JPH05506565A - 抗炭水化物抗体および炭水化物抗原を使用する後天性免疫不全症候群（ａｉｄｓ）およびａｉｄｓ関連症候群（ａｒｃ）の処置のための薬剤および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗炭水化物抗体および炭水化物抗原を使用する後天性免疫不全症候群（ＡｌＤｓ ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）の処置のための薬剤および方法 発明の分野 本発明は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲ Ｃ）の処置および特に抗炭水化物抗体を使用してＡＩＤＳおよびＡＲＣの処置の ための薬剤に関する。

発明の背景 ウィルス性感染に関する宿主細胞での変異糖鎖形成かを報告されている。（レイ 等、（１９７８年）、パイロロジー、第８８巻、１１８頁；クマラサミー等、（ １９８５年）、アチーブ・オブ・バイオケミ支トリー・アンド・バイオフィジッ クス、第２３６巻、５９３頁）。腫瘍遺伝子と同様に、サイトメガロウィルスま たはＨＩＶにより誘発される変態糖鎖形成は、本来の宿主細胞に存在しない新規 抗原の産生をもたらす（アンドリュー等、（１９８９年）、ジャーナル・オブ・ イクスペリメンタル・メディスン、第１６９巻、１３４７頁、アダチ等、（１９ ８８年）、ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディスン、第１６７巻、 ３２３頁）。オリゴ糖エピトープを同定するモノクローナル抗体を使用して、感 染後ＬｅＹおよびＬｅ”抗原の出現を検出した。

種々の研究は、インビトロでのＨＩＶ感染の炭水化物部分の関与を示した。すな わち、感染した細胞でのゴルジ糖鎖形成における初期段階の阻害は産生ウィルス の感染性を減少する。（グラター等、（１９８７年）、ネイチャー、第３３０巻 、７４頁；モンテフィオリ等、（１９８８年）　、ＰＮＡＳ、第８５巻、９２４ ８頁）。更に、恐らく感染細胞のｇｐ　１２０−グリカンとの特異的な相互作用 により、レクチンはシンシチウム産生を阻止し、また無細胞ウィルスの感染性を 中和する。（リフロン等、（１９８６年）、ジャーナル・オブ・イクスペリメン タル・メディスン、第１６４巻、２１０１頁）。しかしながら、標的Ｔ４細胞の Ｎ−糖鎖形成での変異がＨＩＶ感染に影響を及ぼすとは思えない（モンテフィオ リ等、（１９８８年）、上掲）。

Ｇｐ１２０は種々のグ；ノカン構造を含み、炭水化物はｇｐ１２０の総量の５０ ％を構成する（マンユーズ等、（１９８７年）、ＰＮＡＳ、第８４巻、５４２４ 頁）。Ｎ−結合グリカンが主にｇｐ１２０上で発見された。（クザラキー等、（ １９８９年）、ジャーナル・オブ・アクワイアード・イムノ・デフィシエンシー ・シンドロームズ、第２巻、１６３頁）。Ｔ４受容体のためのｇｌ）１２０上の 結合部位が分子の非直線状Ｃ末端部分に位置すると思われる（ラスキイー等、（ １９８７年）、セル、第５０巻、９７５頁）。グリカンがウィルス結合に直接的 に関与しているかどうかは明白でない。すなわち、抗体を中和する場合に見られ るように、阻害レクチンは結合部位に隣接したグリカンに結合し、Ｔ４−ｇｐ１ ２０結合を立体的に妨害しているかもしれない（バラライ等、（１９８８年）、 エイズ、第２巻、１６５〜１６９頁；リンスレイ等、（１９８８年）、ジャーナ ル・オブ・パイロロジー、第６２巻、３６９５頁）。レクチンの研究によりｇｐ １２０に対してこれまで確認されたグリカンは、遍在しており、レクチンに基づ く処置の治療的可能性が小さいと思われる。

本出願の優先権主張日後に刊行された記事において、ハンセン等、（１９９０年 ）、ジャーナル・オブ・パイロロノー、第６４巻、２８３３頁は、３種の炭水化 物エピトープ（Ａ　１、Ｌｅ’およびシアロシル−Ｔｎ）がＨＩＶ感染後にＴリ ンパ系細胞上で優先的または独占的に発現すると記載している。単純ムチン型構 造シアロシル−Ｔｎおよびその関連ＴｎおよびＴ抗原は、一般に正常成人細胞の 細胞表面に発現しない。癌細胞がこれらの抗原を発現し、免疫系に感作するため に、これらの抗原に対する体液性免疫反応が癌患者に見られル（スブリンガー等 、（１９７９年）　、Ｐｒｏｇ、Ａｌ　ｌｅｒｇｙ１第２６巻、４２頁）。ハン セン等（１９９０年）、上掲、はＴｎおよびＴに対する抗体はＨＩＶ上のこれら の抗原の存在を示さなかったことを開示している。これは、インビトロでの免疫 −中和アッセイの結果であり、使用されるモノクローナル抗体の特異性質に依存 する。

エイズは、その病因がＨＩＶと称される新種のリンパ栄養のレトロウィルスの感 染に関連するものであると確認された紛れもなく新しい疾患として知られている 。この疾患は欠陥細胞媒介性免疫および絶対的リンパ球減少症、特に減少ヘルパ ーニリン３球（Ｔ４またＣＤ４）に関連する陳害により特徴付けられる。これは ＨＩＶがＣＤ４母集団に優先的に感染するという事実のためである。指摘される 臨床的特徴およびヘルパーＴリンパ球減少症候群の複合により通常明示される前 症候群であるＡＲＣは、エイズより先行し得るものである。

ＨＩＶでの感染の診断は通常ＨＩＶに対して作られた抗体を検出することに基づ いて行う。確かな抗体プロフィルは疾患の程度で変化し得る（ガロ等、（１９８ ６年）、Ｐｒｏｇ、Ａｌ　ｌｅｒｇｙ、第３７巻、１頁）。

それを特徴づけるためになされた顕著な進歩にもかがゎらず、エイズおよびＡＲ Ｃの処置および予防方法は未だほとんど開発されていない。それらの処置および 予防のより優れた方法を開発することは大いに必要である。

発明の概要 新規の抗体は抗−Ｔｎ抗体である。この型のモノクローナル抗体は、使用された ウィルスまたは標的細胞への結合のいずれかにより、インビトロでＨＩＶ感染お よびシンシチウム形成を阻害し得る。従って、それはウィルス関連のウィルス性 糖質タンパク質およびグリコスフィンゴリピドとして発現する炭水化物を同定す るために使用され得、それによって免疫治療および／またはワクチン開発に有効 であることが期待される標的としてのウィルス被膜のグリカンを同定するのに使 用し得る。

新規の抗体はエイズまたはＡＲＣの進行の阻害または遅滞に使用され得る。この 目的のための薬剤は、抗−Ｔｎからなる抗体の１種またはそれ以上の抗体の薬学 的効果量および薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を含む。

もう一つの態様において、本発明は、１種またはそれ以上のＴｎ抗原の免疫学的 有効量、および薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を含むエイズおよ びＡＲＣに対するワクチンを提供する。

エイズおよびＡＲＣに対して活発に免疫化する方法は、Ｔｎ抗原の１種またはそ れ以上の免疫学的有効量および薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を 含む薬剤を対象物に投与することを含む。

発明の詳細な説明 炭水化物構造は標的細胞への病原体の初期付着に含まれる。本発明の開発中、抗 炭水化物モノクローナル抗体のパネルについて、使用されたウィルスまたは標的 細胞へのいずれかの結合により、インビトロでのＨＩＶ感染阻害能力を試験した 。炭水化物抗原に対するモノクローナル抗体はウィルスによる感染を阻止し得、 シンシチウム形成も阻害し得た。ウィルス感染の阻害は、ウィルス株（ＨＴＬＶ 目、Ｂおよび患者分離物ＳＳ　ｌ−００２）　、ウィルス増殖に使用された細胞 株（Ｈ９およびＭＴ４）または感染の標的として使用された細胞型（リンパ球ま たは単核球）に影響されない。モノクローナル抗体をウィルスとともにブレイン キュベートしたときだけでなく、細胞を感染以前にブレインキュベートしたとき 、阻害が観察された。すなわち、モノクローナル抗体はウィルス性情タンパク質 として発現した炭水化物構造を認識すると思われ、ウイルスニンベロープのグル カンは免疫治療および／またはワクチンの開発のために有効な標的であることが 期待される。

抗−Ｔｎ抗体は以下の構造を有するＴｎ炭水化物抗原に特異的である。

Ｇａ　１ＮＡｃαｌ−０−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ抗−Ｔｎ　ＭＡｂは以下の構造を有す るシアロシル−Ｔｎ炭水化物抗原と交差反応し得る。

ＮｅｕＡｃａ２−６Ｇａ　ＩＮＡｃａｌ−０−３ｅｒ／Ｔｈｒ抗原に対するの適 当な抗−Ｔｎ抗体のアイソタイプおよび親和性は、ある抗体と別の抗体では非常 に変化し、すなわち、Ｔｎ対する特異性は、これらの抗体の性質を厳密に区別化 するものである。

好ましいマウスモノクローナル抗体の例は、１９９０年、１１月１４日付でＰＨ ＬＳ・センター・フォー・アプライド・マイクロバイオロシー・アンド・リサー チ、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー、ポート ンダウン、ソールズベリー、ウイルトンヤー、イングランドに寄託された新規ハ イブリドーマＫＴＨ１、ＫＴＨ２およびＫＴＨ３により製造された抗体を含む。

各々３種の寄託されたハイブリドーマの受託番号９０１１１４０１．９０１１１ ４０２．９０１１１４０３である。しかしながら、モノクローナル抗体ＫＴＨ１ 、ＫＴＨ２およびＫＴＨ３の識別的性質を有する他のモノクローナル抗体を使用 し得る。

炭水化物抗原Ｔｎへの特異的結合に加えて、モノクローナル抗体ＫＴＨ１、ＫＴ Ｈ２およびＫＴＨ３の別の識別的性質は、各々ＩｇＧ１、ＩｇＭおよびＩｇＭで あるそれらのアイソタイプである。

炭水化物抗原Ｔｎに対するポリクローナル抗体は公知の方法で製造し得る。

Ｔｎ抗原に対する抗体を得るのに使用される免疫原は、多くのムチン型糖タンパ ク質のコア構造である。「ムチン型糖タンパク質」とは、この明細書で用いる場 合は、セリン残基またはトレオニン残基に高度の〇−結合糖鎖形成を有する高分 子量タンパク質を意味する。ムチン型糖タンパク質はＳ−８依存績合によりさら に重合され、上皮性の分泌物の主要成分である。「ムチン型糖タンパク質のコア 構造」とは、この明細書で用いる場合は、周辺置換のない基本炭水化物構造を意 味し、これはムチン型糖タンパク質のタンパク質部分に直接的に連結する。本発 明において、糖タンパク質が高分子量（相対分子量〉１０６ダルトン）を有する 限り、ムチン型糖タンパク質のＴｎコア構造を免疫原として使用することができ 、ムチンと同じ程度に糖鎖形成される、即ち総量の５０％以上が糖鎖形成される 。

Ｔｎ抗原を含む動物ムチンも免疫原として使用し得る。

Ｔｎ抗原免疫原は、Ｔｎ抗原コア構造を露出させるムチン型糖タンパク質の酵素 的または化学的修飾により、またはムチン上にＴｎコア構造を有するムチンの分 離により得ることができる。これらのムチンは数種の動物に存在する。Ｔｎ抗原 免疫原を常用方法により分離し、精製し得る。

例として、シアリルーＴｎコア構造を製造するために酵素的または化学的修飾さ れるムチン型糖タンパク質をセファロース４Ｂまたはセファクリル２００５を通 してゲル＃過により分離し得る。ついで、分離された糖タンパク質を下記の方法 により、酵素的または化学的に修飾し、Ｔｎコア構造を露出させ、Ｔｎコア構造 を免疫原として使用するために精製する。

精製のために、修飾されたムチンをゲル濾過により、例えばセファロース４Ｂま たはセファクリル２００を通して分離し得る。合成分子濾過膜カラム上での高圧 クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフィー　ファルマシア）は酵素的ま たは化学的に修飾されたムチンの分離にもまた有効である。しかしながら、モノ クローナル抗体を製造するための免疫原として、修飾されたムチンを精製する必 要はない。未修飾ムチンの少量の存在は、本発明の目的のために免疫原としての 使用には有害でない。更に、もし適当な常用の予防措置をとるなら、修飾は常に 定量的である。

動物種に由来し、シアリル−Ｔｎコア構造形態で既に糖タンパク質を含むムチン は常用法、たとえば上記のようにセファロース４Ｂ、セファクリル２００または ＦＰＣＬを通してゲル濾過により得られる。

種々のムチン型糖タンパク質のＴｎ構造を露出させるのに使用し得る酵素的修飾 の型の実施例は、特異的シアリダーゼによるＧａ１ＮＡｃ付着した末端位のα２ −３シアリル残基およびα２−６シアリル残基の除去またはクロストリジウム・ ベルフリンゲヌスシアリダーゼによる全シアル酸の全除去を含む。酵素的修飾は β−ガラクトシダーゼ（好ましくはカロニア・ラムパスから）、α−フコシダー ゼおよびＮ−アセチルへキソサミニダーゼによる処理をも含む。

ムチン糖タンパク質の酵素的加水分解は、ヒロハシ等、（１９８５年）　、ＰＮ ＡＳ、第８２巻、７０３９〜７０４３頁、およびケルドセン等、（１９８８年） 、キャンサー・リサーチ、第４８巻、２２１４頁に開示されている。

ムチン型糖タンパク質のＴｎコア構造を露出させるのに使用し得る化学的反応の 実施例は、過ヨウ素酸酸化、ついで水素化ホウ素ナトリウムによる還元および弱 酸での処理を含む。その製造をスミス分解（スビリオ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌ、　（１９７２年）、第２８巻、３〜４３頁）と呼ぶ。この化学的処理 は、上記のようにンアリダーゼ処理により除去され得るシアル酸を除いて、炭水 化物残基の非還元末端を除去する。

免疫原として使用され得る動物から分離されるムチンの例は、炭水化物鎖の９０ ％がＴｎ抗原であるヒツジ下顎ムチンおよび炭水化物鎖５０％がＴｎ抗原であり 、炭水化物鎖の２０％がＴ抗原および他の未同定の残基を含むウシ下顎ムチン（ ＢＳＭ）を含む。Ｔｎ抗原をンアリダーゼを使用してシアロシル残渣の除去によ りシアロシルＴｎムチンから製造する。

この動物起源のムチンを、上記のように常用ゲル濾過またはＦＰＬＣのような同 様の方法により免疫原として使用するために精製し得る。しかしながら、免疫原 の精製はモノクローナル抗体の製造には必須ではない。

ヒト赤血球グリコフォリンを、マーチエン−およびアンドリュー、サイエンス（ １９７１年）、第１７４巻、１２４７〜１２４８頁により初めて開示された方法 によりヒト赤血球膜から得る。

Ｔｎコア構造を有する糖タンパク質かどうかはヘリックスポマチア力ラムを用い てアフィニティークロマトグラフにより（カーターおよびシャロン、（１９７７ 年）、アシーブズ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス、 第１８０巻、５７０〜５８２頁）、または抗Ｔｎ抗体を有する糖質タンパク質（ ケミバイト、エドモンド、アルバータ、カナダ）のイムノブロッティングにより 同定され得る。

抗原の分布はかなり制限される。しかしながら、本発明に有用であるＴｎ抗原の 出所の一つは、偏平肺癌細胞株ＱＧ５６およびＬＵ−６５の培養上清である（ヒ ロハシ等、（１９８５年）、上掲、およびタカハシ等、（１９８８年）、キャン サー・リサーチ、第４８巻、４３６１頁）。

第２の出所は、再度、化学的または酵素的にＴｎに変換され得る高密度のシアリ ル−Ｔｎを含む、ヒツジ下顎ムチンである。

第３の起源は、生合成的に製造されたＴｎ−タンパク質である。

セリンおよび／またはトレオニンアミノ酸残基を含む、合成ペプチドまたは組換 えタンパク質は天然起源のグリコリルトランスフエラーゼ（ＵＤ　Ｐ−Ｇ　ａ　 ｌ　ＮＡ　ｃ　セリン／トレオニン−ペプチド−Ｎ−アセチルガラクトサミニル トランスフェラーゼ）を用いてインビトロで糖鎖形成され得る：エルハマー等、 （１９８２年）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー参照。

第４の出所は化学的に合成されたＧａ１Ｎａｃαｌ−０−ＳｅｒまたはＧａ　ｌ ＮＡｃ　ａｌ−０−Ｔｈｒ　（スウェーデン、バイオカーブ社市販品）である。

本発明の目的のために免疫原として有用な形態中Ｔｎ抗原を得るために、培地上 清から、上記の種々の細胞株を公知の方法により培養する。ついで培地上清を処 理し、以下のようにシアリルＴｎ抗原を得る。

例えば、処理は以下のようである。懸濁中で培養された細胞から培養終了培地を 凍結乾燥し、元の容積の１１５０に容積を減少させる。濃縮培養終了培地を４℃ で０．０１％アジ化ナトリウムを含む、リン酸緩衝塩類溶液に対して大量に透析 する。透析された物質をセファロース４Ｂに入れ、ゲル濾過する。空隙容量を溜 め、更に濃縮し、セファクリル２００上で再びクロマトグラフにかける。空隙容 量中の糖質ンパク質画分を免疫原として使用する。全工程は、シアリル結合が不 安定であるために、制限時間内に低温度（４℃）で終了しなければならない。

ついで免疫原を免疫化のために処理し得る。例えば、Ｔｎ抗原（例えば、４．０ 　ｇ）を蒸留水（例えば、４ｍ１）に溶解し、酸で処理されたサルモネラミネソ タの適当量（例えば、１６ｍｇ）と十分混合し、凍結乾燥する。乾燥混合物を適 当な担体（例えば、２０ｍＭリン酸緩衝液を含む１４０ｍＭＮａＣ１、ｐＨ７， ０）の適当な容量（例えば、４．０ｍ１）中に懸濁し、ムチン約１００μｇおよ び細菌４００μｇ部を静脈内注射する。

免疫化は、細菌へ吸収の代わりにフロイント完全アジュバントで行うこともでき る。ムチンとサルモネラミネソタ間の量の比を変え得る。最良の結果はサルモネ ラミネソタを、ヤング等、（１９７９年）、ジャーナル・オブ・エクスベリメン タル・メディスン、第１５０巻、１００８〜１０１９頁、による前記と同様に酢 酸で処理したときに観察された。

免疫化のために使用される宿主細胞は、その牌細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）が ハイブリドーマ製造に適している、すなわち、ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞株と 細胞融合し、安定なハイブリドーマの確立が可能である動物のいかなる系統また はいかなるの種類のマウスまたはラットであってもよい。

免疫化の計画は、ムチン免疫化に対する宿主動物の感受性に依存するが、上記の プロトコールはマウスに適切である。別の条件もまた適用し得る。適当な免疫化 計画は当技術の熟練者により決定され得る。

例えば、Ｂａ１ｂ／ｃマウスの適当な免疫化計画は、５週間週に１度、尾静脈に 免疫原製剤を静脈注射し、ついで、１力月中止後、免疫原製剤で促進させる。

宿主に投与される免疫原製剤の量はムチンの分子量、炭水化物エピトープの露出 量およびムチン型糖タンパク質に関連するエピトープの新規性および密度に依存 する。マウスに注射される糖タンパク質の範囲は、生理食塩水１００μｍ中にコ ートされた３〜５μｇであり、体重が１００〜１５０ｇである個々のマウスに静 脈注射する。

フロイント完全アジュバントを使用するとき、生理食塩水５００μｍ中糖タンパ ク質約２０μｍをフロイント完全アジュバント５００μｌで乳状にし、約２００ μｌを多部位に皮下注射する（約５０μｍ／部位）。

サルモネラミネソタでコートされたまたはフロイント完全アジュバントで混合し た抗原の同量をラット、ハムスター、またはモルモットのような宿主に使用する 。数倍量をウサギのような宿主に使用する。動物の体重に比例して抗原の量を増 加することを必要としない。

十分量の抗体が全血清に検知され得るまで免疫化を繰り返す。宿主の膵臓細胞を 除去し、牌細胞を良く確立された技術によりＨＡＴ感受性ミエローマ細胞と融合 する（コーラ−およびミルスタイン、（１９Ｌ５年）、ネイチャー、ｉｊｆ！２ ５６巻、４９５〜４９７頁、およびヤング等、（１９７９年）、上掲）。

ＨＡＴ感受性ミエローマ細胞はＮ５−１．５Ｐ−１、または（好ましくは）ＳＰ −２であって良く、例えば、しかしＨＡＴ感受性ミエローマ細胞のいずれの型も 使用し得る。時折、抗体が宿主血清中に検知されなかったとしても、バイブリド ーマミニコーマ細胞と宿主胛細胞の融合後に確立され得る。したがって、細胞融 合以前に抗体を検知することは必須でない。通常、ヤング等、（１９７９年）、 上掲に記載されたように、融合はポリエチレングリコール中で行われる。

融合細胞をミニクローンが形成するまで９６ウエルプレートで培養する。最後の ブースター注射後４８〜７２時間のスプレノサイトを使用すること、および良（ 増殖しているミエローマ細胞と融合すること、増殖する多数の生存融合細胞を得 ることが重要である。インキュベーター中の温度およびＣ○２濃度を融合細胞を 培養の初期段階で注意深く制御しなければならない。

当技術の熟練者は培養条件を容易に決定し得る。フィーダー細胞は本発明の過程 に記載の融合細胞を増殖させるために必要でない。

適当な培養期間の後、免疫化に使用されたシアリル−Ｔｎ抗原と反応する抗体を 分泌するハイブリドーマを限界希釈により、すなわち、１細胞／新規の培地光た り細胞１個以上になる点まで希釈することによりクローン化およびサブクローン 化し、ついでウェル中ヘブレーティングする。

一般に、９６ウエルプレートの各ウェルは、ＰＢＳ中、糖タンパク質溶液で各ウ ェルのインキュベーションにより、免疫原として使用されるＴｎコア構造を含む ムチン糖タンパク質でコートする。例えば、０．１〜１０ｕｇ／ｍｌ溶液１００ μｌを加えて、−夜インキユベートする。糖タンパク質溶液を除去し、洗浄し、 さらに５％ウシ血清アルブミンとインキュベートし、抗体をスクリーニングする ために使用する前にプレートを不活化する。この方法は、ヒロハン等、（１９８ ５年）、玉揚に開示されている。

特定の抗原と反応する抗体を分泌するハイブリドーマを以下のようにスクリーニ ングする。抗原−被覆ウェルに結合する抗体を、通常、最初にヤング等、（１９ ７９年）、玉揚に開示された＋２５ｉ−ラベルプロティンＡによる第２の抗体（ 抗−マウスＩｇＭおよびＩｇＧヤギまたはウサギ抗体）により検出する。この方 法は、使用し得るＥＬＩＳＡ検定法より感受性がよいが、ＥＬＩＳＡ検定法も使 用し得る。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ検定法は自動読み取り機および市販のＥＬＩＳＡキッ トの使用により簡便に行い得る。

このようにして分離されたハイブリドーマにより分泌されるＴｎ抗原に対するモ ノクローナル抗体を、ハイブリドーマ細胞培養の大量バッチを増殖させ、上清か らの抗体の精製または腹水液の製造を刺激するバイブリーマ株をマウスに注射す ることにより多量に製造し得る。両者の方法は当技術において公知である。

本発明のモノクローナル抗体を多量に製造する方法はヤング等、（１９７９年） 、玉揚に開示されている。

本発明の分離されたハイブリドーマを懸濁培地中、または細胞を圧縮し、高密度 で増殖させるグラスファイバーコンテナー中でより簡便に大量バッチで増殖させ る。抗体は培養培地に広（存在し得る。

モノクローナル抗体を公知の方法、例えば、プロティンＡを使用してのアフィニ ティー分離または逆相アルキル化シリカゲルゲル上高圧液体クロマトグラフィー または合成ポリスチレンゲル濾過カラムの使用のような公知の方法により精製し 得る。

薬剤の適当な投与量は、投与の形態に依存して、熟練技術者により容易に決定し 得る。さらに具体的には、なおいっそうのＡＩＤＳ感染を抑制する抗体の静脈内 投与の適当な用量が種々の常用実験により決定される。例えば、ＫＴＨｌ、ＫＴ Ｈ２およびＫＴＨ３抗体はインビトロで２μｇ／ｍｌの濃度でＨＩＶ感染を阻害 し得る。ＫＴＨ−１１５，６ｍｇは、血液約７．８１を有する体重６０ｋｇの男 性に投与するとき、ＨＩＶ感染を防ぐのに十分であると思われる。

人体抗体が、このインビボでの阻害を行うために非常に好ましい。

薬剤投与の適当な方法は当技術の熟練者により決定し得る。抗体は静脈内投与し 得るが、しかし他の投与形態もまた可能である。

適当な薬学的に許容される担体、希釈剤および添加剤は熟練技術者により容易に 決定し得る。例えば、抗体を生理学的緩衝溶液に可溶化して、投与し得る。しか しながら、担体が特に好ましくいことには重要でない。

構造が上述したものである抗原Ｔｎをケルドセン等、（１９８８年）、キャンサ ー・リサーチ、第４８巻、２２１４頁に記載の公知の方法により、またはＴｎ抗 原または生合成生成Ｔｎ糖ペプチドを含む精製免疫原を製造するための上記の方 法により天然物から分離し得る。

本発明のワクチンの適当な投与方法、免疫学的有効投与量および薬学的に許容さ れる担体、希釈剤および添加剤を熟練技術者により容易に決定し得る。例えば、 ワクチンとしてＴｎ抗原の免疫学的活性用量は約５５μｇ／注射である。しかし ながら、担体分子は重要である・Ｔｎ抗原でコートされたＢＣＧは、へＩＤＳ感 染を防ぐのに有効な方法であると思われる。ある例では、皮肉または皮下に注射 されるＢＣＧ５００μｇにコートされたＴｎ抗原５０μｇである。

以下の実施例は、本発明の抗体が製造方法を詳細に説明し、試験例はそれらの利 用性を具体的に説明するものである。全てのパーセント、比、部などは重量によ る。ＦＣＳ＝ウシ胎仔血清。

抗炭水化物モノクローナル抗体 試験された抗体、特異性、アイソタイプ、製造の参考文献を第１表に示す。第１ 表に示された種々のモノクローナル抗体は、糖タンパク質の〇−結合鎖の周辺に 見られる炭水化物構造を定義する（クロアゼンおよびハコモリ、（１９８９年） 　、Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、第５６巻、１頁参照）。

全細胞を５〜１５％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび１ｍＭピルビン酸塩を含む ＲＰＭＩ　１６４０中で増殖させ、０，０２％ＮａＮ３とともに４℃で放！する 。

はじめに、表出した全モノクローナル抗体を、約１０〜５０ｕｇ免疫グロブリン （Ｉｇ）／ｍｌを含む無菌培養バイブリーマ上清としてＨＩＶ阻害を試験した。

最終的に、モノクローナル抗体ＫＴＨ１、ＫＴＨ２およびＫＴＨ３を培養上清か ら精製後に使用した（Ｆｉｇ、１およびＦｉｇ、３、参照）。ＫＴＨＩ　（Ｊｇ ＧυをプロティンＡ−セファロースクロマトグラフィーにより、ＫＴＨ２（Ｉ　 ｇＭ）およびＫＴＨ３（ＩｇＭ）を製造者（ファルマシア、ｕｐｐｓａｌａ、ス ウェーデン）により記載されたイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。

第１表に引用する文猷は下記のものである。

１）ヒロハシ、（１９８５年）　、ＰＮＡＳ、第８２巻、７０３９頁。

２）クローセン等、未発行。

３）クローセン等、（１９８８年）、モレキュラー・イムノロジー、第２５巻、 １９９頁。

４）ケルドセン等（１９８８年）、キャンサー・リサーチ、第４８巻、２２頁。

ＫＴＨ２（ＩｇＭ） Ｔｎ　Ｇａ１ＮＡｃａ−０−３ｅｒ／Ｔｈｒ　ＫＴＢ３　（ＩｇＧ）Ｌｕ３５　 （ＩｇＭ）　１） ＬＥ３　（ＩｇＧ２Ａ）　２） シアｏ　ＮｅｕＡｃａ２−６ＧａｌＮＡｃａｌ−０−３ｅｒ／Ｔｈｒ　ＫＴＨ３ （ＩｇＭ）シル−Ｔｎ　ＴＫＩ１２　（ＩｇＧ１）　４）β７２．３（ＩｇＧ１ ）　４） Ｔ　Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ　ａｌ−０−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ　Ｈｆ１８　（Ｉ ｇＭ）　３）細胞 ＨＩＶ感染実験のために、Ｔ４−リンパ球細胞株Ｈ９（ボボビッチ等、（１９８ ４年）、サイエンス、第２２４巻、４９７頁、ＯＥＭ（フォーリー等、（１９６ ５年）、キャンサー、第１８巻、５２２頁）およびＭＴ４（ハラダ等、（１９８ ５年）、サイエンス、第２２９巻、５６３頁）を１０％ＦＣＳ　（５％ＯＥＭ細 胞）、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン、１００Ｉ Ｕ／ｍｌストレプトマイシンを有するＲＰＭＩ　１６４０　（増殖培地）を使用 して３７℃、５％Ｃｏ２で培養した。細胞を２〜１０ＸＩＯ’セル／ｍｌの濃度 で維持し、培地を週に２度交換する。

単核球中ＨＩＶ感染実験のために、細胞株Ｕ９３７（レビー等、（１９８５年） 、バイロロノー、第１４７巻、４４１頁）を上記と同様に培養後使用した。

ウィルス源 参照記号ＨＴＶ−１１１ＨＴＬＶ、、１Ｂ　（ポポウッチ等、（１９８４年）、 サイエンス第２２４巻、４９７頁）で長期にわたって慢性的に感染させたＨ９細 胞からの上清を無菌濾過し、分割し、使用まで一８０℃で保管スル。ＨＴＶ−１ ｆｉＳＳＩ−００２を上記Ｃｆう等、（１９８９年）　、ＰＮＡＳ、第８６巻、 ７１３９〜４３頁）と同様にＨＩＶ感染患者（ＣＤＣＩ　Ｉ）から分離した。つ いで、ウィルスをＭＴ４細胞中に３度通して、上記を同様に保管する。使用前に 、ウィルス製剤のＴＣＩＤｓ。をＭＴ４細胞およびＵ９３７細胞中測定した。

毒性 モノクローナル抗体製剤の毒性を２０〜０μｇ／ｍｌ精製抗体を含む増殖培地申 ２４ウェル細胞培養プレート中０．５ｘｌＯ’ＭＴ４細胞をインキュベートする ことにより試験し、上清を培養４日後適当な濃度の抗体を含む新鮮培地と交換す る。トリフアンブル−排除を用いて、０，４および７日に生存細胞を数える。

ＬＩＳＡ 細胞不在の上清を二重抗体サンドウィッチＥＬＩＳＡを使用してＨＩＶ抗原の試 験をした。ニールセン等、（１９８７年）、ランセット、第８５３２巻、５６６ 頁参照。各プレートは標準ＨＩＶ抗原製剤の系統希釈を含み、光学密度（４９０ ｎｍ）をこの標準製剤に関して表す（任意の単位）。インビトロでの全感染実験 は未処理のＨＴＬＶ、、、Ｂを使用する対照を含んでいる。培養４日後、上清を 希釈し、この対照から約２の０Ｄ４９０を得た。感染阻害を試験した全抗体を、 ＥＬＩＳＡ検出の妨害について試験し、そのような妨害は見られなかった。

スクリーニング Ｔｎでの免疫化により刺激されたモノクローナル抗体を含む新しス開発されたハ イブリドーマ上清、すなわちＫＴＨ１〜３をＴｎ抗原を使用して、および下記の ウィルス阻害検定法で抗原特異性により両方でスクリーニングする。確立された 対照抗体は、先に非阻害であると発表された抗−Ｔｎ抗体Ｌｕ３５　（ハンセン 等、（１９９０年）、上湯）およびＩｇＧ２Ａ抗−Ｔｎモノクローナル抗体ＩＥ ３（タローセン等、未刊行）を含んだ。更に、阻害的であると先に発表された抗 体はシアロシルＴｎ抗原に対するものであった。ＴＫＨ２およびＢ７２．３（ケ ルドセン等、（１９８８年）、上湯）を陽性の対照として含んだ。抗Ｔ抗体、Ｈ Ｈ８（タローセン等、上湯）を陰性の対照としてまた含んだ（第１表参照）。

ウィルス阻害検定法 ２５　ＴＣＩ　Ｄ５０　ＨＴＬＶＩＩＩＢをバイブリーマ上清０．５ｍｌと混合 し、３７℃で１時間インキュベートした。ＭＴ４細胞（１×１０６）をこの混合 物中に懸濁し、３７℃で２時間インキュベートした。十分、洗浄後、細胞を対応 ＭＡｂの１０％ｖ　／　ｖを含む増殖培地（４ｍｌ）中に再懸濁した。

結果をＦｉｇ、ｌに示した。Ｆｉｇ、１において、縦座標は４日後（塗りつぶし た柱）および７日後（ハツチング）、抗原産生の任意の単位で表す。横座標は未 処理ウィルスでの対照（ｒｏＭＡｂＪ　）　、ウィルス不在の対照（○ＨＩＶ） 、または記載のＭＡｂを含むハイブリドーマ上清を表す。

感染阻害 種々の細胞系中ＨＩＶ感染に対してＭＡｂ類の阻害効果を測定するために、ＭＴ ４細胞株のリンパ球性細胞およびＵ９３７細胞系の単核球性細胞をＨＩＶ−１ウ ィルス菌種各々ＨＴＬＶ、、、Ｂまたは５ＳＩ−００２の感染のために標的細胞 として使用した。

５００μｍ増殖培地中１０’ＭＴ４細胞を２時間２５ＣＣＩＤ、。

ＨＩＶ−１で接種した。接種以前に、細胞またはウィルス性接種物のいずれかを ＭＡｂの系統希釈で１時間ブレインキュベートした。

ブレインキュベートされたＭＡｂ細胞を接種前に洗浄した。接種後、細胞を洗浄 し、４種で２００，０００細胞を７日間２４ウ工ルＮＵＮＣ皿でＭＡｂなしで増 殖培地で培養した。培養４日後、培養培地中ＨＩＶ抗原を二重サンドウィッチＥ ＬＩＳＡ（ハンセン等、（１９９０年）、上湯）を使用して測定した。抗原濃度 を模擬ＨＩＶで接種し模擬処理細胞の対照培養中で相当する日数での抗原濃度に 関連して表した。Ｕ９３７細胞における感染の阻害を同様の方法で検定した：２ Ｘ１０’Ｕ９３７ｍｊａを２５ＣＣＩＤｓｏＳＳＩ　００２で接種し、４重で２ 週間連続して培養した。Ｕ９３７培養の感染を１００日目評価した。

結果をＦｉｇ、２および３に示す。Ｆｉｇ、２において、縦座標はＭＡｂで処理 されたＨＴＬＶＩＩＩＢでのＭＴ４細胞の感染後４日のＨＩＶ抗原産生（対照に 対する％）を示す。Ｆｉｇ、３において、縦座標ハＭＡ　ｂ　テ処理すｔＬ７’ ：ＨＩ　Ｖ単離ＳＳ　ｌ−００２ｔ’＋７）Ｕ９３７細胞の感染１０日後ＨＩＶ 抗原産生（対照％）を示す。Ｆｉｇ、２およびＦｉｇ、３の各図において、横座 標はウィルス接種物に関するＭＡｂの濃度を示す（ｎｇ１５０％細胞培養感染投 与量）。

Ｆｉｇ、２およびＦｉｇ、３は、精製ＭＡｂＫＴ８１〜３がリンパ球性および単 核球性細胞で異なる２種のＨＩＶ−１を使用してＨＩＶ感染の濃度依存阻害をも たらしたことを示す。リンパ球性および単核球性細胞系でＭＡｂ類ＫＴＨＩ〜３ の８０％有効投与量は各々１０〜１５および４０〜５００ｎｇ１５０％細胞培養 感染投与量であった。

阻害特異性 感染性検定を、ＭＡｂでウィルスまたは細胞のブレインキュベート後もしくは合 成Ｔｎ抗原、Ｇａ１ＮＡｃ−３ｅｒ　（バイオカーブ、ランド、スウェーデン） とＭＡｂでウィルスまたは細胞のブレインキュベート後上記のように行う。

ＭＴ４細胞またはＨＴ　Ｌ　Ｖ　１＋　＋　ＢをＣＣＩＤ５ｏまたはＰＢＳ当た り２０および４重ｇＭＡｂＫＴＨ１とブレインキュベートする。２５ＣＣＩＤ、 ｏＨＴＬＶｍＢで接種する前に、ブレインキュベート細胞を完全に洗浄した。４ 日目の感染を模擬処理対照培地に対するに関する培養上清中ＨＩＶ抗原濃度（パ ーセント）として表す。結果を４重の測定の平均値として第２表に示す。

第２表 ！１１Ｖ　細胞 ４ｎｇＫＴＨ１／ＣＣＩＤ５ｏ　４５．６％　９９１％２０　ｎ　ｇＫＴＨ１／ 　ＣＣＩ　Ｄｓｏ　１ゴ％　１０５．２％１００μｇＧａ　］ＮＡｃ−５ｅ　ｒ 　１００．４％　９７．３％４ｎｇＫＴＨ１／ＣＣＩＤ５゜ ＋１００μｇＧａ］ＮＡｃ−５ｅｒ　９７．８％　９８％第２表は抗−Ｔｎ抗体 （ＭＡｂ　ＫＴＨＩ）によるＨＩＶ感染の阻害は細胞でなく抗体のウィルスに対 する結合の結果であることを示す。感染の阻害がＧａ　１ＮＡｃ−９ｅ　ｒ　（ Ｔｎ抗原）によりなくなる。これは感染の阻害がウィルスとＭＡｂの特異的相互 作用の結果であったことを確証するものである。

シンシチウム形成の阻害 ＨＴ　Ｌ　Ｖ　１１＋　Ｂ感染Ｈ９細胞（２Ｘ１０’）を９６ウエル細胞培養プ レート中０．５または５０ｎｇＫＴＨ１を含む５０μｌ増殖培地中で１時間ブレ インキュベートした。５０μｍ増殖培地中１１０５ｃＥ細胞を加えた。２４時間 共培養後、シンシチウム（膨張する細胞質を有する多核巨細胞）の総数を顕微鏡 により数えた。

抗ＴｎＭＡｂＫＴＨ１によるＨＴＶ感染および非感染リンパ球のシンシチウム活 性の減少を示す結果を第３表に示す。

第３表 ＫＴＨＩ　（ｎｇ）　シンンチウム／ウェル結果から、Ｔｎ抗原類が抗−Ｔｎ抗 体を使用する受動免疫治療のための標的として機能することが推定され得る。

本発明の２種のＭＡｂ、すなわちＫＴＨＩ　（Ｉ　ｇＧ）およびＫＴＨ２（Ｉｇ Ｍ）が、Ｔｎ抗原に特異的である、一方、ＭＡｂＫＴＨ３（ＩｇＭ）はＴｎ抗原 およびシアロシルＴｎ抗原に対する抗体である。免疫化のために、しかしながら 、シアリル化Ｔｎ（ＮｅｕＡＣα２−６ＣＩＮＡＣαｌ−０−３ｅｒ／Ｔｈｒ） は、直接の前駆体、Ｔｎ　（Ｇａ　ＩＮＡＣα１−ｅｓｅｒ／Ｔｈｒ）より合成 的製造がより困難である。３種ＭＡｂ類全てインビトロでのＨＩＶ感染を阻害す ることが判明した。阻害は濃度依存的であることを示し、ウィルスとのエピトー プ特異性相互作用の結果であり、非感染細胞とではない。抗ＴｎＭ、Ａｂが感染 および非感染細胞間のシンンチウム産生を阻害することが判明した。

ＨＩＶの抗体媒介阻害は、数種の抗体が単核球／マクロファージの感染を増大し 得るという観察により最近反論された（マツダ等、（１９８９年）、５ｃａｎｄ 、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、第３０巻、４２５頁、ロビンソン等、（１９８９年） 　、ＰＮＡＳ、第８６巻、４７１０頁）。しかしながら、本発明で採用された抗 −Ｔｎ抗体はリンパ球（ＭＴ４細胞）の感染を阻害するだけでなく、単核球（Ｕ ９３７細胞）の感染もまた阻害することが判明した。

ＨＩＶ中和抗体が）ＩＩＶ感染患者に観察され、またｇｐ１２０およびｇｐ４１ から選択された合成ペプチドを使用してインビトロで製造された（ウェーバ−等 、（１９８９年）、ランセット、第１巻、１１９頁、チャン等、（１９８６年） 、ＥＭＢＯＪ第５巻、３０６５頁；ラスキー等、（１９８６年）、サイエンス、 第２３３巻、２０９頁）。これらは疾患の進行を防御するのではなく、型特異性 である。ｅｎｖ遺伝子中突然変異を含むＨＩＶにエスケープ突然変異株がインビ トロで発生するのが観察され、その場合、ウィルスは先に抗体を中和する作用を 避は得る（ワイス、（１９８８年）、ジャーナル・オブ・アクワイアード・イム ノ・デフィシエンシー・ンンドローム、第１巻、５３６頁）。ウマ感染貧血ウィ ルスに対する抗血清の抗−ＨＩＶ反応性ＨＩＶエンベロープの炭水化物の部分と 比較して開示しているが、炭水化物特異性抗体によるＨＩＶ中和は以前に開示さ れていなかった。炭水化物エピトープをＨＩＶエンベロープのペプチド部分をコ ード化するゲノム中突然変異により容易に影響を及ぼされ得ないと思われる。す なわち、この結果はウィルス性グリカンが抗ウイルス性免疫治療および／または ワクチン開発のための標的と考えられ得る。

実施例１　抗−ＴｎＭＡｂ類およびハイブリドーマ免疫原の分離 シアリダーゼ処理ヒツジ下顎ムチン（ＯＳＭ）をＴｎ抗原の資源として使用する 。Ｏ３Ｍ上約９Ｏ％炭水化物鎖シアリル−Ｔｎ抗原からなり、これはシアリダー ゼ処理後、Ｔｎ抗原に転換する。

ＯＳＭをヒツジ下顎腺から常法により分離した（テタマンチおよびピッグマン、 （１９６８年）、アンーブ・オブ・バイオケミストリー・バイオフィジックス、 第１２４巻、４５〜５０頁）。簡潔に言えば、下顎腺の水性抽出液を酸性ｐＨ（ 例えば、３）で沈澱させた。これをムチンクロットと呼ぶ。ムチンクロットを遠 心分離し、水に溶解し、ｐＨを中性に調整し、酢酸ナトリウム中分別エタノール 沈澱を行った。

免疫化およびモノクローナル抗体の確立上記で分離された高分子量のＴｎ抗原を １．０ｍｇタンパク質／４ｍｌ水の量で蒸留水に溶解し、フロイント完全および 不完全アジュバントの等量と混合した。混合物を１時間３７℃で完全に混合した 。

２００μｍ部（すなわち、２００μｇ糖タンパク質および４００μｇ細菌）をＢ ａ１ｂ／ｃマウスに腹腔内注射した。最初のフロイント完全アジュバントの注射 後、フロインド不完全アジュバントの注射を２週間後に行った。最終ブーストを アジュバントなしで静脈内に与えた（２００μｍ生理食塩水中１００μｇ）。

ブースター注射３日後、動物を殺し、膵臓細胞を除去し、牌細胞を常用法により マウスミエローマＮ５−１細胞と融合した（コーレル等、止揚）。

選択的培地上で増殖させたハイブリドーマを、上記の０３Ｍ、脱シアリル化Ｏ８ ＭおよびグリコフォリンＡとのモノクローナル抗体反応性の常用法によりスクリ ーニングした。グリコフォリンＡをシグマ・ケミカル・カンパニー、ミズーリ、 セントルイスより購入した。

０５Ｍを常用法によりクロストリジウム・ベルフリンゲン　スタイブＸから０． １ユニット／ｍｌニューラミニダーゼ（シグマ）で処理して脱シアリル化した（ ケルドセン等、（１９８８年）、止揚）脱シアリル化Ｏ５Ｍで陽性反応であった モノクロ−チル抗体を分泌する約４０ハイブリドーマであることが判明した。そ れらのうち、３２はＯＳＭとも反応した。脱シアリル化Ｏ８Ｍ（Ｔｎ抗原）およ びＯＳＭ（シアロシル−Ｔｎ）間の交差反応がＴｎ抗原（脱シアリル化○ＳＭ） に対する免疫化へのマウス（およびウサギ、下記参照）免疫反応の主な現象であ ると判明した。脱シアリル化Ｏ８Ｍを独占的に結合するかまたはＯＳ　Ｍと交差 反応する全てのハイブリドーマは、ハンセン等、（１９９０年）、止揚に詳細に 記載されている標準検定でＨＩＶインビトロ感染をほとんど中和し得た。更に、 ＭＡｂ類のＴｎ抗原特異性を公知のＴｎおよびシアロシルＴｎ抗原の分布の様々 なセクションで免疫蛍光組織学により確認した（ヒロハン等、（１９８５年）、 止揚）。これらのハイブリドーマを大規模生産し、モノクローナル抗体の反応性 をＯＳＭ、脱シアリル化Ｏ８Ｍおよびグリコフィリンで再試験した。

Ａ、脱シアリル化○ＳＭとの強い反応性を示し、グリコフィリンＡまた０９Ｍと 反応性を示さない七ツクローナル抗体を分泌するハイブリドーマが判明し、０３ Ｍおよび脱シアリル化Ｏ３Ｍの両者との反応性を示す抗体もまた判明した。

初期の検討において、抗原の資源は、主要な抗原性エピトープとしてＴｎ抗原を 担持するヒツジムチンであった。ムチンは大型糖質タンパク質あるだけでなく、 均質に精製することおよび構造情報を得るのが困難である。更に、ヒツジ資源は ヒトワクチンにおける使用に関して問題があった。この障害を排除するために、 これらの抗原の製造の半生合成アプローチは以下の実施例に記載のように開発し た。

実施例２　生合成Ｔｎ抗原 ペプチド合成 約４０アミノ酸残基までの天然発生のアミノ酸配列は標準法により構成要素とな るアミノ酸から合成され得る。この実施例において、○ＳＭタンパク質コアの配 列またはＧＰ１２０ＨＩＶエンベロープタンパク質の配列を使用した。合成され たペプチドを可逆的に固定化し得るために、ペプチドを可逆的に、例えば、ＴＮ Ｂ−チオールアガロース（ピアス、イリノイ、ＵＳＡ）に結合し得るＳＨ−反応 基を有するＮ２−末端システィン残基を含むように選択した。この場合のペプチ ドはＳｅｒおよびＴｈｒを含む。

ＵＤＰ−Ｇａ　ｌＮＡｃの可溶化と分離：ポリベブチドα−Ｎ−アセチルガラク トサミニルトランスフェラーゼトランスフェラーゼの適切な資源はウン初乳また はラン胸腺であるが、このトランスフェラーゼは多種の動物およびヒト組織およ び細胞系に存在する（エルハマー等、（１９８６年）、ジャーナル・オブ・バイ オロジカル・ケミストリー、第２６０巻、５２４９頁）。

トランスフェラーゼをトリトンＸ−１００で可溶化し、エルハマー等、（１９８ ２年）、玉揚、に記載の脱糖鎖形成化Ｏ８Ｍセファロース上アフィニティクロマ トグラフイーにより精製し得る。別法として、たとえば、チバクロンブルーアガ ロース（シグマケミカル）はラン胸腺から可溶化された酵素と結合し、このトラ ンスフェラーゼをＫＣＩにより溶出し得る。更に、トランスフェラーゼをＮ末端 ンステイン残基によってＴＮＢチオールアガロースに結合したセリン／トレオニ ン含有合成ペプチドに結合し、ＥＤＴＡおよび塩またはＵＤＰで溶出し得る。こ のトランスフェラーゼの精製およびアミノ酸の配列は、組換え型トランスフェラ ーゼを使用する必然的可能性でもってトランスフェラーゼ遺伝子のｃＤＮＡクロ ーン化を可能にする。更に、遺伝子のクローン化は、細胞中へのｃＤＮＡの形質 導入および発現を可能にし、ｃＤＮＡの形質導入により発現された他の組み換え 型タンパク質の糖鎖形成の考案を可能にする。

セリン／トレオニン残基を含む合成ペプチドの糖鎖形成固定化ペプチド（ＴＮＢ −チオールアガロース）をα−Ｎ−アセチルグリコサミンを加えてＵＤＰ−Ｇａ 　ｌＮＡｃから糖鎖形成し、ＭｎＣ１ｇの存在中ポリペプチドα−Ｎ−アセチル ガラクトサミルトランスフェラーゼＵＤＰ−ＧａＩＮＡｃにより触媒され得るコ ニの目的のために、トランスフェラーゼを均質に精製するか、またはさほど精製 されていムい状態で使用し得る。トランスフェラーゼおよびＵＤＰ−Ｇａ　ＩＮ ＡＣとペプチドアガロースをインキュベートすることにより、セリン残基および トレオニン残基の約８０％を［１’Ｃ］　Ｇａ　ｌＮＡｃ取り込みにより証明さ れるように糖鎖形成する。

糖鎖形成後、アガロースを十分洗浄し、生成した糖ペプチドを還元剤（２−メル カプトメタノールまたはＤＴＴ）により分離し得る。

糖ペプチドを均一形態で得、熟練技術者により容易に決定し得るように構造決定 解析され得る。

生合成Ｔｎ免疫原の製造 製造されたＴｎ糖ペプチドを、有効なＮ２末端システィン基のＳＨ反応基を使用 して、例えばピアス、イリノイ、ＵＳＡ、マレイミド活性化キーホールインベッ トヘモシアニンを使用して、または熟練技術者により容易に利用され得る他の方 法により、適当な担体タンパク質に結合し得る。

結論 ヒト有機体において通常発現されないＨＩＶエンベロープタンパク質ＧＰ１２０ に関する炭水化物エピトープを同定した。これらの炭水化物エピトープに対する モノクローナル抗体は、インビトロでＨＩＶ感染およびジンシチウム産生を中和 し、ワクチンが少なくとも部分的にＨＩＶにより発現した炭水化物に基づき得る ことを示唆している。この炭水化物を使用してウサギでの予備的なワクチン研究 はこの考えを支持する。検討は最初に３種の炭水化物エピトープ（組織血液群Ａ 、ＬｅＹ、およびシアロシルＴｎ）を確認したが、今ではデータは炭水化物抗原 Ｔｎが同等かそれより良い免疫中和エピトープを示唆する。

特に、抗−ＴｎＭＡｂＫＴＨ３（Ｉ　ｇＭ）はシアロンルーＴｎと交差反応し、 ＨＩＶ感染およびンンシチウム産生を中和する。抗−ＴｎＭＡｂＫＴＨｌ　（Ｉ ｇＧ１）およびＫＴＨ２（Ｔ　ｇＭ）はインビトロでのＨＩＶ感染およびシンシ チウム産生を中和するが、一方、Ｔｎ抗原でのウサギの免疫化は、インビトロで ＨＩＶ感染アッセイにより予想されたようにＨＩＶ免疫中和効果を生じる。

実施例２に記載の結合体は本来のＴｎムチン抗原と類似の性質を有し、動物およ びヒトにおいて同じ体液性の（抗体）反応をもたらす。ＨＩＶエンベロープ糖タ ンパク質からのペプチド配列を使用することにより、ＨＩＶタンパク質への体液 性および可能な細胞性の免疫反応もまたもたらすことは当然である。

門！Ｉ ＦＩＮ　Ｚ ＩＧ３ 要　約　書 炭水化物抗原Ｔｎに対するモノクローナルまたはその他の抗体は、ＡＩＤＳまた はＡＲＣの進行を阻害または遅延するために使用され得る。抗原は、免疫化のた めにワクチンに使用することができる。

国際調査報告 、。＋ａｍｍ＋ｗ□ＩＡ、Ｉ１．．．，５゜、ア、ＰＣＴ／ＥＰ　９０１０２１ ６１国際調査報告 ＥＰ　９００２１６１ Ｓ＾　４２６０６

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．炭水化物抗原Ｔｎに対する精製されたまたは非天然生成の抗体。
2. ２．ＡＩＤＳまたはＡＲＣの進行の阻害または遅延に使用するための炭水化物抗 原Ｔｎに対する抗体。
3. ３．請求項１または請求項２記載のモノクローナル抗体。
4. ４．請求項３記載のモノクローナル抗体を産生する能力を有することを特徴とす るハイプリドーマ。
5. ５．受託番号ＥＣＡＣＣ９０１１１４０１、９０１１１４０２および９０１１１ ４０３で寄託されたハイブリドーマのいずれかの性質を有する、請求項４記載の ハイプリドーマ。
6. ６．ＡＩＤＳまたはＡＲＣの進行の阻害または遅延に使用するための薬剤の製造 のための、炭水化物抗原Ｔｎに対する抗体の使用。
7. ７．炭水化物抗原Ｔｎおよび生理学的に許容される担体、希釈剤または添加剤を 含む、ワクチン組成物。
8. ８．ＡＩＤＳまたはＡＲＣに対する対象物の免疫化に使用するための薬剤の製造 のための炭水化物抗原Ｔｎの使用。
9. ９．炭水化物抗原Ｔｎ対する薬学的効果量を対象物に投与することを含む、対象 物におけるエイズまたはＡＲＣの進行を阻害または遅延するための方法。
10. １０．炭水化物抗原Ｔｎの免疫学的効果量を対象物に投与することを含む、エイ ズまたＡＲＣに対して対象物を免疫化するための方法。