JPH05508161A - ヒアルロン酸の非水溶性誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒアルロン酸の非水溶性誘導体 発明の背景 本出願は１９８７年９月１８日付で出願された“ヒアルロン酸の非水溶性誘導体 °と題するＨａｍｉｌｔｏｎらの米国特許出願第０７／１００，１０４号の一部 継続出願である。本発明は化学的に修飾されたヒアルロン酸から形成される生物 適合性フィルム及びゲルに関する。

ヒアルロン酸″ＨＡ’は例えば滑液、硝子体液、血管壁及び磨帯と他の結合組織 でみられる天然ムコ多糖である。多糖は交互のβ　１−３　グルクロニド及びβ 　１−４　グルコサミニド結合により結合された交互のＮ−アセチル−Ｄ−グル コサミン及びＤ−グルクロン酸残基からなり、そのため反復単位は（１−４）− β−Ｄ　−ＧｌｃＡ（１−３）−β−Ｄ　−ＧＩｃＮＡｃ−である。水中にヒア ルロン酸は溶解して高粘性の液体を形成する。天然源から単離されたヒアルロン 酸の分子量は通常 ５×１０〜１×１０７ドルトンの範囲内である。

ここで用いられる“ＨＡ”という用語はヒアルロン酸と例えばヒアルロン酸ナト リウム（ナトリウム塩）、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム及 びヒアルロン酸カルシウムを含めたそのヒアルロン酸塩のいずれかを意味する。

化学的に修飾（“誘導”）された形のＨＡは術後期間中に体組織の付着又は癒着 を防止するため外科補助物として有用である。誘導化ＨＡゲル又はフィルムは相 互付着を阻止するために分離したままにされるべき組織間の箇所中に注入又は挿 入される。有効であるためには、ゲルはそのゲルが最後に分散して組織が接触し たときにそれらがもはや付着する傾向を有しないほど十分に長い時間にわたり適 所に留まって組織接触を妨げねばならない。

化学的修飾ＨＡは制御的放出薬物デリバリ−上も有用である。Ｂａ１ａｘｔら、 １９８６年、米国特許第４，５８２゜８６５号明細書では“ＨＡの架橋ゲルは、 それに分散されているが、該ゲル高分子量マトリックスに共有結合されていない 低分子量物質の放出を遅らせることができる”と述べている。Ｔ１．Ｒｏ＋ｅｍ ａｎ　ｅＩａｌ、、ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ　ＤｓｌｉｖｅｒＹＳ ７ｓｊｅｍｓ　（制御的放出デリバリ−システム）、Ｍｘ＋ｃｅｌ　Ｄ＋ｋｋｅ ｒ、　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　ＹｏｒｋにおいてＲ，ＶＳｐａ「ｅ「ｅｔａｌ、、１ ９８３．ｃｈａｐｔｅ＋　６．ｐａｇｅ＋　１０７−１１９では直接的に又は中 間結合基としてアラニン架橋を含むエステル複合体のいずれかにより、エステル 結合を介してヒアルロン酸に共有結合されたクロラムフェニコールの徐放性につ いて記載している。

１、Ｄｘｎｉｓｈｅｆｋ７　ｅｔ　ａｌ、１９７１．Ｃａ＋ｂｏｈ７ｄ＋ａｔｅ 　Ｒｅ＋、、Ｖｏ１１６、ＩＮｇｅ＋　１９９−２０５　では水溶液中１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（“ＥＤＣ”） の存在下においてムコ多糖をアミノ酸エステルと反応させることでムコ多糖のカ ルボキシル基を置換アミドに変換することによるムコ多糖の修飾について記載し ている。彼等はグリシンメチルエステルをＨＡを含めた様々な多糖と反応させた 。得られる生成物は水溶性である；即ち、それらは水中又は体組織間で出会うよ うな水性環境中において急速に分散する。

ＨＡ組成物を低水溶性にする提案としてはＨＡを架橋することがある。Ｔ、Ｊ、 Ｒｏｓｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ　Ｄｅｌ ｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ　においてＲ，Ｖ、５ｐａｒｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３．Ｃｈａｐ ｔｅｒ　８゜ｐａｇｅｓ　１０７−１１９ではシスティン残基をアミド結合でＨ Ａに結合し、しかる後結合されたシスティン残基間でジスルフィド結合を形成さ せてシスティン修飾ＨＡを架橋させることによるＨＡの修飾について記載してい る。システィン修飾ＨＡはそれ自体水溶性であり、ジスルフィド形への酸化によ る架橋時のみ非水溶性となった。

Ｄｅ　Ｂｅ１ｄｅｒらの国際出願公開第ＷＯ３６１００９１２号明細書では二又 は多機能性エポキシドでカルボキシル含有多糖を架橋することにより製造される 術後組織付着防止用の徐分解性ゲルについて記載している。低い水溶解性を有す るＨＡの架橋ゲルを製造するために提案された他の反応性二又は多機能性試薬と しては：５０℃でアルカリ性媒体中における１、２，３．４−ジェポキシブタン （Ｔ、Ｃ，Ｌａｕｒｅｎｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４．Ａｃｔａ　Ｃｈｅ＊、５ ｃａｎｄ、、ｖｏｌ。

１ｇ、ｐａｇｅ　２７４）　；アルカリ性媒体中におけるジビニルスルホン（Ｅ 、Ａ、Ｂａ１ａｓｚら、米国特許第４，５８２，８６５号。

１９８６年）；ホルムアルデヒド、ジメチロール尿素、ジメチロールエチレン尿 素、エチレンオキシド、ポリアジリジン及びポリイソシアネートを含めた様々な 他の試薬（Ｅ、Ａ、Ｂａ１ａｓｚら、英国特許出願第８４　２０　５６０号、１ ９８４年）がある。Ｔ、Ｍａｌｓｏｎら、１９８６年２国際出願公開第ＷＯ３６ １０００７９号明細書ではＨＡを二又は多機能性エポキシドのような二又は多機 能性架橋試薬と反応させることにより硝子体液代替物として使用されるＨＡの架 橋ゲルの製造について記載している。

Ｔ、Ｍａｌｓｏｎら、１９８６年、欧州出願節０　１９３　５１０号明細書では 架橋ＨＡゲルを真空乾燥又は圧縮することによる成形品の製造について記載して いる。

発明の要旨 本発明はゲルを形成するために十分な条件下でＨＡ。

ポリアニオン系多糖及び活性化剤を混和することによる非水溶性ゲルの製造方法 を特徴とする。

好ましいポリアニオン系多糖としてはカルボキシメチルセルロース（“ＣＭＣ’ 　）　、カルボキシメチルアミロース（“ＣＭＡ”　）　、コンドロイチン−６ −硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン及びヘパリン硫酸がある。　ＣＭＣ及びＣＭ Ａが特に好ましい。ＨＡ及びポリアニオン系多糖は一緒に添加でき、しがる後活 性化剤が加えられるが又はポリアニオン系多糖は活性化剤しがる後ＨＡ添加で混 和してもよい。もう１つの選択肢は活性化剤及びＨＡを混和し、しかる後ポリア ニオン系多糖を加えることである。

反応を実施する上で好ましいｐＨは４．０〜５．０である。多糖に関して好まし い濃度は０．００５〜０．　１Ｍ、更に好ましくは０，０１〜０．０２Ｍである 。多糖対活性化剤のモル比は好ましくは少くとも１：１、更に好ましくは約１： ４である。好ましい活性化剤はカルボジイミド、例えば１−エチル−３−（３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチル アミノプロピル）カルボジイミドメチオシドである。

ゲルは付着防止組成物の形で、例えば膜の形で又はシリンジでの配合用に適した 組成物の形で提供される。それはそれ全体に分散された薬学上活性な物質を含有 してもよい；このようなケースにおいて、ゲルは薬物デリバリ−システムとして 有用である。適切な物質としては成長因子、酵素、薬物、バイオポリマー及び生 物学上適合しうる合成ポリマーがある。

ここで用いられる“フィルム”という用語はゲルを圧縮するか又はゲルを脱水す ることで形成される物質を意味し、本発明のいかなるゲルもこのようなフィルム に形成してよい。

“生物適合性“物質とは、その用語がここで用いられるように、生物学的機能に 関して医学上許容されない毒性又は有害効果を有しない物質である。

“ポリアニオン系多糖”とは約４．０以上のｐＨ値で２以上の負荷電基、例えば カルボキシル基を有する多糖である。

我々はＨＡを適切な活性化剤及びポリアニオン系多糖で処理することによりいか なる別添加される二又は多機能性架橋試薬も使用せずに低い水溶解性を有するゲ ル又はフィルムが得られることを発見した。

“水溶性”ゲル又はフィルムとは（該用語が本明細書において用いられているよ うに）、水中１％重重量型量（’　ｖ／ｖ’　）　ヒアルロン酸ナトリウムの水 溶液を乾燥することにより形成される寸法３ｅｍＸ３ｃｍＸ０．　３ｍｍを有す るものであり、これを２０℃で蒸留水５０ｍ１のビーカー中にいれて攪拌せずに 放置した場合に３分間後にフィルムとしてのその構造上の一体性を失い、２０分 間以内で全部分散されてしまうようなものをいう。本発明の“非水溶性”フィル ム（該語句及び類似用語が本明細書において用いられる）は、ＨＡの１％水溶液 を用いて形成され、本発明に従い修飾され、同寸法を有し、同様に２０℃で蒸留 水５０ｍ１のビーカー中攪拌せずに放置された場合２０分間後でも構造上完全な ままである；即ち、フィルム境界及び端部は２４時間後もなお存在するが、但し そのフィルムは膨潤されている。

ＨＡは、それがＨＡにおけるカルボキシル基を核攻撃され易くするか又はポリア ニオン系多糖と非水溶性ゲルを形成し易くするように水性混合液中で処理された 場合に、その用語がここで用いられるように、“活性化”されると言われる；　 “活性剤”とはＨＡ含有水性混合液中でＨＡをそのように活性化させる物質であ る。

ゲル及びフィルムは非水溶性であるため、それらは未反応物質を除去するため使 用前に水で十分に洗浄することができる。

本発明のフィルム及びゲルは反応混合液中に色素又は染料を含有させることで着 色形に製造することもできる。

このような着色フィルム及びゲルは適所にあるか又は配置中により見易くでき、 手術操作中に取扱う上でそれらを無色物よりも容易にする。

多糖修飾フィルム及びゲルは水和された場合であってもそれらの強度を留める。

それらは縫合の必要性なしに生物組織に付着するため−それらは術後付着防止膜 として有用である。それらは出血の存在下でも組織に適用できる。

本発明の他の特徴及び利点はその好ましい態様の以下の記載及び請求の範囲から 明らかであろう。

ポリアニオン系多糖修飾ＨＡ ポリアニオン系多糖修飾ＨＡゲル及びフィルムは非水溶性物質を形成するため（ 前記のような）ＨＡをポリアニオン系多糖及び活性化剤と混和することにより通 常製造される。沈澱物は術後付着防止に有用な薄膜に流延できる。それは前記の ように着色してもよい。沈澱物から流延されたフィルムの強度を増加させるため 、フィルムはそれらが真空下（約３０　ｍｍＨｇ）約１０５℃で２４時間加熱さ れる脱水熱処理に付してもよい。

多糖及びＨＡは一緒に混和でき、しかる後活性剤が加えられる。一方、多糖は活 性剤と反応させ、しかる後ＨＡを添加してもよい。第三の選択肢はＨＡを活性化 剤と混和し、しかる後多糖を加えることである。好ましい活性化剤としては前記 されており、カルボジイミド類のＥＤＣ及びＥＴＣがある。反応は４〜５のｐＨ で実施されることが好ましい。好ましい多糖濃度は０．００５〜０．１Ｍの範囲 内であり、更に好ましくは０．０１〜０．０２Ｍの範囲内である。多糖対活性化 剤の好ましいモル比は少くとも１：１、更に好ましくは約１＝４である。

本発明のゲル及びフィルムは通常下記のようにして得られる。ＨＡは水に溶解さ れ、得られた水性混合液のｐＨは下方に調整される；次いで溶解されたＨＡは適 切な活性化剤を混和することにより活性化され、適切なリジンエステルが活性化 ＨＡと混和され、望ましいゲルが形成するまで放置される。活性化剤及びエステ ルはどんな順序で混和してもよい。

本発明のリジン修飾ゲル及びフィルムの好ましい製造方法はここで更に詳細に記 載される。当業者であれば認識するように、本発明のゲル及びフィルムは本発明 の方法に属するが、但しここで記載されたものとは特に異なるプロトコールを用 いて得ることもできる。

ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムのようなヒアルロン酸の塩のサンプル は水性混合液を得るため水に溶解される。様々な供給源のうちいずれからのＨＡ も使用できる。周知のように、ＨＡは動物組織から抽出できるか又は細菌醗酵の 産物として回収できる。ヒアルロン酸は例えば国際出願公開第ＷＯ３６１０４３ ５５号明細書で記載されるようにバイオプロセス技術により商業的量で産生でき る。好ましくはこの第一水性混合液中におけるＨＡの濃度は０．４〜２．５％重 量／重量（“ｗ／ｗ”）の範囲内である。その後の反応はそれより有意に低い濃 度のとき遅くて有効性が小さくなり、一方それより有意に高い濃度のときはそれ らの高粘性のため取扱いが困難である。

水性ＨＡＡ合液は酸性であって、好ましくはｐＨ４，０〜５．０、更に好ましく はｐＨ４，３〜４．７５を有するべきである。それより低いｐＨ値のとき好まし い活性化剤ＥＤＣは不安定であり、それより高い値のとき反応速度は減少する。

好ましくはヒアルロン酸はｐＨを調整するために加えられるが、但し他の公知の 酸も使用できる。

水性ＨＡＡ合液のｐＨが調整されると、活性化剤が混和される。好ましい活性化 剤としてはカルボジイミド、最も好ましくはＥＤＣ（一部の参考文献においてこ の物質は１−　（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド又 は“ＤＥＣ”と称される）又はＥＴＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ プロピル）カルボジイミドメチオシド）がある。

次いで核性リジンエステルが水性ＨＡ活活性副剤混合液混和される。好ましいエ ステルとしてはメチル、エチル又はｔ−ブチルエステルがある。リジンはジ−リ ジン、トリーリジンもしくはポリリジン又はそれらの塩酸塩の形でもよい。

リジンエステル及び活性化剤は全部一度に又は徐々にいずれかでどんな順序によ りｐＨ調整ＨＡ混合液に混和してもよい。

着色生成物が望まれるならば、サーバ（Ｓｅｒｖａ）により“サーバブルー°と して販売される、°クマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｌｅ”）ブリリアントブルーＲ− ２５０−とじても知られるブルー色素“ブリリアントブルーＲ″のような色素又 は染料の溶液がこの時点で反応混合液に混和できる。得られる生成物は体組織の 色と良いコントラストを示せる青色を有し、そのためそれが手術時に取扱われる とき及びそれが適所におかれたときフィルム又はゲルを見易くする。

試薬（及び存在するとすれば染料又は色素）が混和されると、反応混合液は単純 にしばらく放置されるかあるいはそれは継続的に又は時々攪拌又はかきまぜられ る。

試薬の混和時にｐＨは上昇するが、反応が進行しても酸の添加で所望のｐＨに維 持できる。しかしながら、我々は様々な望ましい物理的性質のフィルム及びゲル が反応が進行するに従いｐＨを単純に上昇させることにより得られることを発見 した。試薬、特にＥＤＣ及びリジンエステルの添加方式は重要でないが、但しこ れらの試薬対ＨＡの比率は重要である。我々はＨＡ：ＥＤＣ：リジンエステルの 比率がに２：１〜１：４：１０の範囲であるときに最良の結果が得られることを 発見した。値が低いほど典型的には弱くてさほど不溶性でない生成物が得られ、 一方位が高いほど典型的には強くてより不溶性の生成物が得られる。

フィルム形成 上記に従い修飾されたＨＡは直接的なやり方でフィルムとして流延できる。典型 的には反応混合液は望ましいサイズ及び形状を有する容器内に注がれ、風乾され る。

一般に、低い表面積／容量を有するようにどろどろして注入された混合液を乾燥 させることで形成されたフィルムは、さらさらした高い表面積／容量の混合液を 乾燥させることで形成されたフィルムよりも大きな強度を有する。

別法として、フィルムは、例えば欧州出願節０１９３５１０号明細書で記載され たように、例えば少くとも一方が多孔質である２表面間でゲルを圧縮するように して水を逃がせる条件下でゲルを圧縮することにより形成できる。

所望であれば、ゲル又はフィルムは例えば水又はＩＭ水性塩化ナトリウムによる 潅流で使用前に洗浄してよい。

一方反応混合液はフィルムとして流延する前に残留試薬を除去するため透析して もよい。残留試薬又は置換尿素のような試薬由来物質を除去するための洗浄はフ ィルム又はゲルが治療用途に用いられるならば望ましい。前記のようにブリリア ントブルーＲで青色に着色されたゲル又はフィルムはこのような洗浄中にそれら の着色を失わない。試薬又は反応生成物の除去は高圧液体クロマトグラフィーで モニターすることができる。

発明の詳細な説明 本発明は下記例で更に詳細に記載される。これらの例は説明のために示され、請 求の範囲で記載された場合を除き本発明を制限するためではない。

ＨＡ　（０，４％ｖ／ｖ、ｏ、ＯＩＭ）と２５０，０００の分子量及び０．６５ 〜０．９０範囲内の置換度を有するアクアロン（Ａｑｕａｌｏｎ）タイプＣＭＣ （０，１９％ｖ／ｖ。

０、ＯＩＭ）を室温で水溶液中−緒に混和した。混合液のｐＨをＩＭ　ＨＣＩの 添加でｐＨ４，７〜４．８に調整して維持した。この溶液の各１００１にＥＤＣ Ｏ，６７ｇ　（０，０４Ｍ）を加えた。ＥＤＣとの反応中、溶液のｐＨを０．１ Ｍ　ＨＣＩの添加でｐＨ４，７〜４．８に維持し、反応を１時間進めたところ、 その間に沈澱物が生成した。未反応ＥＤＣは３及び１９時間間口２回透析物交換 して２４時間にわたり酸性水（ｐＨ４，０）に対する透析により沈澱物から除去 した。次いでＨＡ／ＣＭＣスラリーを平坦な型に流延し、室温で２４時間風乾し た。

ＨＡ／ＣＭ（膜は実験動物モデルで術後付着形成の発生率を減少させることが示 された。ラット盲腸剥離モデルを用いた実験において、ＨＡ／ＣＭＣ膜を外科的 に剥離されたラット盲腸の周囲においた；事前の研究では付着が制御的方式で剥 離されたラットの盲腸に容易に生じることを証明した。ＨＡ／ＣＭＣ膜又はＯＲ Ｃ膜〔付着防止用にジョンソン＆ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ　＆Ｊｏｈｎｓｏ ｎ）から市販されるインターシード（Ｉｎｔｅｒｃｅｅｄ）　Ｔ　Ｃ７膜〕のい ずれかを受容した動物群における盲腸付着は、盲腸が剥離されたが但しいかなる 膜も受容しなかった動物における付着コントロールと比較した。これら実験の結 果はＨＡ／ＣＭＣ膜がコントロール動物及びインターシードＴＣ７フイルムを受 容した動物と比較して付着形成を一貫して減少させることを示した。

江ｌ：この例では活性化剤としてＥＤＣ及び核剤としてロイシンメチルエステル 塩酸塩を用いてヒドロゲルを製造した。

１Ｘ１０〜２Ｘ１０”の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム（４００Ｂ；　 １．　Ｏｍａｏｌのカルボキシル基）を蒸留水１０−１に溶解した。水溶液のｐ Ｈは０．ｌＮＨＣｌの添加でｐＨ４，７５に調整した。次いでＥＤＣ３１４Ｂ　 （１，６４ａｕｗｏｌ）をすべて一度に、しかる後Ｌ−ロイシンメチルエステル 塩酸塩１９０鳳ｇ（１，０５ｇａｏｌ）を加えた。その後反応混合液のｐａは２ 時間で６．２まで上昇した。反応混合液を室温で５時間保った後、それは濃厚な 不溶性ヒドロゲルを形成した。このヒドロゲルはその物理的性質の喪失なしに残 留試薬を除去するためＬＭ　ＮａＣ１溶液で洗浄することができた。

酊：この例では様々なＥＤＣ／ロイシンＳＨＡ比をゲル形成及び性質の比較のた めに用いた。

操作は例１のとおりであって、水１５１中ヒアルロン酸ナトリウム（４００Ｈ； 　１．　Ｏｓｍｏｌのカルボキシル基）を用いた。次いで別々の実験において下 記量のＥＤＣ及びロイシンメチルエステル塩酸塩を加えた：　ＥＤＣｌ　５３ｍ ｇ　（０，８ｓｍｏｌ）　／ロイシンメチルエステル塩酸塩　１　８２ｍｇ（１ ，Ｏｍｍｏｌ）　；　ＥＤＣ７６ｍｇ（０，４ｓｉｏｌ）／ロイシンメチルエス テル塩酸塩９０■ｇ（０，５ｍｌ１ｏｌ）　；Ｅ　Ｄ　Ｃ３８Ｂ　（０，２ｉＩ ｌｏｌ）　／ロイシンメチルエステル塩酸塩４５ｍｇ　（０，２５ｍ１ｏｌ）　 ｏ強いヒドロゲルはＥＤＣ及びロイシンメチルエステル塩酸塩の最大比率のとき 例１のように得られた。最小比率の試薬（０，２ＩＩＩＩｏｌ／　０　、　２５ 〜１．０ｉｓｏｌＨＡカルボキシル基）のときは弱いゲルを得たが、これは２週 間浸液体に崩壊した。

のため半分に減少させた。

操作は例１のとおりであったが、但しＨＡ（４ＱＯｉｇ；１．０薩ｓｏｌのカル ボキシル基）を１５１ではなく３０１の水に溶解した（　１−１／３％ｖ／ｗＨ Ａ）ｏヒドロゲルを形成したが、但しそれは例１で得られた場合よりも弱かった 。

例５：この例では活性化剤としてＥＤＣ及び核剤としてロイシンメチルエステル 塩酸塩を用いてフィルムを製造した。

ヒアルロン酸ナトリウム（４００ｍｇ；　１．　０ｍ１ｏｌのカルボキシル基） を蒸留水４０１に溶解した。溶液のｐＨは０．ＩＮＭＣＩの添加でｐＨ４，７５ に調整した。

次いでＥＤＣ（３１４Ｂ；　１．６４ｓｉｏｌ）を一度に、しかる後り一ロイシ ンメチルエステル塩酸塩１９０１ｇ（１、０５ｓｗｏｌ）を加えた。反応混合液 のｐＨは２時間で６．２まで上昇したが、しかる後溶液を面積６３６〇−のペト リ皿中に注ぎ、２日間かけてフィルムになるまで乾燥させた。こうして得られた フィルムは強く、水及び１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性であった。そのフィルムはそ れらの物理的性質の喪失なしに残留試薬を除去するため例１のように水又は水性 ＮａＣ１で洗浄することができた。このようなフィルムの赤外線スペクトル測定 分析では約２１３０ｃｍ−’でカルボジイミド吸収を示さず、約１７４０ｃ＋＋ 　、１７００ｃｍ−’、１６５０　ｃＩＩ−’及び１５５０　ａｍ−１で吸収を 示した。

例６：この例では様々なＨＡ濃度を得られるフィルム性質の比較のためフィルム 製造で用いた。

例４で記載された操作を繰返し、蒸留水３０１．４０１又は１００膓１（こＨＡ （４００１ｇ；　１．　０Ｉｌ＋ｍｏｌのカルボキシル基）を溶解して得られる ３種の異なる初期ＨＡ濃度を用いた。これら各々の初期濃度のＨＡを用いて得ら れたフィルムは強く、水及び１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性であり、ある濃度範囲の ＨＡが使用できることを示した。

これらフィルムの各々はその物理的性質の喪失なしに水又は水性ＮａＣ１で洗浄 することができた。

例７：この例では、フィルムを形成した後にそれを洗浄する場合と比較するため 、フィルムを形成するため流延する前に反応混合液を透析する効果について示し ている。

ヒアルロン酸ナトリウム（水４０ｓｌ中４００Ｂ）、ＥＤＣ（３１４Ｂ；　１． ６４ｓ■ｏｆ）及びＬ−ロイシンメチルエステル塩酸塩（１９０ｓｇ；　１．　 ０５ｍｍｏｌ）を例４のように反応させた。反応終了（２時間）時に反応混合液 は残留試薬を除去するため１２．ＯＯＯＮＭｖカットオフ透析管で水に対して透 析した。次いで透析された混合液を例４のようにフィルムとして流延した。こう して得られたフィルムは強く、水又は１Ｍ水性ＮａＣ１に不溶性であった。

例８：この例においてフィルムは異なる表面積／容量で混合液を乾燥させて得ら れたフィルムの性質を比較するためより粘稠に注がれた反応混合液を乾燥するこ とで形成した。

例４のようにして得られた反応混合液（反応液容量４０ｍ１）を小さなベトリ皿 （面積３３３０−）に流延した。こうして得られたフィルムは１Ｍ水性ＮａＣ１ 及び水（１００℃；１時間）に不溶性であった。

例９：この例においてフィルムは他のアミノ酸エステル及びＥＤＣで活性化され たＨＡを用いて製造した。

ＨＡの溶液（Ｈ２０４Ｏｍ　Ｉ中４００曹ｇ）を０．１ＮＨＣＩでｐＨ４，７に した。次いでＥＤＣ（３１４１１ｇ；１　、　６　ｍｍｏｌ）をすべて一度に、 しかる後アミノ酸誘導体１　■ｏｌを加えた。反応混合液をベトリ皿に注ぎ、乾 燥させた。不溶性フィルムはＬ−バリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−イソロイシ ンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩及びＬ−フェニル アラニンメチルエステル塩酸塩から得た。

例１０：この例においてフィルムは核剤として単純な一級アミン（アニリン）を 用いて製造した。

ＨＡの溶液（Ｈ２０４Ｏｍ　ｌ中４００　ｍｇ）を０．ＩＮＭＣＩでｐＨ４，７ にした。次いでＥＤＣ（３１４−ｇ；１　、　６　ｍｍｏｌ）をすべて一度に、 しかる後アニリン１　ｍｍｏｌを加えた。反応混合液をペトリ皿に注ぎ、乾燥さ せ、不溶性フィルムを得た。

例１１：この例においてフィルムはロイシンの他のエステルを用いて製造した。

ＨＡの溶液（Ｈ２０４Ｏｍ　Ｉ中４００　ｍｇ）を０．１ＮＭＣＩでｐＨ４，７ にした。次いでＥＤＣ（３１４１ｇ；１　、　６５ｉｏｌ）をすべて一度に、し かる後ロイシンエステル１　ｕｉｏｌを加えた。反応混合液をベトリ皿に注ぎ、 乾燥させた。不溶性フィルムはＬ−ロイシンエチルエステル塩酸塩及びＬ−ロイ シンｔ−ブチルエステル塩酸塩の双方から得た。

ステルを用いて製造した。

ＨＡの溶液（Ｈ２０１Ｓ　ｓ　Ｉ中４００層ｇ）をｐＨ４，７にし、ＥＤＣ（３ １４■ｇ；　１．　６１１０＋）　Ｌかる後アミノ酸誘導体（１ｉｍｏｌ）を加 えた。反応混合液は５〜２４時間以内で濃厚なゲルを形成した。非水溶性ゲルは Ｌ−バリンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−イソロイシンメチルエステル塩酸塩、Ｌ −アルギニンメチルエステル塩酸塩、Ｌ−プロリンメチルエステル塩酸塩及びＬ −ヒスチジンメチルエステル塩酸塩を用いて得た。

例１３：この例においてフィルムは核剤としてアミノ酸アミド（ロイシンアミド ）を用いて製造した。

ＨＡ（７）溶液（Ｈ２０４Ｏｍ　Ｉ中４００　ｍｇ）を０．１ＮＭＣＩでｐＨ４ ，７にした。次いでＥＤＣ（３１４■ｇ；１、　６ｍ５ｏｌ）をすべて一度に、 しかる後り一ロイシンアミド塩酸塩１１■０１を加えた。反応混合液をペトリ皿 に注ぎ、乾燥させ、不溶性フィルムを得た。

例１４：この例においてゲルはロイシンエチルエステル塩酸塩を用いて製造した 。

ＨＡの溶液（Ｈ２０１Ｓ　ｓ　Ｉ中４００　ｍｇ）をｐＨ４゜７１こし、ＥＤＣ （３１４■ｇ；１．６虐５ｏｌ）　Ｌかる後ロイシンエチルエステル塩酸塩（１ 、Ｏｇａｏｌ）を加えた。混合液は５〜２４時間以内で濃厚な非水溶性ゲルを形 成した。

他剤としてＥＴＣを用いて製造した。

１×１０〜２×１０６ドルトン範囲内の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム （４００Ｈ；　１．　Ｏｓ＋ｇｏｌのカルボキシル基）を水（１０ｍｌ及び３ｏ １）に溶解した。

各水溶液（７）ｐＨは０．ＩＭ　ＥＣＩ（７）添加テｐＨ４，７５＋、：調整し た。次いでＥＴｃ４７５ｍｇ（１，６■■ｏｆ）をすべて一度に、しかる後り一 ロイシンメチルエステル塩酸塩１９０Ｂ（１，０５５■■ｏｆを加えた。この反 応混合液のｐＨは次の２時間でｐＨ６，２まで上昇した。水１０−１を含有した 反応混合液は不溶性ゲルを形成した。水３０１を含有した反応混合液は乾燥後に 不溶性フィルムを生じた。

例１６：この例は着色フィルムの製造について示している。

ＨＡの溶液（Ｈ２０３Ｏｍ　Ｉ中４００　ｍｇ）を例１３のようｌ：ｐＨ４，７ ５１：し、しかる後ＥＴＣ（４７５ｍｇ；１　、６　ｗｍｏｌ）及びロイシンメ チルエステル塩酸塩（１９０ｓｇ；　１．０５■ｏｌ）を加えた。次いでＨ２゜ （０、５ｍｌ）中“サーブブルー”（５ｍｇ／厘１）の希溶液を反応混合液に加 えた。得られた混合液をベトリ皿に注ぎ、非水溶性ブルーフィルムを１６時間後 に得た。青色はフィルムがＩＭＮａＣＩＬかる後Ｈ２０で洗浄された後もフィル ムに残留した。

例１７．この例は化学的修飾ＨＡのフィルムの組織生物適合性について示してい る。

例４で記載された操作に従い製造されたフィルム４片及び２つのＵＳＰ陰性コン トロール片をホワイトニューシーラントウサギ（２匹／試験）のを椎傍筋肉中に 外科的に埋め込んだ。試験部位は７２時間後に肉眼的に又は７日間後に完全組織 病理学的にいずれかで評価した。

Ｕ　Ｓ　Ｐ　ＸＸＩ、ｐ、１２３７によれば、試験物質はプラスチック物質の評 価に関するＵＳＰ埋込み試験の要求を満たした。

例１８：この例はリジン修飾ＨＡの製造について示している。

水中ＨＡの０．４％（ｖ／ｖ）溶液を調製した。この溶液のｐＨは酸の添加で４ ．３〜４．７５に調整した。この溶液の各１００１にＥＤＣが完全に溶解するま で攪拌しながらＥＤＣｏ、７６ｇを加えた。ＨＡ／ＥＤＣ溶液の各１００１にＬ ＭＥが完全に溶解するまで攪拌しながらリジンメチルエステル（ＬＭＥ）０．２ ０ｇを加えた。

ＨＡ、、ＥＤＣ及びＬＭＥの添加は室温で行った；最終ＨＡ／ＥＤＣ／ＬＭＥ溶 液が形成されたら、それを必要になるまで４℃で貯蔵した。

ＬＭＥ修飾ＨＡ物質は最終用途に応じて様々な形状、大きさ及び粘稠度に加工で きる。物質の薄いシートが望まれるならば、混合液は平坦な表面上に注ぐことが できる。次いでこの物質は環境又は高温下で水を蒸発させることにより固体に変 えることができる。物質のシートを得る代替法はそれを凍結乾燥に付すことであ る。最終生成物の孔径は初期凍結温度を調整することでコントロールできる。湾 曲表面及び他の形状は最初にゲルを陰像表面上に流延してから記載されたように 加工することで同様に得られる。乾燥されたシートは所望であればカーバー　（ Ｃａｒｖｅｒ）実験室用プレスで所定厚さに圧縮することにより更に加工できる 。これは間隔が制限された解剖学的構造間に薄いフィルムをいれることを要する 用途において特に有用である。

標準塩水中で再水和された凍結乾燥物質の機械的試験では１７０〜９００ｇ／ｃ ｄの破断値まで力を生じた。この物質に関する破断値までの伸び率は３３〜６２ ％であった。

用途 本発明のフィルム又はゲルは、例えばＤｅＢｅｌｄｅｒらの国際出願公開第ＷＯ ３６１００９１２号明細書で記載されるように、外科業界で公知の操作に従い術 後又は治癒期間中に体組織の付着又は癒着を防止するため外科補助物として使用 できる。手術中に適切な１以上のゲル又はフィルム片が分離したままにされる組 織間に挿入又は注入される。

本発明のフィルム又はゲルは徐放性薬物デリバリ−用にも使用できる。デリバリ −される薬物は、例えばＴ、Ｊ。

Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　においてＲ，■、 ９ｐａｒｅｒｅｔ　ａｌ、、１９８３．Ｃｈａｐｔｅｒ　６．ｐａｇｅｓ　１０ ７−１１９で記載されたように、ゲル又はフィルムに共有結合させることができ る；こうしたゲル又はフィルムはデリバリ−が望まれる箇所に埋込み又は注入す ることができる。

他の態様 他の態様も下記請求の範囲内に属する。

要　約　書 外科補助物として有用なヒアルロン酸、ポリアニオン系多糖及び活性化剤の反応 生成物を含有した非水溶性生物適合性ゲル。

国際調査報告

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. １．ゲルを形成するために十分な条件下において水溶液中に０．４〜２．６％Ｗ ／Ｗ範囲内の濃度でＨＡ、ポリアニオン系多糖及び活性化剤を含むことからなる 非水溶性生物適合性ゲルの製造方法。
2. ２．ポリアニオン系多糖がカルぼキシメチルセルロース、カルボキシメチルアミ ロース、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン及びヘパリン硫 酸からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. ３．ポリアニオン系多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項２に記載 の方法。
4. ４．ポリアニオン系多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項２に記載 の方法。
5. ５．ＨＡ及びポリアニオン系多糖が一緒に加えられ、しかる後活性化剤が加えら れる、請求項１に記載の方法。
6. ６．ポリアニオン系多糖が活性化剤と混和され、しかる後ＨＡが加えられる、請 求項１に記載の方法。
7. ７．ＨＡが活性化剤と混和され、しかる後ポリアニオン系多糖が加えられる、請 求項１に記載の方法。
8. ８．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項１に記載の方法。
9. ９．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボ ジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド メチオジドからなる、請求項８に記載の方法。
10. １０．ポリアニオン系多糖が０．００５〜０．１Ｍの濃度で存在する、請求項１ に記載の方法。
11. １１．ポリアニオン系多糖が０．０１〜０．０２Ｍの濃度で存在する、請求項１ ０に記載の方法。
12. １２．方法が４．０〜５．０のｐＨで実施される、請求項１に記載の方法。
13. １３．ポリアニオン系多糖対活性化剤のモル比が少くとも１：１である、請求項 １に記載の方法。
14. １４．ポリアニオン系多糖対活性化剤のモル比が約１：４である、請求項１３に 記載の方法。
15. １５．請求項１の方法に従い製造された非水溶性生物適合性ゲル。
16. １６．ＨＡ、ポリアニオン系多糖及び活性化剤の反応生成物からなる非水溶性生 物適合性ゲル。
17. １７．活性化剤がカルボジイミドからなる、請求項１６に記載のゲル。
18. １８．カルボジイミドが１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カル ボジイミド又は１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミ ドメチオジドからなる、請求項１７に記載のゲル。
19. １９．ゲル内に分散された薬学上活性な物質を更に含む、請求項１６に記載のゲ ル。
20. ２０．薬学上活性な物質が成長因子、酵素、薬物、バイオポリマー及び生物学上 適合しうる合成ポリマーからなる群より選択される、請求項１９に記載のゲル。
21. ２１．ポリアニオン系多糖がカルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルア ミロース、コンドロイチン−６−硫酸、デルマチン硫酸、ヘパリン及びヘパリン 硫酸からなる群より選択される、請求項１６に記載のゲル。
22. ２２．ポリアニオン系多糖がカルボキシメチルセルロースである、請求項２１に 記載のゲル。
23. ２３．ポリアニオン系多糖がカルボキシメチルアミロースである、請求項２１に 記載のゲル。
24. ２４．ゲルが付着防止組成物の形である、請求項１６に記載のゲル。
25. ２５．組成物が膜の形である、請求項２４に記載のゲル。