができる。その構成部分において、レダクターゼをコードするＤＮＡ配列が、５′から３′の転写方向で、宿主細胞中で転写および翻訳を促進することができる転写開始調節領域、レダクターゼをコードする核酸配列および転写終結領域を有する組換え構成物中に合体される。

宿主に依存して、調節領域は異なるであろうが、ウィルス、プラスミドまたは染色体遺伝子等からの調節領域を含む。原核または真核微生物、特に単細胞宿主中での発現には、多種多様な構成的または調節性プロモーターを使うことができる。微生物中での発現は植物酵素の準備源を提供することができる。記載されている転写開始領域の中でも、細菌および酵母宿主、例えばＥ、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　）、ダーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、トリプトファンＥ等といった遺伝子由来の領域である。

大部分については、組換え構成物は、アシルレダクターゼの生産に備える植物中で機能的な調節領域を含む。植物レダクターゼまたはその機能的断片をコードする転写解読枠は、転写開始調節領域の５′末端に連結されるだろう。翻訳開始領域が所望されることもあり、翻訳開始領域は該レダクターゼｃＤＮＡ配列の５′ 非コード領域からまたは構成物の転写開始領域と本来連結した翻訳開始領域から提供することができる。一般に、転写および翻訳調節領域の組合せはプロモーターと呼称される。植物中での構造遺伝子の種々様々な構成的または調節性発現、例えば誘導性発現に備える多数のプロモーターが利用可能である。

植物中での構成的遺伝子発現に備えるのに有用であることが知られている配列の中には、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）遺伝子に関連する調節領域、例えばツバリンシンターゼ（Ｎｏｓ）　、マンノピンシンターゼ（Ｍａｓ）またはオクトピンシンターゼ（Ｏｃｓ）遺伝子、並びにウィルス遺伝子の発現をコードする領域、例えばカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓおよび１９ｓ領域がある。本明細書中で使用する「構成的ノなる用語は、必ずしも成る遺伝子が全ての細胞タイプ中で同じレベルで発現されることを指摘するのではなく、ある種の変形がしばしば豊富に見つけられるけれども、その遺伝子が広範囲の細胞タイプ中で発現されることを示す。他の有用な転写開始領域は、ある種の組織中でのまたはある種の増殖条件下での転ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット等からの転写開始領域である。

植物宿主中てのアシルレダクターゼタンパク質の発現が所望される態様では、完全な植物アシルレダクターゼ遺伝子の全部または一部の使用が望ましいことがあり、即ち５′上流非コード領域（プロモーター）、構造遺伝子配列および３′下流非コード領域を使うことができる。異なるプロモーター、例えば着目の植物宿主にとって生来であるプロモーター、または変更されたプロモーター、即ち、ある遺伝子源に由来する転写開始領域と別の遺伝子源に由来する翻訳開始領域を有するもの、または増強されたプロモーター、例えば二重３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーター、が所望される場合、標準技術を使ってそれらの配列を一緒に連結せしめることができる。

５′上流非コード領域が種子成熟の間に調節される別の遺伝子から得られる応用では、植物の肝組織中で卓越的に発現されるもの、例えばＡＣＰまたはナビン由来の転写開始調節領域が所望される。そのような［種子特異的プロモーター」は、１９８８年１月２５日出願の米国特許出願第０７／１４７．７８１号（１９９１年８月８日出願の米国特許出願第０７／７４２．８３４号）、および“Ｎｏｖｅｌ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａ１１ｙ巳ｘｐｒｅｓｓｅｄ　Ｉｎ　Ｅａｒｌｙ　５ｅｅｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｒｅ１ａｔｅｄＴｈｅｒｅｔｏ″という発明の名称を有する１９９０年３月１６日またはその付近に出願の米国特許出願第０７／４９４．７２２号の技術に従って、獲得および使用することができる。それらの同時係属出願は全て参考として本明細書中に組み込まれる。種子組織中で卓越的に発現される転写開始領域は、他の植物部分における遺伝子産物の破壊的または不利な作用を最小にするため、脂肪アルコール生産に望ましいと考えられる。

本発明の組換え構成物中に転写終結調節領域も提供することができる。転写終結領域は、植物アシルレダクターゼをコードするＤＮＡ配列、または別の遺伝子源に由来する便利な転写終結領域、特に転写開始領域と本来関連する転写終結領域により提供することができる。転写終結領域は、典型的には、該終結領域が由来する構造遺伝子の３′側の少なくとも約０．５ｋｂ、好ましくは約１〜３ｋｂの配列を含むだろう。

発現用の着目のＤＮＡ配列として植物アシルレダクターゼを育する植物発現構成物は、様々な植物で、特に非常に長鎖の脂肪アシルＣｏＡ分子（特にナタネの高エルカ酸変異体）を生産する植物、例えばアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａ）で使用することができる。他の着目の植物は、望ましい基質、例えば中鎖または長鎖脂肪アシル分子を生産するものであり、そのようなものとしては、ナタネ（Ｃａｎｏｌａ変種）、ヒマワリ、ベニバナ、綿、サルスベリ（Ｃｕｐｈｅａ）　、大豆、落花生、ココナツおよびアブラヤシ並びにトウモロコシが挙げられるが、それらに限定されない。宿主細胞中にＤＮＡ発現構成物を導入する方法に依存して、他のＤＮＡ配列が要求されることがある。重要なのは、本発明が双子葉類と単子葉類に適用でき、そして新規のおよび／または改良された形質転換および再生技術に容易に適用できるであろうことである。

形質転換の方法は本発明にとって重要ではない。植物形質転換の様々な方法が現在利用可能である。穀物を形質転換させるために一層新規な方法が利用できるので、それらをこの記載に従って直接適用することができる。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）に本来感染しやすい多数の植物種は、アグロバクテリウム媒介形質転換のバイナリ−ベクター法または三分節系交配を介して好結果に形質転換せしめることができる。宿主植物細胞への核酸配列の輸送に備えるのに有用である他の配列は、植物病原性ウィルスまたは植物転置因子から誘導することができる。加えて、様々な単子葉および双子葉植物種の形質転換に備える、マイクロインジェクション、ＤＮＡ粒子衝撃、エレクトロポレーションの技術が開発されている。

組換え構成物を開発する際に、該構成物の種々の成分またはその断片は、通常、細菌宿主、例えばＥ、コリ中で複製することのできる便利なベクター中に挿入されるだろう。文献に記載されている多数のベクターが存在する。各クローニング後、プラスミドを単離し、更なる操作、例えば制限、新規断片の挿入、連結、欠失、挿入、切除等にかけ、所望の配列の成分を組み立てることができる。一端構成物が完成すれば、それを次いで宿主細胞の形質転換の方法に応じた更なる操作のために適当なベクターに挿入することができる。

通常、この組換え構成物中には、宿主中での発現に必要な調節配列を有しそして形質転換細胞の選択に備える構造遺伝子が含まれるだろう。該遺伝子は、細胞障害因子、例えば抗生物質、重金属、毒素等に対する耐性、栄養素要求宿主への原栄養性を提供する補完、ウィルス免疫性、等に備えることができる。同様に、色の変化により同定することができる化合物の生成に備える酵素、例えばＧＵＳ、または発光の生成に備える酵素、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子が有用である。発現構成物が導入される様々な宿主種に依存して、形質転換組織の選択または検出のためｌまたは複数のマーカーを使うことができ、この場合具なる宿主には異なる選択条件が使われる。

植物の形質転換にアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）を使う時、一端または両端がＴ−ＤＮＡに境する核酸配列、特に左および右ボーダー領域、より特別には少なくとも右ボーダー領域を有することが望ましいだろう。それらのボーダー領域は他の形質転換方法を使う時にも有用であることがある。

アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）またはリゾゲネシス（Ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓｉｓ）配列を植物形質転換に用いる場合、宿主中に存在するＴ】−またはＲ１−プラスミド上のＴ−ＤＮＡとの相同組換えのためにアグロバクテリウム宿主中に導入することができるベクターを用いてもよい。組換え用のＴ−ＤＮＡ含有Ｔｉ−またはＲｉ−プラスミドは武装されてもよく（瘤形成を引き起こすことができる）、または武装解除されてもよい（瘤形成を引き起こすことができない）。後者は、植物宿主細胞へのＤＮＡの輸送に必要なトランス作用性因子をコードするｖｉｒ遺伝子の機能的補完が形質転換アグロバクテリウム宿主中に存在している限り許容される。武装されたアグロバクテリウム株を使うと、正常な植物細胞の混合物（そのうちの幾つがか所望の核酸配列を含む）を生じることができ、その植物細胞は腫瘍形成遺伝子の存在のため瘤形成を行うことができる。所望の核酸配列を含むが腫瘍遺伝子を欠いている細胞は、通常の形質転換植物が得られるような混合物から選択することができる。

宿主植物細胞を形質転換するビヒクルとしてアグロバクテリウムを使う好ましい方法では、Ｔ−ＤＮＡボーダー領域により隣接された発現または転写構成物が、Ｅ、コリとアグロバクテリウム中で複製することのできる広範囲宿主用ベクター中に挿入されるだろう。そのような広範囲宿主用ベクターは文献中に記載されている。汎用されるのは、ｐＲＫ２またはその誘導体である。例えば、Ｄｉｔｔａら（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（＋９８０）　７７：７３４７− ７３５１）およびＥＰＡ　Ｏ１２０５１５を参照のこと。これらは参考として本明細書中に組み込まれる。あるいは、植物細胞中で発現させようとする配列を、別々の複製配列（一方はＥ、コリ中で該ベクターを安定化するもので、他方はアグロバクテリウム中で該ベクターを安定化するもの）を含むベクター中に挿入することができる。例えば、ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌ　ｔ（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　（１９９０）貝：２６９−２７６）を参照のこと。前記文献中では、ｐＲｉＨＲＩ　ＣＪｏｕａｎｉｎら、１Ｊｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８５）　２０１：　３７０−３７４）複製開始点が使われ、アグロバクテリウム宿主細胞中での植物発現ベクターの安定性の付加に備えている。

アグロバクテリウム中で複製することができる上述したようなベクターを使うことは好ましい。この方法では、プラスミドの組換えは不要であり、そして宿主アグロバクテリウムのｖｉｒ領域が植物宿主細胞へのＴ−ＤＮＡボーダー配列の輸送に必要なトランス作用性因子を供給することができる。

アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）細胞の形質転換には、例えば、アグロバクテリウム形質転換法を使うことができる。そのような１つの方法はＲａｄｋｅら（Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｔ、　Ｇｅｎｅｔ、　（１９８８）７５：６８５−６９４）により記載されている。

本発明を今まで一般的に記載してきたが、本発明は次の実施例を参照することによって一層容易に理解されるだろう。下記の実施例は例示のためにのみ提供されるのであって、特記しない限り本発明を限定するものではない。

ミクロソーム換調製物または可溶化されたタンパク質調製物中のアシルＣｏＡレダクターゼ活性をアッセイする方法を記載する。

Ａ、　放射能探識物質〔１４Ｃ〕シアン化カリウムを対応するアルキルメシレートと反応させ、次いでアルキルニトリルを遊離脂肪酸に塩基加水分解することにより、長鎖（１−”Ｃ）脂肪酸（比活性５１〜５６　Ｃｉ１モル）、即ち１１−シス−エイコセン酸、　１３−シス−トコセン酸および１５−シス−テトラコセン酸を調製する。エーテル性ジアゾメタンを使ってそれらの脂肪酸をメチルエステルに変換し、調製用硝酸銀薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により精製する。該脂肪酸メチルエステルを加水分解して遊離脂肪酸に戻す。３つのＴＬＣ法により放射化学純度を評価する：順相シリカＴＬＣ１硝酸銀ＴＬＣ１およびＣ１８逆相ＴＬＣ，それらの方法によって測定した放射化学純度は９２〜９８％であった。ＹｏｕｎｇおよびＬｙｎｅｎ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（１９６９）　２４虹３７７）の方法により、対応する長Ｍ　（１−”Ｃ）脂肪酸から１０　Ｃｉ１モルの比活性の長鎖（１−”Ｃ）アシルＣｏＡを調製する。他の（１−”Ｃ）アシルＣｏＡ　、例えばＮ−１４Ｃ〕テトラカセノイルＣｏＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ　（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　［Ｌ）から購入した。（１−１４Ｃ）ヘキサデカナールは、ＰｌｅｔｃｈｅｒおよびＴａｔｅの方法（Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　（１９７８）１６０１−１６０２　）のミクロスケール修飾に従って、（１ −”Ｃ）ヘキサデカン−１−オールのジクロメート酸化により調製する。生成物を調製用シリカＴＬＣにより精製し、そして使用するまで一７０°Ｃでヘキサン溶液として保存する。

■、アッセイＩ：　２０μＭの（１−１４Ｃ）アシルＣｏＡ　（通常はテトラコセノイルＣｏＡ　、比活性２〜５　Ｃｉ１モル）をアッセイ試料および２ｍＭ　ＮＡＤＰＨと共に０．２５ｍ１の容量においてインキュベートすることにより、ミクロソーム膜調製物中のレダクターゼ活性を測定する。

インキュベーション混合物は、更に、１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロール、１ｍＭ　ＤＴＴを含み、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（４−（２−ヒドロキシエチルクー１− ピペラジンエタンスルホン酸）（ここでおよび以後に言及されるＨＥＰＥＳは、ｐＨ７，５に調整された１Ｍ原液から添加される）により緩衝化されている。

アシルＣｏＡ基質の添加によってアッセイを開始し、３０°Ｃで１時間インキュベーションを行う。アッセイ試験管を氷上に置き、即座に０、２５ｍ１のイソプロパツール：酢酸（５：　１．　ｖ／ｖ　）を添加することにより、アッセイを停止する。未標識のワックスエステル（０，１■）およびオレイルアルコール（０，１■）をキャリヤーとして添加する。

ＨａｒａおよびＲａｄｉｎ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７８）　９０：４２０）のスケールダウンプロトコールにより、（”Ｃ）脂質を抽出する。停止させたアッセイ液に６１ｄのへキサン／イソプロパツール（３：　２．　ｖ／ｖ　）を添加する。試料を渦動攪拌し、２−の水性硫酸ナトリウム溶液（５，５％、　Ｗ／Ｖ　）を加え、そして試料を再度渦動攪拌する。

２、アッセイ２：　２０μＭの（１−”Ｃ）アシルＣｏＡ　（通常はテトラコセノイルＣｏＡ　、比活性２〜５　Ｃｉ１モル）をアッセイ試料および２ｍＭ　ＮＡＤＰＨと共に０．２５−の容量においてインキュベートすることにより、ミクロソーム膜調製物中のレダクターゼ活性を測定する。

インキュベーション混合物は、更に、１０％（Ｗ／Ｖ）グリセロール、１ｍ１Ｊ　ＤＴＴを含み、５０ｄ　ＨＥＰＥＳ　（４−Ｃ２−ヒドロキシエチルクー１− ピペラジンエタンスルホン酸）（ここでおよび以後に言及されるＨＥＰＥＳは、ｐＨ７，５に調整された１Ｍ原液から添加される）により緩衝化されている。もし、原調製物中に更に存在するアシルＣｏＡ　：アルコールアシルトランスフエラーゼ活性（これはレダクターゼ反応生成物を消耗する）を阻害することを所望するならば、アッセイ混合物中に０．３％ｗ／ｖ　ＣＨＡＰＳを含める。このＣＨＡＰＳ濃度は、レダクターゼ酵素に対して最小の影響を有するがアシルトランスフェラーゼ反応を完全に阻害し、よってレダクターゼ活性の定量を簡易化する。

アシルＣｏＡ基質の添加によってアッセイを開始し、３０°Ｃで１時間インキュベーションを行う。アッセイ試験管を氷上に置き、即座に０、２５ｍ１のイソプロパツール：酢酸（５：　１．　ｖ／ｖ　）を添加することにより、アッセイを停止する。未標識のワックスエステル（２５μｇ）、オレイルアルコール（５０ μｇ）およびオレイン酸（５０μｇ）をキャリヤーとして添加する。）ＩａｒａおよびＲａｄｉｎ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７８）　９０４２０〕のスケールダウンプロトコールにより、〔１４Ｃ〕脂質を抽出する。停止させたアッセイ液に４−のへキサン／イソプロパツール（３：　２．　ｖ／ｖ　）を添加する。試料を渦動攪拌し、２ｒｎＩの水性硫酸ナトリウム溶液（６，７％、　Ｗ／Ｖ　）を加え、そして試料を再度渦動攪可溶化されたレダクターゼ活性をアッセイするためには、酵素の活性化のための塩の添加を含む幾つかの変更か必要である。可溶化されたレダクターゼアッセイのためのアッセイ用緩衝液は、ミクロソーム膜調製物アッセイについて上記に示した通りであるが、ただし次の変更を伴った。

ａ、０．３〜０．５Ｍの最終濃度になるようにＮａＣ１を添加する。

ｂ、〜１＋ｎＭのＥＤＴＡを含める。そしてＣ，アッセイしようとする酵素試料（薬量的には０４７５％ＣＨＡＰＳを含む）を５０．３％に希釈する（ＣＨＡＰＳのＣＭＣは〜０．５％である）。

Ｄ、　アッセイ生成物の分析ミクロソーム膜調製物レダクターゼアッセイまたは可溶化レダクターゼアッセイのいずれかの生成物を分析するために、２つのプロトコールを開発した。下記に「詳細アッセイ」として記載される１つのプロトコールは、時間がかかるけれどもより高度な定量的結果を与える。「迅速アッセイ」として下記に記載される他方のプロトコールは、レダクターゼ活性の尺度を提供し、迅速であって一層簡便であるが、定量性は低い。

１、　詳細アッセイ：　硫酸ナトリウムの添加および試料の渦動攪拌後、上の有機相を除去し、下の水相を４−のヘキサン／イソプロパツール（７：　２．　ｖ／ｖ　）で洗浄する。有機相をプールし、窒素下で蒸発乾固せしめる。液体残渣を少量のへブタン中に再懸濁し、そしてアリコートを液体シンチレーションカウンティングにより放射能分析する。試料の残りは、凛識種のＴＬＣ分析、またはワックスエステルを開裂させる誘導化に用いることができ、それによって生産される全アルコールの量を与えることができる。

脂質のクラス分析のために、試料をシリカゲルＴＬＣプレートに適用し、該プレートをヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（例えば８０：２０：１または７０：３０：ｌ　Ｖ／Ｖ／Ｖ　）中で展開する。大まかにはワックスエステル（リガーゼが存在する時、ミクロソーム膜調製物アッセイと同様）、遊離脂肪酸、脂肪アルコールおよび起源の極性脂質である脂質クラス間の放射能の分布を、ＡＭＢ［Ｓ放射分析画像処理システム（ＡＭＢ［Ｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｉｎｃ、、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を使って測定する。必要であれば、個々の脂質クラスをＴＬＣプレートから回収し、更なる分析に使うことができる。

ワックスエステルの開裂には、Ｐｉｎａら（ＬｉＰｉｄｓ　（１９８７）　２２：３５８−３６１〕のグリニヤール誘導体化プロトコールに基づくスケールダウンプロトコールを使用する。試料を２００μｇのキャリヤーワックスエステルと共に、テフロン被覆ちスクリューキャップが付いたガラス試験管中で乾燥する。

乾燥ジエチルエーテル（０，４ｍｌ）、酢酸エチル（３μｌ）およびジエチルエーテル中の３Ｍ臭化エチルマグネシウム（０，ＩｒＩＬｌ）を順次添加する。試料を渦動攪拌し、室温で少なくとも２時間放置し、その後、水で飽和されたジエチルエーテルを注意深く添加して過剰の試薬を分解する。ＩＭ　ＨＣＩとへキサンの各２−を添加し、試験管を渦動攪拌する。上の有機相を水で洗浄しく２Ｘ２ｍｌ’）、５０〜１００μｌのエタノールの存在下で蒸発乾固せしめる。

試料を５０〜１００μｌのへキサン中に再懸濁し、ＴＬＣプレートに適用する。

順相および逆相ＴＬＣ系の両方を分析に使った。順相ＴＬＣはシリカＴＬＣプレートを使用し、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（７０：３０＋２　ｖ／ｖ／ｖ）で展開する。逆相系はＣ１８プレートを使い、メタノール中で展開する。

２、迅速分析：　硫酸ナトリウムの添加および試料の渦動攪拌後、既知の割合の有機相を取り出し、液体シンチレーションカウンティングによりカウントする。

この計算値を使って有機相中の全カウントを見積もる。有機相の別の部分を取り出し、窒素下で乾固せしめ、ヘプタン中に再溶解し、そして詳細アッセイについて記載されるようにしてスキャンする。こうして、アルコール中に取り込まれる全ラントの割合が決定される。

実施例２−　ホホバアシルＣｏＡレダクターゼの特徴づけレダクターゼ活性を育するホホバタンパク質調製物を獲得する方法およびこの酵素活性の研究結果が与えられる。

Ａ、　種子形成とアシルＣｏＡレダクターゼ活性プロフィールカリフォルニア用デービスで５種類の植物において二車に渡り胚形成を追跡した。胚の生体重および乾重は、約８０日から約１３０日までかなり一様な速度で増加することが観察された。脂質の抽出は、胚の生体重が約３００■（約８０日）に達すると、脂質重対乾重の比が５０％の最大レベルに達することを明らかにした。

実施例１に記載した通りに、発育中の胚においてアシルＣｏＡレダクターゼ活性を測定した。ホホバ種皮が阻害因子の源であることが決定されたので、種皮を除去した後、胚を液体窒素中で凍結させて一７０℃で貯蔵した。

無細胞ホモジネートまたは膜画分中のいずれかで測定した時のアシルＣｏＡレダクターゼ活性の発育プロフィールは、開花後約１１５８目にピークに達するレダクターゼ活性の大々的誘導を指摘する。従って、酵素学的研究用の胚は、開花後約９０〜１１０日の間、即ちレダクターゼ活性が高くなり、脂質の沈着が最大レベルに達しておらず、そして種皮が容易に除去できる期間に収穫した。レダクターゼ活性の最大増加速度は、開花後８０日〜９０日の間に認められる。従って、ｃＤＮＡライブラリー作製用の胚は、おそら（レダクターゼタンパク質の合成速度が最大になるであろう開花後８０日９０日目に収穫した。

同様に、アシルＣｏＡレダクターゼをコードするｍＲＮＡのレベルはこの時期に最大であると予想されだろう。

Ｂ、　分画研究ホホバ胚試料を分画する初期の試みによって、遠心分離から生じる脂肪層、上清および沈澱画分におけるレダクターゼ活性の変動性分布が得られた。潜在的に活性分布に影響を与える多数の処理、例えば超音波処理、浮上勾配、および抽出緩衝液への種々の剤の添加、を試験した。抽出緩衝液への塩の配合は、１００．０００　Ｘｇで１時間の遠心分離による上溝画分中へのりガーゼ活性の回収を最大に改善させた。抽出緩衝液ハ３Ｍ　ＮａＣｌ　、　０．３Ｍ’ｚ　ａ糖、１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　ＤＴＴ　、並びにプロテアーゼ阻害剤としての１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．７　ｕｇ／ｉのロイペプチン、０．５μｇ／−のペプスタチンおよび１７μｇ／−のフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）から成る。

Ｃ１ミクロソーム膜調製物透析後に１００．０００　Ｘｇで１時間の遠心によりまたは硫酸アンモニウム沈澱により、上記の上清から高レベルのレダクターゼ活性を存する粒子を得ることができる。透析法は実施例３に詳細に記載される。レダクターゼ活性を有するそれらの粒子の更なる分析、例えば密度勾配遠心、ゲル浸透クロマトグラフィー、およびタンパク質／リン脂質分析は、それらの粒子が膜画分を表すことを確立する。この膜調製物は高いシトクロムＣレダクターゼ活性も存し、この活性は小胞体（ＥＲ）　Ｉｔ！のマーカーとして使われる。それらの研究は、レダクターゼタンパク質が膜に関係することを確立する。

硫酸アンモニウム分画には、本質的には実施例３に記載の通りにホホバ胚から１００．０００　Ｘｇ上清を得る。同容量の硫酸アンモニウム溶液（３３，２ｇ／１０（７）をゆっくり上清画分に添加しく攪拌しながら）硫酸アンモニウム濃度を３０％にする。この濃度はレダクターゼ酵素を効果的に沈澱させるであろう濃度である。更に３０分間攪拌した後、該上清を２６．０００　Ｘ　ｇで３０分間遠心し、得られたベレットを、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、　ＩＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１ｍＭ　Ｐ！ｊｓＦから成る溶液を使って最初の上清画分Ｓｌの容量の１７１０において再懸濁する。この懸濁液を１００、０００　Ｘ　ｇで１時間遠心し、得られたベレットを２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ。

１０％グリセロール中に再懸濁する（再び、Ｓｌ容量の１／１０において）。この懸濁液の１００．０００　Ｘ　ｇでの遠心によって洗浄されたミクロソームベレットＰ４が得られ、これをＳｌ容量の１／２ｏの２５ｍＭＨＥＰＥＳ、　１０％グリセロール中に再懸濁して約３〜４■／−のタンパク質濃度を与える。後で使用するために了りコートを一７０°Ｃで凍結する。

載されりＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１１４相分画方法を使って、ホホバレダクターゼが組込み型膜タンパク質であるか、またはＭＨとより弱く結合しているか（一層高親水性のタンパク質）を決定する。この技術は、本質的には、氷上で膜と１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１１４とをインキュベートし、次いで該混合物の温度をそれらの条件下での前記界面活性剤の濁点より高い温度に上昇させることを含む（濁点は非常に大きなミセルが自発的に形成する温度であり、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１１４については〜２０°Ｃである）。遠心分離すると２つの別々の相が観察され、下は界面活性剤に富む相であり上は界面活性剤が少ない相（ここでは水相と呼ばれる）である。組込み型膜タンパク質は、界面活性剤に富む相に優勢的に分配され、一層高親水性のタンパク質は水相中に回収されることが示されている。ホホバ膜調製物をこのＴｒｉｔｏｎ　Ｘ１１４相分画プロトコールにかけると、レダクターゼ活性は界面活性剤に富む相に存在し、水相中には全くレダクターゼ活性が検出されない。これはレダクターゼ酵素が原級込み型タンパク質であることの証拠である。

Ｅ、レダクターゼ酵素の更なる特徴づけ上記のミクロソーム膜調製物をレダクターゼ酵素の更なる特徴づけに使う。レダクターゼ酵素はｐＨ５〜９の範囲に渡り活性であることが示された。特徴づけ実験は細胞質の推定生理学的ＰＨに近似するｐＨ７，５において行った。

■、　塩の効果：　−塩基塩については０．５Ｍの標準濃度を使ってレダクターゼ活性に対するそれらの効果を調べた。二価カチオンまたはアニオンを存する塩は０．１６７Ｍ　（０，５Ｍ−塩基塩と同じイオン強度を与える）で調べた。０．５Ｍ　ＮａＣ１の添加により１５倍までの刺激が観察される。−価と二価の他の塩（例えばＬｉＣ１，ＫＣＩ、　ＭｇＣ１ｚ、　ＣａＣ１ｔおよびＮａ２５Ｏ４）もまた、レダクターゼ活性を刺激することがわかったが、ＮａＣ１刺激と比較すると一般に小さい程度であった。強いカオトロピック塩であるＫＳＣＮおよびＮａ５ＣＮはレダクターゼ活性の刺激を全く与えないかまたは限界的な刺激を与えた。

２、　他のエフェクター：　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）はレダクターゼ活性を刺激することが認められたが必須ではなく、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は幾らかの刺激を与え、その最適濃度は２、５ｍＭであった。低い（０，０２〜０．０７５　■／ｄ’）　ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）濃度において小さい活性刺激が観察されたが、０．２■／−以上のＢＳＡ濃度では活性の阻害が観察された。

アシルＣｏＡレダクターゼがＮＡＤＰＨ特異的活性（Ｐｏｌｌａｒｄら、前掲）であるという初期の観察を確証した。バックグラウンドより上のＮＡＤＨ依存性活性は全く測定されなかった（　ＮＡＤＰＨ依存性活性のく２％）。

また、レダクターゼ反応の水溶性最終生成物であるＣｏＡとＮａＤＰ”は両方とも有意な活性の阻害を与え（ミリモル濃度で）、一方でＮＡＤＨとＮＡＤ　”は活性に対して限界的効果を有した。

３、　基質特異性：　様々な鎖長の脂肪酸の千オニステル、アシルＡＣＰおよびアシルＣｏＡをレダクターゼ酵素の基質として比較した。

テトラコセノイルーＣｏＡ　（２４：　Ｉ　−ＣｏＡ　）基質は高濃度で強い基質阻害を示すので、１０ＭＭの基質濃度で試験を行った。それらのアッセイにおけるＮａＣｌ濃度は０１５Ｍである。基質特異性実験の結果を下表１に与える。

表１：レダクターゼのアシル特異性１２：Ｏ＜０．０１　＜Ｑ、　１５２４：１　１９．９テトラフセノイルーＣｏＡは試験したものの中で最高の基質活性を有したので、これを更なる酵素精製および特徴づけ実験におけるレダクターゼアッセイに使う。着目のバルミトイル−ＣｏＡ　（Ｃ１６：Ｏ−ＣｏＡ　）およびバルミトイル −ＡＣＰ　（Ｃ１６：０−ＡＣＰ　＞を基質として直、接比較した。バルミトイル−ＣｏＡに対する活性はバックグラウンドよりもわずかに上であったけれども、バルミトイル−ＡＣＰに対する活性は高かった。以前に、ステアロイル−ＡＣＰ　（Ｃｌ８：０−ＡＣＰ　）が基質として活性を有することが示されている（Ｐｏｌｌａｒｄら、前掲）。

同じく着目されるのは、バルミトイル−ＣｏＡはレダクターゼ酵素に対する貧弱な基質であると思われるけれども、未標識のバルミトイル−ＣｏＡ　（０〜３０ μＭ）と（１−１４Ｃ）テトラコセノイルーＣｏＡ　（２０ＭＭ）を使って行った競合阻害実験において、テトラコセノイルーＣｏＡに対するレダクターゼ活性の５０％阻害は５μＭバルミトイルーＣｏＡのところで起こったことである。よって、バルミトイル−ＣｏＡはアッセイ条件下では貧弱な基質であるけれども、それは有効な阻害剤である。

４、レダクターゼ阻害剤アッセイ：　レダクターゼタンパク質の他のタイプの幾つかの既知阻害剤を、ホホバアシルＣｏＡレダクターゼ活性に対するそれらの効果について試験した。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素Ａレダクターゼ）の強力な阻害剤であるメビノリンは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼに対する阻害濃度（約１ｎＭのに、）と比較して、比較的高い濃度（１００μＭ）においてのみ効果があった。セルリネンはβ−ケトアシルチオエステルシンターゼに共存結合することが周知であるが、ホホバアシルＣｏＡレダクターゼに対する強力な阻害作用は全（持たない。

スルフヒドリル遮断剤もレダクターゼ活性に対する効果についてスクリーニングした。Ｎ−エチルマレイミドは強力に活性を阻害することが認められたが、ｐ− ヒドロキシメルクリルベンゾエートは幾分阻害効果があり、そしてヨードアセトアミドは全く効果かなかった。この証拠は、アシルＣｏＡレダクターゼが種々のスルフヒドリル遮断試薬に対して相当な選択性を示す必須のスルフヒドリル基を存するという結論を導く。

実施例３−　アシルＣｏＡレダクターゼの精製レダクターゼ活性を有するホホバ膜調製物の単離、レダクターゼ活性の可溶化およびレダクターゼタンパク質の精製に使うことができる方法を記載する。

Ａ、ミクロソーム膜調製物胚の水分（４５〜７０％）を測定することにより評価して、開花後的９０〜１１０８目にホホバ胚を収穫する。外殻と種皮を除去し、液体窒素中で子葉を素早く凍結させ、更なる使用のため一７０″Ｃで貯蔵する。

最初のタンパク質調製のため、凍結した胚を液体窒素温度においてｌｉＲ製の乳鉢と乳棒で擦ることにより粉砕する。典型的な実験では、７０　ｇの胚を処理する。

粉末を胚７０　ｇ当たり溶液２８０　ｒｎｌの割合で次の高塩溶液に添加する＝３１Ｊ　ＮａＣ１，０，３１Ｊシヨ糖、１００ｄ　ＨＥＰＥＳ　、　２ａ＋Ｍ　ＤＴＴ並びにプロテアーゼ阻害剤である１ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡ、０．７μｇ／−のロイペプチン、０．５　μｇ／ｒｎｌのペプスタチンおよび１７Ｍｇ／−のＰＭＳＦｏ　Ｐｏｌｙｔｒｏｎ組織ホモジナイザーを使って約３０秒間前記緩衝液中に粉末胚を分散させることにより、無細胞ホモジネート（ＣＦ）Ｉ）を作製する。このホモジネートを３層のＭｉｒａｃｌｏｔｈ　（ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ、　ＬａＪｏｌｌａ、　ＣＡ）を通して濾過し、濾液を１００．０００　Ｘｇで１時間遠心する。

得られた試料は、ベレット、上清および浮遊脂肪層から成る。脂肪層を除去し、上溝画分を収得し、ＩＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭＤＴＴおよび１ｍＡＪ　ＥＤＴＡから成る溶液に対して一晩透析する（緩衝液の３回の交換を伴う）。透析物を２００．０００　ｘ　ｇで１時間遠心してベレッＮ）Ｐ２を与える。該ベレットを、もとのＣＦＨ容量の約ｌ／２０において２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）　、　１０％　（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．５Ｍ　ＮａＣ１中に再懸濁し、ミクロソーム膜調製物を与える。

実施例１に記載した通りに活性をアッセイする。アシルＣｏＡレダクターゼの回収率は無細胞ホモジネート中のもとの活性の約３０％と評価される。この調製物中のアシルＣｏＡレダクターゼ活性は一７０°Ｃで貯蔵すると安定である。

Ｂ６　レダクターゼタンパク質の可溶化２％（Ｗ／Ｖ）の最終濃度を与えるようにミクロソーム膜調製物に固体のＣＨＡＰＳ　（３−（（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート）を添加する。試料を氷上でゆっくりと振盪させながら約１時間インキュベートし、次いで２５ｍＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）、１０％グリセロール、０．３４Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡで希釈してＣＨＡＰＳ濃度を０．７５％にそしてＮａＣｌ濃度を約０．４Ｍに下げる。次いで該試料を２００，０００　Ｘｇで１時間遠心分離し、上滑を回収し、実施例１に記載の通りにレダクターゼ活性についてアッセイする。典型的には、ミクロソーム膜調製物からのレダクターゼ活性の８５％が上清画分に回収される。可溶化されたレダクターゼ活性は一７０°Ｃで貯蔵すると安定である。

Ｃ１ブルーＡカラムクロマトグラフィー約２５−のベッド容積を有するカラム（１，８Ｘ〜１０ａｎ）を調製し、これにブルーＡ　（Ｃｉｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ　Ｆ３ＧＡ　；　Ａｍ１ｃｏｎ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｗ、Ｒ。

Ｇｒａｃｅ　＆　Ｃｏ、　）を充填し、０．４！Ｊ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａ　Ｃ２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳＣｐＨ７，５）　、２０％（ｗ＃）グリセロール、０．７５％ＣＨＡＰＳ　、　１ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡＩを用いてカラムを平衡化させる。

上記の可溶化されたレダクターゼ調製物をブルーＡカラムに負荷する。

数カラム容積の０．４Ｍ　ＮａＣ１含有緩衝液八を用いてカラムを洗浄し、次いで０．５Ｍ　ＮａＣ１含有緩衝液八で更に洗浄する。レダクターゼ活性の９０％以上がカラムに結合し、他のタンパク質の８５％以上がカラムを素通りする。１．ＯＭ　ＮａＣ１含有緩衝液Ａを用いてカラムからレダクターゼ活性を溶出せしめる。画分を収集し、実施例１に記載の通りにレダクターゼ活性についてアッセイする。レダクターゼ活性を含む両分をプールし、−７０°Ｃで貯蔵する。典型的には、負荷したレダクターゼ活性の３０〜５０％が１．ＯＭ　ＮａＣ１緩衝液での溶出により回収される。

Ｄ、サイズ排除クロマトグラフィーブルーＡカラムからプールした活性画分を、ＹＭ３０膜（ＡｍｉｃｏｎＤｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｗ、Ｒ，Ｇｒａｃｅ）が取り付けられた加圧セル中での限外濾過により、〜ｌＯ倍濃縮する。典型的には、ブルーＡカラムから〜９０ｒｎｌの量で活性を溶出せしめ、それを〜８−に濃縮し、そして次のように２つのセファクリル（ＳｅｐｈａｃｒＹｌ）　Ｓ−１００カラムに適用する。カラム（２，５Ｘ７５ＣＩ１１）に５１００ＨＲ媒体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）を充填し、そして０．５Ｍ　ＮａＣ１含有緩衝液八で平衡化させる。次のタンパク質標準：ウシ血清アルブミン（６６ｋＤ）　、カルボニックアンヒドラーゼ（２９ｋＤ）　、シトクロムＣ（１２，４ｋＤ）およびブルーデキストラン（間隙容積の測定に使う）を使ってサイズ検定する。

濃縮試料の４１ｎＪ！アリコートを各５１００カラムに適用し、約１７０／時間の直線流速において展開する。〜４時間に渡り画分を収集し、各画分中のレダクターゼ活性を実施例１に記載の通り測定する。

負荷した活性の６０％以上が、約４９　ｋＤの見かけ分子量のところで溶出する１つの主ピークにおいて回収される。プールした活性画分の容量は約３０〜３５ −／カラムである。

Ｅ、アフィニティークロマトグラフィーカラム（１，５ｃｍＸ　〜２　ｃｍ）にバルミトイル−ＣｏＡアガロース（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）を充填し、そして緩衝液Ｂ（０，ＩＭ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａ）で平衡化させる。ゲル濾過カラムからプールした活性画分を上記と同様な限外濾過により〜１６倍濃縮する。濃縮した試料中のＮａＣｌレベルを緩衝液Ａでの希釈により０．５Ｍから約０．１Ｍまで下げる。希釈試料をカラムに適用し、次いで数カラム容積の緩衝液Ｂで洗浄する。次いで１５ｍＭ　ＮＡＤＨを含む緩衝液Ｂ　１０−でカラムを洗浄した後、更に緩衝液Ｂで洗浄する。

緩衝液Ｂ中の１５ｍＭＮＡＤＰＨ１５ｍ／をカラムに流すことにより、レダクターゼ活性を溶出させる。典型的には、１つのゲル濾過カラムからの材料を一度にアフィニティーカラム上で処理することができ、そして該カラムに適用した活性の７０％以上がＮＡＤＰＨでの溶出により回収される。活性画分をプールし、レダクターゼ活性、タンパク質濃度およびポリペプチド組成について分析する。タンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ（ＡｎａｌＹ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７６）　７２：２４８−２５４）により記載された色素結合法に基づいて市販のキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ。

ＣＡ）を使って評価される。

Ｆ、　５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析試料のポリペプチド組成は５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｏ，に、（１９７０）Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２２７：　６８０−６８５）により分析する。電気泳動用の試料は、原液からＳＤＳとジチオトレイトールをそれぞれ２％と３０ｍＭの最終濃度になるように添加することによって調製される。

約５０μｌの試料を、１２％分離ゲル（ＮＯＶＥＸ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）を有するアクリルアミドゲルのウェル上に負荷する。Ｂｉｏ−Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから分子量標準を購入した。タンパク質は銀染色により検出する（Ｂｌｕｍら、約５２　ｋＤと約５４ｋＤの見かけ分子量を有する２つの主要なポリペプチドバンドがアフィニティーカラムからの活性試料中に検出され、この２つのポリペプチドバンドを合わせるとこの調製物中のタンパク質の〉９５％を占める。未変性の状態でのレダクターゼ酵素の見かけのサイズは約４９　ｋＤである（上述のようなサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した時）ので、それらのバンドは、１つの酵素の２つの異なるサブユニットというよりもむしろレダクターゼ酵素の関連形態を表すようだ。

Ｇ、　膜へのタンパク質のプロッティング上記レダクターゼポリペプチドを５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、ニトロセルロースまたはＰＶＤＦのいずれか、１ｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）またはＰｒｏＢｌｏｔｔ　（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ：　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）のいずれかの膜へ移行せしめることにより、それらのタンパク質のアミノ酸配列決定用に単離する。タンパク質をその後酵素消化するであろう場合にはニトロセルロースが好ましく、Ｎ−末端配列決定法および臭化シアン消化から生じるペプチドの配列決定にはＰＶＤＦが有用である。

ｌ　ニトロセルロースへのプロッティング：　タンパク質をニトロセルロースに電気プロッティングせしめる時、プロッティング時間は、５〜２０％メタノール中の２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１９２ｍＭグリシンのような緩衝液中で典型的には１〜５時間である。電気プロッティング後、１％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．１％（ｗ／ｖ）　Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｓで２分間膜を染色し、そして２〜３回交換する０、１％（Ｖ／Ｖ）酢酸中で１回交換あたり２分間膜色する。次いでそれらの膜をヒートシールしたプラスチック袋中に一２０°Ｃにて湿潤保存する。時間が許すならば、プロットを凍結せずに、後述されるようなアミノ酸配列の決定用のペプチドを作る消化に即座に使用する。

２、　ＰＶＤＦへのプロッティング、　タンパク質を［ｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ　Ｐ’／ＤＦに電気プロッティングせしめる時、プロッティング時間は、１０％（ｖ／ｖ）メタノール中の１２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ　１５ｍＭグリシンのような緩衝液中で通常は約１〜２時間である。ＰＶＤＦへの電気プロッティング後、５０％（ｖ／ｖ）メタノール／１０％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．１％（ｗ／ｖ）クーマシーブルーで５分間膜を染色し、そして２〜３回交換する５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中で１回交換あたり２分間膜色する。

次いでＰＶＤＦ膜を３０分間風乾し、次いでヒートシールしたプラスチック袋中で一２０°Ｃにて乾燥保存する。ＰＶＤＦ膜、例えばＰｒｏＢｌｏｔｔにプロッティングされたタンパク質は、完全タンパク質のＮ末端配列を決定するのに直接使うことができる。ＰｒｏＢｌｏｔｔにタンパク質を電気プロッティングさせるプロトコールは、実施例４Ａにおいて後述される。

実施例４−　アミノ酸配列の決定この実施例では、アシルＣｏＡレダクターゼ活性に関係づけられる植物タンパク質のアミノ酸配列の決定方法を記載する。

Ａ、タンパク質の臭化シアン開裂およびペプチドの分離Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｉｎｃ、（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗ［）のＰｒｏｂｅ−Ｄｅｓｉｇｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ＳｅｐａｒａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌに記載された方法論を使って、着目のタンパク質において臭化シアン開裂を行う。上述のようにしてレダクターゼタンパク質をＰＶＤＦ膜にプロッティングせしめる。

次いで該プロットからタンパク質バンドを切り取り、７０％（Ｖ／Ｖ）ギ酸中の臭化シアンの溶液に浸し、この溶液中で室温で一晩インキユベートする。

このインキュベーション後、臭化シアン溶液を除去し、プールし、そしてＲｅａｃｔｉ−Ｖａｐ蒸発器（Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　［Ｌ）を使って連続窒素流の下で乾燥する。７０％（Ｖ／Ｖ）イソプロパツール、０．２％（Ｖ／Ｖ）トリフルオロ酢酸、０．１ｍＭリジンおよび０．１ｍＭチオグリコール酸といったペプチド溶出溶媒を使って臭化シアンペプチドの追加の溶出を行い、完全な除去を保証することができる。次いで溶出溶媒を取り出し、乾燥した臭化シアン溶液を含む試験管に添加し、上記と同様に乾燥する。新鮮な溶出溶媒を使って溶出操作を繰り返してもよい。次いで乾燥ペプチドに５０μ！の）ＩＰＬｃ用純水を添加し、５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ（Ｓａｖａｎｔ、　Ｉｎｃ、、　Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、　ＮＹ）中での蒸発により水を除去する。

Ｓｃｈｉｇｇｅｒおよびｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８７）匹６：３６８−３７９〕により記載されたものに類似したＴｒｉｓ／Ｔｒｉｃｉｎｅ　５ＤＳ−ＰＡＧＥ系を使ってペプチドを分離する。１２５〜１５０ボルトの定電圧で約１時間または追跡用色素がゲルの下端から流出し始めるまでゲルを泳動する。移行前にゲルを移行緩衝液（１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　５０ｍＭグリシン、１０％（ｖ／ｖ）メタノール〕中に１５〜３０分間浸す。

ゲルをＰｒｏＢ１ｏｔｔ配列決定用膜（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）に５０ボルトの定電圧で２時間プロッティングせしめる。クーマシーブルー〔５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中０．１％〕で膜を染色し、そして５０％（Ｖ／Ｖ）メタノール／１０％（Ｖ／Ｖ）酢酸中で２分間×３回脱色する。次いで膜を３０〜４５分間風乾した後、−２０″Ｃにて乾燥保存する。

ＰｒｏＢｌｏｔｔ上にブロッティングされたペプチドは、ポリブレンコーティングされたグラスファイバーフィルターを添加せずにそのままタンパク質シークエンサーのシークエンサーカートリッジに導入することができる。わずかに変更された反応サイクルＢＬＯＴ−１（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより供給）を使ってペプチドを配列決定する。また、溶液Ｓ３（ブチルクロリド）をＳｌとＳ２の５０：５０混合物（ｎ−へブタンと酢酸エチル）により置き換える。

ＰｒｏＢｌｏｔｔにブロッティングされた試料を配列決定する時は常にそれらの２つの変更が使われる。

Ｂ、プロテアーゼ消化およびペプチドの分離ニトロセルロースにブロッティングされたタンパク質は、配列決定用のペプチドを得るためにプロテアーゼ消化にかけることができる。使用する方法はＡｅｂｅｒｓｏｌｄら（ＰＮＡＳ　（１９８７）　８４：６９７０　）の方法である。レダクターゼタンパク質のバンドおよび対照として使用する等量のブランクニトロセルロースをニトロセルロース膜から切り取り、ＨＰＬＣ用純水で数回洗浄してＰｏｎｃｅａｕ　Ｓを除去する。この洗浄後、０．５％酢酸中の０．５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ−４０゜Ａｌｄｒｉｃｈ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）　１．０　ｍｌを膜切片に添加し、この混合物を３７°Ｃにて３０分間インキュベートする。ＰＶＰ−４０を完全に除去するために、ニトロセルロース片を多量のＨＰＬＣ用純水で洗浄しく８Ｘ５Ｊ）、２１４　ｎｍでの洗浄液の吸光度を分光光度計でチェックする。また、ＰＶＰ−４０処理と洗浄後までバンドを小切片に切らなければ、ＰＶＰ−４０はより一層容易に除去される。それらの２つの変更はＰＶＰ−４０に関する妨害問題を排除する。

次いで適当な消化緩衝液、例えばトリプシン消化緩衝液の１００ｍＭ炭酸水素ナトリウムｐＨ８，２、またはエンドプロテイナーゼｇｌｕｃ緩衝液の２５ｍＭ炭酸アンモニウム／１ｍＭ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ７，８中に膜切片を懸濁させる。消化混合物にアセトニトリルを５〜１０％（Ｖ／ｖ）の濃度になるように添加する。消化緩衝液中にプロテアーゼを希釈し、そして典型的には１：１０　（ｗ／ｗ）のプロテアーゼ対タンパク質の比において消化混合物に添加する。消化物を１８〜２４時（社）インキュベートする。例えば、トリプシン消化物は３７°Ｃでインキュベートし、そしてエンドプロテイナーゼｇｌｕｃ消化物は室温でインキュベートする。同様に、他のプロテイナーゼ、例えば１ｙｓｃおよびａｓｐＮを使ってレダクターゼタンパク質を消化してもよい。個々の消化緩衝液条件は異なり得るけれども、消化、ペプチドの分離、精製および配列決定のためのプロトコールは、トリプシンおよびｇｌｕｃでの消化について記載されたものと実質的に同じである。

一晩のインキュヘーション後、ｌＯμβの１０％（ｖ／ｖ）　トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または１μ！の＋００％ＴＦＡの添加により消化反応を停止させる。

ニトロセルロース片から消化混合物を取り出し、ニトロセルロース片を１００μ βの消化緩衝液１５〜ｌＯ％アセトニトリルで１〜５回洗浄し、それらを５ｐｅｅｄ−Ｖａｃ中で１００μ１未満の容量に濃縮する。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）　１３０型高性能液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）中に取り付けられたＶｙｄａｃ逆相Ｃ１８カラム（２，１ａｍ　ｘ　１００　ｍｍ）上でペプチドを分離する。ペプチドを溶離せしめるのに使う移動相は次の通りである：緩衝液Ａ：０．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２，２＋緩衝液Ｂニア０％アセトニトリル１０．１ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ２，２゜２時間に渡る１０−５５％緩衝液Ｂ、５分間に渡る５５−７５％緩衝液Ｂおよび１５分間一定の７５％緩衝液Ｂという３段階勾配を５０μｌ／分の流速で使用する。ペプチドを２１４　ｎｍで検出し、手動で収集し、次いて一２０ ″Ｃで保存する。

Ｃ０タンパク質およびペプチドのＮ末端配列分析全ての配列分析は、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７Ａ　Ｐｕ１ｓｅｄ−ＬｉｑｕｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　５ｅｑｕｅｎｃｅｒ上でのエドマン分解によって行う。該シークエンサーにより生じるフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸は、オンライン式Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　１２０Ａ　ＰＴＨＡｎａｌｙｚｅｒにより分析する。データを収集し、Ａｐｐｌｅ　ＭａＣｉｎｔＯ３ｈ用のＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓ−ｔｅｍｓ　６１ＯＡ型デ一タ分析システムを使って集積し、また、ＰＥ　ＮＥＬＳＯＮ。

Ｉｎｃ、　（Ｃｕｐｅｒｆｉｎｏ、　ＣＡ）からのＡＣＣＥＳＳ”　ＣＨＲＯＭソフトウェアを使ってＤｉｇｔａｌ　Ｍｉｃｒｏｖａｘ上に集積する。配列データをチャートレコーダーから記録し、これをＰＴＨアナライザーのインプットに受理し、そして６１０Ａ型ソフトウエアから得られた定量データを使って確かめる。

全ての配列データをデータ分析システムの助けをかりて２人のオペレーターにより独立して読み取る。

ＨＰＬＣのピークオフとして得られたペプチド試料については、予めシークエンサー中で３回の予備サイクルにかけられたポリブレン被覆グラスファイバーフィルター（Ａｐｐｌｌｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ。

ＣＡ）上に試料を載せる。還元・アルキル化されているペプチドについては、各シークエンサーサイクルからのＰＴＨ−アミノ酸生成物の一部を液体シンチレーションカウンター中でカウントする。

Ｉｍｍｏｂ　ｉ　Ｉｏｎ−Ｐに電気ブロッティングされたタンパク質試料については、着目のバンドを切り取り、次いで上述の通り予め予備サイクルにかけられたポリブレン被覆グラスファイバーフィルター上に載せ、そして製造業者の指示に従って反応カートリッジを組み立てる。

ＰｒｏＢＩｏｔｔｏ上に電気ブロッティングされたタンパク質試料については、グラスファイバーフィルターは不要である。

少量の試料（５〜３０ピコモル）からタンパク質配列を得るためには、ＴｅｍｐｓｔおよびＲｉｖｉｅｒｅ　（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９８９）　１８３：　２９０３により記載された４７７Ａ変換サイクルおよび１２ＯＡアナライザーを使う。

Ｄ、レダクターゼペプチドのアミノ酸配列精製されたレダクターゼ調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥに適用し、５４　ｋＤと５６ｋＤタンパク質を分離する。分離した材料をニトロセルロース型の膜（［ｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｎ）に移行せしめ、Ｐｏｎｃｅａｕ　Ｒｅｄで染色してバンドを位置決定する。５６　ｋＤまたは５４　ｋＤタンパク質のいずれかを含むプロットの切り取った部分をトリプシン処理し、トリプシンペプチドを逆相ＨＰＬＣにより分離する。各レダクターゼタンパク質からの数個のペプチドから得られた配列情報を下の表２に与える。

表２　：　５４　ｋＤおよび５６　ｋＤレダクターゼタンパク質のペプチド配列５６　ｋＤレダクターゼペプチド　５６　ｋＤ　レダクターゼペプチド１）　Ａ工ＬＶＴＧＡＴＧＳＬＡＫ　ｌ）　ＡＩＬＶＴＧＡＴＧＳＬＡＫ２）　ＬＱＮＥｘＦＧＫＥＬＦＫ　２）　ＬＧＬＤ工ＮＶＥＫ３）　ＶＴＶＶＰＧＤＩＴＧＥＤＬ　３）　ＴよりＮＶＰＶＹＹＧ４　）　ＬＧＬＤ　工ＮＶＥＫ　４　）　Ｙｌ／ＥＰ　ＶＴＹｘＶＧＳＳＡＡＮ５）　ＴＩＤＭｎＶＹＹＧＫ　５）　ＬＶＤｒＹＫｐ６　）　ＹＶＥＰ　ＶＴＹＨＶＧＳ　ＳＡＡＮＰＭ　６　）　ＥＧ　工ＶＥＡｆｌｌ”Ｙｒ刀　ＬＳＡＬＰＥＭＡＪ（Ｒ７）　ＡＩＮｈａＤＹＦＬ８）　ＬＶＤ工ＹＫ　８）　ＴＨＦＰＧＶｔ／Ｅ３（ＶＬ９）　ＥＧ工ＶＥＡＤｌ’ＦＭＦＤ１０）Ａ工ＮＷＥＤ　ＹＦＬＫＴｘＦＰＧＶＶＥ　ｘＶＬ２つのレダクターゼタンパク質の相同性は上記のペプチド配列から明白である。５４　ｋＤタンパク質からの配列ペプチドは全て、配列決定された５６　ｋＤペプチド中にも見つかる。決定されたアミノ酸配列と５６　ｋＤ　レダクターゼをコードするｃＤＮＡがら推定されたレダクターゼアミノ酸配列（Ｉ］］）との間には１つの食い違いがある。アミノ酸４６０はｃＤＮＡ配列データによればセリンである。５４および５６　ｋＤペプチド６および９からのそれぞれの情報は、この位置がグリシンであることを示す。

４つの異なる制限酵素を使って制限酵素消化したホホバゲノムＤＮＡのサザンブロソト分析は、レダクターゼｃＤＮＡプローブにハイブリダイズする１つの主バンドと１つの副バンドを検出する。

実施例５−　ホホバｃＤＮＡライブラリー開花後８０〜９０日目に収集したホホバ胚から単離したポリ　（Ａ）“ＲＮＡからのホホバ胚ｃＤＮＡライブラリーの作製を記載する。

ＲＮＡを単離する。この方法では、特記しない限り、全ての段階を４°Ｃで行う。］Ｏｇの組織を液体窒素下でワーリングブレングー中で組織が微粉末になるまで粉砕する。液体窒素を蒸発せしめた後、１７０−の抽出緩衝液（２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，０，１６０ｍＭ　ＫＣｌ、　２５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　７０１１１Ｍ　ＭｇＣｌ□、　１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００，０，５％デオキシコール酸ナトリウム。

１ｍＭスペルミジン、　１０ｍＭβ−メルカプトエタノールおよび５００ｍＭショ糖）を添加し、組織を約２分間ホモジナイズする。ホモジネートを無菌ガーゼを通して濾過し、１２．０００Ｘｇで２０分間遠心する。上溝を５００−の無菌フラスコ中にデカンテーションし、そして１／１９容の２０％界面活性剤溶液（２０％Ｂｒ１ｊ　３５．２０％Ｔｗｅｅｎ　４０．２０％Ｎｏ１ｄｅｔＰ−４０ｗ／ｖ）を室温で添加する。溶液を中くらいの速度で４°Ｃで３０分Ｍ攪拌し、次いで上清をＪ２．０００Ｘｇで３０分間遠心する。

上清の約３０−アリコートを無菌のＴ１６０遠心管に分取し、４０ｍＭＴｒｉｓ　ｐＨ９，０，５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　２００ｍＭ　ＫＣｌ、　３０ｎ＋Ｍ　ＭｇＣ１ｚ、　１．８Ｍショ糖および５ｍＭβ−メルカプトエタノールを含む溶液７ｒｎｌで重層する。試験管を抽出緩衝液によって最上部まで満たし、Ｔｉ６０ローター中で４°Ｃにて６０．０００　ｒｐｍで４時間遠心する。遠心分離後、上溝を吸引除去し、０．５−の再懸濁緩衝液（４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ９，０，５ｍＭ　ＥＧＴＡ、　２００ｍＭ　ＫＣＩ。

３０ｍＭ　ＭｇＣｌ□、　５ｍＭβ−メルカプトエタノール）を各試験管に添加する。試験管を氷上に１０分間置き、その後ペレットを徹底的に再懸濁し、プールする。次いてそれを１２０Ｘｇで１０分間遠心して不溶物を除去する。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，６，２００ｍＭ　ＥＤＴＡ、２％Ｎ−ラウリルサルコシネート中の自己消化した１■／ｉのプロテイナーゼに溶液１容量を上清に添加し、混合物を室温で３０分間インキュベートする。

１／１０容の酢酸ナトリウムと２容のエタノールを添加することによりＲＮＡを沈澱せしめる。−２０°Ｃで数時間後、４°Ｃにて１２．０００Ｘｇで３０分間遠心することによりＲＮＡをペレット化する。このペレットを１０ｍ１のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　１ｍ１Ｊ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、同容量のＴｒｉｓ　ｐＨ７，５飽和フエノールで抽出する。４°Ｃにてｉｏ、ｏｏｏｘｇで２０分間遠心することにより相分離し、水相を除去し、有機相を１容のＴＥ緩衝液で再抽出する。次いで水相をプールし、１容のクロロホルムで抽出する。遠心によって再度相分離し、上述の通り水相をエタノール沈澱せしめ、ポリリポソームＲＮＡを得る。

該ＲＮＡを高温緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣ１，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，５，１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．１％５ＤＳ）中でセルロースカラム（Ｓｉｇｍａ−ｃｅｌｌ　５０　）に通すことにより、リポソームＲＮＡ調製中の多糖汚染物を除去する。該汚染物はカラムに結合し、そしてＲＮＡは溶出液中に収集される。溶出液画分をプールし、ＲＮＡをエタノール沈澱させる。沈澱した全ＲＮＡを少量で再懸濁させ、オリゴｄ（Ｔ）−セルロースカラムに適用してポリアデニル化ＲＮＡを単離する。

Ｂ、プラスミドベクター中でのｃＤＮＡライブラリーの作製ポリアデニル化ＲＮＡを使ってプラスミドクローニングベクターｐｃＧＮＩ７０３においてｃＤＮＡライブラリーを作製する。プラスミドベクター　１）ＣＧＮＩ７０３は、市販のクローニングベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ１３−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ　；　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）から誘導され、次のようにして作製される。ＢａｍＨｌでの消化、マングビーンエンドヌクレアーゼでの処理および平滑末端連結によってＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ　Ｍ１３ −のポリリンカーを変更し、ＢａｍＨＩ欠失プラスミドｐｃＧＮ１７００を作製する。ｐｃＧＮ１７００をＥｃｏＲＩ　と５ｓｔｌて消化しく隣接制限部位）、そしてＢａｍＨｌ、　Ｐｓｔｌ、　Ｘｂａ［、Ａｐａ［およびＳｍａ　Ｉ制限部位、ＡＡＴＴの５′突出末端、並びにＴＣＧＡの３′突出末端を有する合成リンカ−とアニーリングさせる。ｐｃＧＮ＋７００への該リンカ−の挿入は、εｃｏＲｒ部位を削除し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ中に見つかる５ｓｔｌ（Ｌばしば“Ｓａｃ　［“とも呼ばれる）部位を再構築し、そして該リンカ−上に含まれる新規制限部位を導入する。生じたプラスミドｐｃＧＮ１７０２をＨｉｎｄｕで消化し、フレノウ酵素で平滑末端にする。直鎖状ＤＮＡをＰｖｕＩ［で部分消化し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて希薄溶液中で連結せしめる。ｌａｃプロモーター領域が削除されている形質転換体を選択しく１）ＣＧＮ１７０３）、それをプラスミドクローニングベクターとして使用する。

簡単に言えば、ｃＤＮＡ合成のためのクローニング方法は次の通りである。プラスミドクローニングベクターをＳｓｔ［で消化し、得られた３′突出粘着末端上にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使ってホモポリマーＴテールを付ける。テールが付けられたプラスミドをオリゴ（ｄＡ）−セルロースクロマトグラフィーにより未消化のプラスミドまたはテールの無いプラスミドから分離する。得られたベクターは、ベクタープラスミドの一方の末端に共有結合的に付けられるｃＤＮＡ第−鎖の合成のためのプライマーとして働く。ｃＤＮＡ　−ｍＲＮＡ−ベクター複合体をデオキシグアノシン三リン酸の存在下でターミナルトランスフェラーゼで処理し、ｃＤＮＡＨの末端にＧ−テールを付ける。

ＢａｍＨ［部位に近接する余分なｃＤＮＡ　−［１１ＲＮＡ複合体をＢａｍＨｌ消化により除去し、一端にＢａｍＨｒ粘着末端を有しそして他端にＧ−テールを有するｃＤＮＡ　−ｍＲＮＡ−ベクター複合体を残す。この複合体を、５　’　ＢａｍＨ［粘着末端、制限酵素Ｎｏｔｌ、　ＥｃｏＲ［および５ｓｔｌの認識配列並びに３’Ｃ−テールを有するアニールした合成環化用リンカ−を使って環化せしめる。連結および修復後、環状複合体を用いて大腸菌ＤＨ５ａ株（ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を形質転換せしめ、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ホホバ［ＥｃＤＮＡバンクは、約５００塩基対の平均ｃＤＮＡ挿入断片サイズを有する約１．５　ＸＩＯ’個のクホホバボリアデニル化Ｉ？ＮＡを用いて、クローニングベクターλＺＡＰ（１／ＥｃｏＲｒ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ）においてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーは、製造業者により提供されたプロトコール、Ｄ？ｉ’Ａおよび菌株を使って作製する。同様に製造業者の指示に従ってＧｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使ってクローンをパッケージングする。

この方法で作製したｃＤＮＡライブラリーは、約４００塩基対の平均ｃＤＮＡ挿入断片サイズを有する約Ｉ　Ｘ　１０’個のクローンを含む。

Ｄ、レダクターゼｃＤＮＡの単離レダクターゼペプチド配列から設計したプライマーを用いるＰＣＲ技術を使って、ｐｃＧＮＩ７０３細菌ベクター中のホホバライブラリーをスクリーニングするためのレダクターゼ核酸配列の約１ｋｂ部分を作製する。

当業界で既知である技術、例えばＭａｎｉａｔｉｓら（前掲）により記載された技術を使って該ライブラリーをスクリーニングする。５６　ｋＤレダクターゼタンパク質のためのクローンｐｃＧＮ７５７１が得られ、そのＤＮＡ配列を決定する。ｐｃＧＮ７５７１の核酸およびアミノ酸配列は図１に与えられる。

ナピン遺伝子からの５′および３′調ｅ領域を使った植物細胞中てのレダクターゼの発現用構成物は次のようにして調製する。

ナビン発現カセットｐＣＧＮ１８０ｇは同時係属米国特許出願第０７１５５０゜８０４号に記載されており、この刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。９ＣＧＮ１８０８を、発現配列のみを移動しそして抗生物質耐性マーカーを移動しないように隣接制限部位を含むように変更し、バイナリ−ベクター、例えばｐｃＧＮ１５５７　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ。

前掲）を与える。Ｋｐｎｌ、　Ｎｏｔ［およびＨｉｎｄ［ＩＩ制限部位を含む合成オリゴヌクレオチドをアニールせしめ、そして唯１つのＨｉｎｄ［Ｉ［部位が再生されるようにｐｃＧＮ１８０８のユニークＨｉｎｄｌｌ［部位のところで連結せしめる。得られたプラスミドｐｃＧＮ３２００は、配列分析により確かめるとナビン３′調節配列の３′末端にユニークＨｉｎｄ［Ｉｌ、　Ｎｏｔ［およびＫｐｎ　［制限部位を含む。

１）ＣＧＮ３２００をＨｉｎｄｌ［［と５ａｃｌで消化し、モしてＨｉｎｄ［目とＳａｃ［で消化されたｐＩｃ１９Ｒ（Ｍａｒｓｈら（１９８４）　Ｇｅｎｅ　３２：　４８１−４８５　）と連結せしめることによりナビン発現カセットの大部分をサブクローニングし、ｐｃＧＮ３２１２を作製する。ナビンプロモーター領域の余分な５′配列を、鋳型としてのＩ）ＣＧＮ３２００、Ｓａｃ　［部位およびナピン５′プロモーターの連結部に隣接する２つのプライマー、並びにｐｃＧＮ１８０８構成物からのＰＣＧＮ３２００のｐＵＣ骨格を使ってＰＣＲにより再構成する。正プライマーはＣ１ａｎ、　Ｈｉｎｄｌ［１，ＮｏｔｌおよびＫｐｎｌ制限部位並びにナビン５′配列のヌクレオチド４０８−４２３　（巳ｃｏＲＶ部位から）を含み、そして逆プライマーは５′プロモーター中のユニークＳａｃ［部位を含むナピン配列７１８−７３９に対する相補体を含む。ＰＣＲは、製造業者の指示に従ってＰｅｒｋｉｎ　Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ熱循環器を使って行った。ＰＣＲ断片を平滑断片として、Ｈｉｎｃ［［で消化したｐＵｃ８　（ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｌｎｇる。ナビン挿入断片を越えるｐｃＧＮ３２１７の配列決定は、ＰＣＲにより不正確なヌクレオチドが全く導入されなかったことを確証する。

ｐｃＧＮ３２１７をＣ１ａＩと５ａｃｌて消化しそしてＣ１ａｌとＳａｃ［で消化されたｐＣＧＮ３２１２と連結せしめることにより、Ｉ）ＣＧＮ３２１７中のナビン５′配列をナピン発現カセットの残部と連結せしめる。得られた発現カセットｐｃＧＮ３２２１をＨｉｎｄｌＩｌて消化し、モしてナピン発現配列をゲル精製し、旧ｎｄｌｌｉで消化されたｐ［ｃ２０Ｈ（Ｍａｒｓｈ、前掲）と連結せしめる。最終発現カセットは、アンピシリン耐性背景中に、ｐｃＧＮ１８０８中に見つかるのと本質的に同一の１．７２５ナビン５′および１．２６５３’調節配列を含むｐＣＧＮ３２２３である。前記調節領域はＨｉｎｄｌｌ［、ＮｏｔｌおよびＫｐｎ　１制限部位により隣接されており、そして５′非フード領域と３ ′非コード領域との間にユニーク５ａｉ１．　Ｂｇｌ［１，Ｐｓｔ［およびＸｈｏ［クローニング部位が置かれている。

レダクターゼｃＤＮＡであるＩ）ＣＧＮ７５７１をＳｐｈ［（塩基＋５９４−１５９９のところの３′非翻訳配列中の部位）で消化し、そしてこの部位にＳａｌ［リンカ−を挿入する。生したプラスミドをＢａｍＨ［と５ａｌＩて消化し、レダクターゼｃＤＮＡを含む断片をゲル精製し、そしてＢｇ　１　［ｒ／Ｘｈｏ　Ｉで消化されたｐＣＧＮ３２２３　（上述のナビン発現カセット）中にクローニングし、ｐＣＧＮ７５８５を得る。

ナビン５′／レダクターゼ／ナビン３′構成物を含むｐＣＧＮ７５８５のＨｉｎｄｌ［Ｉ断片を、Ｈｉｎｄｒ［［で消化されたｐｃＧＮ１５７８　（ＭｃＢｒｉｄｅおよびＳｕｍｍｅｒｆｅｌｔ、前掲）中にクローニングし、植物形質転換用バイナリ−ベクターであるＩ）ＣＧＮ７５８６を得る。　Ｈｏ１ｓｔｅｒｓら（Ｍａｔ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。

Ｂ、　植物の形質転換高エルカ酸の種子、例えば栽培品種レストン（Ｒｅｓｔｏｎ）、およびセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）のカノーラ堅品種の種子を９５％エタノールに２分間浸し、−滴のＴｗｅｅｎ　２０を含む１．０％次亜塩素酸ナトリウム溶液中で約３０分間表面滅菌し、そして無菌蒸留水中で３回すすぐ。次いてピリドキシン（５０μｇ／Ａ’）、ニコチン酸（５０μｇ／β）、グリシジ（２００１１ｇ７Ｇおよび０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒ　（Ｇｉｂｃｏ）　ｐＨ５，８が補足された１／１０濃度のムラシゲ最少有機培地（Ｇｉｂｃｏ；　Ｇｒａｎｄ［５ｌａｎｄ、　ＮＹ）を有するマゲンタ（Ｍａｇｅｎｔａ）箱に播く。２２〜２４℃の細胞培養室中で、約４５〜５５μアインシユタイン／平方メートル／秒（μＥｍ−”　Ｓ−’）の強度の冷蛍赤色光を用いた１６時間の光周期において、種子を発芽させる。

６〜７日齢の実生から胚軸を切り取り、約２〜４−の長さの切片に切断し、そしてフィーダープレートＣＨａｒｓｈら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８５）のイノシトール、１．３■／ｌのチアミン−ＨＣｌ　、２００■のに凰ＰＯ４，３％ショ糖、２．４−Ｄ　Ｃ１，０ｍｇ／Ｉ）　、０．６％（Ｗ／Ｖ）　Ｐｈｙｔａｇａｒを含みそしてオートクレーブ滅菌前にｐＨを５．８に調整した培地（ＭＳ　Ｏ／Ｉ１０培地）の入ったペトリ皿（１００Ｘ２５ｍｍ）に、１，０−のタバコ懸濁培養物を接種することにより使用前日に調製する。ＩＯ−の培養物を＋００　ＷＬｌの新鮮なＭＳ培地〔フィーダープレートについて記載した通りであるが、２．４−Ｄ　（０，２■／β）、キネチン（０，１■／ｌ）を含む〕に移すことにより、タバコ懸濁培養物を毎週継代培養する。支持細胞を使わない実験では、胚軸外植片を切断し、ＭＳＯ／Ｉ１０培地の上の濾紙ディスク上に載せる。全ての胚軸外植片を３０μＥｍ−”　Ｓ−’　〜６５μＥｍ−”　Ｓ−’の強度の連続光の下で、２２〜２４°Ｃにて２４時間フィーダープレート上で予備インキュベートする。

バイナリ−プラスミドを含むＡ、ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）εＨＡ　１０１株の単一コロニーを５−のＭＧルブロスに移し、そこで３０°Ｃにて一晩増殖させる。胚軸外植片をｌＸｌ０”細菌／−に希釈された細菌を含むＭＧルブロス約ｌ〇−中に含浸し、そして約１０分後にフィーダープレート上に置く。ＭＧルブロスはＩｆあたり、５ｇのマンニトール、１ｇのＬ−グルタミン酸または１．１５ｇのグルタミン酸ナトリウム、０．２５ｇのＫＨｚＰＯ４，０，１０ｇのＮａＣ１，０，１０ｇのＭｇ５（Ｌ・７Ｈ２０，１■のビオチン、５ｇのトリプトンおよび２．５ｇの酵母エキスを含み、該ブロスはｐＨ７，０に調整される。アグロバクテリウムとの４８時間の同時インキュベーション後、胚軸外植片を、濾過滅菌したカルベニシリン（５００■／Ｉ！、オートクレーブ滅菌後に添加する）および硫酸カナマイシン（２５■／　Ｉ！　、　ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　：　［ｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮ　）を含むＢ５０／Ｉ１０カルス誘導培地（Ｉｍｇ／Ａ’の２．４−Ｄ、０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒが補足されたＢ５塩およびビタミン）に移す。

約８５μＥｍ”　Ｓ−’の連続光の下で３〜７日培養後、切断面にカルス組織が認められたら、胚軸外植片を苗条誘導培地Ｂ５ＢＺ　（３■／Ｉ！のベンジルアミノプリン、１■／ｌのゼアチン、１％ショ糖、０，６％Ｐｈｙｔａｇａｒが補足されそして５．８にｐＨ調整されたＢ５塩およびビタミン）に移す。この培地はカルベニシリン（５００■／ｊ７）と硫酸カナマイシン（２５■／１）も含む。二週間毎に胚軸外植片を新鮮な苗条誘導培地に継代培養する。

１〜３か月後に胚軸カルスから苗条が再生する。少な（ともｆａｎの高さの緑色苗条をカルスから切り取り、Ｂ５塩およびビタミン、１％ショ糖、カルベニシリン（３００■／１）、硫酸カナマイシン（５０ｍｇ／Ｉりおよび０．６％（ｗ／ｖ）　Ｐｈｙｔａｇａｒを含む培地上に置（。２〜４週間後、緑色のままの苗条をもとから切り取り、そして発根誘導培地（８５塩およびビタミン、１％ショ糖、２■／ｉのインドール酪酸、５０■／ｌの硫酸カナマイシンおよび０．６％Ｐｈｙｔａｇａｒ）の入ったマゲンタ箱に移す。

より記載されたようなアグロバクテリウム媒介形質転換によって得上記の結果は、脂肪アルコールの形成において活性である可溶化された種子植物脂肪アシルレダクターゼタンパク質を得ることができることを証明する。アシルレダクターゼタンパク質を得る方法およびそのアミノ酸配列が提供される。加えて、レダクターゼ核酸配列も提供される。それらの核酸配列を操作して、宿主細胞中での該配列の転写および／またはレダクターゼタンパク質の発現に備えることができる。

レダクターゼタンパク質は様々な用途に利用することができる。

本明細書中に引用された全ての刊行物および特許出願は、個々の刊行物または特許出願があたかも明確に且つ個別的に参考として本明細書に組み込まれると指摘されたかのように、本明細書に参考として組み込まれる。

明確化と理解の目的で本発明を今まで幾分詳細に説明および実施例によって記載してきたが、本発明の技術に照らしてみれば、添付の請求の範囲の精神および範囲から逸脱することなく幾つかの変更および改良を行い得ることは当業者にとって容易に明らかであろう。

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国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．部分精製された種子植物脂肪アシルレダクターゼであって、脂肪アシル基質からの脂肪アルコールの形成において活性である前記レダクターゼ。
２．脂肪アシルＣｏＡ基質に対して活性を有する、請求項１のレダクターゼ。
３．式Ｃ２ｘ（ここでＸは８〜１２から選択される）の炭素鎖を有する脂肪アシル基質に対して活性を有する、請求項１のレダクターゼ。
４．前記レダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である、請求項１のレダクターゼ。
５．ホホバ胚から得ることができる、請求項１のレダクターゼ。
６．約５５ｋＤの分子量を有する前記レダクターゼから本質的に成る、請求項５のレダクターゼ。
７．組換え構成物であって、脂肪アシル基質からの脂肪アルコールの形成において活性である脂肪アシルレダクターゼの少なくとも一部分をコードする核酸配列を含んで成る組換え構成物。
８．前記レダクターゼが脂肪アシルＣｏＡ基質に対して活性を有する、請求項７の組換え構成物。
９．前記レダクターゼが式Ｃ２ｘ（ここでＸは８〜１２から選択される）の炭素鎖を有する脂肪アシル基質に対して活性を有する、請求項７の組換え構成物。
１０．前記レダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である、請求項７の組換え構成物。
１１．前記核酸配列が種子植物から得ることができる、請求項７の組換え構成物。
１２．前記核酸配列がホホバから得ることができる、請求項７の組換え構成物。
１３．宿主細胞中での前記レダクターゼコード配列の少なくとも転写に備える５ ′非コード配列を更に含んで成る、請求項７の組換え構成物。
１４．宿主細胞中での前記レダクターゼコード配列の発現に備える５′非コード配列を更に含んで成る、請求項７の組換え構成物。
１５．前記レダクターゼコード配列が前記５′非コード配列に対してアンチセンス方向にある、請求項１３の組換え構成物。
１６．前記宿主細胞が植物細胞である、請求項１３，１４または１５のいずれか一項の智換え構成物。
１７．請求項７に記載の組換え構成物を含んで成る細胞。
１８．請求項７に記載の組換え構成物を含んで成る植物細胞。
１９．請求項７に記載の組換え構成物を含んで成るアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａ）植物細胞。
２０．種子植物脂肪アシルＣｏＡレダクターゼを含んで成る原核細胞。
２１．宿主細胞中で脂肪アシルレダクターゼを生産する方法であって、脂肪アシル基質からの脂肪アルコールの形成において活性である脂肪アシルレダクターゼをコードする核酸配列を含んで成りそして前記レダクターゼコード配列が前記細胞中で機能的な調節要素の支配下にある組換え構成物を含む宿主細胞を、前記レダクターゼ配列の発現を引き起こすであろう条件下で増殖させる段階を含んで成る方法。
２２．前記宿主細胞が種子植物胚細胞である、請求項２１の方法。
２３．前記宿主細胞がアブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａ）である、請求項２１の方法。
２４．前記核酸配列が種子植物から得ることができるものである、請求項２１の方法。
２５．可溶化された種子植物脂肪アシルレダクターゼであって、脂肪アシル基質からの脂肪アルコールの形成において活性である前記レダクターゼ。
２６．脂肪アシルＣｏＡ基質に対して活性を有する、請求項２５のレダクターゼ。
２７．式Ｃ２ｘ（ここでＸは８〜１２から選択される）の炭素鎖を有する脂肪アシル基質に対して活性を有する、請求項２５のレダクターゼ。
２８．前記レダクターゼがＮＡＤＰＨ依存性である、請求項２５のレダクターゼ。
２９．ホホバ胚から得ることができる、請求項２５のレダクターゼ。
３０．約５５ｋＤの分子量を有する前記レダクターゼから本質的に成る、請求項２９のレダクターゼ。