JPH05507441A - 産業水系中の表面からバイオフイルムを除去するかまたは同表面上のバイオフイルムの堆積を防止するための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業水系中の表面からバイオフィルムを除去するかまたは同表面上のバイオフィ ルムの堆積を防止するための組成物および方法 表面上の生物学的汚染は多くの商業用および産業用水性処理および水取り扱い系 において重大な経済的開面である。この汚染は微生物および／または細胞外物質 の蓄積物であるバイオマスにより、さらに、バイオマス中に止どまる汚物や残骸 によりもたらされる。細菌、真菌、酵母、珪藻類および原虫類はバイオマスの蓄 積をもたらす生体の内のほんの幾つかである。制御されない場合、これらの生体 によりもたらされる生物学的汚物は処理操作に悪影響の可能性、諸処理の効率の 低下の可能性、エネルギーの無駄の可能性および製品品質の低下の可能性がある 。

発電所、製油所、化学工場、エアコン系並びに商業用および産業用操業で使用さ れる冷却水系は、しばしば、バイオフィルムの問題にぶつかる。バイオフィルム は生体の層の堆積である。冷却水系は、通常、冷却塔中で空気／水界面に移行し た浮遊生体で、並びに、系への補給水からの水伝送生体で汚染される。このよう な系中の水は、通常、これらの生体のための優れた生長培地である。制御されな い場合、これらの生長からもたらされるバイオフィルムによる生物学的汚染は塔 をふさぎ、バイブラインをふさぎ、そして熱伝達表面をスライムの層で覆う可能 性があり、それにより、適当な操作を妨害し、装置の効率を低下させ得る。

生物学的汚染で問題となり易い産業プロセスには、バルブ、紙、板紙および布、 特に、水により積層する不織布、の製造に使用するものがある。例えば、抄紙機 は「白水系」と呼ばれる再循環系で大量の水を取り扱う。白水系はバルブ分散物 を含有する。抄紙機への供給は、典型的には、繊維性および非繊維性製紙用固形 物を約０．　５％のみしか含まない。このことは、紙１トン当たりにおおよそ２ ００トンの水が抄紙機を通過することを意味し、そのうちのほとんどが白水系中 に再循環される。

これらの水系は微生物にとって優れた培地を与え、ヘッドボックス、水路および 製紙用装置に微生物のスライムの形成をもたらし得る。このようなスライムマス は水流およびストック流に悪影響を与え得るばかりでなく、スライムマスが束縛 から脱すると、紙にしみ若しくは穴、並びに抄紙機の操業に経費的な崩壊をもた らすウェブの破壊をももたらし得る。

背景技術 微生物活性の制御については、伝統的に毒性薬品の分野であった。毒性薬品の制 御技術は従来技術によく示されている。米国特許第３，９５９，３２８号、４゜ ０５４．５４２号および４，２８５，７６５号各明細書は毒性薬品を用いて支障 のある微生物を殺すことによる方法を例証している。これらの方法は、支障のあ る微生物を除去することによる当面の問題を廃除することの妥当性のため、そし て、微生物を殺しうる多くの有機および無機薬品のため、従来技術において報告 されている多くの研究努力の主流を占めていた。

毒性薬品を使用することに一定の欠点がある。微生物に対して毒性のこれらの薬 品のほとんどは、ヒトを含む、より高等生物までにも毒性である。地球環境上、 および食品連鎖上、これらの毒性薬品の好ましくない影響はよく文献で証明され ている。従って、毒性薬品で微生物を制御するどのような方法も高等生物の集団 の安泰にいくらかの影響を与える。

毒性薬品の影響は、さらに、生体自身の自然の防御機構により制限される。プラ ンクトンもしくは浮遊性生体は微生物を制御するのに使用するほとんどの薬剤に より容易に撲滅される。しかし、系の表面に棲息する固着もしくは定着生体は多 糖類の被覆により保護されており、環境毒素の作用を避けるのにいくらか有効で ある。したがって、多糖類被覆により与えられている保護を打ち破るのに毒素の 増量投与を相当必要とするかもしれない。

生物学的活性の好ましくない影響を制御するためのいくつかの試みは毒性薬品の 使用を避けるか、または環境上のこれらの毒性薬品の影響を軽減するかのいずれ かである。例えば、米国特許第３．７７３，６２３号および第３，８３４，１８ ４号（両特許ともＲａｔｈｅｒ等に与えられた）明細書は、産業用水系中の細菌 性スライムの形成を制御するためにレバンヒドロラーゼ酵素の使用を開示する。

米国特許第４，０５５，４６７号（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎに与えられた）明細 書はベントサナーゼーヘキソサナーゼ（ｐｅｎｔｏｇａｎａｓｅ−ｈｅｘｓａｎ ａｓｅ）酵素である、市販品、Ｒｈ。

ｚｙｍｅ肝１５０を使用することによる、産業処理水と接触状態の固体表面上の スライムの蓄積からの防止方法を開示する。この方法はプランクトン生体が当該 生体の固着層上に蓄積するのを防止するものであり、したがって、当該生体は多 糖類外層を分泌できる。しかし、Ｒｈｏｚｙｓｅ　ＩＩＰ−１５０は、多糖類被 覆により保護されてすでに蓄積したスライム層を攻撃するためのものではない。

これらの多糖類は細菌の集団中への上記酵素の浸透割合を減少させる。

酵素と界面活性剤との組み合わせは長年の間、布のクリーニングおよび染み抜き の分野に使用されてきた。米国特許第３．５１９，３７９号（Ｂｌｏｓｅｙｅｒ 等に与えられた）明細書は蛋白分解酵素と過酸化物とを有機洗浄剤およびアルカ リ性ビルダーとともに使用して優れた染み抜き効果に到達した、ンーキングおよ び洗濯方法を開示する。米国特許第３．９８５，６８６号（Ｂａｒｒａｔに与え られた）明細書は、なかんずく、カチオン性およびアニオン性界面活性剤および 酵素、特にプロテアーゼを含膏する酵素系洗剤組成物を開示する。

Ｂｌｏ曽ｅｙｅｒ等およびＢａｒｒａｔは疎水性汚染もしくはじみの除去を扱っ ている。この汚染およびしみは有機性であるが、それらはその起源において直接 生物学由来ではなく、産業用水系環境中のものでない。汚染およびしみ抜き技術 は有機性物質を除去するために酸化剤化合物の使用にある程度依存している。産 業用水系中で適当な制御に達するのに使用される酸化剤化合物には塩素又は塩素 誘導体もしくは塩素置換体等がある。

水の精製のために使用される逆浸透膜上のバイオフィルムの成長を制御するため に酵素と界面活性物質との組み合わせの使用についての言及が技術文献中にある ［＾ｒｇｏ、　Ｄａｖｉｄ　Ｇ、等、　Ａｑｕａ　Ｓｃｉ、　Ｔｅｃｈ、　Ｒｅ ｖ、、　ｒ逆浸透膜の微生物学的汚染（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｆｏｕｌｉｎｇ 　ｏｒ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｏｓｍｏｓｉｓ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　）　Ｍｏｌ　 ６．１９８２．　ｐｐA　４８１− ４９１；　Ｉｈ１ｔｔａｋｅｒ、　Ｃ，等、　Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　Ｅｎｖ ｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＬ　ｒ逆浸■■ からバイオフィルムの除去のためのクリーニング方法の評価（Ｅｖａｌｕａｔｉ ｏｎ　ｏｆ　Ｃ１ｅａｎｉｒ＋ｇ　ＳｔｒａＬｅｇｊｅｓ　ｆｏｒ　Ｒｅｍｏｖ ａｌ　ｏｒ　Ｂｉｏｆｉｌｓｓ　ｆｒｏｍ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｏｓｍｏｓｉｓ@ ｋｌｅｓｂｒａｎｅｇ ）　Ｖｏｌ　４ｇ（２）、　Ａｕｇ　１９８４．　Ｉｌ＋）、　３９５−４０３ ］　、これらの膜は酢酸セルロースから製せられたポーラス構造である。

しかし、Ａｒｇｏ等により微生物が単一種であることが見いだされ、１ｌｈｉｔ ｔａｋｅｒ等により９５％以上がマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｓ）であるとして後の研究で確認されているこの微生物は、産業系中の基体上 に最も一般に広がって−）る種と異なる。この相違の生物学的理由は、産業系で 見いだされる細菌体の一般的な分類に対してよりも、螺旋巻逆浸透膜の酢酸セル ロース基質がマイコノ１′クチ１功ムにより好適であるためである。

したがって、従来技術で検討された環境は混合ミクロフローラを産生ずるような ほとんどの産業系中に見いだされる環境と大分異なっていた。事実、Ｎｏｖｏ− Ｎｏｒｄｉｓｋによる欧州特許出願番号Ｗ０　９０１０２７９４号は、特定の多 糖類に必要な酵素がその生体に対して特異的であることを開示する。

さらに、１ｈｉｔｔａｋｅｒ等はそのミクロフローラ集団の年代が進むにつれて 、それらの処理プログラムの有効性が著しく減少することに気づいた。これは生 体の数が増加するにつれて生体がその処理に対して一層有効に抵抗できたことを 暗示する。

Ａｒｇｏ等は、塩素で処理した系が酵素プログラムと比較して一層有効に処理さ れたことを開示する。Ｉｈ１ｔｔａｋｅｒ等は一定の酵素、界面活性化合物およ び漂白剤を含む市販クリーニング製品の使用が試験したもののうち、（イオフイ ルムを制御するのに最も有効であったことを観察した。しかし、Ｉｈ１ｔｔａｋ ｅｒ等は、処理また（よ処理の組み合わせがバイオフィルム成長のあらゆる段階 で完全には有効でな−）かまたは有効でないことにも気づいた。Ａｒｇｏはさら に試験したクリーナー１ますべでの膜からすべてのバイオフィルムを一様に除去 はしなｔ）ことを指摘する。

米国特許第４．．９３６，９９４号（Ｙｉａｔｒに与えられた）明細書は冷却塔 の表面を覆うスライムから、セルラーゼ、α−アミラーゼおよびプロテアーゼを 配合した酵素製剤を用いてスライムを除去する方法を開示する。ｌ１ａｔｒは三 種の酵素の組み合わせを必要とし、第３欄、４１〜４４行に、これらの酵素のう ちいずれも単独では充分有効にスライム除去しないであろうと記載する。

米国特許第４，６８４．４６９号（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ等に与えられた）および米 国特許第４．．３７０．１９９号（ＯｒｎｄｏｒｆＴに与えられた）各明細書は 、双方とも酵素−触媒処理殺生物剤を用いるバイオフィルムの制御法を開示する 。これらの方法は毒物の使用を排除せず、単に酵素成分を毒性薬品の性能を改良 するためにのみ使用する。

発明の開示 本発明は、ヒト、魚、またはさらに生物学的汚染問題の原因となるスライム形成 性微生物に対して毒性の薬品を使用する必要のない、水系中の固体基体からバイ オフィルムを除去するか、または固体基体上にバイオマスもしくはバイオフィル ム、そして、特に、バイオフィルムからなる複合バイオマス（以下、「バイオフ ィルム」という用語はバイオマスおよびバイオフィルムの双方を含む）の堆積＼ ＮＮ町 薬品と組み合わせて使用することができる。

特に、本発明は少なくとも二種の生物学的に産生じた酵素と少なくとも一種の界 面活性剤（湿潤剤）、特にアニオン界面活性剤とを、バイオフィルム、特に複合 バイオフィルムを結合する多糖類物質を破壊するのに有効な量で組み合わせるこ とに関する。本発明の方法はフィルムを構成する個々の生体を剥き出しにしし、 そして、それらを洗い去り、かくて、より多くの多糖類およびより多くの微生物 を処理に触れさせることができる。したがって、本発明の方法は堆積の厚さを減 少させ且つ形成による堆積を防止することの両方が可能である。

発明者等は、浸透および分散目的のために界面活性剤を添加することにより、本 発明の性能を改良でき、且つ配合をより広い範囲の条件にわたって、より有効で あるようにできることを見いだした。具体的には、本発明はアルカリ性ｐＨ値お よび酸性ｐＨ値の双方で達成できる。本発明に有用な界面活性剤の種類はアニオ ン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤であることができ、アニオン性界面 活性剤が好ましい。

発明者等は、特に、伝熱を遅らせる問題をもたらし、そして、産業系において栓 をする種類の生体に特異的である多糖類と化学反応し且つ破壊するのに非常に好 ましい生物学的に産生じた酵素類の組み合わせを見い出した。更に、発明者等は 産業系に問題をもたらす生体を取り囲む保護層に浸透するのに非常に有効な非常 に好適な界面活性剤を見い出した。

本発明はプランクトン生体と固着生体との微生物生態系の間で区別できる。与え られた表面の自由エネルギーが表面に付着する生体を決定しうろことが知られて いる。鋼や銅のような金属、ガラス、陶材またはその他の滑らかな硬質表面は軟 質プラスチックもしくはポリマー表面と基本的に異なる生体の発育を選択的に促 進する［ＦｌｅＬｃｈｅｒ、　ｌ１ａｄｉｌｙｎ等、Ａｐｐｌｉｅｄ　ａｎｄ　 Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙB 「固体表面へのマリーン・シュードモナス属菌の付着における基層特徴の影響（ １ｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｒ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｕｍ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔ ｉｃｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｏｒ　ａ　Ｍ≠窒奄獅■@Ｐｉ ｅ ｕｄｏｓｏｎａｄ　ｔｏ　５ｏｌｉｄ　５ｕｒｆａｃｅｓ）、　Ｊａｎ、　１９ ｇ９．　ｐｐ、　６７−７２］　ｏ発明者等は実際の水性系から得られた数種の 細菌を、細菌が一定の表面に存在することを決定するために検討した。

具体的には、発明者等は化学薬品分解方法に非常に抵抗する実際的な複合生態系 の典型である微生物の混合集団を用いた試験プロトコールを使用した。事実、生 体は実際の問題の状況から分離され、産業水中の、＜イオフイルム軽減の影響の より良好な尺度を与えた。従って、本発明はバイオフィルム成長の原因となる目 標生体を正確に診断すること、および、これらの特定の種類の生体を保護する重 合体結合剤を化学的に攻撃することに向けられている。このような微生物には細 菌等があり、藍藻類（ｂｌｕｅ−ｇｒｅｅｎ　ｆｏｒｍｓ）を含む。

産業系用の酵素の正確な組み合わせは、特定の産業系中で典型的に厄介な生体の 種類に注意を向けることを必要とする。伝熱表面を作るのに使用する材料（例え ば、ガラス、プラスチｌり並びに鋼、軟鋼、銅合金等の金属）に体して厄介な問 題となる生体の種類に特に注意が払われる。

従って、本発明は硬質表面上の複合生物学的フィルムの生長を実際に制御しその フィルムから生きている生体を除去する生物学的酵素と界面活性剤との高性能な 系を与えることができる。

膏利には、本発明は集団の年代に無関係に生体を有効に除去することができる。

微生物の新しい生長発育が一様に進み、且つ充分に早い時期に問題が適当に敏速 に対処されなかったため系の性能に非常に重大な経済的影響を与える可能性があ る場合に特別な重要性がある。

本発明に対する別の利点は公知の除去法とこの酵素系との適合性である。公知の 除去法には、塩素、臭素、過酸化物もしくはオゾンのような酸化剤またはオキ／ プントを使用するような方法がある。しかし、有利には、本発明は作用するのに 従来法の化学薬品の存在を必要としない。

最後に、発明者等は、セルラーゼが試験したプロトコールの対象生体に有効でな かったことを見い出した。

本発明の実施のための最適態様 発明者等は、固着微生物の蓄積層を産業水系中の固体基体から除去するおよび／ または産業水系中の固体基体上の固着微生物の堆積を防止するための方法並びに 組成物を見い出した。この水系に、（１）少なくとも一種の酸性プロテアーゼま たはアルカリ性プロテアーゼ、（２）少なくとも一種のグルコアミラーゼまたは α−アミラーゼおよび（３）少なくとも一種の界面活性剤を接触、好ましくは、 フラッシュさせる。好ましくは水溶液の形態のこれら（１）、（２）および（３ ）成分の組み合わせは固着微生物、特に細菌を取り囲む多糖類物質を破壊できる 。

酸性プロテアーゼまたはグルコアミラーゼはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅ ｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）から誘導されうる。アルカリ性プロテアーゼまた はα−アミラーゼは枯草！１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）から誘導 されうる。さらに、酸性またはアルカリ性プロテアーゼはパイナツプルの幹から 誘導されうる。

本発明に有用な代表的な酸性またはアルカリ性プロテアーゼにはエンドペプチダ ーゼがある。５ｏｌｖａｙ　Ｅｎｚｙ＋ｓｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃｏｒｐ ｏｒａｔｅｄにより市販されているＨＴ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７５ はアルカリ性プロテアーゼの例であり、弱酸性およびアルカリ性バイオフィルム 溶液双方中でその活性を示した。

別の酵素成分には、グルコアミラーゼおよびα−アミラーゼがある。５ｏｌｖａ ｙ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより市販さ れているＤＩＡＺＹＭＥ　Ｌ−２０Ｏはグルコアミラーゼの例である。酸性およ び弱アルカリ性バイオフィルム溶液中で活性を示した。

ＤＩＡＺＹＭＥ　Ｌ−２００はアメリカ化学会基準により１，４−α−Ｄ−グル カングルフヒドロラーゼという化学名を与えられているが、観察された大体の活 性を記載する一つの方法としての基準しなる。ヒドロラーゼは加水分解に関連す る反応を触媒する。

グルコヒドロラーゼは、攻撃する特定の基質が多糖類およびオリゴ糖基質型を育 し、攻撃する結合の種類はグリコシド結合の加水分解であることを示す。グリコ アミラーゼ活性は、加水分解が複合多糖類内のグリコシド結合により結合されて いるデンプン部分に向けられることを示す。

活性では、グルコヒドロラーゼ活性はσ−Ｄ−１．６−グリコシド結合およびα −Ｄ−１．４−グリフシト結合に向けられる。デンプン、デキストリン、アミロ ペクチンおよびその他のオリゴ糖、並びに多糖類がこれらの結合を構成し、した がって、単糖類、グルコースが大きな多糖類またはオリゴ糖部分内にある場合、 グルコースがこれらのすべての場合に遊離されるであろう。それ故、グルコアミ ラーゼおよびグルコヒドロラーゼは加水分解によりグルコース遊離を示す。

好適な酵素の組み合わせは訂−ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ−Ｌ−１７５およびＤＩ ＡＺＹＭＥ　Ｌ−２００である。

界面活性剤は、例えば、アニオン性または非イオン性であることができ、好まし くは、アニオン性である。本発明に有用なアニオン性界面活性剤の例にはエーテ ルアルコールサルフェート類およびアルキルアリールスルホネート類、例えば、 ドデシルベンゼンスルホン酸がある。

本発明に従う酵素および少なくとも一種の界面活性剤の組み合わせは処理しよう とする水１００万部当たり１部〜１００部に好ましくは変動させうる供給割合で 一緒にかまたは別々に水系に対して供給できる。個々の成分間の割合は、好まし くは、１０％の界面活性剤および９０％組み合わせた酵素と、１０％の組み合わ せた酵素および９０％の界面活性剤との間で変動させることができる。好ましく は、少なくとも一種のプロテアーゼ酵素と少なくとも一種のグルコアミラーゼも しくはα−アミラーゼ酵素との間の割合はＩＯ１〜１１０に変動できる。

特に好適な実施態様は、（１）少なくとも一種の酸性プロテアーゼまたはアルカ リ性プロテアーゼ、（２）少なくとも一種のグリコアミラーゼまたはα−アミラ ーゼおよび（３）少なくとも一種の界面活性剤、好ましくはアニオン性界面活性 剤の各３成分が等しい割合の組み合わせである。従って、供給溶液は好ましくは 各３成分が等噴含有する好都合の供給強度となるように製される。

この特に好適な供給溶液は、各成分が、処理しようとする水１００万部当たり、 処理しようとする水中で、約２０部の濃度となるように処理しようとする水に添 加する。この濃度では、この溶液は２〜３時間内にバイオフィルムを顕著に減少 させることができる。添加剤の濃度がもつと低くても同じ結果を達成するのに使 用できるが、バイオフィルムの露出の期間がより長い。逆に、酵素混合物の濃度 がより高い場合、バイオフィルム層はより急速に減少できる。

系のｐＨの変化が中性の境界をまたがってｐＨの単数単位未満の時、数種の酵素 の中で性能の顕著な差異が見い出された。バイオフィルムを良好に制御するのに 異なる酵素がしばしば必要であった。本明細書の開示により、当業者は特定のバ イオフィルムを処理するのに適当な酵素／界面活性剤の組み合わせを容易に見い 出すことができる。

実施例 スライム形成性微生物を製紙工場の水系から得た。これらの微生物は緑膿菌（Ｐ ＳＥＬＩＤＯＭＯＩＩＡＳ　ＡＥＲＵＧＩＮＯ３Ａ）、クレブ’７ｘラーｙｆキ シトカαＬＥＢＳＩＥＬＬＡ　０ＸＹＴＯＣＡ）およびエンテロバクタ・クロア カニ（ＥＮＴＥＲＯＢＡＣＴＥＲＣＬＯＡＣＡＥ）細菌種として確認された。

これらの細菌は、単独でも、組み合わせても、適切な栄養環境下で生長させると 、１８〜２４時間内で表面に粘稠な粘着性のスライムフィルムを産生じた。生長 を支持し、弱酸性条件および弱アルカリ性条件の双方でこれらの細菌種によりス ライムを産生ずる人工生長培地を開発した。これらの生長培地は下記のような処 方であった。

アルカリ性生長培地 表１ 表２ 酸性生長培地 オートクレーブ中でこれらの培地を滅菌した。冷却したら、これらの培地を滅菌 した２５０ｍ１の三角フラスコに注ぎ、約２００ｍ１の容量にした。約ＩＸ３イ ンチの寸法の予じめ滅菌したガラススライドを各滅菌フラスコに無菌的に浸した 。前述した細菌種をこれらの栄養溶液中で別に培養し、各々を、前記滅菌フラス コｍ液に０．１．ｍｌはど加えた。次いで、これらの接種した溶液を１８〜２４ 時間、約３５℃で培養した。優れた、単一の細菌スライムフィルムをガラススラ イド表面上に１８〜２４時間の培養時間内に産生じた。

人工フ１ｉ子受容体である２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−（ｐ−ニトロフェ ニル）−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＮＴ　ＤＹＥ）の使用により バイオフィルムを肉眼で観察できる存在にした。この染料は数分以内に均一なバ イオフィルムを深赤色に染めた。数分以内に均一なバイオフィルムがはっきりと 見えるようになった。このようなバイオフィルムの存在では、安定な着色したホ ルマザン生成物が形成され、標準的な取り扱いによりガラス表面から容易には取 り除（ことができなかった。この方法は、バイオフィルムを取り除くのに化学処 理の有効性を決定するのに使用された。

次のデータはこの細菌性バイオフィルムモデルを使用してめた。バイオフィルム の不安定化と除去における優秀性の度合いを、対照と比較して、処理後に残って いるバイオフィルムのおおよその百分率を関連化した評価系により視覚的に決定 した。バイオフィルムの付着性を、対照と比較して反応したｒｌＮＴＪテトラゾ リウムのガラス表面上の存在の黴により等級をつけた。

ガラススライド処理を評価するための記号の説明ガラス表面に対するバイオフィ ルムの付着を下記のように評価した。

〇−視覚的なバイオフィルムの存在は認められなかった。

Ｉ−スライド表面積の１０％がｒｌＮＴ　ＤＹＥＪで視覚的に被覆された。

２−スライド表面積の２０〜４０％がｒｌＮＴ　ＤＹＥＪで視覚的に被覆された 。

３−スライド表面積の４０〜６０％がｒｌＮＴ　ＤＹＥＪで視覚的に被覆された 。

４−スライド表面積の６０〜８０％がｒｌＮＴ　ＤＹＥＪで視覚的に被覆された 。

５−スライド表面積の８０〜１００％がｒｌＮＴ　ＤＹＥＪで視覚的に被覆され た。

各実験の開始時では、全てのガラス表面がバイオフィルムで覆われていた。最終 的な評価は、静ｌ処理の間に、依然として残っているバイオフィルムの量又は「 除去されない」ことに関する。結論として、２又はＩの評価を得た処理は非常に うま（いったバイオフィルム軽減処理であると考えられる。

特に示さない限り、接触時間はおおよそ１８時間であった。生長培地溶液はｐＨ ６，６（弱酸性）又はｐＨ７，４（弱アルカリ性）のいずれかであった。静菌条 件は、バイオフィルムの除去に影響を与えるような撹流を起こさないように維持 した。

実施例　１ 実施例　２ 実施例　３ 実施例　４ 半精製濃縮（クルード）グルコアミラーゼ（例えば、１．４−α−Ｄグルカング ルコヒドララーゼ 記号の説明：（＜１０％）は１０％未満の対照が所定時間内の所定の箇所で観察 可能なバイオフィルムとして依然として残ったことを意味する。

実施例　５ ゛１４精製した濃縮（クルード）ＨＴ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７５細 閑プロテアーゼ 実施例　６ 生物学的アニオン性洗浄剤を用いるバイオフィルムの減少実施例　７ ドデシルベンゼンスルホン酸＋グルコヒドロラーゼ＋１−ＩＴ−ＰＲＯＴＥＯＬ ＹＴＩＣ−Ｌ−１７５細菌プロテアーゼの組み合わせ記号の説明：対照の％；（ Ａ）はドデシルベンゼンスルホン酸　（Ｂ）はグルコヒドロラーゼ　（Ｃ）はＨ Ｔ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩ　Ｃ−Ｌ−］、７５実施例Ｉで、広範囲の酵素が、結 果において等しく広い応答を生じさせる処理として使用された。スライム不安定 化剤として全ての酵素が有効であるのではなかった。例えば、酸性溶液バイオフ ィルムの付着スライム減少剤として、ＨＴ−Ｐｌ？０ＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１ ７５，７ミ０グルｌシダーゼ、ＭＩＬＥＮＺＹＭＥ　ＡＰＬ　４４０、ＭＩＬＥ ＩＩＺＹＩＩＩＥ　ＡＦＰ　２０O Ｇ、ＢＲＯＭＯＬＡＩＮ　１：１０．ＤＩＡＺＹＭＥ　Ｌ−２０＋１．ＴＥＮＡ ＳＥ　Ｌ−３４０およびＴＩＪＡＳＥ　Ｌ−１２００は全て■■ の酵素処理剤より優れた性能を示した。アルカリ性溶液でＴＥＮＡＳＥ　Ｌ−３ ４０およびＴＥＮＡＳＥ　Ｌ−１２００がそれらの活性を損失したという事実は 注目に値する。

従って、実施例１で試験したＩ８酵素のうち、６種が非常に優れたバイオフィル ム減少特性（１または２）を弱酸性および弱アルカリ性スライムの双方で示した 。これらの６種の酵素のうち、ＭＩＬＥＮＺＹｉ［Ｅ　ＡＦＰ　２００Ｇ、ＢＲ ＯＩｌｌＯＬＡＩＩｉ　１：１０および訂−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７ ５は蛋白質の内部ペプチド結合を加水分解できる特性に関与するプロテアーゼで ある。これら３種は広い基質特異性を有し、種々のｐＨ範囲で活性を維持する。

アミログルコンダーゼおよびＤ１＾Ｚｎ１Ｅ　Ｌ−２００（グルコアミラ−セノ 一種）ハ、本質的にグルコースの定量的収量をもたらすデンプンおよび２ｉ１Ｊ ゴ塘の線状および分枝状双方のグリコシド結合を加水分解できる酵素である。こ れらの酵素は、α−Ｄ−１．６−グリコシド分岐点および主要線状α−Ｄ−１゜ ４グリフシト結合の双方の加水分解を触媒する。

これらの酵素処理剤を用いて細菌活性は観察されなかった。しかし、対照と比較 して、これらの各々の酵素処理剤のいずれを用いてもわずか１０％の表面積しか 付着バイオフィルムを示さなかった。（ｆｌＴ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−１７ ５がアルカリ溶液中で２０〜４０％の表面積を示した以外は。）実施例２は、代 表的な洗浄剤のうち、数種のアニオン界面活性剤のみが弱酸性および弱アルカリ 性双方の条件下で静菌バイオフィルム除去能力を呈したことを示す。ドデシル硫 酸ナトリウムおよびドデシルベンゼンスルホン酸はわずか１０％のバイオフィル ムがガラススライド表面に残ったのみであった。これらのアニオン界面活性剤が 寒天平板計数算出の使用による細菌効果を全く生じなかったことが観察された。

実施例３は、酸性溶液およびアルカリ性溶液のバイオフィルムの完全除去が酵素 と界面活性剤との種々の組合せ（ドデシル硫酸ナトリウムのほか、訂−ＰＲＯＴ ＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７５またはアミログルコシダーゼのいずれかを用いた） を用いて観察したことを示す。特定の酵素と特定の界面活性剤との組合せがいず れかを単独で用いたのと比較してフィルム除去においてより優れていたというが 明白に示されている。

実施例４および５は、グルコアミラーゼプロテアーゼおよびＨＴ−ＰＲＯＴＥＯ ＬＹＴｒＣ−（、Ｉ　７５ブＯｆ７−ゼの双方共５０ｐｐｍで１８時間内に９０ ％以上のバイオフィルムが除去することができたことを示す。同様に、実施例６ に示されているように、ドデシル硫酸ナトリウムおよびドデシルベンゼンスルホ ン酸の双方が５０ｐｐｍで１８時間内に１０％のバイオフィルムを除いて全てを 除去した。しかし、実施例７は、１．ｏｐｐｍの各活性酵素および１０ｐｐｍの ドデシルベンゼンスルホン酸がわずか４時間内にばらつきなく少なくとも９０％ のフィルムを除去させたことを示す。

熱交換条件下でのバイオフィルムの除去産業用熱交換器中の生物学的制御方法の 効果を評価するために、熱交換管中で適当な微生物を成長させ、系の幾つかの特 性、例えば、圧力降下や熱伝達係数におけるそれらの影響を測定した。

圧力降下を測定して記録するための装置が図］に図示されている。螺動ポンプ２ はリザパー１から栄養ブロスを、螺動ポンプ５はバイオフィルム制御薬剤４を慣 用の混合ボット７にそれぞれ供給する。螺動ポンプ２および５は各々速度制御器 ３および６により独立して制御できる。得られる混合物を混合物ポットから採取 して圧力交換器８にポンプを用いて供給し、次いで、ステンレス鋼製フィル９に 入れる。このコイルは温度制御装置付き水浴中に入れられており、温度制御装置 ＩＯにより周囲温度〜９５℃のいずれかの温度に維持できる。現在の試験プロト コールでは、前記管はタイプ３１６ＳＳであり、内径１．０ｍｍ、長さ１．Ｏｍ を有していた。管温度を３５℃に維持した。

各試験実験を管部のみの接種を用いて開始した。これは、大濃度の２細菌種、緑 膿菌（Ｐｓｅｕｄｏ＊ｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびエンテロバクタ −１クロアカニ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ）を含有する栄養 ブロスを注入することによりなした。これらの菌の双方とも侵入の困難な厚いス ライム層を発生させる能力があることが知られている。接種溶液は１ｍｌの溶液 当たり１０＠〜１０＄の菌を含有した。注射器により直接前記ＳＳ管部に１時間 に亙って供給した。接種後、ＳＳ管を混合室に連結し、その結果、螺動ポンプの 出力が混合室より移動し最終的にＳＳ管を通過しうる。螺動ポンプＡより供給さ れる液体は、Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓからの脱水濃縮物より作ら れた希釈、無ｍ栄養ブロスであった。この濃縮物は無菌ＤＪ水で８００ｍｇ／Ｉ にした。この組成物は試験コイル中の細菌の健常生長を支持するが接種しなかっ た系のその他の部分中の細菌の生長を制限するのに足る程度に栄養に富んでいた 。

現場の制御スキームがあった場合に、管中に内部圧力をもった未処理管中に圧力 差を形成させることにより各実験が測定された。圧力減少％を計算するための式 は以下の通りである。

減少％−［ｉ　（ｐｃ−ｐｔ／ｐｍ−ｐｃ）１　本１００式中、Ｐ、−試験の圧 力差：Ｐ、＝添加なしの最大圧力ニＰＩ−開始時の圧力差である。これらの値の 測定が試験装置の出力の概念図中に存在されている（図２）。

実施例８は処理プログラムの効果を示す実施例　８ 添加ブレンドはドデシルベンゼンスルホン酸、グルコヒドロラーゼおよびＨＴ− ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＶ−Ｌ−１７５の組合せである。

酵素処理中の圧力降下 試験１は酵素がそれぞれ２０ｐｐｍとそれと同レベルの湿潤剤の使用によりもた らされた圧力の減少を示す。試験２は酵素がそれぞれ４０ｐＩ）ｍと湿潤剤４０ ｐｐｍとを組合せて処理したことによりもたらされる圧力の減少を示す。試験３ ．４．５および６は単独で使用した各々の単一成分（４０ｐｐｍ）および塩素（ １゜０ｐｐｍ）の効果を示す。試験７はいずれの対照添加剤を使用しない試験実 験である。

表から明らかなように、３成分の混合物は等しい割合で単独で供給した３成分の いずれかがスライム層の減少したよりも顕著に大きく減少した。組合せは９１％ の圧力減少を示し、個々の成分は圧力降下においてわずか１５％〜３１％の減少 を生じるのみであった。

要約書 、　、　Ｎ＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１００８１１

Claims (43)

【特許請求の範囲】
1. １．水系中の少なくとも一種の固着した微生物により形成されたバイオフイルム を固体基体から除去または固体基体上の堆積を防止する方法であって、前記のよ うな除去または防止の必要性の認められる水系に、（１）少なくとも一種の酸性 プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼ、（２）少なくとも一種のグルコア ミラーゼまたはα−アミラーゼ、および（３）少なくとも一種の界面活性剤を接 触させる段階からなり、成分（１）、（２）および（３）の組合せが固着した微 生物を取り囲む多糖類物質を破壊することができる、前記方法。
2. ２．前記成分（１）、（２）および（３）成分の組合せが水溶液の形態にある請 求項１記載の方法。
3. ３．前記微生物が細菌である請求項１記載の方法。
4. ４．成分（１）がアスペルギルス・ニガ−（Ａｓｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ ）から誘導される少なくとも一種の酸性プロテアーゼである請求項２記載の方法 。
5. ５．成分（１）が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｌｉｌｉｓ）から誘導され る少なくとも一種のアルカリ性プロテアーゼである請求項２記載の方法。
6. ６．成分（２）が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｌｉｌｉｓ）から誘導され ろ少なくとも一種のα−アミラーゼである請求項２記載の方法。
7. ７．成分（２）がアスペルギルス・ニガ−（Ａｓｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ ）から誘導される少なくとも一種のグルコアミラーゼである請求項２記載の方法 。
8. ８．前記成分（１）である少なくとも一種の酸性プロテアーゼまたはアルカリ性 プロテアーゼがパインアップルの幹から誘導される請求項２記載の方法。
9. ９．少なくとも一種の前記酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼがエ ンドペプチダーゼである請求項２記載の方法。
10. １０．少なくとも一種の前記界面活性剤がアニオン界面活性剤である請求項２記 載の方法。
11. １１．前記アニオン界面活性剤がエーテルアルコールサルフェートまたはアルキ ルアリールスルホネートである請求項１０記載の方法。
12. １２．前記アニオン界面活性剤がアルキルアリールスルホネートであり、そして ドデシルベンゼンスルホン酸である請求項１１記載の方法。
13. １３．前記アニオン界面活性剤がエーテルアルコールサルフェートであり、そし てドデシル硫酸ナトリウムである請求項１１記載の方法。
14. １４．前記成分（１）の少なくとも一種の酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プ ロテアーゼ、前記成分（２）の少なくとも一種のグルコアミラーゼまたはα−ア ミラーゼおよび前記成分（３）の少なくとも一種の界面活性剤が等しい割合量で ある請求項２記載の方法。
15. １５．少なくとも一種の前記酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼが ＨＴ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７５である請求項２記載の方法。
16. １６．少なくとも一種の前記グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼがＤＩＡＺ ＹＭＥ　Ｌ−２００である請求項２記載の方法。
17. １７．少なくとも一種の前記グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼがアミログ ルコシダーゼである請求項２記載の方法。
18. １８．前記水が白水である請求項２記載の方法。
19. １９．前記水のｐＨがアルカリ性である請求項２記載の方法。
20. ２０．前記水のｐＨが酸性である請求項２記載の方法。
21. ２１．前記水系が抄紙機および関連する装置の一部である請求項２記載の方法。
22. ２２．前記水系が、水の貯蔵、清澄化、移動および熱交換装置を含む冷却水系で ある請求項２記載の方法。
23. ２３．前記水系が、水の貯蔵、清澄化、精製および移動装置を含む水精製系であ る請求項２記載の方法。
24. ２４．前記水系が、その水溶液が冷却、スチーム発生、工場内供給および処理加 工に使用きれる工場供給系である請求項２記載の方法。
25. ２５．前記基体には、銅合金、軟鋼、ステンレス鋼、ガラス、陶材またはプラス チックがある請求項２記載の方法。
26. ２６．（１）少なくとも一種の酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼ 、（２）少なくとも一種のグルコアミラーゼまたはα−アミラーゼ、および（３ ）少なくとも一種の界面活性剤を含む組成物であって、成分（１）、（２）およ び（３）の組合せが固着した微生物を取り囲む多糖類物質を破壊することができ る、前記組成物。
27. ２７．前記成分（１）、（２）および（３）の組合せが水溶液の形態にある請求 項２６記載の組成物。
28. ２８．成分（１）がアスペルギルス・ニガ−（Ａｓｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅ ｒ）から誘導されろ少なくとも一種の酸性プロテアーゼである請求項２７記載の 組成物。
29. ２９．成分（１）が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から誘導さ れる少なくとも一種のアルカリ性プロテアーゼである請求項２７記載の組成物。
30. ３０．成分（２）が枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）から誘導さ れる少なくとも一種のα−アミラーゼである請求項２７記載の組成物。
31. ３１．成分（２）がアスペルギルス・ニガ−（Ａｓｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅ ｒ）から誘導される少なくとも一種のグルコアミラーゼである請求項２７記載の 組成物。
32. ３２．少なくとも一種の前記酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼが バインアップルの幹から誘導される請求項２７記載の組成物。
33. ３３．少なくとも一種の前記酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼが エンドペプチダーゼである請求項２７記載の組成物。
34. ３４．少なくとも一種の前記界面活性剤がアニオン界面活性剤である請求項２７ 記載の組成物。
35. ３５．前記アニオン界面活性剤がエーテルアルコールサルフェートまたはアルキ ルアリールスルホネートである請求項３４記載の組成物。
36. ３６．前記アニオン界面活性剤がアルキルアリールスルホネートであり、そして ドデシルベンゼンスルホン酸である請求項３５記載の組成物。
37. ３７．前記アニオン界面活性剤がエーテルアルコールサルフェートであり、そし てドデシル硫酸ナトリウムである請求項３５記載の組成物。
38. ３８．前記成分（１）の少なくとも一種の酸性またはアルカリ性プロテアーゼ、 前記成分（２）の少なくとも一種のグルコアミラーゼまたはα−アミラーゼおよ び前記成分（３）の少なくとも一種の界面活性剤が等しい割合量である請求項２ ７記載の組成物。
39. ３９．少なくとも一種の前記酸性プロテアーゼまたはアルカリ性プロテアーゼが ＨＴ−ＰＲＯＴＥＯＬＹＴＩＣ−Ｌ−１７５である請求項２７記載の組成物。
40. ４０．少なくとも一種の前記グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼがＤＩＡＺ ＹＭＥ　Ｌ−２００である請求項２７記載の組成物。
41. ４１．少なくとも一種の前記グルコアミラーゼまたはα−アミラーゼがアミログ ルコシダーゼである請求項２７記載の組成物。
42. ４２．前記微生物が細菌である請求項２７記載の組成物。
43. ４３．前記組成物が非毒性である請求項２７記載の組成物。