JPH05507700A - 生物学的活性分子を同定するための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生物学的活性分子を同定するための組成物及び方法本発明は、分子生物学の領域 に属し、そして臨床業界において医薬品として利用されるであろう生物学的活性 分子を同定するための組成物及び方法を提供する。

分子生物学の主たる目標は、実用的な臨床的有用性を有する生物学的活性分子の 同定にある。分子生物学者に採用されている一般的手法はまず対象の生物活性体 を同定し、次いでこの活性体を純粋となるまで精製することにある。次に、この 分子がタンパク質であると仮定すると、このタンパク質をシーケンス化し、そし てこの配列情報を、この対象のタンパク質をコードする可能なコドン組合せを示 す合成りＮＡオリゴヌクレオチドを作り上げるために用いる。次にこのオリゴヌ クレオチドをプローブとして、このタンパク質を生産する生物起源に由来するメ ツセンジャーＲＮＡに由来するｃＤＮＡライブラリーを釣り出すために用いる。

このようにして同定したｃＤＮＡ配列を操作して、適切な発現系において発現さ せる。

第二のより近年の手法は発現クローニングと称され、これは対象のタンパク質の 精製及びシーケンス化、並びにｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするためにオ リゴヌクレオチドプローブを作り上げることをしていない。この手順はまず生物 学的活性分子の存在を確認し、メツセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡを作り上げ、 そしてこのｃＤＮＡを直接適切な発現ベクターの中にクローンすることにより成 る。このベクターは典型的には、このタンパク質の発現を現実化するために適切 な宿主細胞の中に導入又はマイクロインジェクトされている発現プラスミドであ る。このプラスミドのプールを生物活性についてアッセイし、そして活性を示す プールのサイズを狭くし、最終的には対象のタンパク質の発現する単一のクロー ンを単離する。

上記の手法とは別に、むろんタンパク質以外のよく知られた生物活性分子も当業 者によく知られている伝統的なスクリーニング手法を用いて常に数多く単離且つ スクリーンされている。更に、薬剤が同定され、そしてその化学構造が明らかと なった後、理論的な薬剤デザインによってこの薬剤のより活性な盟を合成する試 みがなされる。

既に、「エピトープライブラリー」が、ランダムなペプチドをコードする合成り ＮＡを繊維状ファージベクターの中にクローンすることによって作られうること が提案されている。Ｐａｒｍｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｍ１−ｔｈ、　１９８８．　Ｇ ｅｎｅ、　７３　：　３０５　、合成りＮＡをコートタンパク質遺伝子■の中に クローンすべきであることが提案され、その理由はコード化ペプチドはｐＩＩ［ の機能に育意に干渉することなく　ｐＨｒの一部となる可能性があるからである 。　ｐｍのアミノ末端側は、Ｅ、コリ（Ｅ。

ｃｏｌｉ）へのファージの感染の際に不線毛に結合することが知られている。こ のようなファージであってその細胞表層上にｐ■の一部としてランダムペプチド を保育且つ発現するものは、抗体によって認識されるエピトープを同定する手法 、特にこのライブラリーからのファージの精製を行うための抗体を用いる手法を 提供しつる。Ｐａｒ−ｍｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、　１９８９．　Ｇｅｎｅ 、　７３　：　３０５　ａ残念ながら、現在までこの手法は何ら育用な生物学的 活性分子を提供していない。

過去の研究者は、Ｅ、コリの外膜タンパク質、ＬａｍＢが遺伝子挿入によって変 化されて約６０個までのアミノ酸残基を有するバイブリドタンパク質を提供する ことができることを示している。Ｃｈａｒｂｉ　ｔ。

Ａ、、　１Ｊｏｌｌａ　Ａ、、５ａｕｒｉｎ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｈｏｆｎｕｎ ｇ、１９８８．　Ｇｅｎｅ、７０：　１８１゜この著者はこのような構造体が生 存細菌ワクチンを提供するのに用いられうろことを考えている。Ｃｈａｒｂｉｔ 、　Ａ、、　Ｂｏｕｌａｉｎ、　Ｊ、　Ｃ，Ｒｙｔｅｒ。

Ａ、　ａｎｄ　Ｈｏｆｎｕｎｇ、　Ｍ、、　１９８６．　Ｅ−λＩＢＯＪ、、５ 　（１１）　：　３０２９　：及びＣｈａｒｂｉｔ。

Ａ、、　５ｏｂｅｚａｋ、　Ｅ、、　Ｍｉｃｈａｅｌ、　Ｕ、Ｌ、、　ＩＪｏｌ ｌａ、　Ａ、、　Ｔｉｏｌｌａｉｓ、　Ｐ、、　ａｎｄＨｏｆｎｕｎｇ、　Ｍ、 、１９８７．　Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、、１３９（５）　：　１６５８をも参照の こと。

タンパク質生物活性分子、及び低分子量分子を同定するために現在用いられてい る手法は、その起源の多大なる認識を必要とし、このことはこのようなプロジェ クトの発展をしばしば制限する。従って、生物活性分子の同定を促進せしめ、そ の結果として有意なる実用的な薬剤の同定において広い用途を有するその他の方 法が熱望されている。

本発明の一観点は、生物活性ペプチドを同定するために用いられつるランダムペ プチドのライブラリーを作製する方法の詳細にある。

本発明の第二の観点は、このランダムペプチド配列をコードする合成りＮＡを適 切な発現ベクターの中にクローンすることによって、ランダムペプチドライブラ リーを作り上げるための方法及び組成物の詳細にある。

本発明の第三の観点はランダムペプチドライブラリーの詳細にあり、ここでこの ペプチドは感染性繊維状ファージの表層上において発現され１０＠種以上のラン ダムペプチド配列のスクリーニングを可能にする。

本発明の第四の観点は、約２Ｘ１０７種の１５残基ペプチドのランダムペプチド ライブラリーを用いる、ビオチン阻害性ストレプトアビジン結合ペプチドの同定 である。これらのペプチドはＨｉｓ　−Ｐｒ。

のジペプチドアミノ酸共通配列を有し、モしてＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎのトリペ プチドアミノ酸共通配列を有しうる。

本発明の第五の観点は、適切なファージタンノくり質を伴う融合タンパク質とし て発現されるランダムペプチドを有する定義する繊維状ファージ発現系の詳細に あり、このランダムペプチドはこのファージの正常な生物活性に実質的に干渉し ない。

本発明の第六の観点は、適切なファージタンパク質を伴う融合タンパク質として 発現されるランダムペプチドを存する定義の繊維状ファージ発現系の詳細にあり 、ここでファージタンパク質はこのファージの表層上で発現され、従ってこのラ ンダムペプチドは露出しており、従ってそれらの生物学的特性を決定するための スクリーニングの用意がなされている。

本発明の第七の観点は、適切なファージタンパク質を伴う融合タンパク質として 発現されるランダムペプチドを有する好適な繊維状ファージ発現系の詳細にあり 、ここでこのファージタンパク質はこのファージの表層上で発現され、そしてこ のランダムペプチドはこのファージタンパク質のアミノ末端領域に位置している 。アミノ末端領域でのランダムペプチドの配置は、生物学的活性に関するペプチ ドのスクリーニングを促進する。

本発明の第への観点は、適切なファージタンパク質を伴う融合タンパク質として 発現されるランダムペプチドを有する好適な繊維状ファージ発現系の詳細にあり 、ここでこのファージタンパク質はこのファージの表層上で発現され、そしてこ のランダムペプチドはこのファージタンパク質のアミノ末端領域に位置し、従っ て生物学的活性に関するペプチドのスクリーニングが促進され、ここでこの融合 タンパク質は以下の構造を有している：■−・・・・・ＲＲ・・・・−・・Ｌ・ −・・−・Ｖ１■は野生型ファージタンパク質のアミノ末端に見い出せる１又は 複数個のアミノ酸を表わし：ＲＲはランダムペプチド配列を表わし；Ｌはスクリ ーニング試薬へのこのランダムペプチド配列の提供を促進するスペーサー配列を 表わし、そしてｖｌはファージタンパク質のアミノ酸配列を表わしている。

上記に加えて、本発明の他の観点が以下に提供する本発明の詳細な説明を読むこ とによって明らかとなるであろう。

図１及び２はＭ１３ＬＰ６７の作製を示す。

表１は、ピリオンの表層上に存在しているストレプトアビジン結合性ペプチドを コードするＭ１３ＬＰ６７ビリオンの富化結果である。この表は、ピリオンがス トレプトアビジンへの一定のペプチドの結合を阻害することも示す。

表２はいくつかのストレプトアビジン結合ファージによってコードされるランダ ムペプチドの推定アミノ酸配列を示す。

本明細書に詳細する発明は既に公開されている文献及び係属中の特許出願を引用 している。例えばこのような文献は科学誌、特許又は係属中の特許出願より成る 。本明細書に挙げた全てのこれらの公開物及び出願は参考として本明細書に組入 れた。

本明細書に、ランダムペプチド配列より成るライブラリーを提供する方法を詳細 する。このライブラリーは特定の生物活性を有するペプチドの同定及び選別、並 びにリガンド特性を有する場合におけるこのようなペプチドをリガンド結合性分 子の単離及び精製のために用いることを含むあらゆる目的のために用いることが できる。リガンド結合性分子の例は可溶性又は不溶性細胞レセプター（即ち、膜 結合レセプター）であるが、結合活性を有すると考えられる酵素を含む実質的に あらゆる分子へと広めることができつる。

「細胞」又は「組換宿主」又は「宿主細胞」は本明細書から明らかな通り、しば しば同じ意味として用いられている。これらの語は直接の対象細胞及びむろんそ れらの子孫を含む。全ての子孫はその親細胞と全く同一でないことが理解され、 これは突然変異の機会又は環境の相違による。

宿主細胞培養物の説明において本明細書で用いられる「形質転換」なる語は、天 然タンパク質の活性を保有する外来タンパク質を生産するように遺伝子操作され た細胞を表わしている。形質転換化細胞の例は本出願の実施例に詳細されている 。細菌がタンパク質を生産するための好ましい微生物である。合成タンパク質も 適切に形質転換された酵母及び哺乳類宿主細胞によって作られつる。

「作動連結されたノとは構成成分の正常な機能が行われるような並列に関する。

従って、コントロール配列に「作動連結された」コード配列とは、このコード配 列がこれらの配列のコントロールのもとて発現されつる形態を意味する。

「コントロール配列」とは、特定の宿主生物における、作動連結されたコード配 列の発現にとって必要なりＮＡ配列を意味する。原核細胞にとって適切であるコ ントロール配列には、プロモーター、任意にオペレーター配列、リポソーム配合 部位、及び可能としてその他の未だあまりよく理解されていない配列が含まれる 。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサ−を用いる ことで知られている。

「発現系」とは、作動連結において所望のコード配列及びコントロール配列を含 むＤＮＡ配列を意味し、従ってこのような配列によって形質転換された宿主はコ ード化タンパク質を生産することが可能である。形質転換を行うため、この発現 系はベクター上に含まれていることがある：しかしながら、近親のＤＮＡは宿主 染色体の中に組込むこともできる。

「成熟」タンパク質なる語は当業界に知られ、そしてこれは生体内又は生体外合 成の最中にタンパク質のペプチドセグメントが除去されたタンパク質を意味する 。

本発明の一態様は、ランダムペプチドのライブラリーを作製するための方法及び 組成物の詳細であり、これはこのランダムペプチド配列をコードする縮重コード 配列を有する合成りＮＡを、このランダムペプチド配列の調節及び発現のための 作動連結状態におけるコントロール配列を有している適切な発現ベクターの中に クローンすることより成る。次にこのベクターを、このランダムペプチド配列の 発現に適合する適切な宿主細胞の中に挿入する。例えば、このベクターの性質に 依存して、これは宿主細胞の中にトランスフェクト、形質転換、エレクトロボレ ート、又はその他の手法において挿入されつる。このランダムペプチド配列は融 合タンパク質構造体の一部として発現されうる。その後、このランダムペプチド 配列を保有している細胞を選別し、単離し、そして増殖する。このランダムペプ チド配列は可溶性又は不溶性型（即ち、膜結合型）において発現されることがで き、そして所望するなら、その特性の同定を目標とする生物学的スクリーンに利 用する前に精製する。

このランダムペプチドをコードする好ましい態様の合成りＮＡ＠重コード配列は 次式によって例示される：（ＮＮＳ）Ｘ ＮはデオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの等量混合物であるか、又は等量の Ａ、Ｔ、Ｃ１及び八より約３０％過剰なＧより成る混合物のいづれかである。Ｓ はＣ及びＧの等量混合物である。Ｘはランダムペプチド配列を構成するアミノ酸 残基の数であり、そしてこれは同定すべきランダムペプチドの特徴に依存して変 わりつる。

好ましくはＸは６以上であるが、１６以下である。しかしながら、これがこのラ ンダムペプチドの好ましいサイズではあるが、より大きいペプチドも、以下の詳 しく説明する通り、本発明の範囲に属することが明らかである。

もしこのランダムペプチドが融合タンパク質の一部として作製されるどき、この ランダムペプチドをコードする合成りＮＡ縮重コード配列を含む好ましい作製体 は次式によって例示される：■−・・・（ＮＮＳ）Ｘ ■は成熟タンパク質のアミノ末端にて見い出せる（複数の）アミノ酸をコードす るヌクレオチド配列であり、これに縮重コード配列が融合されている；Ｎはデオ キシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＴの等量混合物であるか、又は等量のＡ、ＴＳ Ｃｌ及びＡより約３０％過剰なＧより成る混合物のいづれかである。ＳはＣ及び Ｇの等量混合物である。Ｘはランダムペプチド配列を構成するアミノ酸残基の数 であり、そしてこれは同定すべきランダムペプチドの特徴に依存して変わりうる 。好ましくはＸは６以上であるが、１６以下である。

このランダムペプチド配列のサイズは数多くのパラメーターに依存して変わりう ろことを認識することが重要であり、且つ当業者にとって明らかであろう。重要 な代表的パラメーターは、融合標的であるタンパク質の性質である。もしこのよ うなタンパク質が、このランダムペプチドライブラリーの形成に貢献する生物学 的活性を有するなら、このランダムペプチドインサートのサイズの決定はそれが 有害な生物学的作用を有するかとうかによる。例えば、Ｅ、コリの外膜タンパク 質ＬａｍＢは、インサートを有する約６０個のアミノ酸残基までのバイブリドタ ンパク質を提供するように遺伝子挿入によって変えられうろことが知られている 。Ｃｈａｒｂｉｔ、　Ａ、、λ１ｏｌｌａ　Ａ、。

５ａｕｒｉｎ、　Ｗ、、　ａｎｄ　Ｈｏｆｎｕｎｇ、１９８Ｂ、　Ｇｅｎｅ　７ ０　：　１８１　ｏ　６０残基数より大きいＬａｍＢは有意なる生物活性を失う 。

より好ましい態様のランダムペプチドカセットが融合タンパク質の一部として発 現されることができ、これは以下の式を有する：Ｖ　−−（Ｎ　Ｎ　Ｓ　）　ｘ 　−−Ｌ　−Ｖ　ｉ■及び（ＮＮＳ）ｘは前記した通りであり、Ｌはこのランダ ムペプチドの活性構造の保持を促進せしめ、且つスクリーニング試薬にこのラン ダムペプチドを提供するのに働くアミノ酸スペーサー配列である。ｖｌはタンパ ク質のコード配列であり、これに作製体が融合する。

この合成りＮＡ縮重コード配列は既知のオリゴヌクレオチド合成技術を用いて調 製される。例えば、合成ヌクレオチドはλ１ａｔｔｅｕｃｃｉら、１９８１．　 Ｊ、　Ａｍ、　Ｓｏｃ、　１０３　：　３１８５のトリエステル法によって調製 するか、又は商業的に入手できる自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて調製 する。

本発明の好ましい態様において、前記した作製体は、このペプチドを適切な支持 体にコンジュゲートせしめることを促進せしめるであろうシスティンをコードす るようにデザインすることができることが注目される。これは別言すれば、ペプ チドを固相に固定することが有利であるアッセイ形式において、このペプチドの 生物学的特性をアッセイすることを促進せしめる。

種々のベクターがこのランダムペプチド配列をクローン且つ発現するために用い られつる。このランダムペプチドをコードする合成りＮＡは最も好ましくはウィ ルスベクターに、そしてより好ましくはバクテリオファージベクターにクローン する。このランダムペプチドを融合タンパク質として発現すべきとき、好ましい ウィルスベクターはλｇｔシリーズ、好ましくはｇｔｌｌ又はλｇｔ　１１　Ｓ ｆｉ　−Ｎｏｔ（プロメガ）を含むその誘導体、及び繊維状バクテリオファージ ベクター、好ましくはＭ２Ｓ、及びｆｄである。最も好ましいのはＭ２Ｓ又はぐ の誘導体である。

λｇｔｌ［において融合タンパク質の一部として発現されるランダムペプチドは 、好ましくは合成りＮＡを、適当な標的タンパク質例えばβ−グリコシダーゼの カルボキシル終止末端をコードする遺伝子の領域にて制限部位にクローンするこ とによって現実化される。

ここで得られる融合タンパク質を、好都合には標準のλｇｔ　１１スクリーニン グアツセイ、好ましくはＤａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ ，Ａの米国特許第４，７８８．１３５号に詳細されている方法を用いてアッセイ する。

好ましい実施態様の融合タンパク質構造は、ランダムなペプチド配列がファージ 表面タンパク質中にクローン化されているフィラメント状バクテリオファージか ら成る。これは、ファージの一部としてランダムなペプチド配列をスクリーニン グする上で有利であり、とりわけ、そのファージを１０１２フアージ／　ｍ　１ 以上でアフィニティーマトリックスにアプライし、よって大量にスクリーニング することができるので有利である。第二に、特定のファージ集団をアフィニティ ーマトリックスから取り出して、実質的な感染活性を維持することができるので 、続く適当なバクテリア宿主の感染によってランダムなペプチドを増幅すること ができる。

いくつかの理由のため、好ましいファージ表面タンパク質は、フィラメント状フ ァージの遺伝子■にコードされている少量のコートタンパク質である。例えば、 ファージの感染性を有意に損なうことなく、外来の抗原エピトープを遺伝子■の 中央部で発現させることがてきる。Ｐａｒｍｌｅｙ及びＳｍ１ｔｈの１９８８年 、Ｇｅｎｅ、７３　：　３０５を参照のこと。さらに、１ヴイリオン当たり５コ ピーの遺伝子■タンパク質がＥ、　ｃｏｌｉ中で発現するので、多コピーを以下 に記載するスクリーニングアッセイにおける検出に利用できる。

ランダムペプチドライブラ・リーを構築するために使用された本発明の好ましい 実施態様のベクターは、λ１１３ＬＰ６７と呼ばれるｕ１３ｍｐ１９の誘導体で ある。このベクターの構築、並びにランダムペプチドをコードする合成変性オリ ゴヌクレオチドのクローニングは、熟練の分子生物学者が普通に採用する技法に よって行った。リーダーは、（１９８２年及び１９８９年、ｖｏｌｕｍｅ　１及 び２）を特に参照した。さらに、本明細書に記載されている多くの材料及び方法 は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　＆ングするための、またクローン化された遺伝子を発現す るためのベクターに関する方法をカバーしている。特に注目すべきものは第１５ ４巻であり、それは、遺伝子の特性決定に有用なｃＤＮＡのクローニング方法、 各種クローン化遺伝子の同定方法及びマツピング技法、オリゴデオキシヌクレオ チドの化学合成及び分析、突然変異誘発、並びにタンパク質工学について記載し ている。最後に、第１５５巻は、制限酵素、特に最近発見されたものに関する記 載、並びにＤＮＡ配列分析のための方法を提供している。本明細書ではこれらの 参考文献の全体を取り入れ、また以下に記載する別の文献も取り入れる。

より詳細には、所望のランダムコード配列を含有する適当なベクターの構築は、 単離したベクター、ＤＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドを切断し、仕立 て、そして所望の形態に再連結する標準的な連結及び制限方法を採用する。

部位特異的なりＮＡ切断は、当該技術分野で一様に理解されている条件下て適当 な制限酵素を用いて処理することによって行われるが、その詳細については、こ のような市販の制限酵素の製造業者によって明記されている。例えばＮｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　ＰｒｏｄｕｃｔＣａｔａｌｏｇを参照のこと 。一般に、約２０μｌの緩衝液中の１ユニツトの酵素によって約ｌμｇのプラス ミドまたはＤＮＡ配列が切断される。本明細書の実施例では、典型的には、過剰 量の制限酵素を使用してＤＮＡ基質を確実に完全に消化している。約３７°Ｃで 約１〜２時間のインキュベーション時間が使用可能であるが、変動は許容できる 。各インキュベーション後に、タンパク質は、フェノール／クロロホルムによる 抽出によって除去され、また続いてエーテル抽出されることができ、そして核酸 は、エタノール沈澱に続＜　５ｅｐｈａ−ｄｅｘ　Ｇ−５０スピンカラムを用い たクロマトグラフィーによって、水性分画から回収される。所望であれば、標準 的な技法を使用するポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動によ って、切断済フラグメントの寸法分離を行うことができる。寸法分離に関する一 般的な説明は、λ１ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　１９８０． ６５．　：　４９９−５６０に記載されている。

制限切断されたフラグメントは、５０ｍ！Ｊ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７，６，５０ｍＭ Ｎａｃｌ、６　ｍＭ　＆１ｇＣ１ｚ、６　ｍｌｊ　ＤＴＴ及び１０　ｍＭ　ｄＮ ＴＰｓ中、２０〜２５℃で、約１５〜２５分のインキュベーション時間を用いて ４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）の存在において、 Ｅ、　ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ■の巨大フラグメント、すなわち、Ｋｌｅｎ ｏｗフラグメントで処理することによってグラ２ト末端化すること脇できる。　

・Ｋｌｅｎｏｗでの処理後、その混合物をフェノール／クロロホルムで抽出して エタノール沈澱する。適当な条件下で３１ヌクレアーゼを用いて処理すると、１ 本鎖部分の加水分解が得られる。

連結を１５〜３０μｍ体積で以下の標準的条件及び温度において行った：　２０ ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣ１，，１０ｍＭ　ＤＴＴ 、３３　ａｇ　／ｍｌ　ＢＳＡ、Ｉ　Ｏｍ＾（−５０ｍ＾ＫＮａＳＩ、そしてｒ 接着末端Ｊ連結については１４°Ｃでｌ　ｍＭ　ＡＴＰ、　０．３−０．６（Ｗ ｅｉｓｓ）単位の７４ＤＮＡリガーゼを、またはＦプラント末端ノ連結について はｌ　ｍＡＩ　ＡＴＰ及び０、３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位Ｔ４リガーゼを使 用した。分子間「接着末端」連結は、３３〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ１１度 で通常行われる。プラント末端連結では、末端の全ＤＮＡ濃度は約１μ八（であ る。

「ベクターフラグメント」を使用するベクターの構築では、５′ホスフエートを 除去してベクターの再連結を防止するために、ベクターフラグメントを細菌のア ルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）で処理するのが普通である。ＢＡＰ消化は、Ｎ ａ＋及びＭｇ“２の存在において、約１５０ａｔｆ　Ｔｒｉｓ中のｐＨ８で、ベ クタ−１μｇ当たり約１単位のＢＡＰを使用して６０°Ｃで約１時間行われる。

核酸フラグメントは、その調製物をフェノール／クロロホルムで抽出し、次いで エタノール沈澱することによって回収される。代わりに、望ましくないフラグメ ントの別の制限酵素消化により二重消化されたベクターにおいて再結合を防止す ることができる。

所望の制限部位を導入するために特定の配列修飾を有するベクターの部分につい ては、部位特異的プライマー誘導突然変異誘発を使用した。例えば、λＩＩ　３ ｍｐ　＋　９を修飾して制限部位を導入し、Ｎ（１３ＬＰ６７を作製することが 望ましい。現在は部位特異的プライマー誘導突然変異誘発は当該技術分野では標 準的であり、そして限定された誤対合を除いて突然変異誘発されるべき１本鎖フ ァージＤＮＡに相補的なプライマー合成オリゴヌクレオチドを使用して行われる 。簡単に言うと、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、ファージ に相補的な鎖を直接合成し、そして得られた２本鎖ＤＮＡでファージを担持して いる宿主細菌を形質転換する。形質転換された細菌の培養物を寒天上で平板培養 し、ファージを有する単一細胞からプラークを形成させる。〜 理論的には、新規プラークの５０％が、１本鎖として突然変異型を有するファー ジを含有し、５０％が元の配列を有する。そのプラークをニトロセルロースフィ ルターに移し、そして正確な対合のハイブリダイゼーションは許容するが、元の 鎖との誤対合がハイブリダイゼーションを防止するのに十分である温度において 、キナーゼ化された合成プライマーを用いてｒリフトノハイブリダイズする。

次いて、そのプローブとハイブリダイズするプラークを拾い、培養し、そしてＤ ＮＡを回収する。

部位特異的突然変異誘発の手順については、以下の特別な実施例において記載す る。しかしながら、部位特異的突然変異誘発は、当該技術分野で周知のいくつか の手順を採用して行うことができる。

これらの技法は、Ｓｍ１ｔｈ、　１９８５．　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｌｅｗ　ｏ ｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、　１９　：４２３に記載されており、またその技法のい （つかの改変が、λ１ｅｔｈｏｄｓｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＩｏｇｙ、　Ｊ５４．　 ｐａｒｔ　Ｅ、　Ｎｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ纒（１９８７）の第１７．１ ８．１９及び２０章に記載されている。好ましい手順の一つは、Ｇａｐｐｅｄ　 Ｄｕｐｌｅｘ部位誘導突然変異誘発法の変法である。その一般的手順については 、上述のＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１７章においてＫｒ ａｍｅｒらが記載している。

Ｍ１３はウィルス又はプラスミドにより増殖され、プラスミドとして増殖される 場合、プラスミドを宿す細胞の同定を促進するため、適当な標識遺伝子を有する ことが望ましい。典型的標識遺伝子は、β−ラクタマーゼであり、ポリメラーゼ 鎖反応（ＰＣＲ）増幅によりプラスミドｐｕｃ　１９又はｐＡｃ　５から得られ る。ｐＡｃ　５はＷＯ３９１０１０２９に記載されている。これは適当なプライ マー及び当該分野において又は米国特許第４．６８３．１９５号（１９８７年７ 月２８日）　、４，６８３．２０２号（１９８７年７月２８日）、及び４．８０ ０．１５９号（１９８９年１月２４日）に開示された公知の標準方法を用いて増 幅される。熱安定性Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメ ラーゼの使用を含むこの方法の改良は、欧州特許出願Ｎｏ、２５８０１７　（１ ９８８年３月２日）に記載された。ＰＣＲは欧州特許出願Ｎｏ、　２３６０２９ （１９８７年９月９日）に記載されたサーマルサイクラ−装置（Ｔｈｅｒｍａｌ 　Ｃｙｃｌｅｒ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔＸＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕ ｓ）を用いて行われる。

以下に示す構成において、正確な連結反応は、まず連結反応混合物により適当な Ｅ、　Ｃｏ１１株を形質転換することにより確認される。

好ましい形質転換細胞は、当該分野において理解されているように、アンピシリ ン、テトラサイクリンもしくは他の抗生物質に対する耐性により、又はプラスミ ド構成の態様に依存する他の標識を用いて選ばれる。ミニブレブ（ｍｉｎｉｐｒ ｅｐ）ＤＮＡは、Ｄ、　Ｉｓｈ−ＨｏｗｏｗｉｃｚらのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、、　９　：　２９８９の方法により形質転換細胞より製造され、 制限により分析され、及び／又はＦ、　Ｓａｎｇｅｒらの１９７７、　Ｐｒａｃ 。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　７４　：　５４６３、ｌｊｅｓ ｓｉｎｇらの１９８１．　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ　Ｒｅｓ、　９　：　３０９ 、又はＭａｘａｍらの１９８０λ１ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 。

６５　：　４９９に記載された方法により配列決定される。

Ｍ１３及び誘導体の増殖に用いられる宿主株は、Ｅ、　Ｃｏ１１　Ｋ１２株ＤＧ ９８、及びＭＭ２９４のｒｅｃＡ、　ｓｕｐ’　、Ｆ’　、　Ｋａｎ’誘導体で ある株Ｈ２４９のようなファージ感染されやすいＥ、　Ｃｏ１１株を含む。Ｈ２ ４９セルはセルが分極される場合に好ましい。ＤＧ９８はＮｏ、１９６５として １９８４年７月１３日に寄託された。

用いる宿主細胞によって、形質転換はそのような細胞に適した漂準方法を用いて 行われる。好ましい方法は、Ｄｏｗｅｒらの１９８８．　Ｎｕｃ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１６　：　６１２７に記載された低電導性溶液内での 電気分極である。通常有効な電気分極機を用いてよく、例えばＢＴＸ製のもので ある。しかし、他の方法も用いてよい。例えば、Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、らの １９７２、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｉｃ、（ＵＳＡ）　６９ 　：　２１１０に記載されているような塩化カルシウムを用いるカルシウム処理 、及びＨａｎａｈａｎ、　Ｄ。

の１９８３．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１６６：５５７−５８０に記載 されているような改良法を細胞壁バリヤーを含む原核生物もしくは他の細胞に用 いてよい。そのような細胞壁を有しない哺乳動物細胞には多くの形質転換法が有 効である。Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂの１９７８．　Ｖｉｒ ｏｌｏｇｙ、　５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が１つの方法である。形 質転換はリン酸カルシウム同時沈澱法の改良法（Ｗａｎｇら、１９８５．５ｃｉ ｅｎｃｅ　２２８：　１４９）を用いて行ってよい。他の形質転換法はＤＥＡＥ −デキストランの使用を含む（Ｓｏｍｐａｙｒａｃ、　Ｌ、　Ｍ、ら、１９８１ ．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｉ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７８　：　７５７５−７５７８）。また、リポフェクション（Ｌｉｐｏ ｆｅｃｔｉｏｎ）はプラスミドＤＮＡを宿主細胞に移すため脂肪マトリックスを 用いる形質転換法を意味する。脂肪マトリックスはりボッエフチン試薬を意味し 、ＢＲＬより入手可能である。リボフエクチン試薬は１ｍｇ／ｍｌの脂肪（ＤＯ ＴλＩＡ　：　ＤＯＰＥ、５０　：　５０）を含む水溶液（脱イオン水及び滅菌 濾過水）を含む。このリポソーム媒介形質転換は、本質的にＦｅｌｇｎｅｒ。

Ｐ、　Ｌ、ら、１９８７．　Ｐｅｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　 ＵＳＡ、　８４　：　７４１３に記載の方法によって行われる。リボフエクチン 試薬及びＤＮＡは、材料が濃すぎる場合に起こる全体の凝集を避けるために血清 フリー媒体に別々に希釈される。例えば、０．５ＸＩＯ’個の細胞は６０ｍｍの 組織培養皿に接種され、そして１〜２０μｇのＤＮＡを含む１．５ｍｌの血清フ リー媒体及び約３０μｇのりボッエフチンを含む１．５ｍｌの血清フリー媒体の 第二の溶液が製造される。希釈されたＤＮＡ及びリポフエクチン溶液は混合され 、細胞上に加えられる。形質転換は血清により阻害されるので、細胞はりボッエ フチン／ＤＮＡ混合物を加えるまえに血清フリー媒体によりよく洗浄される。

特定のランダムペプチドの特性によって、１種以上のアッセイ法を用いてアッセ イされる。通常、ランダムペプチドを検出することを目的とするこの方法は、適 当な結合分子を結合するその能力によってランダムペプチドを検出する。これは 、ランダムペプチド結合活性についてテストされる分子である。アッセイ形式に よって、ラベルしてもよくしなくてもよい。さらに、そうすることを望む場合、 アッセイに用いる前にランダムペプチド配列を精製してよい。

ランダム配列が融合した蛋白、好ましくはフィラメントウィルス表面蛋白の一部 である場合、ランダムペプチド配列の存在は選ばれた結合分子へのウィルスの結 合、及び結合した及び結合していないウィルスを分離することにより示される。

このようにして、重要なランダムペプチドを含むウィルスは分離され、その後好 適な宿主細胞の感染により増幅される。ランダム配列、並びに予想されるアミノ 酸配列をコード化するウィルスは、ポリメラーゼ鎖反応及びＤＮＡ配列を含む陣 準法を用いて得られる。

ウィルスを発現するランダムペプチドもラベルした結合分子を用いて明らかにさ れる。ウィルス融合蛋白、好ましくはラムド（ｌａｍｂｄａ）バクテリオファー ジに用いたように、１つの方法は、Ｄａｖｉｓ、Ｒ，Ｗ、　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ 、Ｒ，Ａ、の米国特許第４．７８８．１３５号に記載された方法と同様である。

ここでレプリカ培養したファージブラックはラベルされた結合分子と接触される 。ランダムペプチド配列を発現するファージにより形成される融合蛋白はラベル された結合分子を結合し、そしてコード化するファージは同定され、分離され、 そしてレプリカプレートから成長される。

上記精製法の各々はランダムペプチドをコード化するウィルスを増やすため、何 度も繰り返してよい。

結合分子は用いられる条件、好ましくはランダムペプチド配列が支持マトリック スに結合した場合において結合分子の検出を許容するあらゆるタイプのラベルで ラベルしてよい。通常、このラベルは測定可能なそしてサンプル内に存在するラ ンダムペプチドの量に相関してシグナルを直接又は間接的に与える。例えば、直 接測定可能なラベルは、放射ラベル（例えば１２５１．３ＳＳ、＋４（等）を含 む。

好ましい直接測定可能なラベルは結合分子に結合しこ酵素であり、これは適当な 基質（例えばワサビペルオキシダーゼ／叶フェニレンジアミン）の存在下で色反 応を与える。間接的測定可能なラベルの例は、ビオチニル化された結合分子であ る。このラベルの存在は、ラベルされたアビジン錯体を含む溶液と接触させるこ とにより測定される。これにより、アビジンはビオチニル化結合分子に結合する 。

次いて、アビジンと結合したラベルが測定される。間接的ラベルの好ましい例は 、アビジンに結合した酵素、上記のような色反応を与える酵素を用いるアビジノ ／ビオチンシステムである。他の検出方法も用いてよい。例えば、アビジンは適 当なラベルされたアビジン結合抗体を用いて検出される。

以下の例は本発明の実施の種々の方法を説明する。しかし、特定の材料及び方法 を示すそのような例を示すことは本発明を限定するものでないことは、当業者に 理解されるであろう。同様に行ってよい多くの変形が存在することも当業者に公 知である。

実施例■ 次の構造を有する縮重オリゴヌクレオチドを合成し、当業界で既知の方法を使っ て精製した： ５　’　ＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴＣＣＧＣＴＧＡＡ（ＮＮＳ）　、　５ ＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣ３’５　’　ＧＧＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴ ＧＧＡＧＧＣＧＧ（ＸＸＸ）　Ｉ　ｆｉＴＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡ ＧＡＡＡＧＧＴＡＣ３’ （ＮＮＳ）＋ｓの合成の間は、Ｎとして等量のデオキシヌクレオチドＡ、Ｃおよ びＴ並びに約３０％多いＧから成る混合物を使用し、モしてＳとしてＣとＧの等 全混合物を使用した。Ｘはデオキシイノシンであり、これは４塩基Ａ、　Ｇ、Ｃ およびＴの各々と塩基対を作る能力があるために使った。Ｒｅ１ｄｈａａｒ−０ １ｓｏｎ、　Ｊ、Ｆ、、および５ａｕｅｒ。

ランダムペプチド配列をコードするヌクレオチド配列の直前には、アラニンとグ ルタミン酸残基をコードするヌクレオチド配列がある。

それらのアミノ酸は、Ｍｌ３の野生型成熟遺伝子■の最初の２つのアミノ末端残 基に相当し、よって下記のように製造する融合タンパク質の生産を促進し得るた めに含めた。

ランダムペプチド配列の直後には、６つのプロリン残基をコードするヌクレオチ ド配列がある。よって、該オリゴヌクレオチドは次のアミノ酸配列をコードする ： Ｈ２Ｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ−Ｚｚｚ＋ａ　ＰｒｏｓＺｚｚは縮重ＤＮＡ配列により コードされるアミノ酸を表わす。後述するように、このオリゴヌクレオチドをＭ ｌ３の誘導体中にクローニングし、上記アミノ酸配列を有し且つその上プロリン 残基の後ろに完全な野生型成熟遺伝子■を有する成熟融合タンパク質を生産せし めた。

ランダムペプチド／遺伝子■融合タンパク質構成物を発現させるのにプラスミド Ｍ１３　ＬＰ６７を使った。Ｍｌ３　ＬＰ６７は図１と２に示されるようにして Ｍ１３ａ＋ｐ１９から誘導した。

簡単に言えば、Ｍ１３ｍｐ１９を２つの経路で変更した。第一の変更は、マーカ ー遺伝子であるβ−ラクタマーゼ遺伝子をウィルス粒子のポリリンカー領域に挿 入することから成った。これは、プラスミドｐＡｃ　５からＰＣＲ増幅により前 記遺伝子を得ることから成った。ｐＡｃ　５鋳盟にアニーリングされたオリゴヌ クレオチドブライマーは次の配列を有する： ５　’　ＧＣＴＧＣＣＣＧＡＧＡＧＡＴＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣ ＴＴＧＧ　３　’５　’　ＧＣＡＧＧＣＴＣＧＧＧＡＡＴＴＣＧＧＧＡＡＡＴＧ ＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣ３’β−ラクタマーゼ遺伝子の増幅コピーを制限酵素 ＢｇｌＵとＥｃｏＲＩで消化し、そして変更されたＭ１３ｍｐ１９の複製形態を ＢａｍＨＴＥｃｏＲＩて消化した。所望の断片を電気泳動により精製し、連結せ しめ、そしてＥ、コリ株ＤＨ５α（ＢＲＬ）中に形質転換せしめた。

挿入断片を含むファージにより形質転換されたＥ、コリをアンピシリンプレート 上て選択した。こうして生産されたファージをＪＤ３２と命名した。

このファージプラスミド形ｕ　ｐＪ　Ｄ　３２　（Ｍ　１３　ｍｐ１９　Ａｍｐ ’）を、２つの制限部位ＥａｇｒとＫｐｎＩがこの領域にコードされるアミノ酸 を変えずに遺伝子■の中に導入されるように、突然変異誘発せしめた。前記制限 部位は、Ｉ　ｎｎ１Ｓ、　Ｍ、ら、“ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ−Ａ　Ｇｕｉｄ ｅｔＯλ１ｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９９０）− 、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｉｎｃ、により記載された標準的ＰＣＲ試 験管内突然変異誘発技術を使って導入した。

１６１１位置の配列ＴＧＴＴＣＣをＧＧＴＡＣＣに変えることによりＫｐｎ１部 位を作製した。この突然変異誘発を行うのに使った２つのオリゴヌクレオチドは 次の配列を有する： Ｌ　Ｐ　１５９　：　ＡＡＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＴＣＬ　Ｐ　１ ６２　：　ＡＧＡＡＴＡＧＡＡＡＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＡＡＧＧＡＥａｇｌ制限 部位を作製するために、次の２つのオリゴヌクレオチドを使って、ｐＪＤ３２の １６３１位の配列ＣＣＧＣＴＧをＣＧＧＣＣＧに変更した： Ｌ　Ｐ　＋６０　：　ＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＣＣＴＴＴＣＴＡＴＴＣＴＣＡＣＴ ＣＧＧＣＣＧＡＡＡＣＴＧＴＬ　Ｐ　１６１　：　ＡＡＡＧＣＧＣＡＧＴＣＴＣ ＴＧＡＡＴＴＴＡＣＣＧより詳しくは、プライマーＬ　Ｐ　１５９とＬＰ１６２ およびＬＰ１６０とＬ　Ｐ　１６１を使って得られたＰＣＲ生成物を、それぞれ ＢｓｐＨＩとＫｐｎＩおよびＫｐｎＩとＡｌｗＮＩて消化した。それらの消化物 を予めＢｓｐＨＴとＡＩｗＮＩで切断したＭＩ３ｍｐ１９にＴ４リガーゼを用い て連結せしめ、Ｍ１３ｍｐＬＰ６６を得た。このベクターは所望のＥａｇＩおよ びＫｐｎＩ制限部位を含むが、アシピシリン耐性遺伝子であるβ−ラクタマーゼ 遺伝子を欠いていた。ｐＪＤ３２をＸｂａｌとＥｃｏＲＩて消化することによっ て該ベクターからβ−ラクタマーゼ配列を除去することにより、ＥａｇｌとＫｐ ｎｌ制限部位並びにβ−ラクタマーセを含むベクターＭ１３ｍｐＬＰ６７を作製 した。次いでβ−ラクタマーゼ遺伝子を、ＸｂａＩとＥｃｏＲＩで予め消化され たＭｌ　３ｍｐＬＰ６６のポリリンカー領域中に挿入した。Ｔ４リガーゼを用い たその後の連結によりＭ１３ｍｐＬＰ６７を作製し、これを使ってランダムペプ チドライブラリーを作製した。図１と２はＭ１３ｍｐＬＰ６７の作製を概略的に 示す。

実施例■ ランダムペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を有するファージを製造するため に、Ｍｌ３　ＬＰ８７をＥａｇＩとＫｐｎＩで消化し、そして上記実施例Ｉに記 載の通り製造したオリゴヌクレオチドに連結せしめた。連結混合物は、４５ｍｇ ／μｌの消化Ｍ１３ＬＰ６７　ＤＮＡ、５倍モル過剰のオリゴヌクレオチド、３ ．６Ｕ／μＩのＴ４リガーセ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）　 、２５　ｍｌｊ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，８）、１０ｍｌ１０ｍ１Ｊ、、２ｎｔｌＤ ＴＴ、０．４ｄＡＴＰおよび０　、　１　ｍｇ／ｍｌのＢＳＡから成った。連結 混合物に加える前に、個々のオリゴヌクレオチドを混合し、９５°Ｃで５分間加 熱し、続いて１５μｌアリコートにおいて室温に冷却した。次に、連結混合物を 室温で４時間インキユベートシ、続いて１５°Ｃで一晩インキユベートした。こ の混合物を後述のようにしてＥ、コリ中にエレクトロポレーションせしめた。

Ｍｌ３　ＬＰ６７　ＤＮＡは、本質的にはＤｏｗｅｒ、　Ｗ、、　Ｊ、Ｊ、Ｍｉ ｌｌｅｒ。

Ｊ、　Ｆ、およびＲａｇｓｄｌｅ、　Ｃ，Ｗ、、　１９８８．　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１６：６１２７に記載された通りにＨ２４ ９細胞中にエレクトロポレーションせしめた。Ｈ２４９細胞はＭＭ２４９のｒｅ ｃＡ、　ｓｕｐ’　、　Ｆ’　Ｋａｎ”誘導体である。簡単に言えば、４Ｘ１０ ”ｆｌｌのＨ２４９細胞と１８ｇのＭｌ３　ＬＰ６７　ＤＮＡをｌ　ｍＭ　Ｈｅ ｐｅｓから成る低電導率溶液８５μｍ中で混合した。この細胞／λ（１３ＬＰ６ ７　ＤＮＡ混合物をＢＴＸエレクトロポレーション装置（ＢＴＸ　Ｃｏｒｐ、） の冷却０．５６ｍｍの間隙電極中に入れ、５６０ボルトの５ミリ秒パルスにかけ た。

エレクトロポレーションの直後に、電極集成体から細胞を取り出し、新しいＨ２ ４９芝細胞と混合し、４００ｃｍ”プレートあたり約２×１０ａプラークの密度 で平板培養した。翌日、各プレートから３０＋＋＋１の新鮮培地を使ってファー ジを溶出させ、ＰＥＧて沈澱させ、２０％グリセロール中に再懸濁し、−７０℃ で保存した。約２．８×１０７ブラークを収穫し、数百プラークを分析してラン ダムペプチド配列を有するおよその数を決定した。ランダムペプチド配列をコー ドする領域においてＤＮＡを増幅させるためにポリメラーゼ連鎖反応を使った時 、約５０〜９０％のファージが遺伝子■の５′末端に６９塩基対の挿入断片を含 むことが決定された。このことは、ランダムペプチド配列をコードするオリゴヌ クレオチドの存在を確証する。ＰＣＲ反応は標準技術を使ってそして次のオリゴ ヌクレオチドを用いて実施した： ５　’　ＴＣＧＡＡＡＧＣＡＡＧＣＴＧＡＴＡＡＡＣＣＧ３　’５　’　ＡＣＡ ＧＡＣＡＧＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧ　３　’反応を４０サイクル行った 後、２％アガロースゲル中での電気泳動により生成物を分離した。それらの結果 に基づくと、２．８Ｘ１０”プラークからのファージが約２Ｘ１０７種の異なる ランダムアミノ酸配列をコードすると計算された。

実施例■ ファージによりコードされるランダムペプチドの特性法のようにしてランダムペ プチドライブラリーをストレプトアビジンへのペプチド結合性についてスクリー ニングした。ストレプトアビジンを固体母材に結合し、当業界で公知の酸物選抜 （バイオパンニング）技術を使って表面上でストレプトアビジン結合性ペプチド を有するファージをスクリーニングするのに使用した。この方法は本質的にはＰ ａｒｍｌｅｙ、　Ｓ、Ｆ、およびＳｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｐ、、　１９８８．　Ｇｅ ｎｅ。

７３　：　３０５により記載された通りに行われた。

簡単に言えば、６０ｍｍのポリスチレンプレート（６０ｘ１５ｍｍ。

Ｆａｌｃｏｎ　Ｃｏｒｐ、）を、細菌増殖の防止のため０．０２％Ｎ　ａ　Ｎ　 ｓを含む０、ＩＭ　ＮａＨＣＯ，（ｐＨ８，６）中の１ｍｇ／ｍｌのストレプト アビジンにより一晩コーティングした。翌日、ストレプトアビジン溶液を除去し 、０．　ＩＭ　ＮａＨＣＯ，（ｐＨ８，６）中の２０ｍｇ／ｍｌのウシ血清アル ブミン、３μｇ／ｍｌのストレプトアビジン、０．０２％のＮａＮ＊、から成る ブロック溶液１０ｍ１を使って少なくとも１時間プレートをブロックした。次に 、プレートをＴ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎてすすぎ、ｔｏ１２ファージを１５分間 プレート上に吸着させ、次いでＴ　Ｂ　Ｓ　−Ｔｗｅｅｎで１０回プレートをす すぎ、ストレプトアビジンに結合しなかったファージを除去した。Ｔ　Ｂ　Ｓ　 −Ｔｗｅｅｎは５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ、　ｐＨ７、５、１５０ｍＭ　Ｎａ ｃｌおよび０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０から成った。

接着したファージを、０．Ｉ　Ｎ　Ｈｃｌ中の６Ｍ尿素（グリシンで２．２にｐ Ｈ調整したもの）から成る無菌溶液８００μｍを用いてプレートから溶出せしめ た。ファージをこの溶液中に１５分間溶出させ、次いでこの溶液を２３μｌの２ ＭＴｒｉｓ塩基で中和した。この手順により約４Ｘ１０’個のファージが得られ た。標準手順を使ったＥ、コリの再感染とプレートストックの調製によりファー ジストックを調製し、ストレプトアビジン生物選抜操作を繰り返した。第二選抜 では、ＩＱＩＯファージが選抜され最終的に１０８が溶出された。

それらのファージを低密度で平板培養し、無作為に選択した個々のプラークから ６０個の別々のファージストックを調製した。

６０の単離別のストレプトアビジン結合特性を詳細に調べた。ファージが実際に ストレプトアビジン結合活性を有するペプチドを発現しないことを保証するため に、ランダムペプチド挿入断片を担持しない過剰量のファージから該単離物を富 化せしめることができるかどうかを決定する実験を行った。生物選抜前の初期混 合物中のランダムペプチド発現ファージ対ＭＩ３ｍｐ１９の比と、溶比液中のそ れの比とを、Ｘｇａｌプレート上に２つのファージ集団を塗抹することにより比 較した。Ｍ１３ｍｐ１９ファージは青色プラークを形成し、Ｍ１３　ＬＰ６７ラ ンダムペプチド配列発現ファージは白色プラークを形成するので、２集団は区別 することができた。６０の単離物のうち５６個が、Ｍ１３ｍｐ１９よりも少なく とも１０個富化されたことが観察された。上記と同様にして、ただしポリスチレ ン皿をストレプトアビジンで処理せずに両方のファージ集団を生物選抜せしめる 対照実験を行った。ランダムペプチド発現ファージの富化は全く観察されなかっ た。更に、表１は、６０の単離物のうちの９つがＭＩ３ｍｐ１９の存在下で８Ｘ １０”　〜６．７　ＸＩ　Ｏ’倍富化されていることを示す。この表はまた、２ つの単離物がストレプトアビジンを結合できなかったことも示す。

単離物　初期　溶出液　富化　初期　溶出液　富化成る種の単離物に関連するス トレプトアビジン結合特性を更に特徴づけるために、選抜溶液にｌμＭビオチン の添加を使ってＭＩ３ｍｐ　Ｉ　９に関する生物選抜実験を繰り返した。ビオチ ンは非常に強固にストレプトアビジンに結合するので、選択したファージのスト レプトアビジンへの結合活性を減少させると予想され得る。実際、表１はビオチ ンが存在する時ランダムペプチド発現ファージの富化が大きく減少することを示 す。

表１に示した単離物Ａ〜■のランダムペプチド配列をコードするＤＮＡを配列決 定し、ランダム配列の推定アミノ酸配列を表２に示す。それらがヒスチジン−プ ロリン共通配列を示すことは明らかである。ストレプトアビジン結合を示さなか った６単離物のランダムペプチド挿入断片も配列決定したが、それらはヒスチジ ン−プロリン共通配列を持たなかった。

表２は幾つかのストレプトアビジン結合性ファージによりコードされるランダム ペプチドの推定アミノ酸配列を表わす。

表　１ 単離物　頻度 コンセンサス　ＨＰ コンセンサス配列、すなわちヒスチジン−プロリンが実際、ストレブタビジンへ の結合を担当することを確かめるために、コンセンサス配列を有するペプチドを 合成し、そして上記のようにストレブタビジン結合の阻害について試験した。そ のペプチドは、ストレブタビジン結合を有意に阻害することが観察された。その ペプチドは、既知方法を用いて合成され、そして次の配列を有した。：Ｌｅｕ− Ａｓｎ−Ｈｉ　ｓ−Ｐｒｏ−Ｍｅ　ｔ−Ａｓ　ｐ−Ａｓｎ−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ− Ｈｉ　ｓ−Ｇ　１ｙ−ＣＯＯＨ実施例実 施例子−ジにおけるランダムペプチドライブラリーの構成１０μｇλｇｔｌｌ　 ５ｆｉ−ＮｏｔをＥｃｏＲＩ及びＮｏｔ　１により切断し、フェノール／クロロ ホルム抽出し、エタノール沈澱せしめ、８０％エタノールにより洗浄し、そして １０μｌのＪＥ緩衝液に再懸濁した。次に、次の２種のオリゴヌクレオチドそれ ぞれ１２．５ピコモルを水２μＩにおいて混合した： ５　’　−ＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＴＣＡＧＴＣＡＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸχＸＸＸＸＧＧＧＣＧＧ ＣＧＧＡＧＧＴＧＧＣＧＧ−３’５　’　−ＡＡＴＴＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣ ＣＧＣＣＧＣＣＣＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮ ＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＮＮＳＴＧＡＣＴＧＡＴＴＧＡＣＧ−３’。

次に、そのオリゴヌクレオチドを８０°Ｃに２分間加熱し、冷却し、そして追加 の水ｌＯμｌ、ＩＯＸリガーゼミックスＱｌａｎｉａｔｉｓにより記載される） ２μｌ、上記の切断されたＤＮＡ５μＩ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＥｎｇＩａｎ ｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　１００．０００〜５００，０００　Ｕ／ｍｌ）　１ｍｌ と共に混合し、そして室温で３時間及び続いて１５°Ｃで２．５日間インキュベ ートした。次に、その混合物の６０％を、１つの５×５Ｘ１．５ｍｍのウェルに おける０、５％アガロースＴＥＡゲル上に負荷した。電気泳動の後、高分子量Ｄ ＮＡバンドをゲルから切り出し、そして１００　ＭのＮａＣ１、３０ｍＭのトリ ス、　ｐＨ８から成る溶液に１〜１２時間置い装。次に、ゲルフラグメントを、 過剰の溶液を除くためにキムワイパーによりプロットし、そして７０°Ｃで溶融 し、そして溶融アガロース５μｍを、個々の２つの管に置いた。その管を、それ ぞれ９０°Ｃに２分間及び６分間加熱し、そして６５°Ｃて２時間インキュベー トした。個々の管から２μｌを、ＣｔｒａｔａｇｅｎｅＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｓ　Ｇｉｇａパック＋ファージ及びバッキングキットを用いてパックした。これ らのパックされたファージを用いて、Ｙ１０９０細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を感染 せしめ、そして１５０ｍｍの直径のプレート当たり５０．０００プラークの密度 でプレートした。４Ｘ１０＠個の個々のプラークをこの方法により生成し、そし てプレート貯蔵物を調製した。

上記λフアージライブラリーを、ペプチドＱＡλＩＧＰＮＬＶＬを認識するネコ 白血病ウィルスに対するモノクローナル抗体によりスクリーンした。その抗体は 、Ｎａｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｉｊ、　βＭ、、　１９８４．ＰＮＡＳ、　８１　： 　３６７５により記載され、そしてそのペプチドはＫｕｌｃｌｉｐ、　Ｓ、　望 Ｈ，，１９８９゜Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　−＝　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｇ、　５ｔｒｕｃ ｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　（Ｊｅａｎ　Ｒｉｖｉｅｒａｎｄ　Ｇａ ｒｌａｎｄ　Ｍａｒｓｈａｌｌ）　Ｅｓｃｏｍ、　Ｌｅｉｄｅｎ、　１９９０に より記載される。

標準のλｇｔｌｌスクリーニング技法は、Ｄａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、、　ａｎｄ　 Ｙｏｕｎｇ。

Ｒ，Ａ、　、アメリカ特許第４．７８８．１３５により記載されているようにし て使用された。６種以上のファージが単離された。その抗体は、それらのファー ジにより創造されるプラーク上に積層されたニトロセルロースフィルター上での タンパク質に結合し、従ってファージにペプチド配列の存在を示唆した。この結 合は、そのフィルター及び抗体を２５μｇ／ｍｌのペプチドＱＡＭＧＰＮＬＶＬ と共に同時インキュベートすることによってひじょうに減じられるが、しかし無 関係なペプチドは効果を育さなかった。

本発明は、特定の！Ｉ！１．様により記載されて来た。しかしながら、本出願は 、本発明の範囲内で当業者により変更及び置換を行なわれ得る。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、−１ 浄書（内容に変■なし） 要約書 生物学的活性を有し、そして予防薬及び／又は治療薬として臨床学的に適用され る分子を同定するためのランダムペプチドライブラリーを合成するための方法及 び組成物が記載される。

手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３３３２／ ２　発明の名称 生物学的活性分子を同定するための組成物及び方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　シタス　オンコロジー　コーポレイシシン４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号５４　補正命令の日付 ６、　補正の対象 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文（２）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （１）明細書、請求の範囲及び要約書の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （２）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）明細書、請求の範囲及び 要約書の翻訳文　各１通 （２）図面の翻訳文　１通 −−―−−＾＃ｋｊＩＩＩＩ　ＰＣＴＩＵＳ　９１１０３３３２国際調査報告 ｕｓ　９１０３３３２

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．タンパク質の一部としてランダムペプチド配列を含んで成るタンパク質であ って、前記ランダムペプチド配列が、前記タンパク質の生物学的性質を有害的に 変更しないことによって特徴づけられるタンパク質。
2. ２．前記タンパク質の一部としてランダムペプチド配列を含み、ここで前記配列 が６〜１６個のアミノ酸残基を有する請求の範囲第１項記載のタンパク質。
3. ３．前記ランダムペプチド配列が約１５個のアミノ酸残基を含む請求の範囲第２ 項記載のタンパク質。
4. ４．前記ランダムペプチド配列が前記タンパク質のアミノ末端近くに存在する請 求の範囲第３項記載のタンパク質。
5. ５．前記ランダムペプチド配列のカルボキシル末端で、有効数のスペーサーアミ ノ酸をさらに含んで成る請求の範囲第４項記載のタンパク質。
6. ６．前記スペーサーアミノ酸がプロリンを含んで成る請求の範囲第５項記載のタ ンパク質。
7. ７．前記スペーサーアミノ酸が約６個のプロリンを含んで成る請求の範囲第６項 記載のタンパク質。
8. ８．タンパク質の一部としてランダムペプチド配列を含んで成るウィルス性表面 融合タンパク質であって、前記タンパク質が、下記式：Ｖ……‥（ＮＮＳ）ｘ… …‥Ｌ……‥Ｖ１〔式中、Ｖはウィルス表面タンパク質Ｖ１のアミノ末端で見出 される１又は複数のアミノ酸残基をコードするデオキシヌクレオチドを表わし、 ＸはＡ，Ｇ，Ｃ及びＴデオキシヌクレオチドの等しい混合物、すなわちＮ，及び Ｃ及びＧデオキシヌクレオチドの等しい混合物、すなわちＳによりコードされる ６〜１６個のアミノ酸残基であり、そしてＬは約６個のリンカーアミノ酸残基を 表わす〕を含んで成るオリゴヌクレオチドによりコードされることを特徴とする タンパク質。
9. ９．タンパク質の一部としてランダムペプチド配列を含んで成るタンパク質をコ ードする核酸配列であって、前記ランダムペプチド配列が、前記タンパク質の生 物学的性質を実質的に有害的に変更しないことによって特徴づけられる核酸配列 。
10. １０．タンパク質の一部としてランダムペプチド配列を含んで成るタンパク質を コードする核酸配列であって、前記ランダムペプチド配列が６〜１６個のアミノ 酸残基有することを特徴とする核酸配列。
11. １１．前記核酸配列が約１５個のアミノ酸残基を含んで成るランダムペプチド配 列をコードする請求の範囲第１０項記載の核酸配列。
12. １２．前記コードされたランダムペプチド配列が前記タンパク質のアミノ末端近 くに存在する請求の範囲第１１項記載の核酸配列。
13. １３．前記ランダムペプチド配列のカルボキシル末端で、有効数のスペーサーア ミノ酸をさらに含んで成る請求の範囲第１２項記載の核酸配列。
14. １４．前記スペーサーアミノ酸がプロリンを含んで成る請求の範囲第１２項記載 の核酸配列。
15. １５．前記スペーサーアミノ酸が約６個のプロリンを含んで成る請求の範囲第１ ４項記載の核酸配列。
16. １６．第１及び第２オリゴヌクレオチドを含んで成るオリゴヌクレオ対であって 、前記第１オリゴヌクレオチドがランダムペプチド配列をコードする核酸配列を 含んで成り、そして前記第２オリゴヌクレオチドが前記ランダムペプチド核酸配 列に結合するデオキシイノシン核酸配列を含んで成ることを特徴とするオリゴヌ クレオチド対。
17. １７．ランダムペプチドライブラリーを生成するための方法であって：ａ）オリ ゴヌクレオチド対を合成し、ここで前記オリゴヌクレオ対が第１及び第２オリゴ ヌクレオチドを含んで成り、前記第１オリゴヌクレオチドがランダムペプチド配 列をコードする核酸配列を含んで成り、そして前記第２オリゴヌクレオチドが前 記ランダムペプチド核酸配列に結合するデオキシイノシン核酸配列を含んで成り ；ｂ）前記ランダムペプチド配列を含む融合タンパク質を生成するために、発現 ベクターにタンパク質をコードする標的核酸配列に前記オリゴヌクレオチド対を 融合し；そしてｃ）前記融合タンパク質を発現できる宿主細胞中に前記発現ベク ターを挿入する段階を含んで成る方法。
18. １８．前記第１オリゴヌクレオチドが、下記式：Ｖ……‥（ＮＮＳ）ｘ……‥Ｌ 〔式中、Ｖはウィルス表面タンパク質Ｖ１のアミノ末端で見出される１又は複数 のアミノ酸残基をコードするデオキシヌクレオチドを表わし、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ及 びＴデオキシヌクレオチドの等しい混合物であり、ＳはＣ及びＧデオキシヌクレ オチドの等しい混合物であり、Ｘは前記発現ベクターにおける前記タンパク質の 生物学的性質を実質的に有害的に変更しないことによって特徴づけられるランダ ムペプチド配列を生成する数に対応し、そしてＬは有効数のリンカーアミノ酸を 表わす〕をさらに含んで成る請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．前記有効数のリンカーアミノ酸が約６である請求の範囲第１８項記載の方 法。
20. ２０．前記リンカーアミノ酸がプロリンである請求の範囲第１９項記載の方法。
21. ２１．前記ウィルス表面タンパク質が繊維状ウィルス表面タンパク質である請求 の範囲第２０項記載の方法。
22. ２２．ＡＴＣＣ受託番号を有する、ランダムペプチドライプラリーをコードする ＤＮＡ配列を含んで成るベクターＭ１３ＬＰ６７、２３．コンセンサス配列ヒス チジ−プロリンを含んで成るストレプタビジンに結合するペプチド。