JPH05508992A - 水中のｅ．ｃｏｌｉを同定するための新規および改良された方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 のＥ、　Ｃ０ＬＩを石　るための　および　された　゛発１ｇとえ最 余朋ヱと九肚 本発明は、水サンプル中のすべての大腸菌群（ｃｏｌｉｆｏｒ＋＊）のレベルお よびＥ、　ｃｏｌｔを同定するための、新規、簡易、迅速、高感度、特異的およ び安価な方法に関する。この方法は、Ｌ」立■の２つの明確な特性、すなわち、 ラクトースの利用およびインドール生成に基づいている。本発明はまた、水中の し」立Ｕの迅速で効果的な同定およびその定量のためのキットに関する。

良災旦宣量 ５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　迄」坦且は、ヒトおよび動物の糞便中に検出 される、通常腸内管に住む通性嫌気性グラム陰性園である。Ｅ、　ｃｏｌｉは、 しばしば尿生殖器管の感染および下痢の原因となる。

Ｌ−！■は通常糞便中に検出されるので、水中に存在することは長い間知られて おり、水および食物中の糞便による汚染の度合の指標として利用されてきた。そ のため、これらの細菌の検出、同定および定量の方法を考案および改良するため に、多くの努力が払われてきた。

しかし、Ｌ」１貝を水質汚染試験の細菌とするには大きな欠点がある：すなわち 、これらを検出するための簡単で特異的な方法がない。従って、これまでは、腸 内細菌科の広いサブセットである大腸菌群を検出していたにすぎない。腸内細菌 科は、糞便中のＥ、　ｃｏｌｉおよび環境細菌を含むが、サルモネラ菌、赤痢菌 およびプロテウス菌を含まない。そのため、大腸菌群が糞便物質による飲料水汚 染の尺度であった。

現在、大腸菌群、特にＬ２凶」、の存在を決定するために実施され得る試験は、 未知の微生物を既知の分類群に分類する特性試験の結果に基づいている。最も一 般的に利用されている試験は酵素試験であり、これは、細菌の代謝に関与するこ とが知られている酵素の存在を、外観の変化、呈色の変化、蛍光性または他の化 学的特性の変化を観察することによって主観的に検出するものである。Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ　、　１９：１０５　（１９８７）。

現在の大腸菌群およびＥ、　ｃｏｌｔの試験のほとんどは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ ｉａ属がグルツースおよびラクトースを発酵し、これらの発酵の結果として、ガ スまたは酸が産生されるという事実に基づくものである。Ｆｏｒｓｃｂ、　Ｍｅ ｄ、　３：５１５　（１８８５）。現在利用され得、水質汚染試験に使用される 方法の概要は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｕｂ　’ｃ　Ｆｌｅａｌｔｈ　Ａｓ５ｏｃ ’ａｔｉｏｎ、　（１９８５）に記載されている。現在使用されている多（の方 法では、ラクトースを酸およびガスに変換する代謝経路の第１段階を触媒する、 大腸菌群細菌の酵素β−Ｄ−ガラクトシダーゼのようなラクトースの代謝に関与 する酵素が使用されている。

２０世紀初期の研究によって、４４．５℃における培養物のインキ二ベーシ望ン を包含する古典的な糞便の大腸菌群試験が導入された。この温度で、Ｅ、　ｃｏ ｌｉは増殖し、ラクトースからガスまたは酸を産生ずるが、環境大腸菌群は増殖 しない。

上記糞便大腸菌群の技術に関して２つの基本的な欠点がある。第１に手順が長い 。この手順では、細菌インキュベーションに使用されるべき４４°Ｃの温度より もやや高い温度を使用するため、ストレスを受けたり、または損傷を受けた細菌 にとってはしばしば致命的になる。従って、糞便の大腸菌群のチューブに、推定 的大腸菌群試験において完全に増殖させた培養物を接種することが通例になって いる。このような手順には２日間要する。あるいは、糞便の大腸菌群のチューブ は、最初は３５℃で短時間、続いて４４．５℃でインキュベートされ得る。しか し、試験時間の短縮による利得は、２回のインキュベーション時間に伴うさらな る操作およびさらなる処理と引き換えると少な−１゜箪２に、この手順では、Ｅ 、　ｃｏｌｔではない大腸菌群の約１０％を、有害で望ましくないし」立■とし て認識し、特異性が限られている。Ｕ吐−組畦ｒａｎ、　Ｍｉｃｒｏｂ、、　５ ５：３３５　（１９８９）。第３に、この手順は、培養チューブ内で行われる。

この各チューブは、ガス泡が蓄積され観察され得る逆回きの第２のチューブ（Ｄ ｕｒｈａｍ　ｔｕｂｅ）に備えられている。

臨床研究所では、腸内細菌科に属する病原性菌の完全に増殖させた単一コロニー をスクリーニングするための、より優れた試験を開発する多くの試みがなされた 。１９８４年には、ＬＣｌｉｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　２０＋１３６に、 腸内および他の臨床標本からの腸内細菌科の完全に増殖させた純粋な培養物を同 定するための複合試験培地である単一チューブが記載されている。用いられた培 地により、運動性、β−ガラクトシダーゼ、フェニルアラニンデアミナーゼ活性 および硫化水素およびインドール生成が検出できる。しかし、この試験法は完全 に増殖させた単一コロニーに対してのみ行われ得るため、水サンプル中では有用 ではない。

近年、病院では、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＲ）の存在は、Ｌ」立■の存在を 示すための容認された指標となった。１９７６年には、Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　５ｅｃｔ、　Ｂ　８４：２４５　（ １９７６）に、Ｅ、　ｃｏｌｉの臨床分離物の９７％がβ−Ｄ−グルクロニダー ゼ（ＧＵＲ）を産生ずるが、はとんどの他の大腸菌群は産生じないことを示す所 見が記載されている。臨床サンプルでＧＵＩ２が好結果をもたらしたことにより 、科学者はこれを食物および水中のＥ、　ｃｏｌｔの検出に適応するようになっ た。

β−グルクロニダーゼの手順の１つの非常に重要な欠点は、すべてまたはほとん どすべてのＥ、　ｃｏｌｔはβ−〇−グルクロニダーゼを産生ずることができる と推定していることである。この推定に基づき、Ｅ、　ｃｏｌｉの迅速同定法（ ＲＩＭ）を含む多くの技術が開発された。以下に引用されたＲＩＭ法は、β−グ ルクロニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼの同時測定、続いてインドールの存 在を決定する方法を包含する。

Ｅ、　ｃｏｌｉを完全に増殖させた単一培養物を同定するための従来の試験法で は、ｐＨ７，５の０−ニトロフェニル−β−〇−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＣ ）のセーレンセン（５ｏｒｅｎｓｅｎ）　リン酸緩衝液を、完全に増殖させた試 験分離物に加え、その混合物を３５°Ｃで１時間インキュベートする工程からな る。Ｌ二二Ｈの存在の有無は、β−ガラクトシダーゼの存在を示す黄色の呈色の 有無により決定される。もとの無色の液体に色の変化が見られない場合は陰性で あり、このサンプルはＥ、　ｃｏｌｉを含まないと推定される。

従来の試験法は、Ｌ工田二ｌ：坦弧、、　１８：１２８７　（１９８３）に記載 されている。これに続いて開発された２つの試験法が、ＲＩＭおよび迅速検出Ｅ 、　ｃｏｌｉ　（ＲＤＥ）である。双方ともβ−グルクロニダーゼの測定に基づ くものである。

ＲＩＭシステムは、木製のスティックに巻き付けられ、試薬に含浸された綿スワ ブからなり、このスワブは完全に増殖させた細ｍ−２０ニーに接触している。細 菌の接種物を含んタコノスワブを、０ＮＰＧ含有の特定のＲＩＭ緩衝液中に入れ 、３５℃で３０−６０分間インキュベートする。陽性のＯＮＰＣ反応は黄色の呈 色で示される。陽性であれば、続いてβ−グルクロニダーゼ活性の存在を、３６ ６ｎｍの紫外線を照射して蛍光を検出することにより決定する。β−グルクロニ ダーゼ試験が陽性であれば、コバックス（Ｋｏｖａｃｓ）試薬を加え、赤色の呈 色によりインドールの存在を決定する。

ＲＤＥ試験は、β−グルクロニダーゼを同定するために若干改良されたシステム であり、基貫を含浸したペーパーディスクを使用する。ＲＤＥでは、完全に増殖 させた細菌のコロニーを希釈水中に接種して、細菌の懸濁液を生じさせる。次に 、β−グルクロニダーゼおよび０ＮＰＧ基質の両方を含むディスクを、３５℃で インキユベートされたチューブに加える。黄色の発色は、合成基質０ＮＰＧを加 水分解するβ−ガラクトシダーゼの存在を示す。０ＮＰＧからの加水分解は、β −ガラクトシダーゼの存在を示すので、　ｃｈｅｒｉｃ　ｉａ　Ａ−Ｄ群、Ｃ１ ｔｒｏｂａｃｔｅｒおよび虹」旦ｕのようなラクトース発酵微生物の存在が示唆 される。β−ガラクトシド試験が陽性のときは、ＲＩＭ試験におけるように、３ ６６ｎｍの紫外線光源でチューブを試験することによって、β−グルクロニダー ゼの存在が決定される。蛍光が観察されれば、β−グルクロニダーゼが存在する ことを意味する。この酵素は、Ｌ」白のすべての臨床分離物の約９７％に存在す ることが知られている。Ａｃｔａ　Ｐａｔｈｏｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃａ ｎｄ、５ｅｃｔ、Ｂ、８４：２４５　（１９７６）。β−グルクロニダーゼ試験 が陰性であれば、インドールの生成を調べるために、このサンプルを用いてイン ドールの指標試験をさらに行う。インドールの存在は赤色の呈色で示される。３ つの試験のすべて（すなわち、０ＮＰＧ、β−グルクロニダーゼおよびインドー ル）が陽性である場合のみ、微生物はおそら（Ｅ、　ｃｏｌｉであると結論づけ られる。３つの試験のいずれかが陰性であれば、微生物がＬ」旦■である可能性 は低いと解釈される。このような場合は、臨床分離物を確実に決定するための別 の工程が行なわれる。Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

２４：３６８　（１９８５）。

すべての臨床のＥ、　ｃｏｌｔの約９７％がβ−グルクロニダーゼを産生ずると いう初期の観察により、いかなる源に由来しようともすべてのＥ、　ｃｏｌｉの ９７％はこの酵素を産生ずると推測されるようになった。しかし、近年では、こ のような推測は誤っており、約３０−５０％のし」立■はβ−グルクロニダーゼ 陰性であり得ることが判明している。

それにもかかわらず、Ｌ」！■の９７％がグルクロニダーゼに陽性であるという 仮説によって、結果的に、いわゆるＭＭＯ−ＭＵＧ　（最少培地０ＮＰＧ−メチ ルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニダーゼ）試験が開発されるようになっ た。これは、現在、大腸菌群のすべてを定量するための分析法の１つとしてＵＳ 　ＥＰＡに承認されている試験法である。

ＭＭＯ−ＭＵＧ試験法では、蛍光化合物ＭＵＧを、β−グルクロニダーゼの基質 として使用する。この試験法は、被験サンプルをＭＭＯ−ＭＵＧ培地に入れ、０ ＮＰＧからのβ−ガラクトシドの産生を観察するものである。ガラクトシドの生 成は、２４時間以内に黄色の呈色を示すことで示され、続いてβ−グルクロニダ ーゼの基質である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニドから蛍光 物質が形成される。ＭＭＯ−ＭＵＧ試験は、アンフォテリシンＢ、　０ＮＰＧ、 　ＭＵＧ、およびソラニラム（ｓｏｌａｎｉｕｍ）を組み合わせた種々の塩から なる特定の複合体培地からなる。ＭＭＯ−ＭＵＧ試験は、すべての大腸菌群を評 価する方法として認められているが、他の大腸菌群からＥ、　ｃｏｌｔを判別す るほど特異的ではない。時間に関しては、この試験法は、少なくとも２４時間の インキュベーションを必要とする。極めて重要なことに、ＭＭＯ−ＭＵＧ試験法 では偽陽性率が１３−３５％の間であるが、より優れた試験法がないため、この 誤差はＵＳ　ＥＰＡに許容されていることがわかった。

しかし、この試験法の最も重要な欠点は、糞便サンプルからのすべてのＥ、　ｃ ｏｌｔのうちわずか約６６−７０％がβ〜グルクロニダーゼ陽性であり、Ｗの約 ３０−３４％はβ−グルクロニダーゼ陰性であることである。その結果、ＭＭＯ −ＭＵＧ試験では約３０−３４％の割合で偽陰性の結果が生じる。耐狙１．　Ｅ ｎｖユＤ凹、　Ｍｉｃｒ。

ｂｉｏｌ、、　５５：３３Ｓ　（１９８９）には、ＭＵＧ含有ラウリル硫酸トリ プトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）　フロースで測定した場合、Ｅ、　ｃｏｌｔのす べての糞便分離物の約３０−３４％は、β−Ｄ−ゲルクロニダーゼ陰性であるこ と、そして、それらのβ−グルクロニダーゼ陽性の中には、β−グルクロニダー ゼの産生に関して温度依存性であることが示された多数のβ−グルクロニダーゼ 陽性の細菌があることが示されている。これらの温度依存性Ｌ」立■は、３７℃ ではβ−グルクロニダーゼの産生は非常に弱いが、４４，５℃では強い陽性であ った。さらに、β−グルクロニダーゼ陰性の）：、　ｃｏｌｉのみを含む糞便サ ンプルもあった。上記の研究で分析されたサンプルは、健常人の糞便のサンプル から採取されたので、上述の試験が実施された場合に、Ｅ、　ｃｏｌｔによる水 質の糞便汚染が３０−３５％の割合で検出され得ないことは明らかである。この 偽陰性率は、公衆衛生において重要な意味を有している。米国南カリフォルニア 州からの水サンプルを試験した時、約４０％のＥ、　ｃｏｌｉがＭＭＯ−ＭＵＧ 　（Ｍ、　ＳｔｅｗａｒｔおよびＢ、　０１ｓｏｎ、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ：　Ａ ｎｎ、　Ｍｅｅｔｉｎ　Ａｍｅｒ、　Ｓａｃ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　（１ ９９０））では陰性であることがわかった。

この高い偽陰性率は、他の研究でも確認された。世界のあらゆる地域から糞便Ｅ 、　ｃｏｌｉを集めて、ＬＴ−ＭＵＧおよびＭＭＯ−ＭＵＧ法の両方で試験した ところ、３０％の偽陰性率が見られた（ムＦｏｏｄ　Ｐｒｏｔ、　５５：９７２ 　（１９９０））。

インドール生成酵素であるトリプトファナーゼは、Ｅ、　００１１の同定に使用 された最初の酵素試験法の１つであった。このインドール試験がＫｉｔａｓａｔ ｏのＺｅ’ｔｓｃｈｒｉｆｔ　Ｈ、Ｌｅｉ　ｚｉ、　７：５１５　（１８８９） に記載されてから１００年の間に、この試験法は、最も有用で信頼できるＥ、　 ｃｏｌｔの試験法の１つであることがわかってきた。この試験法は、他の大腸菌 群か叡Ｌ」旦■を識別するために、Ｉｄｅ　ｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　’Ｅ ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、第２版〜Ｂｕｒｇｅｓｓ　Ｐｕｂｌ、　 （１９６２）に発表された、古典的な１ＭＶｉｃ試験に記載されているように実 施される。

インドール試験の主な欠点は、ラクトースを利用する試験と併用できないこと、 そして水サンプル中のし」准Ｈを藺単に単一チューブを用いた試験法として実施 できないことである。

インドール試験の原理は、トリプトファンをインドールに代謝する酵素であるト リプトファナーゼを形成するＥ、　ｃｏｌｉの能力にある。この能力は、Ｌ一旦 ■が哺乳類の腸管で増殖する能力と密接に関係しているようである。腸内細菌科 の多くの種類がトリプトファナーゼを産生ずる能力を有しているため、この酵素 の存在により、トリプトファンの異化代謝産物としてインドールが蓄積される。

従って、この酵素の存在は、腸記載の、インドールの生成を同定するのに使用さ れる標準培地は、炭水化物を含有しない培地中で、３５°Ｃで２４時間のインキ ュベーションを行うことと、コバックス試薬を用いたインドール試験（ｅｉｔ、 　Ｉｍｍｕｎｉｔａｅｔｆｏ　ｓｃｈ、　ＥＸ　、　Ｔｈｅｒ、、　５５：３１ １（１９２８））とを必要とする。この反応は、インドールとｐ−ジメチルアミ ノベンズアルデヒドとの比色反応に基づく。この試験法では、遊離インドールは 、アミルアルコールまたはキシレンのような液体溶媒で抽出することによって除 去され、残留トリプトファンと遊離インドールとを分離させる。この残留トリプ トファンもまた、適切な条件下でｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドと反応す る。

Ｊ、　Ａ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　６３：３２９　（１９８？）に記載の 別のインドールの比色反応は、酸性溶液中での、ビロール環中のα位またはβ位 がフリーのインドールとグルタコニック（ｇｌｕｔａｃｏｎｉＣ）アルデヒドと の縮合に基づくものであり、その結果、赤−青紫色のポリメチン色素が形成され る。同様の考えに基づくマイクロテストは、腸内細菌科を迅速に同定するのに有 用であり、Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃ　ｏｂｉｏ　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、５ｃａ ｎｄ、Ｓ　ｅｔ、、９２：２３９　（１９８４）に記載されている。

上述の現在用いられている方法、試験および技術に関する欠陥および欠点は、本 発明の方法によって克服される。

良豆！！且 本発明の１つの局面は、水サンプル中のすべての大腸菌群およびＬ」！■の存在 を決定するための、高感度、迅速、特異的、正確、および安価な方法である。

本発明の他の局面は、水サンプル中のＥ、　ｃｏ■の存在を決定するための、迅 速で視覚的な方法である。

本発明のさらなる局面は、水サンプル中に存在するＬｊユ１の最確数を測定する ための定量法である。

本発明の他の局面は、水中のし」且■の存在を迅速で視覚的に決定するためのキ ット（ＥＣＯＴＡＧ）、水サンプル中のすべての大腸菌群およびＬ」旦■の存在 を決定するためのキット（ＣＯＬ　ＩＴＡＧ）、そして存在する大腸菌群の数お よびＬ」立りの数を定量するためのキット（ＥＣＯＴＡＧ−ＱＵＡＮＴ　Ｉ）で ある。

の　な１ｆ＋ 図１は、１８時間のインキュベージ１ン後の、Ｌ」旦■試験チューブ（ＥＣＯＴ ＡＧ）の概略図である。

図２は、１８時間のインキ１ベージ曹ン後の、大腸菌群試験チューブ（ＣＯＬ　 ＩＴＡＧ）の概略図である。

及豆ユ１区ユ１皿 本発明は、Ｌ」！■が、２つの非常に明確な特性（すなわち、ラクトースの利用 およびインドールの生成）を示す唯一の主要な腸内細菌のグループであるという 所見に基づいている。

ラクトースの利用の測定方法とインドール生成の測定方法とを組み合わせること により、水中のし」立■を決定するための、新規の、改良された、迅速、高感度 、特異的、安価、高信頼性、および正確な試験が開発された。

本発明は、インドールを生成する酵素であるトリプトファナーゼが、ラクトース の存在下で強く抑制される（Ａｂｓｔｒａｃｔ二勧ｎ、　Ｍｅ射−１測Ｌ」立Ｌ Ｊ且二ｌ泣１．．　Ｑ１２　（１９９０））　と（１う観察に基づいている。従 って、この抑制は、単にラクトースを培地から除去し、これを０ＮＰＧのような 適切な合成β−Ｄ−ガラクトピラノシド（本出願では、用語「ガラクトシド」お よび「ガラクトピラノシド」は同じ意味である）に代用することによって防ぐこ とができる。０ＮＰＧは、ラクトースを利用する細菌の能力を示すために有用で ある。しかし、ラクトースとは異なり、０ＮＰＧはトリプトファナーゼまたはイ ンドールの生成を抑制しない。従って、インドールの生成は、コバックス（Ｋｏ ｖａｃｓ’　）またはエールリッヒ試薬のような適切な試薬を加え、特徴的な色 の変化を調べることによってのみ評価され得る。

本発明はまた、異化代謝産物抑制の役割を認識することに基づいている。容易に 用いられる炭水化物エネルギー源（この場合過剰量のラクトースまたはラクトー ス代用物）による異化代謝産物抑制は、効率の低いエネルギー源（この場合トリ プトファン）の代謝、変換、および利用を弱める。

本発明で使用される培地は、このような異化代謝産物抑制の原因とならない、ま たは引き起さない程度の、少量の代用となるエネルギー源を利用する複合指標培 地であるＴＡＧ（トリプトファン−ガラクトシド）を導入することによって、そ のような異化代謝産物抑制を防ぐ。

本発明により、水サンプル中の大腸菌群およびＬ」！Ｈの存在を同時に検出する ことができる。これは、迅速な単一チューブを用いた試験として用いられ得、単 一培養物の分離または完全に増殖させたコロニーの産生を必要とせず、１個のＬ ｃｏｌｉ菌の存在さえも同定できる。

この発明は、続いて、アミノ酸であるトリプトファンがインドール、ピルビン酸 およびアンモニアに代謝され、インドールがアンモニアと等モル量生成されると いう観察に基づいている。この試験は、迅速で、所用時間は最終的にＬ」二はの 存在の有無を決定する汚染の程度によるが、２−２４時間であり；水サンプル中 のし」且■の存在の有無にかかわらず、偽陰性または陽性を生じることな（、は ぼ１００％の精度で決定されるため正確であり；希釈法を用いて、水中の最も可 能性の高い汚染Ｅ、　ｃｏ■の数および１個のし」立ｕさえも同定できるため、 高感度であり：有害性のない大腸菌群とＬ−二■とを識別することができるため 、Ｌ」旦■に特異的である。この試験は、ラクトースの利用を証明する酵素であ るβ−ガラクトシド、およびインドールの生成を証明する酵素であるトリブトフ ァナーゼの存在を同時に決定する。この試験を用いることによって、インドール を生成し、同時にラクトースを利用する細菌だけが陽性の結果を生じる。水サン プル中では、そのような能力は主に大腸＠Ｌ」亘■中にのみ存在する。

この試験は、インドールを生成し、同時にラクトースを発酵し、これによりトリ プトファンとガラクトシドとを最少限しか含まない特定の培地中で呈色および／ または蛍光を生じるような腸内細菌科に特異的である。水サンプル中では、これ らの腸内細菌科は、Ｅ、　ｃｏｌｉがほとんどである。

インドールの生成は、グルコース、ラクトースまたは他の容易に利用できる糖に よって一般に抑制される。その結果、インドール試験は、Ｅ、　ｃｏｌｔの通常 の代謝経路に関与する基質として知られているラクトースの存在下では作用しな い。

Ｅ、　ｅｏｌｉをラクトース含有培養培地に置くと、誘導酵素であるβ−ガラク トシダーゼが大量に合成されるという事実は周知である。誘導されたβ−ガラク トシダーゼは、反応スキームエによりラクトース（１）を加水分解し、燃料およ び炭素源として直接使用され得るＤ−グルコース（ＩＩ）およびＤ−ガラクトー ス（ＩＩＩ）を産生ずる。

反１ヒし先：コ仁」− β−力゛ラクトシタ゛−七゛ ラクトース　＋　Ｈ２Ｏ−−−−−−−−Ｄ−り゛ルコース　＋　Ｄ−力゛ラク トース（＋）　（ＩＩ）　（ＩＩＩ） Ｅ、　ｃｏｌｉのこの明確な特性は、本発明の第１の特性の１つとして使用され る。本発明では、このような特性を有する腸内細菌科をこのような特性を持たな いものから、迅速かつ正確に分離し得る。この試験では、ラクトースを利用する 能力は、色素産生性または蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシドの加水分解により 検出される。

Ｅ、　ｃｏｌｔの第２の明確な特性は、トリプトファンを窒素源として利用し、 これを酵素トリプトファナーゼで代謝するという能力である。この反応はインド ール試験で検出される。このインドール試験は、反応スキーム■で示される反応 に基づている。トリプトファン（ｍは、Ｅ、　ｃｏｌｔ）リプトファナーゼによ り遊離インドール（■）、ピルベートｍ）およびアンモニウム（Ｖｒｌ）に代謝 される。

反叉じし先二ノー」− Ｌ」旦旦 トリプトファン＋Ｈ２０−−−→　遊離インド−ル　＋　ヒ゛ルヘ゛−ト　＋　 アンモニア（ＩＶ）　）す７’）７ｙナーセ゛　（Ｖ）　（Ｖｌ）　（ＶＩＡ） Ｅ、　ｅｏｌｉの第１および第２の明確な特性は両方とも、Ｌ」■細胞の代謝の 柔軟性に基づいている。Ｌ」！■は、有機源の炭素と代謝エネルギーとを必要と している点で、有機栄養生物であるが、このカテゴリー内では代謝上可変性があ る。ラクトースの場合に見られるように、エネルギー源および炭素源としての利 用できるグルコースが存在しない場合、Ｅ、　ｃｏｌｌは、ラクトースを利用し 、素早く酵素合成を新しく方向づけることによって、ラクトースをＤ−グルコー スおよびＤ−ガラクトースに代謝させるために十分なβ−ガラクトシダーゼを産 生ずる。

炭素源としてのラクトースと同様に、Ｅ、　ｃｏｌｉはまた、アンモニア以外の 種々の窒素源を利用し得る。実際に、Ｅ、　ｃｏｌｔ細胞に十分な外因性のアミ ノ酸供給物が与えられている場合には、これらの細胞はアンモニアから新規にア ミノ酸を合成しなくなり、その代わりに予め生成された酸を使用するように必要 であれば、ある種のアミノ酸を燃料および炭素源として使用し得る。本発明は、 このＥ、　ｃｏｌｔの特性を認識した上で、分子内にインドールを含有するアミ ノ酸であるトリプトファンを有効に利用するものである。トリプトファンは、特 定の酵素トリプトファナーゼにより、遊離インドール、ピルベートおよびアンモ ニウムに代謝され得る。インドールを測定するための極めて特異的な試験がある ので、本発明では、この特徴を、ラクトースの発酵およびインドールの生成の両 方を持たない他のすべての細菌からＥ、　ｃｏｌｉを分離するために使用する。

しかし、インドールの生成はラクトースの発酵の存在下では阻害されるので、本 発明では、そのような代謝阻害を回避するために、ラクトース代用物を使用する 。

本発明は、実際に、上述の背景技術に基づき、酵素β−ガラクトシドの存在の決 定および遊離インドールの存在に基づいている。

上述のように、多量のラクトースが培地中に存在する場合、ラクトースは酵素β −ガラクトシダーゼに触媒されて、この酵素の産生が引き起こされる。β−ガラ クトシダーゼは、明確な化学特性を有し、容易に測定または同定され得る。しか し、ラクトースがトリプトファンからのインドールの生成を阻害することは周知 であるので、明らかにラクトースが存在する場合には、インドールは生成され得 ず、測定され得ない。ラクトースを、β−ガラクトシダーゼによって代謝され得 る代用化合物で代用することによって、ラクトースの阻害効果は回避される。そ の結果、ラクトース代用物により、インドールが生成され、同時に測定される。

本発明は、Ｌ」旦■がすべての代謝の要求に迅速に応答し得る転換可能な微生物 であることをさらに有効に利用している。

測定され得る特定のラクトース代用物が唯一の炭素源として提供されると、Ｌ」 立■はβ−ガラクトシダーゼを直ちに産生ずることによって素早（応答する。し かし、すべての他のさらに容易に利用される炭素源が培地から取り除かれると、 このＥ、　ｃｏｌｉ代謝制御システムは、トリプトファンを炭素源として認識す るようになる。このように、トリプトファンが提供され、すべての他の炭素源が 完全に取り除かれるか、またはこれらが試験に有効に使用されるように調節され ると、Ｌ」士はトリプトファナーゼを多量に生成し、トリプトファンは、容易に 測定可能な遊離インドールに変換される。本発明の試験においては、３つの基本 的な細菌実験セ・ノドアップを内容を改変して試験した。

セントアップ１：サルモネラ園を含有するが大腸菌群またはＥ、　ｃｏｌｉｌｉ を含有しないコントロールサンプル。

セットアツプ２　：　Ｅ、　ｃａｌｆ菌を含有する実験的サンプル。この群は、 Ｌ二立１ｉ　ＡＴＣＣ２５９２２、ＥＣＯＲ１３、ＥＣＯＲ８、ＥＣＯＲ５、Ｅ ＣＯＲ４、ＥＣＯＲ６、ＥＣＯＲ４７、ＥＣＯＲ１３のような、Ｌ−匪Ｈの種々 のタイプを含み、これらはすべてＡ＋ａｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ　Ｃ。

１１ｅｃｔｉｏｎから入手した。ＴＣ２４４、ＴＣ２３４；カリフォルニア大学 バークレー内部で単離されたＴＣ２１８、ＴＣ２１７またはＦＤＡ研究所のＰｅ ｔｅｒ　Ｆｅｎｇから入手されたＰＦ　２２６、ＰＦ　２２２゜セットアツプ３ 　：　ＴＣ２５７、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　Ｐｎｅｕ＋ａｏｎｉａｅＳ１士■ｏ ｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅ、またはＣ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄ ｉｉのような他の大腸菌群を含有する実験サンプル。

Ｂ、　Ａｗｅｓから入手されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔ　ｈｉｍｕｒｉｕｍは 、通常ラクトースおよびインドール共に陰性である。Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＴＣ２２ ４，２３４，２１８，２１７は、インドールおよびラクトース陽性である。

Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＰＦ　２２２および２２６は、インドール陽性およびラクトー ス陽性である。

Ｌ」立■の存在の有無を迅速に試験するために、セットアツプ１．２および３を 使用した。すべての大腸菌群およびＬ」匝に、セットアツプ１．２および３を使 用した。半定量には、任意のセットアツプが使用され得る。

種々の培地ベースを調製し、試験した。培地ベースのための基本的な要件は、少 なくとも最適な最少量のトリプトファンまたはトリプトファン代用物および最適 な最少量のラクトース代用物を含むことであった。

本発明の最も重要な特徴の１つは、異化代謝抑制を培地内の成分によって防ぐよ うにデザインされたトリプトファンおよびβ−ガラクトシドを含む新規のタイプ の培地である。そのような異化代謝産物抑制は、効率の低いエネルギー源（トリ プトファン）の代謝、変換および利用を抑制する、容易に使用される炭水化物エ ネルギー源（ラクトース代用物）が過剰量にある場合に生じる。

本発明の培地主成分の独自性は、そのような異化代謝産物抑制を防ぎ、取り除く ために調整された成分によって得られる。つまり、ＭＭＯ−ＭＵＧまたは他の現 在用いられている培地を使用すると、これらの培地においては、Ｌ」！Ｈの第２ の独自の特徴（すなわち、インドールの生成）が、β−グルクロニダーゼまたは 他の過剰に供給されたラクトース代用物により異化的に抑制される。

ところが、本発明のＴＡＧ培地は調整されたエネルギー源を提供するので、ラク トースの利用およびインドールの生成の両方が同時に進行され得る。従って同一 のチューブ内で同時に測定できる。その結果、ＴＡＧ培地はラクトース代用物お よびインドール源を主成分として含む。さらに、増殖促進成分および他の成分が 加えられる。

本発明の実施において使用される培地の第２の最も重要な要件は、この培地が増 殖抑制ではなく増殖促進であることである。そのため、本発明のＴＡＧ培地は、 酵母抽出物のような増殖維持および増殖促進成分、アミノ酸、またはトリプトー ス（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）のようなタンパク質加水分解物をかなり多量に含有する 。

これらの成分は、Ｅ、　ｃｏｌｉの増殖を促進し維持するために十分な量を加え られる。そのため、本発明のまた別の特徴は、Ｌ」旦Ｈの増殖を大きく促進する ことであり、これにより少量のし」旦Ｈ（多くの場合希釈率の高い水サンプルに 存在する１個のＥ、　ｃｏｌｉ）でも検出できる。これは、酵母抽出物またはト リプトースのような代替栄養成分を代用することによって、Ｅ、　ｃａｌｆの増 殖が促進されるために達成され得る。従って、本発明のＴＡＧ培地中での）：、 　ｃｏｌｉの増殖は、他の現在用いられている培地に見られるように、栄養素と しての０ＮＰＧおよびＭＵＧの利用によって制限されない。

本発明は、トリプトースによりＬ−二■の増殖を意図的に促進することにより、 少数のまたは単一のし」旦り細胞の回収に非常に効果的な培地または培地群を利 用する。

標準ＥＣ培地、ＭＭＯ−ＭＵＧ（Ｃｏｌｉｌｅｒｔ）培地およびＴＡＧ（Ｃｏｌ ｔ　ｔａｇ）培地を使用し、比較して得られた結果を表１および２に示し、実施 例９で論じる。

存在する少量のＬ−！Ｈのサンプルを試験し、信頼性のある結果（すなわち、単 一の大腸菌り一遼■細胞からの陽性反応）を得るための能力は、汚染の希釈率が 大きく、培養物または容器中にＥ、　ｃｏｌｉが１個しか存在しないかまたはほ とんど存在しない場合の本試験において、非常に重要な特徴である。

他の周知のＥ、　ｃｏｌｔの検出方法に対するさらなる別の重要な改良点は、本 発明の方法で達成された時間の短縮である。

本発明の培地は、ＭＭＯ−ＭＵＧ培地を含む他のどの培地よりも速く応答する。

これは、）：、　ｃｏｌｉ細胞が１個しか存在しないかまたはほとんど存在しな い、希釈倍率の高い水サンプルを試験する場合に特に明確になる。このような例 では、培地中に存在する増殖促進成分によって、他の試験が２４−４８時間また はさらに長い時間を要するのに対して、２−２４時間以内に陽性または陰性の結 果が得られ得る。

本発明の培地は、Ｌふ且細胞の増殖を促進しまたは維持するが、同時に異化代謝 抑制を防いで抑制する成分のバランスを慎重に用いる。これらの特徴により、ラ クトース代用物（β−ガラクトシダーゼ）を用いた炭水化物の利用および第２の 窒素源を用いるインドールの生成を組み合わせことができ、Ｌ」旦■の存在を特 徴づける両方の特徴（すなわち、ラクトースの利用とインドールの生成）の試験 が可能になる。通常の環境下ではラクトースの発酵によってインドールの生成が 抑制され、そして、トリプトファンはエネルギー供給源とじては優先順位が低い ため、他の試験では、ラクトースの発酵によってトリプトファンのインドールへ の代謝が充分回避され抑制される。従って、インドールの存在は同一チューブ中 では同時に測定され得ない。

ラクトース代用物としては、非蛍光化合物０ＮＰＧ、インドリル−β−Ｄ−ガラ クトシド、Ｘ−ガラクトシド（５−ブロモ、６−クロロ−インドリル−β−Ｄ− ガラクトシド（Ｘ−ＧＡＬ））　、８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−ガラクト ピラノシド（ＨＱＤＧ）および他のラクトース置換体を０．０５−１０　ｇ／Ｌ 好ましくは標準液１リットル当り０．５ｇの割合で、および０．１−３０７１、 好ましくは濃縮溶液１リットル当りＬａｇ、　または蛍光メチルウンベリフェリ ル−ガラクトシド（Ｍｔｌ−ＧＡＬ）置換体を、０．０５−５ｇ、好ましくは０ ．２５　ｇ／Ｉの割合で使用した。好ましくはＱＮＰＧまたはＭＵ−ＧＡＩ、を 使用する。

非蛍光ラクトース置換体は、通常黄色（ＯＮＰＧ）または青色（Ｘ−ＧＡＬまた はインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を呈する。ヒドロキシキノリンは、塩化 鉄のような鉄塩の存在下で、濃黒色色素を産生ずる。ＭＵ−ＧＡＬは、紫外線下 で肉眼的に検出できる蛍光を生じる。

Ｅ、　ｃｏｌｉ上で赤色を生じるインドール源として、トリプトファンおよび他 のインドール源またはイオン化されると明るい黄色を示すが脱プロトンされると 無色である、５−ｏ−ニトロフェニル−１−システィン（ＳＯＰＣ）のような非 インドールトリプトファン類似体が使用される。トリプトファンは、好ましい源 として、０．１から２０　ｇ／ｌ、好ましくは標準液１リットル当り１　ｇ。

および０．１から３０　ｇ／Ｉ、好ましくは濃縮溶液１リットル当り３ｇの割合 で使用される。トリプトファン由来の０−ニトロ−チオフェノールは、赤色を生 じる。５ＯＰＣ由来のインドールは、黄色を生じるが、青色を生じるＸ−ガラク トシドと共に使用される場合は、緑色を生じる。このように、トリプトファンを ｓ。

ＰＣに代用することで試験の色をデザインおよび選択することができる。

培地は任意に、増殖促進成分を含む。この成分としては、アンモニウム塩、加水 分解されたタンパク質、またはペプチド混合物のような第２の窒素含有化合物、 好ましくはトリプトースまたはさらなる窒素源として他の窒素含有ブロースを、 濃縮溶液で０．０５−３０　ｇ／ｌ、好ましくは１リットル当り３−３０　ｇの 割合で含有する。さらに、酵母は、１０　ｍｇ−１０ｇ／ｌ、好ましくは５０　 ｍｇ／ｌの割合で加えられ得る。

さらに、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト”ピラノシド（ＩＰＴＧ）、メチ ルチオガラクトシド、メリビオースのようなβ−ガラクトシダーゼ酵素誘導剤を 、基準の培地ベースで０．０１から１ｇ／ｌ、好ましくは０．１ｇ／Ｉ、および 濃縮された培地で０．０３から３　ｇ／１．好ましくは１リットル当り０．３ｇ の量で加えられる。妨害細菌の増殖を阻害するために、培地はまた任意に、ラウ リル硫酸ナトリウム、胆汁酸塩、界面活性剤、タージトール（ｔｅｒｇｉｏｌ） −７、抗生物質モネンシン（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）　、ナリジキシン酸（Ｎａｌｉ ｄｉｘｉｃ　ａｃｉｄ）またはその他の細菌増殖阻害剤を、標準培地で０．０１ から１　ｇ／ｌ、好ましくは１リットル当り０．１ｇ、および濃縮培地で０．０ ３から３　ｇ／ｌ、好ましくは１リットル当り０゜３ｇの割合で含む。

ＴＡＢ培地を調製するために、上記の成分を、希釈または脱イオン水のような１ リツトルの滅菌液に溶解する。さらなる量の塩化ナトリウム、またはリン酸−ナ トリウム、硫酸マグネシウム、リン酸−カリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、硫 酸マグネシウム、リン酸二ナトリウム、グルタミン酸モノナトリウムおよびその 他の適切な塩を、細菌に対して毒性のない００Ｏ１から１０　ｇ／ｌの割合で、 最終培地に加え、５０　ｍｍｏｌにまで濃縮する。

種々のベースを調製し、試験した。

１）′のＴＡＧ立　ベース １ｇのトリプトファンおよび無機塩として、リン酸二ナトリウム（３ｇ）、硫酸 マグネシウム（０，ｔｇ）、リン酸−カリウム（０，５ｇ）を希釈水に溶解した 。この溶液を１２１°Ｃで１５分間滅菌した〇０ＮＰＧを５ｇ／ｌの希釈水に溶 解し、室温で濾過滅菌し、トリプトファン塩溶液で１０倍に希釈した。得られた 保存溶液を使用するまで冷蔵庫で２−８°Ｃで保存した。

２）　れたＴＡＧ″　ベース 通常のＴＡＧ培地ベースに、濾過滅菌された溶液として加えられた０、１ｇ／ｌ 　１ＰＴａを添加した。溶液を穏やかに混合し、すべての成分を溶解させた。使 用するまで、この培地を冷蔵庫に保存した。

３）３　’　ＴＡＧ”　ベース この培地は、３ｇのトリプトファン、１．５ｇの０ＮＰＣ，０，３ｇのＩＰＴＧ 、および通常のＴＡＧ培地ベースよりも３倍高いレベルの無機塩を含む。トリプ トファンおよび塩を加熱滅菌した。０ＮＰＣおよびｌ　ＰＴＧを濾過滅菌した。

その後、この培地を冷蔵庫に保存した。

４）ラウリル　ナトリウムＴＡ０３　ベース１ｇのトリプトファン、０．５ｇの ０ＮＰＣ，０，１ｇのラウリル硫酸ナトリウム、（１，１ｇのインプロピルチオ −β〜Ｄ−ガラクトピラノシドおよび塩化ナトリウムを５０　ｍｍｏｌまで、お よびリン酸二ナトリウム、リン酸−カリウムおよび硫酸マグネシウムを上述のよ うに調製した。ラウリル硫酸ナトリウムと、トリプトファンおよび他の熱安定成 分とを加熱滅菌の前に混合した。

ｓ＞　ａｉｍ立　ベース １ｇのトリプトファン、０．５ｇの０ＮＰＣ，３ｇのトリプトース、０゜１ｇの ラウリル硫酸ナトリウム、ｏ、ｔｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラ ノシドおよび塩化ナトリウムをＳｏ　ｍｍｏｌまでを、０．８５％塩化ナトリウ ム溶液（生理食塩水）　１０１００Ｏに溶解する。

ＴＡＧ　のその　の ６）１ｇのトリプトファン、（１，１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸 −カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウムおよび０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウ ムを、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液を、１２１°Ｃで１５分間高 圧減菌し、０．５ｇの濾過滅菌した０ＮＰＧを加える。

７）１ｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸− カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウムおよ び５０ｍｇの酵母抽出物を、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液を、１ ２１℃で工５畜間高圧滅菌し、０．５ｇの濾過滅菌された０ＮＰＧを加える。

８）１ｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸− カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウムおよ び２０ｇのトリプトースを、ｌｏＯ＋ａｌの希釈水に溶解する。この溶液を、１ ２１℃で１５分間濾過滅菌滅菌し、０．５ｇの濾過滅菌された０ＮＰＧを加える 。

９）１ｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン酸− カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム、お よびｏ、　Ｓｇのグルタミン酸モノナトリウムを、１００＋＊ｌの希釈水に溶解 する。この溶液を、１２１℃で１５分間高圧減菌し、０．５ｇの濾過滅菌された ＱＮＰＧを加える。

１０）　Ｉｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン 酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム 、０．２５の硫酸アンモニウム、およびＯ，Ｓｇのグルタミン酸モノナトリウム を、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液を、１２１°Ｃ″ｒ１５分間高 圧滅菌し、０．５ｇの濾過滅菌された０ＮＰＧを加える。

１１）　Ｉｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン 酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム 、および０．２５の硫酸アンモニウムを、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。こ の溶液を、１２１°Ｃで１５分間高圧滅菌し、０．５ｇの滅菌された０ＮＰＧを 加える。

１２）　１ｇのトリプトファン、Ｏ，Ｉｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン 酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム 、および１００５ｇの酵母抽出物を、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶 液を、１２１℃で１５分間高圧滅菌し、０．５ｇの滅菌された０ＮＰＣを加える 。

１３）　Ｉｇのトリプトファン、Ｏ，Ｉｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン 酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム 、および２５Ｂの酵母抽出物を、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液を 、１２１℃で１５分間高圧滅菌し、ｏ、　５ｇの滅菌された０ＮＰＧを加える。

１４）　Ｉｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、（１，５ｇのリ ン酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウ ム、および５ｇのトリプトースを、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液 を、１２１℃で１５分間高圧減菌し、０．５ｇの濾過滅菌された０ＮＰＧを加え る。

１５）　Ｉｇのトリプトファン、０．１ｇの硫酸マグネシウム、０．５ｇのリン 酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ｇのラウリル硫酸ナトリウム 、２．５ｇのトリプトースを、１０１００Ｏの希釈水に溶解する。この溶液を、 １２１°Ｃで１５分間高圧滅菌し、０．５ｇの濾過滅菌された０ＮＰＧを加える 。

１６）ｎ狙１１度液 ０、２８５ｇのトリプトファン、０．８５５ｇのリン酸二ナトリウム、０．１４ ２５ｇのリン酸−カリウム、０．０２８５ｇのラウリル硫酸ナトリウム、０．０ ２８５の硫酸マグネシウム、およびＯ’、７１２５ｇの硫酸アンモニウムを、２ ８５＋１１１の生理食塩水に溶解し、保存溶液として使５０ｍ１のＴＡＧ保存溶 液に、０．０５ｇの酵母抽出物を加えて、１ｇ／ｌの酵母保存溶液を得た。これ を１０倍に希釈して使用する。

１８）ユ鉦用と１液 ２５ｍ１ｌ１７）ＴＡＧ保存溶液（１６）に、０．１２５ｇのＯＮＰＧを加える 。この溶液を濾過滅菌する。

この保存溶液を、ＴＡＧ培地の最適化に試験される、多くの特異的ＴＡＧ溶液を 調製するのに使用される有用なベースＴＡＧ溶液として調製した。

これらと、上述した成分群または上述した成分の１個以上を完全に置き換えた他 の成分群からなる他の改変ＴＡＧ培地は、本発明の範囲にあると考えられる。

ＴＡＧ培地ベース溶液を、高圧滅菌、ミクロポア濾過、照射またはこのような目 的に適切な他の任意の方法、すなわち個々の成分を破壊しない方法、のいずれか によって滅菌する。この滅菌は、滅菌ガラス器具、滅菌溶液および滅菌成分を用 いて行なわれ、または部分的混合は高圧滅菌され得、または完全ＴＡＧ溶媒は濾 過滅菌され得る。

（以下余白） この保存溶液または既製の溶液は、好ましくは２−８°Ｃで冷蔵庫中で保存され 、または凍結乾燥、トライブレンド、および照射、減圧乾燥、凍結乾燥され得ま たは産業上知られる他の任意の適切な方法で保存され得る。

任意のＴＡＧ培地または同様の培地成分は、乾燥混合物として混合され得、また は任意の適切な揮発性の有機溶媒または無機溶媒中で混合され得る。滅菌は、照 射または溶媒そのものによって行なわれ得る。

Ｌ」立■の存在を調べるための細菌試験に使用される場合は、滅菌ＴＡＧ培地の 適切な量を水サンプルと混合し、水サンプル：ＴＡＧ溶媒が１：１０から１０＝ １の割合で、好ましくは２：１の割合で試験する。この溶液を穏やかに攪拌また は混合し、３Ｇ−５０°Ｃの温度で、好ましくは３５″Ｃで４時間および４４． ５°Ｃでさらに２４時間までインキュベートする。混合物のインキュベーション は、５０℃よりも高い温度で行なわれるが、この温度では弱いまたは損傷を受け たし」立■は生存できないため、偽陰性の結果を生じ得る。インキュベーション が３５’Ｃといった低温で一度だけ行なわれると、インドールに関して偽陽性の 結果が生じる。

このサンプルを、２から４８時間低温でインキュベートする。もし、２４−４８ 時間で呈色変化が起こらなければ、ＬＪ立■は存在していない。通常、わずかな し」旦■汚染は、早ければ２時間以内、通常は１５−１８時間、遅くとも２４時 間以内に検出され得る。

他方、多量の大腸菌群またはｍで汚染された水サンプルは、培地をかなり早く発 色させる、４４．５℃でインキユベートした場合、約２−６時間で陽性の結果が 得られる。

すべての大腸ｍ群およびＥ、　ｃｏ上１の定量試験は、Ｃ０ＬＩＴＡＧ”および ＥＣ０ＴＡＧ”と呼ばれる。双方の試験を図１および２に示す。

図１（２１ページのセットアツプ２）は、ＥＣ０ＴＡＧ試験の結果力、Ｅ、　ｃ ｏｌｉの４つの株（即ちＬ」立■株ＡＴＣＣ２５９２２−ｆ、−ブ１および２、 ＥＣＯＲ４−ｆ、−ブ３および４、ＥＣＯＲ５−ｆ、−ブ５および６、ＥＣＯＲ ６−チューブ７および８）を用いて行なわれたことを示す。

すべてのチューブを、旦Ｃ０１１を含む水サンプルをＴＡＧ培地番号３と混合り また後、３５℃で１８時間インキュベートした。チーＸ−ブ１．３．５および７ の水層下部に現れた黄色は、β−ガラクトシダーゼ活性を示す。コバソクス試薬 を２滴加えた後、溶液の一番上にできる赤味がかった紫の輪（チ１、−ブ２．４ ．６および８では有機層）は、インドールの存在を示す。インドールの生成はイ ンドール陽性の大腸菌群の存在を示す。水中では、はとんどのインドール陽性大 腸菌群がＥ、ｃｏｌｉである。

比較のために、図２（１４ページおよび１５ページのセットアツプ１およびセッ トアツプ３）では、チューブ９−１４中のサンプルは非電、」１貫の大腸菌群で ある。特（こ、チューブ９および６では腸内細菌科であり、チューブ１１および １２ではＣｉｔ　ｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ、およびチューブ３および １４では肺炎杆菌である。チューブ１５および１６では、非大腸菌群のサルモネ ラ菌である。これらのすべての細菌はインドール陰性であり、図１に記載のよう な試験工程と同じ工程にかけられた場合、チューブ９．１１および１３中でチュ ーブ１．３．５および７に見られた黄色と同様の黄色を示した。コバックス試薬 をチューブ１ｏ、１２および１４に加えた場合は、色の変化はなかった。有機層 の黄色の呈色は、インドール陽性の細菌が存在せず、チューブ９−１４に存在す るすべての細菌がインドール陰性（すなわち、大腸菌群であるがＬ」亘■ではな い）であることを示し、インドールの生成がないことを示した。Ｃ０ＬＩＴＡＧ およびＥ　Ｃｏ　ＴＡ　Ｇ試験の正確性を試験するためのコントロールとして、 非大腸菌群であるサルモネ」を、同じ工程を使用して試験した。チューブ１５お よび１６の溶液は、肉眼では無色であり、大腸菌群を示す黄色の呈色もＥ、ｃｏ ｌｉを示す赤紫色の呈色も示さない。

トリプトファンおよび０ＮＰＧ含有のＴＡＧ培地を使用した、Ｃ０ＬＩＴＡＧお よびＥＣ０ＴＡＧの両方の試験によって得られる呈色の結果は、下記のように要 約され得る。

水層および有機層中の無上、は、Ｅ、ｃｏｌｌおよび大腸菌群の双方が存在して いないことを示す。

水層および有機層中の１色の呈色は、Ｅ、　ｃｏｌｉを含み得または含み得ない 大腸菌群の存在を示す。

コバックス試薬と反応した後の有機層中の黄色の呈色は、Ｌ」匪■が存在しない ことを示す。

フバックス試薬と反応した後の有機層中の赤紫色の呈色は、Ｌ」！■が存在して いることを示す。

種々の培地では、Ｘ−ＧＡＬを０ＮＰＧに換えると、黄色ではなく、大腸菌群の 存在を示す青色が得られる。

０ＮＰＧではなく　ＭＵ−ＧＡＬを含有する種々の培地では、大腸菌群を含むサ ンプルは紫外線照射下で蛍光を発する。

ＨＱＤＧおよび塩化鉄含有の種々の培地では、大腸菌群の存在は黒色色素によっ て示される。

０ＮＰＧの代わりにＸ−ＧＡＬが使用され、トリプトファンの代わりに５ｏｐｃ が使用される培地では、Ｅ、　ｃｏｌｔの４在は緑色の呈色により確認される。

５ｏｐｃは、黄色を生じ、Ｘ−ＧＡＬは青色を生じる。

これが合わされて、Ｅ、　ｃｏｌｉの存在を示す緑色が現れる。

存在するＥ、　ｃｏｌｔの数を定Ｉするために、さらに、ＥＣ０ＴＡＧ試験が使 用され得る。典型的には、実施例５に記載するように、生理食塩水または０．１ ％ペプトン含有水サンプルを連続希釈し、その後、ＥＣ０ＴＡＧ試験が行なわれ 得る。黄色の存在が、すべての希釈液中で記録される。結果は、従来技術に認め られている周知の方法により、最確数試験表を用いて計算される。

社料 エールリッヒ試薬、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドの酸性化ｎ−ブチルア ルコール（Ｓｉｇｍａ）溶液；コバックス試薬、ｐ−ジメチルアミノベンズアル デヒドの酸性化イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ）　；　）リブトファン（Ｓ ｉｇｍａ）　；　トリブトーゼ（Ｄｉｆｃ。

）、０−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｓｉｇ＋＋＋ａ）、ラ ウリル硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）　；イソプロピルβ−ローチオガラクトピ ラノシド（Ｓｉｇｍａ）　；酵母抽出物（Ｄｉｒｅｏ）、Ｌ−グルタミン酸（ま たはＳｉｇｍａ　Ｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ）。

実ＪＪｉ上 この実施例では、水サンプル中のＥ、　ｃｏｌｔおよび／または大腸菌群の存在 の有無を速やかに視覚的に°Ｃ０ＬＩＴＡＧ”テストで決定する方法を説明する 。本方法は、大腸菌群およびＬ−二■に特異的な特性、すなわち、ラクトースの みを利用する能力（大腸菌群）およびラクトースの利用およびインドールの生成 能力（Ｅ、　ｃｏｌｉ）を利用する。

この方法の原理は、通常インドールの形成を阻害するラクトースを、酵素β−ガ ラクトシダーゼによって、ラクトースと同様に代謝または利用される別の基質で 代用することである。

ラクトース代用物は、トリプトファンからのインドールの生成を阻害しない。し たがって、サンプルが黄色を呈した場合は、大腸菌群を含むが、Ｅ、　ｃｏｌｉ は含むかもしれないし、含まないかもしれない。黄色を呈さない場合は、大腸菌 群もＥ、　ｅ匝も存在しない。黄色を呈し、且つ、フバックス試薬を添加した後 に紫色を呈した場合は、Ｌ」且■が存在する。

この方法を実施するために、最小限量のトリプトファンおよびラクトース代用物 である０ＮＰＧを含む特異的トリプトファン−ガラクトシダーゼ（ＴＡＧ）培地 を調製して使用した。培地は、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド （ＩＰＴＧ）、およびラクトース産生誘導剤を任意に含み、蒸留水中で調製する 。

””ＴＡＧ　１　ノー　’ １ｇのトリプトファンと無機塩として、リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウム 、およびリン酸−カリウムを蒸留水に溶解した。溶液を１２１℃で１５分間滅菌 した。０ＮＰＧを５ｇ／ｌで蒸留水に溶解し、室温で濾過滅菌し、トリプトファ ン塩溶液で１０倍に希釈した。得られた保存溶液を、使用するまで２−８℃で冷 蔵庫で保存した。

ＴＡＧ立　ベース　２　の １ｇのトリプトファン、リン酸−カリウム、３ｇのリン酸二ナトリウム、０．１ Ｇのラウリル硫酸ナトリウム、２．９ｇの塩化ナトリウム、および１．０ｇのト リプトースを、１０００　ｍｌの蒸留水に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌した 。その後、濾過滅菌温溶液として、０．５ｇの０ＮＰＧおよび０．１ｇのＩＰＴ Ｇを添加した。使用するまで、培地を冷蔵庫で保存した。

ＴＡＧ　ベース　３　の−１ 上記の培地のすべての成分を通常の３倍の濃度で調製した。

例えば、３ｇのトリプトファン、１．５ｇの０ＮＰＧ、および０．３ｇのｌ　Ｐ ＴＧである。成分を混合し、濾過滅菌し、上記のように保存した。

Ｅ、Ｃｏｌ゛の゛　の−法 図１および図２に、この実施例を示す。３　＋ｉｌの濃縮ＴＡＧ培地を含有する 、予め滅菌された２０ｍ１の容器に、０．０１０　ｍｌの０．８５％生理食塩水 サンプル中に存在するテストすべき１０００個の細菌細胞を接種した。

サンプル１−８はＥ、　ｃｏｌｉであった：１および２はＡＴＣＣ２５９２２で あった。

３および４はＥＣ０Ｉｉ　４であった。

５および６はＥＣＯＲ５であった。

７および８はＥＣＯＲ６であった。

サンプル９−１４は非Ｅ、　ｃｏｌｉ大腸園大腸あった：９および１０はＥｎｔ ｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅであった。

１１および１２はＣ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉであった。

１３および１４は肺炎杆菌であった。

サンプル１５および１６は非大腸菌群であった：１５および１６はサルモネラ園 であった。

容器を閉じ、サンプルと培地とが適切に混合されるように穏やかに振った。容器 を３５℃の水浴に入れ、４時間インキュベートし、その後、４４．５℃で２０時 間インキュベートした。インキュベートした後、サンプルを肉眼で観察した。

葭果：　。

対照サンプル１５および１０は無色のままであり、大腸菌群もＥ、　ｃｏｌｔも 存在しなかった。サンプル１−８の水層が明るい黄色を呈してβ−ガラクトシダ ーゼの存在を示した時、Ｌ」遼■が存在し、増殖して数が増大していることがわ かった。大腸菌群サンプル９−１４の水層もまた明るい黄色を呈し、このことは 、大腸菌群の存在およびそれに続く増殖を示した。

他のすべてのチューブ（すなわち、チューブ２．４．６および８）でコバソクス 試薬を数滴用いて実施したインドールテストによって、サンプル２．４．６、お よび８がＥ、　ｃｏｌｉを含むことが示された。紫色の呈色はインドールの存在 を示す（図１）。

サンプル９−１４の水層は黄色を呈しく図２）、β−ガラクトシダーゼ活性の存 在を示す。コバックス（Ｋｏｖａｓ）試薬をチューブ１０．１２．１４および１ ６に添加した時、紫色は呈さなかった。

このことは、インドールが生成されず、したがってこれらの細菌がＥ、　ｃｏｌ ｉでなかったということを示す。

チューブ１５および１Ｇは、黄色も紫色も呈さない非大腸菌群であり、したがっ て、大腸菌群もＥ、　ｃｏｌｉも含んでいなかった。

これは、大腸菌群およびＬ−１旦の存在の有無を決定する方法である。黄色の呈 色およびインドールテストにより、サンプル】−８に、Ｅ、　ｅｏｌｉの特性で あるラクトースの利用およびインドール生成が存在したことを示す。サンプル９ −１４の黄色の呈色およびインドールテストが陰性であることは、Ｌ」山以外の 大腸菌群の存在を証拠づけた。

支施漕ｌ ”　ＥＣ０ＴＡＧ’観ＩＣＫユ隘に水！ンブルのおよびＥ、　Ｃ０ＬＩの゛　キ ラー凡 ■ 水中のＥ、　ｃｏｌｉの存在は一般的に下水汚染の証拠として認識されている。

Ｌ」立Ｈは、腸内細菌科の橿である。Ｅ、　ｃｏｌｉは、それを他の腸内細菌科 および他の大腸菌群から区別する２つの特性：ラクトースの利用およびインドー ル生成を有している。

Ｅ、　ｃｏｌｉの検出において、ＥＣ０ＴＡＧ　ＱＵＩＣＫ　ＴＥＳＴは、これ ら２つの特性を利用し、ラクトースの利用に関わる酵素であるβ−ガラクトシド 、およびインドール生成に関わる酵素であるトリプトファナーゼを決定する。Ｅ 、　ｅｏｌｉの存在の検出において、水サンプルを、トリプトファンおよびＯ− ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を含むＥｃｏＴＡｃ　Ｑ ＵＩＣＫ　ＴＥＳＴ培地と、３５℃で４時間反応させ、その後、４４．５℃で２ ０時間、または黄色を呈するまで反応させる。黄色の呈色の存在は、ラクトース の利用を示す。インドールの生成は、コバックス試薬により赤紫色と決定される 。水層中の黄色の呈色の存在は、ラクトースの利用を示し、赤紫色の呈色は、イ ンドールの生成を示し、両方の呈色が見られた場合は、テストした水サンプル中 におけるＥ、　ｃｏｌｔの存在を示す。

産二１」玉Ｉ工１直 ＥＣ０ＴＡＧ　ＱＵＩＣＫ　ＴＥＳＴは以下から成る：１００　＋ｉｌのレベル に目盛りがついた、ストッパー付き滅菌済２０．０　ｍｌ容ガラスバイアル３個 であり、各々５０　ｍｌの凍結乾燥された濃縮ＴＡＧ培地を含む。

濃縮ＴＡＧベース培地は、蒸留水に溶解した、３ｇのトリプトファン、１．５ｇ の０ＮＰＧ、　ＯＪ　ｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉ ＴＰＯ）　、９　ｇの塩化ナトリウム、０．３　ｇの硫酸マグネシウム、１．５ 　ｇのリン酸−カリウム、９ｇのリン酸二ナトリウム、および０．９ｇのラウリ ル硫酸ナトリウムを含む。

滅菌済。

ドロツバ−付きコバノクス試薬人りバイアル。

ＥＣ０ＴＡＧ　ＱＵＩＣＫ　ＴＥＳＴを、使用するまで２−８℃で冷蔵庫で保存 する。使用の準備が整うまでガラス容器を開けない。

扛料 テストすべき水サンプルは希釈しない。

ｉ工工立藍 原理：培地中のトリプトファンはＬ」互■に窒素源を供給し、Ｅ、ｃｏｌｉｈリ ブトファナーゼによって代謝されることにより、遊離インドール、ピルビン酸、 およびアンモニアを当モル量で形成する。ラクトースの代わりに０ＮＰＧが、β −ガラクトシダーゼにより代謝される。３５°Ｃで、Ｌ−担■が増殖し、０ＮＰ Ｇを利用して、インドールを生成する。４４．５℃で、他のすべてのインドール 陽性非Ｉ１１．　ｃｏｌｉ！Ｉが排除される。β−ガラクトシドは培地を黄色に する。トリプトファンを唯一の窒素源として用いるので、この条件下では大腸菌 群およびＬ」立■以外の細菌は黄色を呈さない。Ｅ、　ｃｏｌｉが存在する場合 、コバックス（Ｋｏｖａｃ’　ｓ）試薬を添加すると、溶液は紫赤色を呈する。

星Ｉ 冷蔵庫から培地の入ったバイアルを取り出し、バイアルを開けて、バイアルの１ ００　＋＊ｌの目盛りまで水サンプルを加える。

ストッパーでバイアルを閉じ、培地と水とが混合するように容器を穏やかに渦巻 状に振る。３５℃で４時間インキュベートし、４４．５°Ｃでさらに２０時間明 るい黄色を呈するまで、または２４時間、どちらか短い時間インキュベートする 。その結果を記録する。コバックス試薬を２−３滴添加し、混合し、１時間放置 する。観察する。即座に呈し得る紫赤色を記録する。

葭見立五五 溶液の明るい黄色の呈色は大腸菌群の存在を示す。赤紫色の呈色はＬ」旦■の存 在を示す。色が変化しない場合は、Ｌ皿も大腸菌群も存在しないことを示す。

支立五ユ ベての　およびＥ、　Ｃｏ１ｔを゛　る　°Ｃ０ＴＴＡＧ“この実施例では、第 １の窒素源としてトリプトファンを、第２の窒素源として窒素を含む別の化合物 、Ｌぷ且増殖プロモーター、およびβ−ガラクトシダーゼの測定用にラクトース 代用物を利用することにより、希釈水サンプル中のすべての大腸菌群およびＥ、 　ｃｏ■の存在を決定する方法を説明する。この条件下において、はとんどの腸 内細菌科は増殖し、すべての大腸菌群は黄色を呈し、インドール生成によって識 別されるし」立■はコバックス試薬によってもエールリッヒ試薬によっても赤紫 色を呈する。

−ＴＧ　ベース　４　の １ｇのトリプトファン、０．５ｇの０ＮＰＧ、　１　ｇのトリプトース、０．１ ｇのラウリル硫酸ナトリウム、０．１ｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト ピラノシド、および最高５０　ｍｍｏｌの塩化ナトリウム、０．１ｇのＭｇＳＯ ４，０，５ｇのＫＨ２ＰＯａ、３ｇのＮａ２ＨＰＯ，を１０００　ｍｌの蒸留水 に溶解し、１２１℃で１５分間滅菌する。０ＮＰＧおよびＩ　ＰＴＧを濾過滅菌 済溶液として添加する。

ＬＩＡＧ立　ベース　５　の− この培地は、すべての成分が３倍の濃度であること以外は、正常培地と同様であ る。存在の有無のテストに使用するためには、この培地を、滅菌した容器中に５ ０　ｍｌずつ調製する。その後、１００　ｍｌの水サンプルを添加し、滅菌した キャップを再度取り付け、容器を３５°Ｃで４時間インキュベートし、その後、 ４４．５℃で２００時間インキュベートる。

べての　およびＥ、　ｃｏｌｉを゛　る　゛この方法を図１および図２に示す。

３０　ｍｌの滅菌済ガラスバイアルを１６個用意し、１−１６と番号を付けた。

３０　ｍｌの凍結乾燥された濃縮ＴＡＧ培地ベース（５）を含有する、これらの 予め滅菌されたバイアルに、０．０１０　ｍｌの０．８５％生理食塩水サンプル 中に存在するテストすべき１０００個の細菌細胞を接種した。

サンプル１−８はＥ、　ｃｏｌｔであった：１および２はＡＴＣＣ２５９２２で あった。

３および４はＥＣＯＲ４であった。

５および６はＥＣＯＲ５であった。

７および８はＥＣＯＲ６であった。

サンプル９−１４は！μ■大腸菌群であった：９および１０はｎｔｅｒｏｂａｃ ｔｅｒ　ｃｌｏａｃａｅであった口１１および１２は虹虹凪ｌ江肛ゴＢ！溢■で あった。

１３および１４は肺炎杆菌であった。

サンプル１５および１６は非大腸菌群であった：１５および１６はサルモネラ菌 であった。

容器を閉じ、サンプルと培地とが適切に混合するように穏やかに振った。容器を ３５℃の水浴に入れ、４時間インキュベートし、その後、４４．５℃で２００時 間インキュベートた。インキュベートした後、翌朝、サンプルを肉眼で観察した 。

■： 対照サンプル１５−１６は無色のままであり、大腸菌群もし瓜も存在しないこと を示した。９−１４の大腸菌群サンプルのみが明るい黄色を呈し、様々な大腸菌 群が存在することを示したが、この時点でサンプル９−１４にＬ」立■が存在す るかどうかは明らかでなかった。Ｅ、　ｃｏｌｉを含むサンプル１−８のみが明 るい黄色を呈し、大腸菌群および／またはＥ、　ｃｏｌｔが存在することを示唆 した。この時点でも、サンプル１−８に大腸菌群のみが存在するのか、Ｌ」！■ のみが存在するのか、両方が存在するのかは明らかでなかった。

その後、サンプル１−１４における遊離インドールの存在を調べた。

滅菌した小さなペトリ皿１４枚のセットを用意し、バイアル１−１４から１　ｍ ｌの溶液をこれらの皿に移した。コバックス試薬で飽和した濾紙をペトリ■の上 に置いた。４時間後、この濾紙に紫赤色の呈色またはスポットがあるかどうかを 調べた。

ペトリ皿９−１４の上に置いた濾紙は染色されず、白いままであり、Ｅ、　ｃｏ ｌｉの不在を示した。濾紙１−８には紫赤色のスポットがあり、Ｅ、　ｃｏｌｉ コロニーの存在を証拠づけた。

１血王土 ”ＣＯＬ　ＩＴＡＧ”ＲＡＰＩＤ　Ｅ、Ｃ，ＴＥＳＴ−サンプル　の　べてのお よびＥ、　Ｃ０ＬＩの゛　キット 斐豹 大腸菌群は、感染性糞便Ｌ」旦■と他の非感染性および環境細菌との両方を含む 腸内細菌科のグループである。水中におけるし」！■の存在のみが一般的に下水 汚染の証拠として認識されている。

Ｅ、　ｃｏｌｉは、腸内細菌科の種である。Ｅ、　ｃｏｌｔは、それを他の腸内 細菌科および他の大腸菌群から区別する２つの特性：ラクトースの利用使用およ びインドールの生成を有している。

すべての大腸菌群およびＥ、　ｃｏｌｔの検出において、Ｃ０ＬＩＴＡＧＲＡＰ ＩＤ　ＴＥＳＴは、これら２つの特性を利用し、Ｌ」！■を含む大腸菌群に見ら れるラクトースの利用に関わる酵素であるβ−ガラクトシダーゼ、および糞便Ｅ 、　ｃｏｌｉにのみ見られるインドールの生成に関わる酵素であるトリプトファ ナーゼを決定する。この培地組成物は、ラクトース代用物により異化代謝産物抑 制を排除し、Ｅ、　ｃｏｌｉの増殖を促進する。すべての大腸菌群の検出におい て、０ＮＰＧ−ラクトース代用物を代謝するβ−ガラクトシダーゼから誘導され た黄色の呈色を観察する。このテストにおいて、水サンプルを、トリプトファン と。−二トロフェニルーβ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）　、ｌ−リブドー ス、ラウリル硫酸ナトリウム、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド 、および塩化ナトリウムを含むＣ０ＬＩＴＡＧ　ＲＡＰＩＤ　ＴＥＳＴ培地と、 ３５°Ｃで４時間反応させ、その後、４４．５℃で２０時間、または黄色を呈す るまで反応させた。黄色の呈色の存在は、β−ガラクトシダーゼにより、ラクト ースの代用物である０ＮＰＧがラクトースを利用したことを示す。黄色の呈色は 、Ｅ、　ｃ。

■を含むすべての大腸菌群の存在を示す。続いて、黄色の呈色を含むサンプルで インドールテストを行う。このテストでは、ステップ１からサンプリングした黄 色を呈するサンプルを少量、フバックス試薬と反応させた。紫赤色を呈するサン プルのみがＬ」丑■を含む。このように、紫赤色によって証拠づけられたインド ールの生成は、テストした水サンプル中におけるＥ、　ｃｏｌｉの存在を示す。

の Ｃ０ＬＩＴＡＧ　ＲＡＰＩＤ　ＴＥＳＴは以下から成るニステップ１：ストッパ ー付き滅菌済２０　ｍｌガラスバイアル２個であり、各々３　ｍｌの凍結乾燥さ れた濃縮ＴＡＧ培地を含む。

濃縮ＴＡＧベース培地は、１０００　ｍｌの蒸留水に溶解した３ｇのトリプトフ ァン、１．５ｇの０ＮＰＧ、０．３ｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシド（［ＴＩ’Ｇ）　、９　ｇのトリプトース、および０．３ｇのラウリル 硫酸ナトリウム、０．３　ｇの硫酸マグネシウム、１．５ｇのリン酸−カリウム 、９ｇのリン酸二ナトリウム、９ｇの塩化ナトリウムを含む。滅菌済。

Ｃ０ＬＩＴＡＧ　ＲＡＰＩＤ　ＴＥＳＴを、使用するまで２−８℃で冷蔵庫で保 存する。使用の準備が整うまでガラスバイアルを開けない。

ステップ２：コバックス試薬を含有するスポットプレート（またはマイクロタイ タープレート）および滴下容器。

杯料 テストすべき水サンプルは希釈しない。

ｉ工上方座 ステップ１の原理：ラクトースの代用物０ＮＰＧを、β−ガラクトシダーゼで代 謝する。３５°Ｃで、Ｅ、　ｃｏｌｉが増殖し、０ＮＰＧを利用して、インドー ルを生成する。４４．５℃で、他のすべてのインドールを生成する非Ｌ」旦■ｔ ｌｉが死滅する。β−ガラクトシドは培地を黄色にする。黄色の培地においては 、大腸菌群とＥ、　ｃｏｌｉの両方が存在する。黄色を呈さないサンプルには、 大腸菌群もＥ、　ｃｏｌｉも存在しない。

ステップ２の原理：培地中のトリプトファンはＥ、　ｃｏｌｉに窒素源を供給し 、Ｅ、　ｃｏｌｉ）リブトファナーゼによって代謝されるごとにより、遊離イン ドール、ピルビン酸、およびアンモニアを当モル量で形成する。トリ、ブトファ ンを唯一の窒素源として用いるので、Ｅ、　ｃｏｌｉ以外の細菌は、コバックス 試薬を添加した場合、紫赤色を呈さない。

冷蔵庫から凍結乾燥された培地の入ったバイアルを取り出し、バイアルを開け、 バイアルの１００　ｍｌの目盛りまで水サンプルを加える。ストッパーでバイア ルを閉じ、培地と水とが混合するように容器を穏やかに渦巻状に振る。３５°Ｃ でインキュベートし、４４．５℃でさらに２０時間または明るい黄色を呈するま でインキュベートする。

無色のバイアルを、黄色を呈したバイアルと分ける。

バストウールピペットで、スポットプレートまたはマイクロタイタープレートの 各々のウェルに、黄色のサンプル１　ｍｌを添加する。コバックス試薬を１滴添 加し、１０秒以内に紫赤色を呈するかどうかを観察する。記録する。

１艮立涯１ ステップ１ サンプルの明るい黄色の呈色は大腸菌群の存在を示すが、Ｅ、　ｃｏｌｔは存在 するかもしれないし、存在しないかもしれな０゜色が変化しない場合は、大腸菌 群およびＬ」！■の不在を示す。

ステップ２ スポットプレートまたはマイクロタイタープレート上のサンプルが赤紫色を呈す ると、遊離インドールの存在を示し、したがって、Ｅ、　ｃｏｌｔの存在を示す 。赤紫色を呈さない場合は、Ｅ、　ｃｏｌｔは不在であるが、大腸菌群は存在す ることを示す。

支五匠エ チューブ　ア・・セイ この実施例では、水サンプル中に存在するし」！■の最確数を定量する方法を説 明する。

この方法は、細菌試験で一般的に用いられる連続希釈方法に基づく。水サンプル を数段階で希釈することによって、Ｌこの実施例では、水サンプル中におけるＬ 」ユ■の存在の有無の決定および定量を速やかに視覚的に行う方法を説明する。

この方法は、Ｌ」匪Ｈに特異的な２つの特性、すなわち、ラクトースの利用およ びインドールの生成を利用する。

この方法の原理は、通常インドールの生成を阻害するラクトースを、ラクトース の場合と同じ酵素によって、すなわちβ−ガラクトシダーゼによって、代謝また は利用される基質で代用することである。このようにして、異化代謝産物抑制を 排除する特異的な調節培地成分により、ラクトース代用物は、トリプトファンか らのインドールの生成を阻害しない。

この方法を実施するために、最小限量のトリプトファンおよびラクトース代用物 である０ＮＰＧを含む、実施例３に記載の特異的トリプトファン−ガラクトシダ ーゼ（ＴＡＧ）　培地第（５）号を調製して使用した。培地は、第２の窒素増殖 プロモーター産生化合物としてイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシ） ’　（ＩＰＴＧ）　、ラクトース酵素産生誘導剤、およびトリプトースを任意に 含み、好ましくは適切な無機塩溶液を用いて調製する。培地を正常な希釈サンプ ルと反応させる。希釈率から、存在するＬ」亘■の最確数を測定し得る。

Ｅ、ｃＯｌｏの゛　の 各々のサンプルについて、滅菌済チューブ５個のセットを３セツト用意し、ＩＡ 、　ＩＢ、　ＩＣ，２Ａ、　２Ｂ、　２Ｃ，３Ａ、　３Ｂ、　３Ｃ，４Ａ。

４Ｂ、　４Ｃ，および５Ａ、　５Ｂ、　５Ｃ：およびＩ、１１などのような他の サンプル記号をつけた。各々のチューブは容量１０　ｍｌの生理食塩水を含有す る。

各群につき３個のサンプルを用いた。

■　対照−サルモネラ園を含む。

ＩＩ　Ｌ」！■ＡＴＣＣ２５９２２、ＥＣ０ＩＩ　４、ＥＣＯＲ５、ＥＣＯＲ６ ＩＩＩ　Ｌ」！Ｌ１肺炎杆菌、Ｃ’ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ、　 ｈ山田ルａｉ！１Ｈｙ１赳以外の大腸菌群 チューブＩ　ＩＡ−１５ＡＳＩＩ　ＩＡ−１１５ＡＳＩＩＩ　ＩＡ−１１１５Ａ などの各々のチューブに、１０　ｍｌのＴＡＧ培地（６）をチューブの目盛りま で加えた。その後、テストすべきサンプルＬｍｌをチューブＩＡ、　ＩＢ、およ びＩＣに添加することにより、１／１ｏの希釈を行った。混合した。チューブＩ Ａから溶液１　ｍｌを取り出し、チューブ２人に移すことにより１／１００の希 釈を行った。混合した。チューブ２Ａから溶液１　ｍｌを取り出し、チューブ３ Ａに移すことにより１／１．０００の希釈を行うた。混合した。チューブ３Ａか ら溶液１ｍｌを取り出し、チューブ４Ａに移すことにより１／１０．０００の希 釈を行った。混合した。チューブ４Ａから溶液１　ｍｌを取り出し、５Ａに移す ことにより１／１００．０００の希釈を行った。チューブＩＢ−５ＢおよびＩＣ −５Ｃも同様に調製した。

大腸菌群サンプル［ＩＩおよびＬ」立■サンプルｒ［も同様に希釈した。

あるいは、生理食塩水または０．１％ペプトン中で連続的希釈を行い、その後、 ３本の培養チューブの各々に、各々の希釈液０．１または１．０　ｍｌを入れて もよい。

チューブを閉じ、蓋をして、水と培地とがよく混合するように穏やかに振った。

チューブを３５℃で４時間インキュベートし、その後、４４．５℃で２０時間イ ンキュベートした。インキュベートした後、サンプルを肉眼で観察した。

グループＩの対照サンプルは、無色のままであり、大腸菌群もＥ、　ｃｏｌｉも 存在しなかった。グループＩＩのＬ」旦■サンプルは明るい黄色を呈し、コバッ クス試薬を添加すると、赤紫色を呈した。チューブＩＩ　ＩＡＳＢ、　Ｃ−３Ａ 、　ＢＳＣには、Ｅ、ｃｏｌｔが多数存在していた。グループＩＩＩの大腸菌群 サンプルは、薄い黄色を呈し、大腸菌群の存在を示唆した。サンプル１１４、Ａ ｌＢ、　Ｃ−５、Ａ、　Ｂ、　Ｃには、かすかに紫色が見えた。

これが、Ｃ０ＬＩＴＡＧおよびＥ、　ｃｏｌｔ多段階希釈方法である。赤紫色の 呈色は、Ｌ」立■の特性であるラクトースの利用およびインドールの生成の両方 が存在することを示し、したがってＬ」＝Ｈの存在が決定される。各々の希釈段 階における陽性のチューブの数を、最確数（ＭＰＮ）の表に当てはめると、もと のサンプル中の大腸菌群および）：、　ｃｏｌｔの濃度が推測される。

支五皿亙 ＥＣ０ＴＡＧ　ＴＥＳＴ−サンプル（’）Ｅ、　Ｃ０１ｊノ半−ｙ　トｌ於 水中に存在するし」！■は、一般的に下水汚染の証拠として認職されている。Ｅ ＰＡが発行している現行の規則では、飲料水の汚染の現在の許容レベルは、全大 腸菌群の約５％である。糞便し一二■が存在すれば、Ｅ、　ｃｏｌｔは大腸菌群 内に現れる。しかし、すべての大腸菌群が糞便からのものではなく、したがって 、全大腸菌群の許容可能５％以内に、どのくらいの最確数のＥ、　ｃｏｌｉが存 在するかを決定することが必要である。

Ｅ、　ｃｏｌｉは、腸内細菌科の種であり、大腸菌群の一つである。

Ｅ、　ｃｏｌｉはそれを他の腸内細菌科および他の大腸菌群から区別する２つの 特性：ラクトースの利用およびインドールの生成を有している。

Ｅ、　ｃｏｌｔの最確数の検出において、ＥＣ０ＴＡＧ　ＴＥＳＴは、これら２ つの特性を利用し、１０倍に希釈された段階におけるサンプルの黄色または赤紫 色の呈色の存在を決定する。Ｌ」立■の存在の検出において、水サンプルを連続 的に希釈し、本質的にトリプトファンおよび。−ニトロフェニル−β−ガラクト ピラノシド（０ＮＰＧ）を含むＥＣ０ＴＡＧ　ＱＵＡＮＴＩ　ＴＥＳＴ培地およ び反応エンハンサ−と３５℃で４時間反応させ、さらに４４．５℃で２０時Ｍ、 または黄色を呈するまで反応させる。黄色の呈色は、テストした水サンプル中に 大腸菌群および／またはＬ」准■が存在することを示す。フバックス試薬と反応 させると、Ｌ」且を含むサンプルは赤紫色を呈した。Ｌ」且■の数は希釈率によ って異なる。

の ＥＣ０ＴＡＧ　ＱＵＡＮＴＩ　ＴＥＳＴは以下から成る：ひとつのサンプルに対 して： １０　＋ｍｌのレベルに目盛りのついた、ストッパー付き滅菌済チューブ１５個 であり、各々初めから１０　ｍｌの凍結乾燥した濃１１ｒＴＡＧ培地ベースを含 む。サンプル同定用にＸと印を付け、さらにＬＡ−５Ａ、　ＩＢ−５８，ＩＣ− ５Ｃに分ける。

濃縮ＴＡＧベース培地は、通常の３倍の濃度で無機塩に溶解された３ｇのトリプ トファン、１．５ｇの０ＮＰＧ、　３　ｇのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラク トピラノシド、および０．３ｇのラウリル硫酸ナトリウムを含む。滅菌済。

コバックス試薬を含有する滴下バイアル。

ＣＨＡＮＧ　ＱＵＡＮＴＩ　Ｅ、Ｃ，ＴＥＳＴを、使用するまで２−８℃で冷蔵 庫で保存する。使用の準備が整うまでガラス容器を開けない。

社料 テストすべき水サンプルは希釈しない。

立エエ方広 原理：培地中のトリプトファンはＥ、　ｃｏｌｔに窒素源を供給し、Ｌμ且トリ プトファナーゼによって代謝されることにより、遊離インドール、ピルビン酸、 およびアンモニアを当モル量で形成する。ラクトース代用物である０ＮＰＧは、 β−ガラクトシダーゼにより代謝される。３５℃で、Ｅ、　ｃｏｌｔが増殖し、 ０ＮＰＧを利用して、インドールを生成する。４４．５°Ｃで、他のすべてのイ ンドールを生成する非Ｅ、　ｃｏｌｉｉ！が死滅する。０ＮＰＧに対するβ−ガ ラクトシドの作用によって培地を黄色にする。トリプトファンを唯一の窒素源と して用いるので、この条件下において、大腸菌群およびＥ、　ｃｏｌｉ以外の菌 は黄色を呈さない。コバックス試薬で、Ｅ、　ｃｏｌｔは赤紫色を呈する。

■ 冷蔵庫から凍結乾燥した培地の入ったチューブを取り出し、チューブを開け、バ イアルの１０　ｍｌの目盛りまで滅菌済蒸留水を加える。゛ ピペットで、テストすべき水サンプル１　ｍｌを、チューブ工ＩＡ、ｘｌＢ、お よびＬ　ＩＣに入れる。混合する。

チューブＸ　ＩＡからサンプル１ｍｌを取り出し、チューブＸ　２Ａに移す。混 合する。

チューブｘ２Ａからサンプル１ｍｌを取り出し、チューブＸ３Ａに移す。混合す る。

チューブλ３Ａからサンプル１ｍ＋１を取り出し、チューブＸ　４Ａに移す。混 合する。

チューブＸ　４Ａからサンプル１　ｍｌを取り出し、チューブＸ　５Ａに移す。

混合する。

同様に、サンプル＠　ＩＢ−Ｘ　５ＢおよびＸＩＣ−Ｘ　５Ｃを調製する。

３５°Ｃで４時間インキュベートし、その後、４４．５℃で２０時間インキュベ ートする。黄色い呈色の存在の有無を記録する。

ストッパーでバイアルを閉じ、培地と水とが混合するようにバイアルを探念に渦 巻状に振る。３５℃でインキュベートし、明るい黄色を呈するまで、または、２ ４時間、どちらか短い時間で、４４．５℃でインキュベートする。コバックス試 薬２−３滴を添加する。

葭ｌ旦１１ 溶液の明るい黄色の呈色は大腸菌群および／またはＥ、　ｃｏｌｌの存在を示す 。赤紫色の呈色は、［：、　ｃｏｌｉの存在を示す。色が変化しない場合は、Ｅ 、　ｃｏｌｉが存在しないまたはＥ、　ｃｏｌｊが確認できないほど少量しか存 在しないことを示す。

希釈率： サンプルの、コロニー形成単位を評価し、これらを記録し、希釈率ごとに表示す る。

支胤五二 ＥＣ０ＴＡＧおよびＣ０ＩＴＡＧメンプランフ　ル　−　′この実施例では、Ｅ Ｃ０ＴＡＧおよびＣ０ＬＩＴＡＧテストの別の方法を説明する。

杯料： 滅菌済メンブランフィルタ−０例えば、様々な標準方法刊行物で推薦されている ように、ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）　ＧＮＧのような、４７１１１％　０．４５ μｌの平坦またはグリッドメンブランが含まれる。疎水性グリッドメンブランフ ィルタ−（ＨＭＧＦ）もまた使用し得る。

工り土叉二ｌｌ： 適切な滅菌可能または予め滅菌された使い捨てフィルター漏斗およびフラスコ。

また、水サンプルをメンブランフィルタ−に通す手動または電気装置。

１並： ＣＯＬ　ＩＴＡＧまたはＥＣ０ＴＡＧタイプの液体培地であり、これを、ゲル（ 典型的には１．５％寒天ゲル）に混ぜることにより、または滅菌済濾紙パッド（ 典型的には直径５５　ｍｍ＋のパッド上に２　ｍｌの培地）を飽和することによ り、流出を防止している。培地を予め滅菌し、ベトリ皿のような適切な滅菌済容 器に保存する。

度！二璽王広： フィルター装置を用いて、１００　ｍｌの水サンプルをメンブランフィルタ−で 注意深く濾過する。その後、滅菌したビンセットでフィルターを取り出し、それ を２　ｍｌのＣＯＬ　［ＴＡＧ−Ｘ−ＧＡＩ、培地で飽和されたパッドの上に注 意深く置く。ＣＯＬ　ＩＴＡＧ−Ｘ−ＧＡＬは、１０００　ｍｌ（７）培地ニラ き、０．５　ｇノ０ＮＰＧｌ、：代えＴＯ，１ｇノＸ−ＧＡＬを用いたこと以外 は、上記のＣＯＬ　ＩＴＡＧ培地と同一である。

フィルター、パッド、および培地を、３５℃で４時間、保護ベトリ皿内でインキ ュベートし、その後、４４．５℃で２０時間インキコベートする。その後、コロ ニーを調べ、青色を呈したものを記録する。これらが大腸菌群である。

どの大腸菌群のコロニーがＥ、　ｃｏｌｔであるかを決定するために、メンブラ ンフィルタ−を、コバックス試薬で飽和された濾紙に移す。

２分後、赤味を帯びたかどうかを観察する。赤味を帯びていれば、インドール陽 性細菌のコロニーであることを示唆している。インドール陽性大腸菌群は、おそ ら＜　Ｅ、　ｃｏｌｔである。

フィルターを穏やかに持ち上げて底側を観察すると、赤色が見やすくなるという こともあり得る。

ニーり双１： 青色のコロニーの数は、コロニー形成単位（ｃｆｕ）　１００　ｍｌ中の大腸菌 群の数である。コバ・ツクス（またはエールリブヒ）試薬との接触によって赤色 に変化する青色コロニーの数ζよ、ｃｆｕ　１００　ｍｌ中のＥ、　ｃｏｌｔの 数である。

支五五工 Ｃ０１ｉｔａテスト　゛　テストとの この実施例では、地表水および地下水サンプルをテストするために用いられてい るＥＣ培地を使った、標準糞便大腸菌群テストと比較した場合の、本発明のＴＡ Ｇ培地の利点を説明する。

甚 Ｌ」立■培地を用いたサンプルをテストするため番ご用（洩られる方法は、成分 の記載も含めて５ｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　ＡＰＨＡ　（１９８５） に記載されている。ＣＣｏ１１ｔａをテストするために用０られる方法は、実施 例１に記載の方法に従う。水サンプル（ま、地表水または地下水から得た。水を 、滅菌済２す・ットル容器（こ採取し、直ちに実験室に運んだ。実験室に到着後 、数分以内に、水を以下のようにして希釈した。

サンプル １．１リツトルの水サンプル； ２、サンプル（１）１０ｍｌを、２倍強さくｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒｅｎｇｔｈ） のＥＣまたはＣＣｏ１１ｔａ培地を１０　ｒａ金含有る試験管（こ添加する；３ 、サンプル（１）１ｍｌを、１倍強さくｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒｅｎｇｔ）のＥＣ またはＣＣｏ１１ｔａ培地を１０１１含有する試験管に添加する；４、サンプル （１）０．１＋＊ｌを、１倍強さのＥＣまたはＣＣ０１ｉｔａ培地を１０１１含 有する試験管に添加する：５、サンプル（１）を希釈して、１０：１溶液（５） を生成し、希釈溶液（５）０．１を、１倍強さのＥＣまたはＣＣｏ１１ｔａ培地 を１０ｍ含有する試験管に添加する； ６、溶液（５）を１０倍に希釈して、０．１＋＊１を、１倍強さのＥＣまたはＣ Ｃｏ１１ｔａ培地を１０１１１含有する試験１各々に添加する。

糞便大腸菌群のテスト条件は標準方法に従った。ＣＣｏ１１ｔａチユーブを３５ ℃で４時間、さらに４４．５℃で２０時間インキュベートした。その後、チュー ブ内の、ＯＮＰＧＳＭＵＧおよびインドール反応を調べた。チューブ間の陽性反 応の数を、標準の「最確数Ｊ　（ＭＰＮ）の表と組み合わせることにより、もと のサンプル中のＥ、　ｃｏｕ菌陽性のＭＰＮを得た。

（以下余白） 勇二り およ　につい　の テスト　の フ　３０００　３０００ １°　豐　弄　弄　：：： ：Ｌ３　３００　コ００　３００　コ００９　５０００　２４．０００　２７Ｇ ｏ　２４．Ｇｏ。

結果を表１に示す。地表水で＋１、サンプル３．４．７．１０．１２、および１ ３は、−を含むすべての大腸菌群を潰１定するＥＣ培地と、ＯＮＰＧＳＭＵＧお よびインドールを測定するＣｏｌ　［ｔａｇテストとの間で、大幅な違ｔ１を示 した。サンプル３を除−Ａて、すべての結果は、Ｃｏｌｔｔａｇテストの方カダ 高かった。さらζこ、ＣｏＩＬｔａｇテストでは、ＭＵＧ陽性サンすルとＭｔｌ Ｇ陰性サンプすとを識別することができた。これ（±、ＭｔｌＧ　ＭＰＮが０Ｎ ＰＧおよびインドＭＰＮ　５００という結果を出したのは、おそら（、Ｌ」准Ｈ に加えて大腸菌群が存在したからであろう。他のすべてのサンプルにおいて、Ｃ Ｃｏ１１ｔａテストは、糞便大腸菌群テストよりも大きいＥ、ｃｏｌｔ　のＭＰ Ｎを示した。

地下水サンプル（９）でも、糞便大腸菌群が、ＣＣｏ１１ｔａの０ＮＰＧおよび インドールよりも少ないＭＰＮを示した。ここでも、ＭＵＧ　ＭＰＮは、０ＮＰ ＧまたはインドールのＭＰＮよりも有意に少ない（Ｐ＜０．０５）。したがって 、ＭＵＧ陰性Ｌ」立ｕが存在するということがわかった。０ＮＰＧおよびインド ールのＭＰＮは、糞便大腸菌群のＭＰＮよりも約５倍大きく、ＭＵＧ　ＭＰＨよ りは約１０倍大きい。

実】１赳」− Ｅ、　ｃｏｌｉテストに　る゛　のＳ この実施例では、３５℃では異なった結果および偽陽性の結果が得られ、４４． ５℃での処理を導入することによって偽陽性の結果が排除されることを説明する 。

甚 実施例８におけるように、地表水からサンプルを採取した。

培地の組成を表２に示す。３つの方法、すなわち、ラウリルトリプトースＥＣ培 地−標準糞便大腸菌群、Ｆｅｄ、−シ狐−，５４（１３５）：　２９９９９（１ ９８９年７月）に記載のＣｏ１１ｌｅｒｔ　（ＭＭＯ−ＭＵＧ）　、およびＣＣ ｏ１１ｔａを用いて比較した。

サンプル採取、希釈およびテストは実施例８または実施例１−６に記載のように 実施した。

の 今１色　表イ史入ｋｔＪ粁　ＯＮアＧ　Ｍ１７Ｇ　インド−ＩしＣＯＬ工ＴＡＧ 　２４００　１：３００　５０００ＣＯＬ工Ｉｊ：ＲＴ　１３００　”５００サ ンプル＝地表水。データは、５本のチューブのＭＰＮである（＃／１００謹ｌ） 。

表２に見られるように、ＭＵＧのカラムのデータは、ＣＣｏ１１ｔａテストの優 越性を明白に示している。すなわち、０ＮＰＧ　ＭＰＨが２４００であり、ＭＵ Ｇ　ＭＰＮが１３００であり、インドールＭＰＮが５０００であった。これは、 ０ＮＰＧ　ＭＰＮがわずか１３００であり、ＭＵＧ　ＭＰＮがわずか３００であ る、Ｃｏ１１ｌｅｒｔテストより上である。

このように、ＣＣｏ１１ｔａはＣｏ１１ｌｅｒｔに比べてはるかに感度が高い。

ＭＬＩＧテストにおける感度の差は、９５％レベルで有意である。

この実験の目的は、インドールについて偽陽性値を示さない、別の温度をめるこ とであった。

表３は、３５℃で４時間インキコベートした後、４４．５℃でさらに２０時間イ ンキュベートした実験で得られた結果を示す。

これらのインキコベーション条件は、表３に見られるように、３５°Ｃでインキ コベーシブンすると、偽陽性結果が得られるという問題を解決した。３５°Ｃに おいては、Ｌ」立■だけでなく、ｎｔ、　ａ　ｏｍｅｒａｎｓ、　Ｓｅｒ、　Ｍ ａｒｃｅｓｃａｎｓＳＬユ肛包」などのような、インドール陽性の他の細菌もイ ンドール陽性結果を示した。したがって、Ｌ」旦ｕが存在しない場合もし一！Ｈ の存在を示唆した。

３（Ｎｋ−）　５００　３００　（ｊＪシ）　３ＣＤ　’ｆ、；５３３１ｔ３（ ５ｉＱ゛）　３００　４３．０００　（ｒＦ、し□、’）　３００　Ｃ’＃ｔｙ ）４４．５℃でのインキュベーシヨンは、偽陽性インドールテスト結果の問題を 解決する。４４．５°Ｃにおいては、インドール陽性ＣＣｏ１１ｔａチユーブに はＥ、　ｃｏｌｉのみが検出された。

これらと同一のサンプルを３５℃で２−４時間だけインキコベートシ、残りの時 間は、４４．５℃でインキュベートしたところ、４４．５℃のＣＣｏ１１ｔａテ ストカラムで見られたように、Ｌ」設置のみの存在が検出された。）：、　ｃｏ ｌｔの同定は、ＥＭＢ寒天プレート上で単離することにより確認し、Ｌ」！■の みの存在は、Ｉｎｔｅｒｏｔｕｂｅ−２テストまたはＡＰＩ−２０Ｅで確認した 。これらの単離物質には、他のインドール陽性細菌はなかった。

ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、２ 要約書 水サンプル中のし」亘ｕを同定する方法。これ６士、Ｌ」立ｕに特異的な２つの 明確な特徴である、インドール生成およびラクトース利用の同時測定（こ基七く 方法である。新規の培地は、主にβグルクロニダーゼ、ト１ノブトファン、およ びトリプトースを含んで０る。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成４年１１月１３日 水中のＥ、　Ｃ０Ｌ４を同定するための新規および改良された方法 ３、特許出願人 住所　アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４６１２−３５５０オークランド、 トウエンティセカンド　フロア−。

レイクサイド　ドライブ　３００ 名称　ザ　リージェンツ　オブ　ザ　ユニバーシティオブ　カリフォルニア ４、代理人 住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区域見−下目２番２７号５、補正書の提出年 月日 １９９２年８月６日 ６、添付書類の目録 （１）補正書の写しく翻訳文）　１通 道）４１【皿： １、水サンプル中のＥ、　ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有用な、ラクト ースの利用およびインドールの生成を測定する方法であって、 （ａ）該水サンプルと、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含む組成物とを接触させ る工程、 （ｉ）　Ｓ−ｔルトーニトロフェニルーＬ−システィンおよびトリプトファンか らなる群から選択される窒素供与化合物および； （ｉｉ）オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはメチルウ ンベリフェリル−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、色素産生性また は蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシド； （ｂ）工程（ａ）の水性混合物を約３０°Ｃから５０℃の間の温度で２から４８ の間の時間インキユベートする工程；（ｃ）該混合物中の黄色または蛍光の有無 によって、ラクトースが利用されていることを測定する工程；（ｄ）ｐ−ジメチ ルアミノベンズアルデヒドを含有する試薬を加える工程：および （ｅ）インドールの生成を示す、赤紫色または蛍光の有無によってＬ」遼■の存 在の有無を決定する工程、を包含する、方法。

２、水サンプル中のすべての大腸菌群およびＬ」且■の存在の有無を試験するの に有用なラクトースの利用およびインド−ルの生成を測定する方法であって、 （ａ）該水サンプルと、以下の（ｉ＞−（ｖ）を含む組成物とを接触させる工程 、 （ｆ）　トリプトファンおよびＳ−オルト−ニトロフェニル−Ｌ−システィンか らなる群から選択される、第１の窒素供与化合物； （ｉｉ）任意に、アンモニウム塩、トリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）、加水分 解されたタンパク質およびペプチド混合物からなる群から選択される、第２の窒 素供与化合物；（ｉｉｉ）ｏ〜ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドお よびメチルウンベリフェリル−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、色 素産生性または蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシド； （ｉｖ）任意に、メリビオース、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドお よびメチルチオガラクトシドからなる群から選択される、β−Ｄ−ガラクトシダ ーゼ酵素誘導剤；および （ｖ）任意に、ラウリル硫酸ナトリウム、胆汁塩、界面活性剤、ターキトール（ ｔｅｒｇｉｔｏｌ）−７およびナリキシジン酸からなる群から選択される、妨害 細菌の増殖阻害剤；（ｂ）工程（ａ）の溶液混合物を、約３０″Ｃから５ｏ″Ｃ の間の温度で２から４８の間の時間インキユベートする工程；（ｃ）該溶液中の 黄色または蛍光の有無により、すべての大腸菌群の存在の有無を決定する工程； （ｄ）ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを含有する試薬を加える工程；およ び （ｅ）インドールの生成を示す、赤紫色の有無によってＬ」貝の存在の有無を決 定する工程、 を包含する、方法。

３、請求項２に記載の方法であって、前記箪２の次窒素供与化合物がトリプトー スであり、前記ラクトース利用誘導剤がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピ ラノシドであり、そして前記妨害細菌の増殖阻害剤がラウリル硫酸ナトリウムで ある、 方法。

４、請求項３に記載の方法であって、インドールを検出する前記試薬が、酸性イ ソアミルアルコールまたは酸性ｎ−ブチルアルコール中に溶解された、ｐ−ジメ チルアミノベンズアルデヒドである、 方法。

５、希釈水サンプル中のＬ」旦■の存在を試験し、定量するのに有用なラクトー スの利用およびインドールの生成を測定する方法であって、 （ａ）希釈されていない水サンプルと、以下の（ｉ）−（ｖ）を含有する組成物 とを接触させる工程、 （ｉ）　トリプトファン、およヒｓ−オルト−ニトロフェニル−し一システィン からなる群から選択される、第１の窒素供与化合物； （１１）任意に、アンモニウム塩、タンパク質加水分解物、トリプトースおよび ペプチド混合物からなる群から選択される、第２の窒素供与化合物； （ｉｉｉ）オルト−ニトロフェニル−β−Ｄガラクトピラノシドおよびメチルウ ンベリフェリル−ガラクトシドからなる群から選択される、色素産生性または蛍 光産生性のβ−Ｄ−ガラクトンド； （ｉｖ）任意に、メリビオース、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシドお よびメチルチオガラクトシドからなる群から選択される、β−Ｄ−ガラクトシダ ーゼ酵素誘導剤；および （ｙ）任意に、ラウリル硫酸ナトリウム、胆汁塩、界面活性剤、ターギトール− ７およびナリキシジン酸からなる群から選択される、妨害細菌の増殖阻害剤；（ ｂ）工程（ａ）で得られた混合液を該組成物（ｉ）−（ｖ）の１０倍容量に希釈 することによって、Ｅ、　ｃｏｌｔの存在を定量する工程；（ｃ）工程（ａ）の 水性混合液を、約３０℃から５０℃の間の温度で２から４８の間の時間インキユ ベートする工程；（ｄ）黄色または蛍光の有無を同定する工程、（ｅ）ｐ−ジメ チルアミノベンズアルデヒドを含有する試薬を加える工程； （ｆ）紫色の有無によってＬ」旦Ｈの存在の有無を決定する工程；および （ｇ）最確数試験によりｌ：、　ｃｏｌｉの数を評価する工程、を包含する方法 。

６、水サンプル中のＥ、　ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有用なラクトー スの利用およびインドールの生成を測定するためのテストキットであって、 （ａ）以下の（ｉ）および（ｉ　ｉ）を含有する濃縮された凍結乾燥培地５０ｍ １を含む、１００ｍ１のレベルに目盛りが付いた３個のストツバ−付滅菌済２０ ０ｍ１容ガラスバイアル、（ｉ）Ｓ−オルト−ニトロフェニル−し−システィン およヒドリブトファンからなる群から選択される、窒素供与化合物；（ｉｉ）オ ルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドまたはメチルウンベリフェ リル−ガラクトシダーゼからなる群から選択される、色素産生性または蛍光産生 性のβ−Ｄ−ガラクトシド； （ｂ）該水サンプルを集めるためのバイアル；（ｃ）該培地を含有する容器に５ ０ｍ１の水サンプルを加えるためのピペッタ−； （ｄ）加熱制御装置および時間制御装置を有する、該培地と該水サンプルとの水 性混合液をインキュベージコンするための恒温槽；および （ｅ）　ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒドを含有する試薬を含有するバイア ル； を含む、テストキット。

７、　ｉｌ請求項に記載のキットであって、ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒ ドを含有する試薬の付加によってラクトースの利用およびインドールの生成の存 在を示す、赤紫色の有無によって、Ｌ」旦■の存在の有無が決定される、キット 。

８、請求項７に記載のキットであって、前記インキュベーターのインキュベーシ ョン温度が３５℃から４４．５℃の間である、キット。

国際調査報告 １、．１覗や叩＾””　”’”””　ｒ／ＩＫＯＩ　Ｉｎ１１．Ｌ’＋１゜

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．水サンプル中のＥ．ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有用な、ラクトー スの利用およびインドールの生成を測定する方法であって、 （ａ）水サンプルと、以下の（ｉ）および（ｉｉ）を含有する組成物とを接触さ せる工程、 （ｉ）Ｓ−オルト−ニトロフェニル−Ｌ−システインおよびトリプトファンから なる群から選択される窒素供与化合物および； （ｉｉ）色素産生性または蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシド；（ｂ）工程（ａ ）の該水性混合物を約３０−５０℃の間の温度で２から４８の間の時間インキュ ベートする工程；および（ｃ）ラクトースの利用およびインドールの生成の存在 を証明する、赤紫色または蛍光の有無によって、Ｅ．ｃｏｌｉの存在の有無を決 定する工程、 を包含する、方法。
2. ２．請求項１に記載の方法であって、前記色素産生性または蛍光産生性のβ−Ｄ −ガラクトシドが、８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−ガラクトシド、インドリ ル−β−Ｄ−ガラクトシド、インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド置換体、 パラまたはオルトーニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチル ウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、またはそれらの混合物から選 択され、前記窒素供与化合物がトリプトファンであり、前記インキュベーション は温度が３５℃で２−４時間および４４．５℃でさらに実施される、 方法。
3. ３．水サンプル中のすべての大腸菌群および／またはＥ．ｃｏｌｉの存在の有無 を試験するのに有用な、ラクトースの利用およびインドールの生成を測定する方 法であって、（ａ）水サンプルと、以下の（ｉ）−（Ｖ）を含む組成物とを接触 させる工程、 （ｉ）トリプトファンおよびＳ−オルト−ニトロフェニル−Ｌ−システインから なる群から選択される、第１の窒素供与化合物； （ｉｉ）任意に、アンモニウム塩、トリプトース（ｔｒｙｐｔｏｓｅ）、加水分 解されたタンパク質およびペプチド混合物からなる群から選択される、第２の窒 素供与化合物；（ｉｉｉ）色素産生性、または蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシ ド； （ｉｖ）任意に、ラクトース利用誘導剤；および（ｖ）任意に、妨害細菌阻害剤 ； を含む組成物とを接触させ； （ｂ）工程（ａ）の該混合溶液を、約３０℃から５０℃の間の温度で２から４８ の間の時間インキュベートする工程；（ｃ）該溶液中の黄色の呈色または蛍光の 有無により、すべての大腸菌群の存在の有無を決定する工程；および（ｄ）工程 （ｂ）で得られた該溶液混合物の一部を、Ｅ．ｃｏｌｉの存在に特徴的な遊離イ ンドールの存在を検出する試薬に、引き続き接触させることによって、Ｅ．ｃｏ ｌｉの存在の有無を決定する工程； を包含する、方法。
4. ４．請求項３に記載の方法であって、第１の窒素供与化合物がトリプトファンで あり、前記第２の窒素供与化合物がトリプトースであり、前記ラクトース利用誘 導剤がイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドであり、そして前記妨害 細菌阻害剤がラウリル硫酸ナトリウムであり、そして前記インキュベーション温 度が３５℃で２−４時間および４４．５℃で２０時間である、 方法。
5. ５．希釈水サンプル中のＥ．ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有用なラクト ースの利用およびインドールの生成を測定する方法であって、 （ａ）希釈されていない水サンプルと、以下の（ｉ）−（Ｖ）を含む組成物とを 接触させる工程、 （ｉ）トリプトファン、およびＳ−オルト−ニトロフェニル−Ｌ−システインか らなる群から選択される、第１の窒素供与化合物； （ｉｉ）任意に、タンパク質加水分解物、トリプトース、およびＳ−オルト−ニ トロフェニル−Ｌ−システインからなる群から選択される、第２の窒素供与化合 物；（ｉｉｉ）色素産生性、または蛍光産生性のβ−Ｄ−ガラクトシド； （ｉｖ）任意にラクトース利用誘導剤；および（ｖ）任意に妨害細菌阻害剤； （ｂ）工程（ａ）で得られた該混合液を該組成物（ｉ）−（ｖ）の１０倍容量に 希釈することによって、Ｅ．ｃｏｌｉの存在を定量する工程；（ｃ）工程（ａ） の該水性混合物を、約３０℃から５０℃の間の温度で２から４８の間の時間イン キュベートする工程；（ｄ）呈色または蛍光の有無により、Ｅ．ｃｏｌｉの存在 の有無を決定する工程、 を包含する、方法。
6. ６．請求項５に記載の方法であって、前記色素産生性または蛍光産生性のβ−Ｄ −ガラクトシドが、８−ヒドロキシキノリン−β−Ｄ−ガラクトシド、インドリ ル−β−Ｄ−ガラクトシド、オルトーニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシ ド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド、またはそれらの混合 物から選択され、前記窒素供与化合物がトリプトファンであり、前記インキユベ ーション温度が３５℃で２−４時間および４４．５℃で２０時間である、 方法。
7. ７．水サンプル中のＥ．ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有用なラクトース の利用およびインドールの生成の測定するためのテストキットであって、 （ａ）水サンプルを、主に窒素源、無機塩、およびラクトース置換体からなる、 凍結乾燥されたＴＡＧ培地を含むバイアルに加える工程； （ｂ）該水と該培地とを混合する工程；（ｃ）該混合物を３０−５０℃の間の温 度で２から４８の間の時間インキュベートする工程； （ｄ）黄色の呈色が起こることを観察する工程、（ｅ）遊離インドールの存在を 検出する試薬を加える工程；（ｆ）該試薬と該工程（ｃ）の該混合物とを混合す る工程；（ｇ）該工程（ｆ）の該混合物を１分から２時間反応させる工程；（ｈ ）赤紫色の呈色の存在を記録する工程；（ｉ）色に変化のないサンプルを、Ｅ． ｃｏｌｉ陰性とし；黄色の呈色を示すサンプルを大腸歯群陽性であるとし、そし て赤紫色の呈色を示すサンプルをＥ．ｃｏｌｉ陽性であると評価する工程、を包 含するテストキット。
8. ８．請求項７に記載のキットであって、前記ＴＡＧ培地がトリプトファン、ｏ− ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、トリプトース、塩化ナトリウム 、硫酸マグネシウム、リン酸一カリウム、リン酸二ナトリウムおよびラウリル硫 酸ナトリウムを含み、前記インキュベート温度が３５℃で２−４時間および４４ ．５℃で２０時間である、 方法。
9. ９．水サンプル中の大腸菌群およびＥ．ｃｏｌｉの存在の有無を試験するのに有 用なラクトースの利用およびインドールの生成を測定するためのテストキットで あって、（ａ）水サンプルを、主に窒素源、無機塩、ラクトース置換体およびト リプトースからなる、凍結乾燥されたＴＡＣ培地を含むバイアルに加える工程； （ｂ）該水と該培地とを混合する工程；（ｃ）該混合物を３０−５０℃の間の温 度で２から４８の間の時間インキュベートする工程； （ｄ）黄色の呈色が起こることを観察および記録する工程；（ｅ）黄色を示さな いサンプルを分離し、これをＥ．ｃｏｌｉ陰性および大腸菌群陰性として記録す る工程；（ｆ）該黄色を示すサンプルを大腸菌群陽性として記録する工程； （ｇ）該黄色のサンプルの一部をスポットまたはマイクロタイタープレートに移 し換える工程； （ｈ）遊離インドールの存在を測定する試薬を加える工程；（ｉ）赤紫色の呈色 が起こることを観察する工程；（ｊ）赤紫色サンプルをＥ．ｃｏｌｉ陽性として 記録する工程、を含む、テストキット。
10. １０．請求項９に記載のキットであって、前記ＴＡＧ培地がトリプトファン、ｏ −ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、トリプトース、ラウリル硫酸 ナトリウム、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、塩化ナトリウム、リ ン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウムおよびリン酸一カリウム、および前記イン キユベーション温度が３５℃で２−４時間および４４．５℃で２０時間である、 方法。
11. １１．水サンプル中に存在するＥ．ｃｏｌｉの最確数を定量する試験を行なうた めに有用なラクトースの利用およびインドールの生成を測定するためのテストキ ットであって：（ａ）１００ｍｌの水サンプルを、主に窒素源、無機塩およびラ クトース置換体からなるＴＡＧ液体培地を含むバイアルに加えて、１：１０の水 サンプル希釈液を得る工程；（ｂ）該水サンプルとＴＡＧ液体培地とを混合する 工程；（ｃ）工程（ｂ）の水サンプル混合液の１０分の１を、主に窒素源、無機 塩およびラクトース置換体からなるＴＡＧ液体培地を含む各バイアルに加える工 程； （ｄ）該水サンプルとＴＡＧ液体培地とを混合する工程；（ｅ）工程（ｄ）の水 サンプル混合液の１０分の１を、主に窒素源、無機塩およびラクトース置換体か らなる、ＴＡＧ液体培地を含む各バイアルに加える工程； （ｆ）該水サンプルとＴＡＧ液体培地とを混合する工程；（ｇ）工程（ｆ）の水 サンプル混合液の１０分の１を、主に窒素源、無機塩およびラクトース置換体か らなる、ＴＡＧ液体培地を含む５個のバイアルのそれぞれに加える工程；（ｈ） 該水サンプルとＴＡＧ培地溶液とを混合する工程；（ｉ）工程（ｈ）の水サンプ ル混合液の１０分の１を、主に窒素源、無機塩およびラクトース置換体からなる 、ＴＡＧ培地溶液を含む５個のバイアルのそれぞれに加える工程；（ｊ）該水サ ンプルとＴＡＧ液体培地とを混合する工程；（ｋ）すべてのチューブを３０−５ ０℃の温度で２−４８の間の時間インキュベートする工程； （ｌ）黄色の呈色の有無を記録する工程；（ｍ）遊離インドールの存在を測定す る試薬を加える工程；（ｎ）該サンプルを混合する工程； （ｏ）Ｅ．ｃｏｌｉ陽性として赤紫色サンプル中のＥ．ｃｏｌｉの存在を、大腸 菌群またはＥ．ｃｏｌｉ陽性として、黄色サンプル中の大腸菌群またはＥ．ｃｏ ｌｉの存在を、Ｅ．ｃｏｌｉ陰性として、呈色の変化のないサンプル中のＥ．ｃ ｏｌｉの欠如を、およびＥ．ｃｏｌｉまたは大腸菌群の量を、希釈率毎によって 表現されるコロニー形成ユニットとして評価する工程、 を包含する、テストキット。
12. １２．請求項１１に記載のキットであって、前記ＴＡＧ培地がトリプトファン、 ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、トリプトース、ラウリル硫 酸ナトリウム、イソプロピル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、塩化ナトリウム、 リン酸二ナトリウム、硫酸マグネシウムおよびリン酸一カリウムであり、そして 前記温度が３５℃で２−４時間および４４．５℃で２０時間である、キット。
13. １３．主にｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドおよびトリプトフ ァンからなる水中のＥ．ｃｏｌｉ検出用培地。
14. １４．主にトリプトファン、ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド およびトリプトースからなる水中のＥ．ｃｏｌｉ検出用培地。
15. １５．水サンプル中のすべての大腸菌群およびＥ．ｃｏｌｉの存在の有無を試験 するのに有用な培地であって、トリプトファン、トリプトース、および色素産生 性または蛍光産生性のβ−ガラクトシドを含む、培地。