JPH05508302A - Ｐｈ１２９ｄｎａポリメラーゼおよび該ポリメラーゼをコードするｄｎａ断片を用いるイン・ビトロｄｎａ合成反応 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

ＰＨ１２９ＤＮＡポリメラーゼおよび該ポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片を 用いるイン・ビトロＤＮＡ合成反応 発明の背景 本発明は、ＤＮＡ配列決定に適したＤＮＡポリメラーゼに関する。 ＤＮＡの配列決定は、１の明確な末端および１の可変末端を有する、一本鎖ＤＮ Ａ断片の４集団を生成することを含む。該可変末端は、常に、特異的な所与のヌ クレオチド塩基（グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミジン（Ｔ）、またはシ トシン（Ｃ）いずれか）で終了する。４種の異なる断片セット、高分解能ポリア クリルアミドゲルで、その長さに基づいて各々が分離されニゲル上の各バンドは ＤＮＡ配列における特異的ヌクレオチドに共直線的に対応し、かくして、所与の ヌクレオチド塩基の配列における位置が同定される。 一般に、２種類のＤＮＡ配列決定法がある。１の方法（マキサムおよびギルバー ト配列決定法）は、各々をその明確末端で単一の放射性同位元素標識で標識し、 特に、各反応で４種の塩基（ＧＳＡ、ＴまたはＣ）のうちの１種またはそれ以上 にて限定された特異的切断を生じるような、単離ＤＮＡ断片の化学的分解を含む 。 他の方法（ジデオキシ配列決定法）は、ＤＮＡ鎮の酵素的合成を含む。４種類の 別々の合成を行い、各反応は、適当な鎖停止ジデオキシヌクレオチドの取り込み を介して特異的塩基（Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ）で停止される。後者の方法が好まし い。というのは、ＤＮＡ断片は（末端標識の代わりに）均一に標識され、かくし て、より大きいＤＮＡ断片は増大していく放射能を持つからである。さらに、５ ｓ５−標識ヌクレオチドを５ａｐ−標識ヌクレオチドの代わりに使用でき、その 結果、よりシャープな決定ができ；反応生成物は解釈するのが単純である。とい うのは、各レーンはＧｌＡ、ＴまたはＣいずれかのみに対応するからである。は とんどのジデオキシ配列決定法で用いる酵素はエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＮＡ−ポリメラーゼ１大断片（フレノウ）、ＡＭＶ逆 転写酵素、およびＴ７　ＤＮＡポリメラーゼである（ターバーら（Ｔａｂｏｒ　 ｅｔ　ａｌ）、米国特許第４７９５６９９号）。配列決定で用いるＴ７　ＤＮＡ ポリメラーゼは池のＤＮＡポリメラーゼよりも有利であると言われている。何故 なら、それは加工的で、関連エキソヌクレアーゼ活性を持たず、ヌクレオチドア ナログの取り込みに対して区別せず、かつプライマーとして用いるオリゴヌクレ オチドが少量でいいからである。 これらの特性は当該ポリメラーゼをＤＮＡ配列決定につき理想的なものにすると 言われている。 発明の概要 第１０）Ｂ様において、本発明は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド塩基配列を決定す るための改良方法をその要旨とする。該方法は、ＤＮＡ分子と、該ＤＮＡ分子に ハイブリダイズできるプライマー分子とをアニールし；４種の異なるデオキシヌ クレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、および特異的ヌクレオチド塩基にて ＤＮＡ合成を停止させる１種またはそれ以上のＤＮＡ合成停止剤を含有する容器 中で該アニールした混合物をインキュベートし、ここに、該停止剤は異なるヌク レオチド塩基にてＤＮＡ合成を停止させ；次いで、インキュベーション反応のＤ ＮＡ生成物をサイズに従って分離し、それにより、ＤＮＡのヌクレオチド塩基配 列の少なくとも一部が決定できることを含む。該改良は、φ２９−タイプのＤＮ ＡポリメラーゼであるＤＮＡポリメラーゼの提供である。 φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡの複製開始で用いる末端蛋白を 含有する関連ファージから単離したいずれのＤＮＡポリメラーゼも意味する。 これらのファージは、一般に、サラス（Ｓａｌａｓ）　［トザ・パイテリオファ ージ（Ｔｈｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ）　１６９．１９８８］によって 記載されている。これらのファージはそれらのＤＮＡポリメラーゼの構造に密接 に関連し、６個と少ないアミノ酸変化によりいくらか異なり、それらのアミノ酸 うちの５個は同様のアミノ酸によって置き換えられている。これらのファージは 、約６および３００個の間の長さの短鎖の末端逆位反復配列を有する。これらの ポリメラーゼは高活性の３’　−５’　エキソヌクレアーゼ活性を有するが、５ ’　−３’　エキソヌクレアーゼ活性は有しない。驚くべきことに、それらはＤ ＮＡポリメラーゼのＴ４ファミリーに関連するにも拘わらず、ジオキシヌクレオ チドのごとき鎖停止剤を適切に認識し、従って、ＤＮＡ配列決定で有用である。 この能力はもっと驚くべきである。 というのは、該エキソヌクレアーゼはデオキシおよびジデオキシＡＤＰを共に認 識するからである［ブランコら（Ｂｌａｎｃｏ、　ｅｔ　ａｌ）、１３．　ヌク レイツク・アシッズ・リサーチズ（Ｂｕｃ、＾ｃｉｄＲｅｓ、）、１２３９．１ ２４６，１９８５コ。 好ましい具体例においては、φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼは、φ２９−タ イプのファージに感染した細胞におけるポリメラーゼであり：φ２９−タイプＤ ＮＡポリメラーゼはφ２９、Ｃｐ−１、ＰＲＤＩ、φ１５、φ２１、ＰＺＥ。 ＰＺＡ、ＮｆＳＭ２Ｙ％Ｂ１０３、ＳＦ５、ＧＡ−１、Ｃｐ〜５、Ｃｐ−７、Ｐ Ｈ１、ＰＨ１、ＰＲ７２２、およびＬｉ２から選択され：φ２９−タイプＤＮＡ ポリメラーゼは修飾されたポリメラーゼであり、天然に存在するポリメラーゼの エキソヌクレアーゼ活性の１０％末滴を有しており、最も好ましくは、該ポリメ ラーゼは１％未満、さらにより好ましくは、実質的にエキソヌクレアーゼ活性が ないものであり：停止剤はジデオキシヌクレオチドである。 関連する態様において、本発明は、鎖停止剤のを供する共に、φ２９−タイプＤ ＮＡポリメラーゼを供することを包含するＤＮＡ配列決定用キットをその要旨と する。キットとは、好ましくは、ＤＮＡ配列決定反応で使用する条件において、 これらの２の成分を各々から分離しておく容器を意味する。 もう１つの関連態様において、本発明は、修飾されたφ２９−タイプＤＮＡポリ メラーゼをコードするＤＮＡ断片をその要旨とし、ここに、該ポリメラーゼはＤ ＮＡ配列決定で用いるのに十分なりＮＡポリメラーゼ活性、および対応する天然 に存在するφ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼの活性の１０％未満であるエキソ ヌクレアーゼ活性を有する。 「対応する」とは、該修飾されたポリメラーゼが、一般に、後者のポリメラーゼ をコードするＤＮＡ配列のｉｎ　ｖｆｔｒｏ突然変異誘発により、天然に存在す るポリメラーゼから由来したことを意味し、後者は対応するポリメラーゼである 。 好ましい具体例において、ＤＮＡ断片を修飾して天然に存在するエキソヌクレア ーゼ活性を実質的に排除し；該ＤＮＡ断片は、ポリメラーゼの１２．１４、また は１６位のアミノ酸がアラニン部位で置き換えられているφ２９ＤＮＡポリメラ ーゼをコードするＤＮＡ配列を包含する。 また、本発明は、前記ＤＮＡ断片から産生されたφ２９−タイプＤＮＡポリメラ ーゼをその要旨とする。 もう１つの態様において、本発明は、ＤＮＡ配列の増幅方法をその要旨とする。 該方法は、二本鎖ＤＮＡ配列の対向鎖に対し第１および第２プライマーをアニー ルし、該アニールした混合物をＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベートするこ とを含む。該改良は、ＤＮＡポリメラーゼとしてφ２９−タイプＤＮＡポリメラ ーゼを使用する。 好ましい具体例において、第１および第２プライマーは、アニーリング後に、相 互に向けられたその３°端を有し；該方法は、さらに、インキュベーション工程 後に、得られたＤＮＡを変性し、該変性ＤＮＡに対して第１および第２プライマ ーをアニールし、最後のアニール混合物を該ポリメラーゼと共にインキュベート することを含み：変性、アニーリング、およびインキュベーションのサイクルは １０〜４０分で繰り返し；φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼはφ２９、Ｃｐ− １、ＰＲＤＩ、φ１５、φ２１、ＰＺＥ、ＰＺＡ、Ｎｆ％Ｍ２Ｙ、Ｂ１０３、Ｓ Ｆ５、ＧＡ−１、Ｃｐ−５、ｃｐ−７、ＰＨ４、ＰＨ１、ＰＲ７２２、およびＬ ｉ２より選択され；該ＤＮＡポリメラーゼは、対応する天然に存在するポリメラ ーゼによって呈される天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性の１０％未満を呈 し、最も好ましくは、該ポリメラーゼは検出されるエキソヌクレアーゼ活性を有 しない。 さらなる態様において、本発明は、長さが１０キロベースを超えるＤＮＡ分子の 生産方法をその要旨とする。該方法は、鋳型ＤＮＡ分子を供し；該鋳型分子と共 にプライマーをアニールし：φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼ、および４種の 異なるデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下で、該アニールしたプラ イマーおよび鋳型分子をインキュベートすることを含む。 また、本発明は、ＤＮＡ分子の一端にてφ２９−タイプ末端ＤＮＡ配列を共有結 合させて生成物を得：次いで、φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ −タイプＤＮＡポリメラーゼの末端蛋白（後記参照）の存在下で、該生成物をイ ンキュベートすることを含む異種ＤＮＡ分子の増幅方法をその要旨とする。 「異種」とは、φ２９−タイプファージＤＮＡ分子内には天然で存在しないいず れのＤＮＡをも意味する。これはいずれの所望の蛋白をコードするＤＮＡをも包 含する。 末端ＤＭＡ配列は、６個および３００個の間の塩基長であり得るφ２９−タイプ ファージＤＮＡの１端または双方の端部で天然で生じる配列である。この配列は 末端蛋白、例えば、φ２９のＰ３蛋白によって特異的に認識され、結合され得る 。 好ましい具体例において、該方法は、増幅すべきＤＮＡ分子の各端部にφ２９− タイプ末端ＤＮＡ配列を供することを含み；該末端配列は５００ヌクレオチド未 満のＤＮＡ断片上に供し：鎖末端蛋白は、φ２９−タイプＤＮＡボリメーゼが天 然で生じるφ２９−タイプファージの末端蛋白である。 本発明は、高加工性で、低エキソヌクレアーゼ活性に産生され得るＤＮＡポリメ ラーゼを提供する。該ポリメラーゼの高加工性は、ＤＮＡ配列決定のみならず、 ＤＮＡの非常に大きな断片（長さが１０キロベースを超えるもの）の増幅にも適 当である。これにより、該ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）− タイプの手法で、あるいは複製タイプの、蛋白複製起点伸長反応で有用である。 ＤＮＡのこれらの長い長さは、ＤＮＡの小さいサンプルが得られる場合に、法廷 関係仕事に、および制限断片長条型分析で用いられる。 本発明の他の特徴および利点は、以下の好ましい具体例および請求の範囲の記載 より明らかであろう。 好ましい具体例の記載 ４、

【図面の簡単な説明】

図面 図面は、ポリメラーゼ間の相同性の部位を示す種々のＤＮＡポリメラーゼのアミ ノ酸配列を示す。ＥｘｏＩ、ＥＸｏＩＩおよびＥｘａｍとは、図面で比較した、 異なるＤＮＡポリメラーゼ間で見い出されたアミノ酸相同性の３領域をいう。星 印は、金属結合、またはエキソヌクレアーゼ分解的触媒反応いずれかに関連する イー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ残基を示す。アステリスクは、一本舗ＤＮＡ結 合に関連するイー・コリＤＮＡポリメラーゼＩ残基を示す。直線または矢印、お よび文字または数字で示された箱は、各々、ＤＮＡポリメラーゼＩのα−へリッ クスおよびβ−シート領域である。 ＤＮＡポリメラーゼ 一般に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは加工的であり、それに関連した天然に生 じるエキソヌクレアーゼ活性を有する。いくつかの好ましい具体例では、該ＤＮ Ａポリメラーゼは関連するエキソヌクレアーゼ活性をほとんどまたは全く有しな い。また、これらのポリメラーゼは鎖−置換活性を有する。 「加工的」とは、ＤＮＡ配列決定伸長反応、あるいは他のプライマー伸長反応で 普通に用いる条件下で、プライマーあるいは鋳型分子いずれかあるいは双方から 解離することなく、同一のプライマー鋳型を用いて、ＤＮＡポリメラーゼが継続 的にヌクレオチドを取り込むことができることを意味する。一般に、本発明のポ リメラーゼは、適当な環境条件下で、少なくとも１〜２キロベースの間で、一般 的には少なくとも５ｋｂ〜１０ｋｂの間で、伸長したプラスマーまたは鋳型に結 合したままである。 鎖−置換を生じる本発明のポリメラーゼの能力は、本発明で有利である。何故な らば、高加工性と組み合わせて、少な（とも７０ｋｂ、あるいはそれを超える長 さのＤＮＡ分子の合成が可能となるからである。鎖置換活性は、いずれかの標準 的な技術によって測定され、例えば、ポリメラーゼを一本鏑環状ＤＮＡ分子（例 えば、Ｍ２Ｓ）およびプライマーと混合してインキュベートし得る。もとの環状 分子を超える長さのＤＮＡ分子を合成するときは、ポリメラーゼは二本鎖分子の ＤＮＡ鎖を置き換え、継続してＤＮＡを合成することができ、かくして、それは 、鏑置換活性を有する。かかる活性は、一般に、単一の蛋白分子、例えば、ｐ２ またはφ２９に存在し、ＡＴＰまたはその等価物の形態のエネルギーを必要とせ ず、ＤＮＡを合成するのに要する標準的なデオキシヌクレオシド三リン酸のみを 利用する。また、この活性は、ＤＮＡ合成が末端蛋白、例えば、ｐ３またはφ２ ９によって開始される場合に観察される。 本発明のＤＮＡポリメラーゼに関連したエキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡ配列 決定反応においてポリメラーゼの使用に有意に干渉しないようである。しかしな がら、エキソヌクレアーゼ活性のレベルは、天然に存在するバクテリオファージ に感染した細胞から単離したＤＮＡポリメラーゼに普通関連する活性の１０％ま たは１％未満、好ましくは０．１％未満のレベルまで減少させるのが好ましい。 本発明のＤＮＡポリメラーゼは、そのポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を 減少するように遺伝的に修飾されたポリメラーゼ、ならびに天然に存在するφ２ ９−タイプＤＮＡポリメラーゼまたはその修飾ポリメラーゼと、あるいは前記列 挙酵素の同等物と実質的に同一のポリメラーゼを包含する。これらの各酵素は修 飾してφ２９ＤＮＡポリメラーゼのものと同様の特性を有するようにできる。 ファージ感染細胞から酵素を直接単離することはできるが、好ましくは、該酵素 はそれを過剰生産する細胞から単離する。 「実質的に同一」とは、該酵素が、該酵素の総じての特性に影響しないアミノ酸 置換を持つことができることを意味する。特に望ましいアミノ酸置換の一例は、 天然酵素が修飾されていずれのエキソヌクレアーゼ活性も除去されたものである 。 この修飾は遺伝的または化学的手段によって行うことができる。 本発明の実施例として、種々の有用な手法でのφ２９ＤＮＡポリメラーゼの使用 を記載する。この実施例は、本発明を限定するものではなく；当業者ならば、前 記ＤＮＡポリメラーゼのいずれも後記する方法で同様に用いることができるのを 認識するであろう。 バクテリオファージφ２９は、５゛端で共有的に連結した３１ｋＤの蛋白を有す る直鎖二本鎖ＤＮＡ分子である。この末端蛋白はｐ３といい、ウィルス遺伝子３ の産物であり、セリン残基のＯＨ基と５’　＝ｄＡＭＰとの間のホスホエステル 結合によって当該ＤＮＡに結合している。φ２９複製は蛋白複製起点メカニズム によっていずれかのＤＮＡ端で開始し、そこでは、末端蛋白ｐ３の遊離分子はｄ ＡＴＰと反応して、伸長のために必要な３′ＯＨ基を提供する蛋白−ｐ３−ｄＡ ＭＰ共有結合複合体を形成する。遺伝子３生成物およびφ２９ＤＮＡ−蛋白ｐ３ 鋳型に加えて、該開始反応は、ＤＮＡポリメラーゼであるウィルス遺伝子２の産 物（ｐ２）を必要とする。遺伝子２から産生された蛋白ｐ２は６６．５ｋＤの分 子量を有する。蛋白ｐ２に関しては、一本舗につき、ある程度は二本鎖ＤＮＡに つき、３’　−５’　エキソヌクレアーゼ活性である。蛋白ｐ２は、ブランコ（ Ｂｌａｎｃｏ）ら［２９ジーン（Ｇｅｎｅ）３３．　１９８４］に記載されてい るごとく、遺伝子２含有組換えプラスミドを有するイー・コリ細胞から標準的な 手法によって精製できる。該蛋白は、さらに、ブランコ（Ｂｌｎｃｏ）ら［１３ ヌクレイツク・アシッズ・リサーチズ（Ｎｕｃ、＾ｃｉｄ、［ｌｅｓ、）、１２ ３９．　１９８５］によって記載されているごとく、ホスホセルロースカラムを 通すことによってさらに精製できる。 ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）らは、前掲、後記するごと（、遺伝子操作によって、 エキソヌクレアーゼ活性の不活化の測定に適したエキソヌクレアーゼアッセイを 記載している。バクテリオファージφ２９におけるｐ２およびｐ３に関連する他 の酵素はｐ５およびｐ６を包含し、それは、サセス（Ｓａｌａｓ）　［Ｌ　Ｏ９ ，ｒ微生物学および免疫学における現在のトピックス（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐ ｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）８９ ．　１９８３］によって記載されているごと（、ｐ２による重合の効率を増大さ せる。 エキソヌクレアーゼ突然変異体 φ２９ＤＮＡポリメラーゼのクローニングと、本発明で有用なエキソヌクレアー ゼ突然変異体の例を産生ずるためのｐ２遺伝子の操作を簡単に記載する。 出発プラスミドは、φ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードし、そのリポソーム結合 配列（ＲＢＳ）を包含するファージφ２９の遺伝子２を含有するｐＢＲ３２２誘 導体であるｐＢｗ２であった［ブランコ（Ｂｌａｎｃｏ）ら、２９ジーン（Ｇｅ ｎｅ）、　３３．１９８４］。この構築においては、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ についての推定ＡＴＧ開始コドンは唯一のＨｉｎｄｌ［［制限部位の３０ｂｐ下 流に位置している。 プラスミドｐＢｗ２をＨｉｎｄｌ［Ｉで直線化し、ヌクレアーゼＢａ１３１での 制御消化に付した。次いで、該ＤＮＡを、遺伝子２を４４４塩基対下流で切断す る制限ヌクレアーゼ５ａｌＩで消化し、５′突出端部をイー・コリＤＮＡポリメ ラーゼのフレノウ断片で満たした。遺伝子２を含有する該ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮ ＡＩ、１ガーゼで結んでプラスミドｐＡＺｅ３ｓｓ　［ザバロス（Ｚａｂａｌｌ ｏｓ）ら、５８ジーン（Ｇｅｎｅ）、６７．　１９８７］とし、ＮｃｏＩで消化 し、次いで、その５′突出端部をフレノウ断片を用いて鵬たした。該連結産物を 用いてコンピテントなイー・コリＭ７２細胞（バクテリオファージλに溶原的、 かつ温度感受性ｃＩ８５７リブレツサーを含有）を形質転換し、アンピシリン耐 性細菌を選択した。３０℃で一晩、続いて４２℃で３時間増殖させることによっ て、アンピシリン（１００μ／ｍｌ）を含有する平板にて後者をレプリカ平板培 養した。コロニーをニトロセルロースフィルターに移し、０．１％ドデシル硫酸 ナトリウムで溶解した。該フィルターを洗浄し、（標準的な手法によって産生さ れた）ウサギ抗−φ２９ＤＮＡポリメラーゼ血清と共にインキュベートし、φ２ ９　ＤＮＡポリメラーゼを含有するコロニーを、［＋２５１］蛋白Ａとのインキ ュベーシユン、続いてのオートラジオグラフィーで検出した。選択したコロニー のＤＮＡ配列決定により、左側φ２９ＤＮＡ端部から、ｐ２についてコードする オーブン・リーディング・フレームにおいて、各々、２８６９〜２８６７位およ び２８６０〜２８５８位に対応するＡＴＧトリブレットで出発するφ２９ＤＮＡ を包含する、組換えプラスミドｐＡＺｗ２００およびｐＡＺａ２０３を選択でき た［ヨシカワ（Ｙｏｓｈｉｋａｗａ）ら、１７ジーン（Ｇｅｎｅ）、３２３．１ ９８２］、バクテリオファージＭｕの遺伝子ｎｅｒのＲＢＳと共に、バクテリオ ファージλのＰＬプロモーターの制御下でφ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードす る遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＡＺｗ２００またはｐＡＺａ２０３で形 質転換したイー・コリＭ７２細胞を３０°Ｃで増殖させ、次いで、４２℃に２０ 分間シフトしてλ　ＣＴ８５７リブレ、ソサーを不活性化し、続いて２時間３８ ℃にすると、酵素的に活性なφ２９ＤＮＡポリメラーゼが合成された。各々、組 換えプラスミドｐＡＺｗ２００およびｐＡＺａ２０３で形質転換した細胞１ｇ当 たり、約１５０および３００μｇの高精製φ２９ＤＮＡポリメラーゼが得られた 。 φ２９ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子およびバクテリオファージＭｕの遺伝子ｇｅｒ のＲＢＳを含有する組換えプラスミドｐＡＺｗ２００からのＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎ ｄｍ断片を、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて、バクテリオファージＭ１３ｍｐ１ ９の複製形態のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌ［１部位に結んだ。イー・コリＪＭ１０ ３細胞をかかるＤＮＡでトランスフェクトし、Ｘ−ｇａｌおよびイソプロピルチ オガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含有する平板で白色のプラークを選択した。選択 したプラークを液体培地で増幅し、複製形態を単離して（制限分析により）所望 のＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｍ断片の存在をチェックした。また、一本舗ＤＮＡを単 離し、ナカムラ（Ｎａｋａｍｕｒａ）ら［１４ヌクレイツク・アシツズ・リサー チズ（Ｎｕｃｌ。 Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）、９６７９．　１９８６］によって記載されているごと（ に行った部位指向突然変異誘発で用いた。該部位指向突然変異誘発で用いた合成 オリゴデオキシヌクレオチドは： １）５’　ＡＧＴＴＧＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＡＣ２）５’　ＧＡＣＴＴＴＧＣＧ ＡＣＡＡＣＴＡＣ３）５°　ＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＣＣＧＧＡＧＣであった。 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよび［Ｙ−３’Ｐ］　ＡＴＰで標識した対応す る突然変位誘発オリゴヌクレオチド５’　［”Ｐ］に対する／ｑブリダイゼーシ ョンによって、点突然変異を有する組換えクローンを選択した。選択したクロー ンから一本鎖ＤＮＡを単離し、完全なりＮＡボリメーゼ遺伝子の配列を測定して 、各クローンが所望の突然変異のみを持つことをチェックした。バクテリオファ ージＴ７のφ１０プロモーターの制御下、ｐＴＴシリーズ［ターバー（Ｔａｂｏ ｒ）ら。 ８２ブロシーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ （Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃｄｓ、ｓｃｉ、）ＵＳＡ、１０７４．１９８５］ のプラスミドｐＴ７−３の対応する部位にクローン化したプラスミドｐＡＺｗ２ ００のＥｃｏＲＩ−ＨｔｎｄｌｌＩ断片を含有するプラスミドｐＡＢｗ２の同一 部位へ、異なるクローンからのＥｃｏＲＩ−Ｂｓ　ｔＢＩ断片を、Ｔ４ＤＮＡリ ガーゼで結んだ。このＥｃｏＲＩ−Ｂｓｔｌ断片は、対応する突然変異配列によ って、その領域において、野生型配列を置き換える。このようにして、φ２９Ｄ ＮＡポリメラーゼのアミノ末端から対応するアミノ酸変化を含有する組換えプラ スミドｐＡＢｎ２Ｄ１２Ａ、　ｐＡＢｎ２Ｅ１４Ａ、ｐＡＢｎ２Ｄ６６Ａ、ｐＡ Ｂｎ２Ｄ１２ＡＤ６６ＡおよびｐＡＢｎ２Ｅ１４ＡＤ６６Ａを選択した。ＩＰＴ Ｇで誘導可能なｌａｃ　ｕｖ５プロモーター［ストラブイエ（Ｓｔｕｄｉｅｒ） ら、工８９ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、１Ｉｏ１．Ｂ ｉｏｌ、）、１１３．　１９８６］の制御下、該組換えプラスミドを用いて、宿 主ＤＮＡにバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するイー・ コリＢＬ２１　（ＤＥ３）細胞を形質転換した。組換えプラスミドの存在につき 、アンピシリン耐性菌を分析した。３７℃で増殖させ、３７℃で１時間インキュ ベートした該組換えプラスミドを含有するイー・コリ細胞へ１ｍＭＩＰＴＧを添 加することによつて、φ２９ＤＮＡポリメラーゼ突然変異体蛋白の発現を得た。 以下のアミノ酸変化＝１）天然のアスパラギン酸の代わりに（ｐ２をコードする 遺伝子における第１メチオニンに関して）１２位にアラニン（Ｄ１２Ａ）：２） グルタミン酸の代わりに１４位にアラニン（Ｅ１４Ａ）；３）アスパラギン酸の 代わりに６６位にアラニン（Ｄ６６Ａ）；４）アスパラギン酸の代わりに１１お よび６６位にアラニン（ＤＩ２Ａ、Ｄ６６Ａ）；および５）１４および６６位に アラニン（Ｅ１４Ａ、Ｄ６６Ａ）を有する５つの異なる突然変異体蛋白が得られ た。該異なる突然変異体蛋白を精製し、前記した標準的なアッセイにより測定し たその３′−５°エキソヌクレアーゼ活性は、野生型の天然に存在するφ２９Ｄ ＮＡポリメラーゼのよりも１００〜１０００倍低かった。 ！匹 株ｐＡＺＷ２００（野生型ｐ２遺伝子）　、ｐＫｃ３０Ａ１（野生型ｐ３遺伝子 ）、ｐＡＢＮ２Ｄ１２ＡＤ６６Ａ　（１２および６６位にアラニンを有するエキ ソヌクレアーゼ欠失ｐ２遺伝子）は、１９８９年３月２４日にＡＴＣＣに寄託し 、各々、受託番号６７９２０．６７９１８．６７９１９が付された。 出願人およびその譲受人スパニッシュ・リサーチ・カランセル（Ｓｐａｎｆｓｈ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｆｌ）　（コンセホ・スベリオール・インベルス テイガシオネス・シエンテイフイカス（Ｃｏｎｓｅｊｏ　５ｕｐｅｒｉｏｒ　Ｄ ｅ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｃｉｏｎｅｓ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃａｓ）Ｓｅｒｒａ ｒｉｏ　Ｎｏ、　１１７．　２８００６．マドリッド、スペイン）は、発行され た特許の期間の最後、培養の最後の請求後５年、あるいは３０年のいずれか遅い 前に培養が死滅したならば、該培養を取り換える義務を有し、その時点で寄託が 公衆に取り消し不能に利用可能とされるかかる特許の発行を受託者に通知する義 務を有することを認めます。３７ＣＦＲセクシヨン１〜１４および３５ＵＳＣセ クシヨン１１２の期間の下で、かかる時間まで特許庁長官は利用可能である。 図面を参照し、前記突然変異体を形成するのに用いたオリゴヌクレオチドは、Ｄ ＮＡポリメラーゼ■のエキソヌクレアーゼ活性を減少させることが知られている 他のポリメラーゼおよび突然変異体とのアミノ酸配列相同性を考慮して選択した ［デルビシイール（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ）ら、２４０サイエンス（Ｓｃｉｅｎ ｃｅ）、１９９　。 １９８８］。適当なエキソヌクレアーゼ突然変異体を生成するような他の突然変 異はブラックボックスで示されている。一般に、これらの位置におけるアミノ酸 は欠失されているか、あるいは異なるアミノ酸で置き換えられるかのいずれかで ある。また、アミノ酸の大きな欠失または多重置換は本発明で有用である。突然 変異誘発の後、エキソヌクレアーゼ活性のレベルを測定し、ＤＮＡポリメラーゼ 活性の量を測定して本発明で用いるのに（例えば、ＤＮＡ配列決定に）十分で、 加工的であり、鎖置換活性を有することが確認される。 黒塗 本発明のＤＮＡポリメラーゼは以下の方法において有用である：制限酵素でＤＮ Ａを消化することによって生じた３′凹化末端を満たすこと：５゛端が突出して いるＤＮＡ断片の末端を標識化すること（充填反応）；平滑末端ＤＮＡ断片また は３゛端が突出しているＤＮＡ断片の末端を標識化すること；ＤＮＡ断片の３゛ 突出末端を除去すること：天然に存在する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を 使用する二本鎖ＤＮＡの部分消化によってハイブリダイゼーションプローブとし て使用するためにＤＮＡ断片を標識化し、次いで、標識ｄＮＴＰで充填反応を行 うこと（置換反応）ニ一本舗ＤＮＡ上での鎖置換合成によって得られた所望の配 列の多重コピーを含有する長い（５〜１０ｋｂ以上）および短い一本鎖ＤＮＡプ ローブの合成（このような長いプローブは高比活性にて標識ｄＮＴＰで標識化さ れ得る）；変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用することによる高比活性で の二本鎖ＤＮＡのランダム標識化；ｃＤＮＡクローニングにおける第２鎖ｃＤＮ Ａの合成ニ一本舗および二本鎖ＤＮＡ鋳型上でサンが一タイプのジデオキシ系［ サンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）ら、７４、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エイ（Ｐ　ｒｏｅ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ　ｃｉ。 ＵＳＡ）、５４６３．１９７７］を使用してＤＮＡを配列決定すること；プラス ／マイナイス型法［サンガーら、９４、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ オロジー（Ｊ　、　Ｍｏｌ、Ｂ　ｉｏｌ、　）、４４１．１９７５］によってＤ ＮＡを配列決定すること；低いＤＮＡ複製適合度の条件下でエキソヌクレアーゼ −欠失ＤＮＡポリメラーゼを使用することによる一本鎖および二本鎖ＤＮＡ鋳型 のランダム突然変異誘発；二本鎖ＤＮＡ鋳型上での部位特異的突然変異誘発；プ ライマーとして合成オリゴヌクレオチドを使用する長い二本鎖ＤＮＡ断片の遺伝 子増幅または合成：およびφ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼ、末端蛋白、反応 を増強するのに必要な補助蛋白、およびφ２９−タイプＤＮＡ−蛋白ｐ３鋳型を 含むφ２９−タイプＤＮＡ複製系を使用する二本鎖ＤＮＡ断片の増幅または合成 。 φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定するのに、ポリメラーゼ 連鎖反応を行うのに、ならびにＤＮＡ極端に長い鎖を生産するために温度サイク リングを必要とせずに増幅するのに特に有用である。これらの方法を詳細に説明 する。 φ２９　ＤＮＡポリメラーゼを用いるポリメラーゼ連鎖反応の例を示す。一般に 、該ＤＮＡポリメラーゼはフレノウまたはＴａｑポリメラーゼの代わりに簡単に 使用され得る。 標的ＤＮＡ　Ｏ，ｉｐ＠ｏｌを、５０ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ｆ（Ｃ／（ｐＨ７，５） および１０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する緩衝液５０μ！中、選択されたオリ ゴヌクレオチド（１５〜２０１ｅｒｓ）各３００ｐ＠ｏｌ、およびデオキシヌク レオシド三リン酸（ＩＮ５ｍＭ）各７５ｎｍｏ１と混合する。該溶液を１０分間 で９５℃にし、水浴中、１分間で３０℃に冷却する。φ２９　ＤＮＡポリメラー ゼ（野生型またはエキソヌクレアーゼ突然変異体いずれか）２０ｎｇを含有する １μｌを該混合物に添加し、該反応を３０℃で５分間進行させ、その後、加熱、 冷却、酵素添加、および反応のサイクルを約９回繰り返す。使用したポリメラー ゼは標準的な方法によって精製する。 ポリメラーゼ連鎖反応で使用される従前のポリメラーゼは約２キロベースより大 きいサイズ範囲のＤＮＡ断片を提供できなかった［サイキ（Ｓ　ａｉｋｉ）ら、 ２３９、サイエンス（Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）　４８７．１９８８　；ケオハヴオン グ（Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ）ら、７１、ジーン（Ｇｅｎｅ）　２１１．１９８８） ］この相対的に短いサイズは、おそらく、これらのＤＮＡポリメラーゼの進行を 妨害する、ＤＮＡ断片の再アニーリングによって生じた二次構造およびヒンダー ランス（ｈｉｎｄｅｒａｎｃｅ）によるものだろう。φ２９ＤＮＡポリメラーゼ は高加工性および鎖置換能を有するので、長い増幅分子を得るためのＤＮＡ増幅 用の理想的な酵素である。 実施例２　：ＤＮＡ配列決定 ＤＮＡの配列決定については、鋳型として一本鎖ＤＮＡを使用する配列方法は、 多少改変したが、実質的にはティパー（Ｔ　ａｂｏｒ）ら［８４、プロシーディ ンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス・エ イ（Ｐ　ｒｏｅ。 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）４７６７．１９８７］によって記 載されている通りであった。 アニーリング反応では、アニーリング反応混合物（２０μｌ）は、４０ｍＭ　Ｔ ｒｉｓ−Ｈ（Ｊ、ｐＨ７，５，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２および７５１Ｍ　ＮａＣ１ を含有する緩衝液中に鋳型ＤＮＡ２．５μ９、プライマー６０ｎｇ（鋳型に対し て１０倍モル比）を含有させた。該混合物を６５℃に１５分間加熱し、次いで、 ３０分間かけて室温（２０〜２５℃）に冷却した。 標識化反応では、すべての４種の停止反応につき、単一の標識化反応を使用した 。アニーリング混合物（２０μｌ）に、各々０．６μＭのｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、 ｄＣＴＰおよび［α−”Ｐ］ｄＡＴＰ、２ｍＭジチオトレイトール、１００■Ｍ Ｔｒｔｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，２０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔおよび８％グリセロール を含有する混合物２０μｌを添加した。φ２９　ＤＮＡポリメラーゼ（野生型ま たはエキソヌクレアーゼ欠失のいずれか、１５０ｎｇ）の添加によって標識化を 開始する。室温で５分間インキュベートし、そこで、反応が完了した。「標識化 」反応混合物の４種の試料液（各８μｌ）を「停止」反応のために使用した。 伸長−停止反応では、４種の別々のジデオキシ「停止」混合物を１．Ｑｍ／のミ クロ遠心管中で調製した。各混合物（２μｌ）は、各２０μＭの３種ｄＮＴＰ。 各々２μＭおよび２００ＭＭである残りのｄＮＴＰおよびその対応するジオデオ キシ−ＮＴＰを含有した。上記標識化反応混合物８μｌを各停止混合物に添加し 、３０℃で１５分間インキュベートした。次いで、停止溶液（９５％ホルムアミ ド／２０ｓ＋Ｍ　ＥＤＴＡｌｏ、０５％キシレンシアツール１０．０５％ブロモ フェノール・ブルー）３μｌを添加した。該混合物を、配列決定ゲル上に６μｌ を負荷するに先立ち、９５℃で２分間加熱した。 二本鎖ＤＮＡ配列に関するプロトコールは、アルカリ−変性工程が先行する以外 は上記プロトコールと同様である。 上記考察の理由に関しては、ＤＮＡ鋳型の二次構造はＤＮＡポリメラーゼの進行 を妨害することもあり得る。これは、ヘアピン構造を形成し得るノ（リントロー ム配列で、または酵素が特異的配列に依存して休止する他の配列で生じ得る。φ ２９　ＤＮＡポリメラーゼの高加工性および鎖置換能のために、このポリメラー ゼで得られた配列決定の結果は従来技術のものよりも優れている。 以下の方法では、反応混合物にｐ５およびｐ６のごとき補助蛋白を含有させるの が有用である。ｐ６の調製はブランコ（Ｂ　１ａｎｃｏ）ら［６２、ジャーナル ・オブ・パイロロジー（Ｊ　、　Ｖｉｒｏｌ、　）、４１６７．１９８８］によ つて開示されている。ｐ５の調製は以下の通りである： 含遺伝子５組換えプラスミド、０Ｍ２６を担持しているイー・コ１バＥ、ｃｏｌ ｉ）Ｋ１２ΔＨ１Δｔｒｐ細胞またはファージφ２９突然変異体５ｕｓ１４（１ ２４２）に感染したビイ・スブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を、精製の ために蛋白ｐ５の供給源として使用した。イー・コリ抽出物に存在する蛋白ｐ５ は、４２℃で２゜５時間誘導した後、合計蛋白の〜１．４％の量であり、ビイ・ スブチリス抽出物に存在する蛋白ｐ５は合計蛋白の〜２．７％の量であった。 含遺伝子５組換えプラスミドｐＧＭ２６を有するイー・コリに１２ΔＨ１Δｔｒ ｐ細胞１０ｇを４２℃で２．５時間誘導し、アルミナ（２０ｇ）と−緒に磨砕し 、０．３Ｍ　ＫＯ２を含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ　ｐＨ７ ，５，５％グリセロール）で抽出した。溶解物を１６．５００Ｘｇで１０分間遠 心し、該ベレットを同緩衝液で再抽出した。２の懸濁液をプールし、硫酸アンモ ニウムで６５％飽和として沈澱させた。ベレットを緩衝液Ａに溶解し、同緩衝液 に対して透析し、ｌｔ衝液Ａ＋２０％グリセロールで希釈し、緩衝液Ａ−１０ｍ Ｍ　ＮａＣ１で平衡化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（２，７ｃｍＸ　１０ｃ ｍ＞を通しただ。該カラムをまず緩衝液Ａ−２０％グリセロールで、次いで、緩 衝液Ａで洗浄し、最後に、蛋白ｐ５を緩衝液Ａ＋５０ｍＭ　ＮａＣｊ！で溶離し た。蛋白ｐ５を含有する両分をプールし、硫酸アンモニウムで６５％飽和に沈澱 させた。該ベレットを１２ｍ１の緩衝液Ａ＋１．４Ｍ硫酸アンモニウムおよび５ ０％グリセロールに再懸濁した。はとんどのｐ５を含有する、遠心の後に残存す るベレットを緩衝液Ａ＋５０％グリセロールに溶解した。φ２９遅延溶解突然変 異体５ｕｓ１４（１２４２）に感染したビイ・スブチリス細胞から、同様の方法 で蛋白ｐ５を精製した。全ての精製工程で、蛋白ｐ５を５ＤＳ−ポリアクリルア ミドゲル電気泳動によって追跡した。 いくつかの調製において、最後の精製工程の後、５ｃｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ。 ｐＨ７，５，０，２Ｍ　ＮａＣ１中１５〜３０％（Ｖ／Ｖ）グリセロール勾配液 ５＠ｌ中、０℃で２６０，０００Ｘ９で２４時間、蛋白ｐ５を遠心した。遠心後 、各０．２．ｌ前記したごと（、φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼを使用する プライマー伸長によってＤＮＡ長鎖を合成できる。この特性は、従前のポリメラ ーゼ連鎖反応で使用した温度サイクリングを必要とせずにＤＮＡを増幅するため に使用され得る。この方法は、オリゴヌクレオチドブライマーよりもむしろ蛋白 プライマーを使用する。一般に、φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼの末端反復 配列は、多（の標゛「１ｉ的な方法のいずれによっても、増幅すべきＤＮＡ分子 の各末端に共有的に結合される。この結合は、増幅すべき配列の直接連結による ものでもよ（、または部位特異的突然変異誘発と同様の方法によるものでもよい 。ここに、末端配列からなるオリゴヌクレオチドを構築して、そのヌクレオチド 配列を増幅を要する隣接ＤＮＡに組換えることが可能となる。別法において、制 限エンドヌクレアーゼを使用して、これらの部位に位置する、末端配列からなる ゲノムＤＮＡおよび合成オリゴヌクレオチドをランダムに切断することもできる 。各々の場合、ヌクレオシド三リン酸と一緒にｐ２およびｐ３蛋白を供すること によってＤＮＡは増幅される。この実施例は、以下の通りである：標準的な方法 によって単離したφ２９ＤＮＡ蛋白−ｐ３の調製物を、制限ヌクレアーゼＣ１ａ ｌで切断して長さ６１４７および１３１３８ｂｐの２の断片を得た。次いで、適 当な多重クローニング部位を含有するＤＮＡ断片を２つのＣ１ａｌ断片と結んで 結合する。次いで、増幅すべきＤＮＡ断片を多重クローニング部位のうちの１つ に結び、得られたＤＮＡをＤＮＡ合成用鋳型として使用する。 インキュベーション混合物は、２Ｓｕｌ中に、５ＱｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐ Ｈ７゜５．１０ｗＭ　ＭｇＣ４，１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭスペルミジ ン、２０鵬Ｍ硫酸アンモニウム、各々８０μＭのｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ および［α−”Ｐ］ｄＡＴＰ、φ２９　ＤＮＡポリメラーゼ８０ｎｇ、遺伝子３ −含有組換えプラスミドｐＫｃ３０Ａ１（ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）ら、２１、 ジーン（Ｇｅｎｅ）　、６５．１９８３）を有するイー・コリＮ９９λｔｓ細胞 からプリエト（Ｐ　ｒｉｅｔｏ）ら［８１、ブロシーデインダス・オブ・ナショ ナル・才力デミ−・オブ・サイエンシズ・ニー・ニス−エイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ ｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、１６３９．１９８４］の記載に 従って精製した末端蛋白ｐ３２０ｎ９、上記に従ってφ２９−感染ビー・サチリ スから精製した蛋白ｐ５（９μｇ）およびｐ６（２μｇ）ならびに所望の量の鋳 型（１０ｎｇ−１μｇ）を含有する。３０℃で６０分間インキュベートした後、 鋳型以外の系の成分を全て含有する２５μｌを添加し、該混合物を３０℃で約６ ０分聞耳度インキュベートする（第２サイクル）。同様の方法で該サイクルを数 回繰本発明のＤＮＡポリメラーゼは、多くの用途、例えば、ＲＦＬＰ分析、およ びＤＮＡプローブ構築に有用な非常に長いＤＮＡ分子の合成を容易とする。この 方法の実施例を示す。 一本鎖Ｍ１３ＤＮＡを１７−ｍｅｒＭ１３オリゴヌクレオチドブライマーでハイ ブリダイズした。インキュベーション混合物は、１０μ！中に５０μＭ　Ｔｒｉ ｓ−Ｈ（ＪＳｐＨ７，５，１ｃｍＭ　ＭｇＣｂ、１瞭Ｍ　ＤＴＴ、プライム化Ｍ １３ＤＮＡ０．５μ９、各々８０μＭのｄＣＴＰＳｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよび［ α−１１ｐ］ｄＡＴＰおよびφ２９　ＤＮＡポリメラーゼ（５０ｎｖ）を含有す るものであった。 ３０℃で４０分間インキュベートした後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの存 在下、該試料をセファデックス（Ｓ　ｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−５０スピンカラ ムを通して濾過し、排除画分のセーレンコフ放射線を計数した。合成したＤＮＡ のサイズを分析するために、試料をＤＮＡ長マーカーと一緒にアルカリ０．７％ アガロースゲル中で電気泳動に付した。該ＤＮＡマーカーを臭化エチジウムで検 出し、合成したＤＮＡを乾燥ゲルのオートラジオグラフィーによって検出した。 ３０℃で４０分間インキュベートするうちに、７０Ｋｂよりも長いＤＮＡが合成 された。 他の具体例は以下の請求の範囲内である。 国際調査報告 ｌＨｍＭ＃１．−＾−１−沖−Ｎｏ、　ＰＣＴ／卦１ｉ９０１０１６３１１＋ｌ ＰｌＲｊ１ｍＮ＆ｌ　ａｅ、＆ｔａｂｍ　Ｎ。Ｋゴ１０３９０１０１６３１Ｐｃ Ｔ／ＵＳ９０１０１６コ１

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ分子にハイブリダイズで奉るプライマー分子と共に該ＤＮＡ分子をア ニールし； ４種の異なるデオキシヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、および特異 的ヌクレオチド塩基にてＤＮＡ合成を停止する１種またはそれ以上のＤＮＡ合成 停止剤を含有する容器中で該アニールした混合物をインキュベートし、ここに、 該停止剤は異なるヌクレオチド塩基でＤＮＡ合成を停止し；次いで、インキュベ ーティング反応のＤＮＡ生成物をサイズに従って分離し、それにより、該ＤＮＡ のヌクレオチド塩基配列の少なくとも一部が決定できる工程よりなるＤＮＡ分子 のヌクレオチド塩基配列を測定する方法において、核ＤＮＡポリメラーゼがφ２ ９タイプＤＮＡポリメラーゼである改良。
2. ２．該φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼが、φ２９−タイプファージで感染し た細胞におけるそのポリメラーゼである請求項１記載の方法。
3. ３．該φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼが、φ２９、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、φ １５、φ２１、ＰＺＥ、ＰＺＡ、Ｎｆ、Ｍ２Ｙ、Ｂ１０３、ＳＦ５、ＧＡ−１、 Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、およびＬ１７から選択され る請求項１記載の方法。
4. ４．該φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼが、天然に存在するポリメラーゼのエ キソヌクレアーゼ活性の１０％未満を有する修飾されたポリメラーゼである請求 項１記載の方法。
5. ５．該ポリメラーゼが、天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性の１％未満を有 するように修飾された請求項４記載の方法。
6. ６．該φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼがエキソヌクレアーゼ活性を実質的に 有しない請求項５記載の方法。
7. ７．該停止剤がジデオキシヌクレオシド三リン酸である請求項１記載の方法。
8. ８．φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼ、および鎖停止剤よりなるＤＮＡ配列決 定用キット。
9. ９．修飾されたφ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ断片であ って、該ポリメラーゼが、ＤＮＡ配列決定で用いるのに十分なＤＮＡポリメラー ゼ活性を有し、対応する天然に存在するφ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼの活 性の１０％未満であるエキソヌクレアーゼ活性を有する該ＤＮＡ断片。
10. １０．該ＤＮＡ断片が実質的にエキソヌクレアーゼ活性を有しないＤＮＡポリメ ラーゼをコードする請求項９記載の断片。
11. １１．該ＤＮＡ断片が、φ２９ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列より なり、ここに該ポリメラーゼの１２、１４または６６位のアミノ酸部位がアラニ ン部位によって置き換えられている請求の範囲第９項記載のＤＮＡ断片。
12. １２．請求の範囲第９項または１０項記載のＤＮＡ断片によって産生されたφ２ ９−タイプＤＮＡポリメラーゼ。
13. １３．第１および第２プライマーを二本鎖ＤＮＡ配列の対向鎖に対してアニール し、次いで、該アニールした混合物をＤＮＡポリメラーゼと共にインキュベート することよりなるＤＮＡ配列の増幅方法において、該ＤＮＡポリメラーゼがφ２ ９−タイプＤＮＡポリメラーゼよりなることを特徴とする改良。
14. １４．該第１および第２プライマーがアニーリングの後に相互に向けられるその ３′端を有する請求の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．該方法が、さらに、該インキュベーション工程の後に、得られたＤＮＡを 変性し、該第１および第２プライマーを該変性されたＤＮＡに対してアニールし 、最後の該アニールされた混合物を該ポリメラーゼと共にインキュベートするこ とよりなる請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．変性、アニーリング、およびインキニベーションの該サイクルを１０〜４ ０回繰り返す請求の範囲第１５項記載の方法。
17. １７．該φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼがφ２９、Ｃｐ−１、ＰＲＤ１、φ １５、φ２１、ＰＺＥ、ＰＺＡ、Ｎｆ、Ｍ２Ｙ、Ｂ１０３、ＳＦ５、ＧＡ−１、 Ｃｐ−５、Ｃｐ−７、ＰＲ４、ＰＲ５、ＰＲ７２２、およびＬ１７から選択され る請求の範囲第１３項記載の方法。
18. １８．該ポリメラーゼが、対応する天然に存在するポリメラーゼによって呈され る天然に存在するエキソヌクレアーゼ活性の１０％末満を呈する請求の範囲第１ ３項記載の方法。
19. １９．該ＤＮＡポリメラーゼが検出可能なエキソヌクレアーゼ活性を有しない請 求の範囲第１３項記載の方法。
20. ２０．鋳型ＤＮＡ分子を供し； プライマーを該鋳型分子と共にアニールし；φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼ および４種の異なるデオキシヌクレオシド三リン酸の混合物の存在下で、該アニ ールしたプライマーおよび鋳型分子をインキュベートすることを特徴とする１０ キロベース長を超えるＤＮＡ分子の生産方法。
21. ２１．φ２９−タイプ末端ＤＮＡ配列をＤＮＡ分子の一端に共有的に結合させて 産物を形成させ；次いで、 φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼ、φ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼの末端 蛋白および４種の異なるデオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で該産物をアニ ールする工程よりなることを特徴とする異種ＤＮＡ分子の増幅方法。
22. ２２．さらに、φ２９−タイプ末端配列を該ＤＮＡ分子の各端部に供する工程よ りなる請求の範囲第２１項記載の方法。
23. ２３．該末端配列が５００ヌクレオチド未満のＤＮＡ断片上に供される請求の範 囲第２２項記載の方法。
24. ２４．該末端蛋白が、その中でφ２９−タイプＤＮＡポリメラーゼが天然で生じ るφ２９−タイプファージの末端蛋白である請求の範囲第２１項記載の方法。