JPH05508997A - 新規熱安定性プルラナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規熱安定性プルラナーゼ 技術分野 本発明は熱安定性酵素の分野に属する。より具体的には、本発明はピロコツカス （ｈ匹匹並旦）属に属する菌株から得ることのできる新規熱安定性プルラナーゼ 類およびそれらの酵素の製造方法に関する。

また、本発明は同一種のプルラナーゼ成分から実質的になるピロコツカス属に属 する菌株のゲノムに由来するプルラナーゼをコードするＤＮＡの組換え法で生産 されたプルラナーゼ調製物に関する。

さらに、本発明はプルラナーゼの澱粉の転化、ならびに液化および／または糖化 工程での使用に間する。

背景技術 熱安定性プルラナーゼは、例えば、バチルス・アシドプルリティカス（Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ　ａｃ旧」叫士辻江匡■）から単離され、そして工業的な糖化工程での それらの使用が知られている（ヨーロッパ特許出願公開第６３，９０９号参照） 、より熱安定性の酵素に対する要求に応えるべく、広範な研究が進められてきた ０本発明の目的は、向上した熱安定性を有する新規プルラナーゼを提供するにあ る。

発明の要約 ピロコツカス（ｈ皿匹匹…）属に属する菌株が特異な熱安定性と熱活性を示す新 規プルラン分解性酵素を生産することがここに見い出された。

したがって、本発明の第一の態様では、ピロコンカス・ボイセイ（ｈ匹匹匹■ｗ ｏｅｓｅｉ）（ＤＳＭ　Ｎｏ、３７７３）またはピロコツカス・フリオサス（ｈ 二組匹■ｆｕｒｉｏｓｕｓ）　（ＤＳＭ　Ｎｏ、３６３８）由来のプルラナーゼ と同等または部分的に同等の免疫化学特性を示すプルラナーゼ類を提供する。

もう一つの態様では、本発明は、ｐＨ５〜７に至適ｐＨ１基質とカルシウムの不 存在下でインキュベーション後に測定した場合に、残存活性が、１００℃で４時 間後に９０％を越え、１１０℃で２０分後に３０％を越え、そして８５〜１１５ °Ｃに至適温度を存することを特徴とするプルラナーゼを提供する。

第三の態様では、本発明は、ピロコツカスのプルラナーゼ生産株を炭素源、窒素 源および無機塩類を含む栄養培地で培養し、次いで所望の酵素を回収する工程を 含む本発明のプルラナーゼの製造方法を提供する。

第四の態様では、本発明は、ピロコツカス属に属する菌株のゲノムに由来するプ ルラナーゼをコードするＤＮＡの組換え法で生産された同一種のプルラナーゼ成 分から実質的になるプルラナーゼ調製物を提供する。より具体的な態様では、本 発明はピロコツカス・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ、３７７３）またはピロコツカス ・フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ、３６３７）由来のプルラナーゼと免疫化学的に同 等または部分的に同等の特性を有する実質的に同一種のプルラナーゼ成分からな るプルラナーゼ調製物を提供する。

第五の１１様では、本発明は、前記プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片を単離 する工程、このＤＮＡ断片を適当なプラスミドベクター中で適当な発現シグナル と共に組み合わせる工程、このプラスミドベクターを適当な宿主へ自律的な複製 プラスミドとしてまたは染色体中へ組込まれるように導入する工程、この宿主微 生物をブルラナーゼの発現を誘導する条件下で培養する工程、ならびに培養物か らプルラナーゼを回収する工程を含んでなる酵素の高発現生産方法を提供する。

第六の態様では、本発明は、澱粉転化工程における本発明のプルラナーゼの使用 に向けられる。より具体的なり様では、本発明は、本発明のプルラナーゼと、グ ルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−アミラーゼまたは他の糖化酵素から 選ばれる１種以上の酵素の存在下で澱粉の加水分解物の糖化を行う工程を含んで なる澱粉のグルコースおよび／またはマルトース含有シロップへの転化方法を提 供する。他の具体的なり様では、本発明は、本発明のプルラナーゼと熱安定性α −アミラーゼの存在下で液化／脱分岐（技切り）を同時に行う工程、次いで、必 要によりプルラナーゼと一緒に、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β− アミラーゼまたは他の糖化酵素から選ばれるＩＮ以上の酵素の存在下での糖化工 程を含んでなる澱粉のグルコースおよび／またはマルトース含をシロップへの転 化方法を提供する。

図面の簡単な説明 本発明は、添付の図面を参照することでさらに具体的に説明される。

図１は、本発明の酵素の温度と酵素活性との間の関係を示す、図２は、本発明の 酵素のｐＨと酵素活性との間の関係を示す、図３は、各種温度（・１００°Ｃ、 ム１１０℃、１１２０°Ｃ）における本発明の酵素の酵素活性の継時変化を示す 、そして図４は、プラスミドｐｓＪ９３３の制限酵素地図を示す。

本発明の詳細な開示 鼠−素 本発明は、ピロコツカス属に属する菌株から得ることができる新規プルラン分解 酵素またはその変異株もしくは変種あるいはピロコツカスの１菌株から得ること のできるプルラナーゼと同等もしくは部分的に同等の免疫化学特性を有するプル ラン分解酵素に関する。

酵素の変種もしくは変異酵素とは、もとの遺伝子のＤＮＡヌクレオチド配列の変 換により得ることができる酵素もしくはその誘導体を意味する。酵素の変種もし くは変異酵素は、その酵素をコードするＤＮＡヌクレオチド配列を適当な宿主微 生物における適当なベクター中に挿入した場合に発現し、そして生産可能である 。宿主微生物はもとの遺伝子が得られる微生物と同一である必要はない。

本発明のプルラン分解酵素は下記の特性により特定される。

ユ止ヱ呵豊血 本発明の酵素類は非常に広範な温度とｐＨ範囲で活性である。これらの酵素は４ ０℃から１３０℃を越える温度範囲でプルラン分解活性を示し、８５〜１１５° Ｃ１より具体的には１００〜１１０℃の範囲に至適温度を示す、これらの酵素は ｐＨ３，５から８を越えるｐｉ範囲でプルラン分解活性を有し、ｐＨ５〜７、よ り具体的にはｐＨ５，５〜ｐＨ６，５の範囲に至適ｐＨを示す、ｐＨ８において 約５５％のプルラン分解活性が測定できる。１００°Ｃで４時間後では、これら のプルラナーゼは実質的にプルラン分解活性を失わない、１００°Ｃで２４時間 後に６５％の残存活性が測定できる。１１０℃で１時間後に約１０％の残存活性 が測定できる。金属イオンの添加は触媒活性にとって不要である。酵素はα−シ クロデキストリンおよびβ−シクロデキストリンにより阻害される。

試験された特定の酵素類は、不規則な態様でプルランのα−１゜６−グリコシド 結合に作用してＯＰ３．ＯＰ６およびＯＰ９　（ＯＰ：重合度）を生成する。低 分子の分枝オリゴ塘もこれらのプルラナーゼの作用を受ける。他方、デキストラ ンは本発明のプルラナーゼで加水分解されない、他の細菌由来のプルラナーゼと 異なり、これらのプルラナーゼはパノースのような小さな基質のα−１，６−結 合も加水分解できる（生成物はマルトースとグルコースである）。

九皮上ヱ符ユ 本発明のプルラナーゼは、ピロコツカス・ボイセイ（ｈ匹匹ｃｃｕｓ分的に同等 の免疫化学的特性を有する。

これらの免疫化学的特性は、免疫交差反応同定試験によって測定できる。この同 定試験は、Ｎ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎ、　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏ −ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎ−Ｇｅｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　（Ｂｌ ａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、　１９８３ ）第５および１４章に従う周知のオフタロニー−二重免疫拡散法または双頭交差 免疫電気泳動により行うことができる。「抗原同等性」とｒ部分抗原同等性」の 語は、同じ本の第５゜１９および２０章に記載されている。

上記方法に従い、本発明の精製プルラナーゼでウサギを感作することにより単一 特異性抗血清が産生される。免疫原をフロインドアジュバントと混合し、次いで ２週目毎にウサギの皮下に注射した。

８１間の総感作後に抗血清を得て、それから上記Ｎ、Ｈ，Ａｘｅｌｓｅｎに記載 されるように免疫グロブリンを調製した。

ブルー　−ゼの會　１１ 本発明のプルラナーゼは、炭素源、窒素源および無機塩を含む適当な栄養培地で ピロコツカスに属するプルラナーゼ生産菌株を培養し、次いで目的の酵素を回収 することにより製造できる。

Ｐ−ボイセイ（Ｐ、　ｗｏｅｓｅｉ）およびＰ−フリオサス（Ｐ、　ｆｕｒｉｏ ｓｕｓ）がピロコツカス属の代表的な苗種である。Ｐ・ボイセイの代表的な菌株 はＤＳＭ　（Ｎｏ、３７７３として）から入手可能であり、Ｐ・フリオサスの代 表的な菌株は、ＤＳＭ　（Ｎｏ、３６３８として）から入手可能である。

超好熱性古細菌ピロコツカスに属する微生物は、８０〜１０５°ＣのｐＨ（１４ ，５と７．５との間で至適な生育を示し、そして澱粉、グリコーゲン、デキスト リンおよびオリゴ糖を含有する各種の複合培地で生育できる。これらの細菌の生 育中に著しい熱活性の細胞内および細胞外プルラナーゼを生産することが明らか になった。

良好な工業的適用性の発酵方法を確立する目的で、栄養培地を連続的に供給する プルラナーゼの生産方法が開発された。栄養培地の連続的な供給が酵素の生産を 促進することが見い出された。その上、ピロコツカス種の生育用のより限定され た栄養培地が開発された。

記載された他の培地との相違は、この培地は混濁せず、そして元素硫黄を含まな いことである。この培地での至適生育と酵素の生産はＮ、　／Ｃｏ、またはＮ２ を連続的に補給することによって達成できる。

このような培地組成の具体例は、表２および３に示される。

１−一二 元素硫黄を含有する複合栄養培地−１（１リットル当り）：海水塩（ｌｌｉｅｇ ａｎｄ、　Ｋｒｅｆｅｌｄ、　ＦＲＧ）　３０　ｇＫＨｚＰＯ４１，５ｇ ＮｉＣ１□Ｘ　６Ｈｚ０　２ｍｇ 本微量元素溶液（下記参照）　１０ｍ１硫　黄（粉末）１０ｇ 酵母エキス　１ｇ ペプトン　２ｇ 澱粉　２ｇ レサズリン　１ｍｇ ＮａｚＳＸ９１（ｚｏ　５００ｍｇ ｐＨを６．３〜６．５に調節 温度９０〜１００°Ｃ Ｈｚ／ｃｏ□の供給：　８０／２０ 傘微量元素溶液（１リットル当り）： ティトリプレックス（Ｔｉｔｒｉｐｌｅｘ）　Ｉ　（Ｍｅｒｃｋ）　１．５　ｇ ＭｇＳＯａ　Ｘ　７Ｈｚ０　３．０ｇ Ｍｎ５Ｏｎ　Ｘ　２Ｌ０　５００５ｇ ＮａＣ１１ｇ ＦｅＳＯ，Ｘ　７Ｍ、０　１００＊ｇ ＣａＣＩｚ　Ｘ　２Ｈｚ０　１００１１ｇ１００ｌ１　Ｘ　７ＨｚＯ１８０ｍｇ Ｃｕ５Ｏａ　Ｘ　５ＨｚＯＬｏｎｇ ＫＡＩ　（５０４）　ｔ　１０ｍｇ ＨゴＢＯゴ　１０−ｇ ＮａｚＭｏＯａ　Ｘ　２Ｈｚ０　１０ｍｇにｉｃｈ　Ｘ　６Ｈｚ０　２５１１ｇ ＣａＣ１ｚ　Ｘ　２Ｈ！０　１０ｍｇ ｐＨを７．０に調節 １−又 元素硫黄を含まない複合栄養培地−１ｆ（ｌリットル当り）：（ＮＨ山ＳＯａ　 １．３ｇ Ｍｇ５Ｏａ　Ｘ　７Ｈｚ０　２５０＊ｇＦｅＳＯ，Ｘ　７ＪＯ３８ｇｇ ＮａｚＳｅＯｓ　Ｘ　５Ｈｚ０　５　ｔｔ　Ｍ傘微量元素溶液（下記参照）　Ｉ Ｏｍｊシスティンｘ　ＨＣＩ　５００ｍｇ ｐＨを６．２〜６．５に調節 温度９０〜ｌＯＯ°Ｃ Ｎｚ／Ｃｏｔ（７）供給：　８０／２０本微量元素溶液（１リットル当り）： ＭｎＣ１ｚ　Ｘ　４Ｈｚ０　１００ｍｇＣｏ（：ｌｘ　Ｘ　６Ｈｚ０　２００ｍ ｇＮｉＣｌ、　Ｘ　６Ｈ１Ｏ１００ｗｇ ＺｎＣ１ｚ　１００ｍｇ ＣａＣ１ｚ　Ｘ　２ＨｚＯ５０＋５ｇ Ｃｕ５Ｏａ　Ｘ　２Ｈｚ０　５０ｍｇ ＮａｚＭｏＯ４Ｘ　２Ｈｚ０　５０１１ｇｌ−主 元素硫黄を含まない複合栄養培地−Ｉｌｌ（１リットル当り）：（ＮＨ４）　ｔ ｓＯａ　１．３　ｇ ＦＩｇＳＯａ　Ｘ　７ＨｔＯ２５０ｍｇＮａＣ１３Ｑ、Ｏｇ ＫＨｔＰＯａ　１．４　ｇ ＣａＣｌ、　５０ｍｇ Ｆｅ５Ｏａ　Ｘ　”ｌｌ１ｔＯ３８ｍｇＮａｔＳｅＯｓ　Ｘ　５ＨｚＯ５ｕ　Ｍ 傘微量元素溶液（下記参照）　ｌｈｌ トリプトン　１ｇ 酵素エキス　１ｇ 澱粉　１ｇ レサズリン　１１ｇ システィンＸ　ＨＣＩ　５０抛ｇ ｐ［Ｉを６．２〜６．５に調節 温度９０〜１００℃ Ｎｔ　／Ｃｏ、の供給：　８０／２０ 微量元素溶液（１リットル当り）： ＭｎＣ１＊　Ｘ　４Ｈｚ０　１００ｍｇＣｏＣＩｘ　Ｘ　６Ｈｔ０　２００ｍｇ Ｎ１Ｃｈ　Ｘ　６）１ｉ０　１００閤ｇＺｎＣＩｇ　１００ｍｇ ＣａＣ１ｔ　Ｘ　２Ｈ！０　５０ｍｇ ＣｕＳＯ４Ｘ　２Ｈｚ０　５０ｍｇ ＮａｚＭｏＯａ　Ｘ　２ＨｔＯ５０ｍｇ１盪人ユ仏抜 ピロコツカスに属する菌株の試験は、それらが少量のプルラナーゼを生産するに すぎないので、これらの微生物の培養による生産は必然的に非常に低収率である 。その上、これらの微生物由来の酵素を用いる研究は、それらが各種の単一プル ラナーゼ成分の複合混合物を生産するため、これらの微生物から得られる調製物 は相対的に低い比活性を有することを明らかにしている。

これらの事実は、ピロコツカス菌株の培養による製造方法の実用的な開発を妨げ ていた。低収率と多酵素系における単一成分の生産を至適化する困難性が、プル ラナーゼ調製物の工業的なコストでの有効な生産の実施を困難にし、そしてそれ らの実用は所望の酵素作用を得るのに多量の酵素の使用が必要であることなどの 困難性により妨げられてきた。

これらの短所は、高い比活性を有する単一成分の酵素調製物の人手を可能にする 高収率法を使用することにより改善できる可能性がある。したがって、本発明の さらなる目的は、実質的に同種のプルラナーゼ成分からなる組換え的なプルラナ ーゼの製造方法とこの単一成分の調製物を生産するための高発現方法を提供する ことにある。

皇：」（分ＩＬｔ宣 本発明は実質的に同一種のプルラナーゼ成分からなる組換え的に生産されたプル ラナーゼ調製物を提供する。このプルラナーゼ成分をコードするＤＮＡは、ピロ コツカス属に属するいずれかの微生物から誘導できる。好ましくは、プルラナー ゼ成分をコードするＤＮＡは、Ｐ・ボイセイまたはＰ・フリオサスの１菌株から 誘導される。Ｐ・ボイセイの代表的な菌株は、ＤＳＭ　（Ｎｏ、３７７３で）か ら入手でき、そしてＰ・フリオサスの代表的な菌株は、前記研究所（Ｎｏ、３６ ３８で）より入手できる。

本発明のプルラナーゼ調製物は、Ｐ・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ、３７７３）また はＰ・フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ、３６３８）から誘導されるプルラナーゼと同 等または部分的に同等の免疫化学特性（例えば、上記Ｎ、Ｈ，＾ｘｅｌｓｅｎ参 照）を示す同一種のプルラナーゼ成分から実質的になる。

好ましくは、本発明のプルラナーゼ調製物は、タンパク質ｌａｇ当り少なくとも ６ブルラナ一ゼ単位（ｐｕ）　、より好ましくはタンパク質１ｇ当り少なくとも ２０ＰＵのプルラン分解活性を有する。プルラン分解活性の測定方法とｐｕの定 義は実施例８に記載する。

本発明のプルラナーゼ調製物は単一成分調製物である。さらに、本発明のプルラ ナーゼ成分は見かけの分子量９５ｋ［ｌを示す、これらの特徴は、本明細書の実 施例９で測定される。

本発明のプルラナーゼ調製物は、実施例７のように測定した場合には、ｐＨ４， ５〜６．０に、より具体的にはｐＨ４，５〜５．５に至適ｐＨを有する。

本発明のプルラナーゼ調製物は、実施例７のように測定した場合には、８５〜１ １５°Ｃに、より具体的には９５〜１１５℃に至適温度を有する。

本発明のプルラナーゼ調製物は、実施例７のように測定した場合には、　１００ °Ｃで３０分後に８０％を越え、好ましくは９０％を越える残存活性を、１００ °Ｃで２時間後に７０％を越え、好ましくは８０％を越える残存活性を、そして １００°Ｃで４時間後に６０％を越え、好ましくは７０％を越え、さらにより好 ましくは、８０％を越える残存活性が測定される熱安定性を示す。

基質特異性に関する研究では、本発明のプルラナーゼ調製物はプルランをほぼ選 択的にマルトトリオースに分解し、パノースをほぼ選択的にグルコースとマルト ースに分解し、そして可溶性澱粉をすべてグルコースオリゴマー、すなわち、グ ルコース、マルトース、グルコトリオースなどに転化する加水分解生成物まで分 解することを示す、プルランの加水分解速度は、著しく速い。

え・に　れるブルーナーゼ 単一成分調製物としてプルラナーゼを得るのに、組換えＤＮＡ法が使用された１ 本発明の方法は、好ましくは、プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片の単離、そ のＤＮＡ断片の適当なプラスミドベクターの適当な発現シグナルとの組み合わせ 、そのプラスミドベクターの、自律複製性プラスミドまたは染色体中への組み込 みのいずれかとして適当な宿主への導入、その宿主微生物のプルラナーゼの発現 をもたらす条件下での培養、ならびに培養物からのプルラナーゼの回収を含んで なる高発現方法である。

組換えＤＮＡ技術およびその方法は、当該技術分野で既知であり、そして当業者 により容易に実施されるであろう。

本発明のプルラナーゼ調製物のプルラナーゼ成分は、ピロコツカス属の−の種に よって生産可能である。好ましい種は、Ｐ・ポイセイおよびＰ・フリオサスであ る。プルラナーゼ成分またはその前駆体をコードするＤＮＡ断片は、例えば、プ ルラナーゼ産生微生物〔例えば、Ｐ・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ、３７７３）また はＰ・フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ。

３６３８）　）のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを樹立し、次いでプルラナ ーゼの全アミノ酸配列もしくは部分アミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌ クレオチドプローブへのハイブリダイゼーシヨンまたは適当なプルラン分解活性 の発現クローンの選択または天然のプルラナーゼ成分に対する抗体と反応性のタ ンパク質生産性クローンの選択、のような常法による陽性クローンの選択により 単離される。

適当なりＮＡ配列のスクリーニングとベクターの構築は、当該技術分野で既知の 標準的方法により実施できる。

特定の宿主微生物でのプルラナーゼの発現を可能にする適当なプロモーター、オ ペレーターおよびターミネータ−配列ならびに複製起源を含んでなる適当な複製 可能な発現ベクターに上記の選択されたＤＮＡ配列が挿入されると、対応する宿 主微生物でベクターは復製可能になる。

次に、得られた発現ベクターで、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 並旦）やバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）　、アスペルギルス（ハ旦Ｉ」…）また はストレプトミセス（鉦胆Ｈ匹匹且）属に属する微生物のような適当な宿主細胞 を形質転換できる。宿主微生物としてＥ・°コＩノ（［ｔ、　ｃｏｌｉ）を使用 する場合には、適当なプラスミドは、ｐＢＲ３２２およびｐＡＣＹＣまたはそれ らの誘導体である。宿主微生物としてバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種が使用さ れる場合には、適当なプラスミドは、ｐＵＢｌｌｏ、　ｐｃ１９４またはｐＥ１ ９４であろう、適当なバチルス種としては、Ｂ・ズブチリス（Ｂ、　５ｕｂｔｉ ｌｉｓ）　、Ｂ　・リケニホルミス（Ｂ。

１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｗｉｓ）、Ｂ−アミロリケファシエンス（Ｂ、ａジ＋Ｉｏ ｌｉ　ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＢ・レングス（Ｂ、　１ｅｎｔｕｓ）を挙げ ることができる。

形質転換された宿主を培養するのに使用される培地は、対応する細胞を生育する のに適するいずれか常用の培地であることができる。

他の生育条件は既知技術の原理に従って選ぶことができる。

本発明の方法により得られるプルラナーゼ成分の熱安定性により、本発明のプル ラナーゼは非常に稀な方法で精製できることが見い出された。したがって、好ま しいＢ様では２本発明は、発酵ブロスを煮沸して天然のタンパクを類の変性を起 こし、次いでその発酵プロスを遠心後上澄からプルラナーゼを回収する工程を含 む発現されたプルラナーゼの精製方法が提供される。

培養物を加熱煮沸することで、天然のタンパク質類、すなわち本発明のプルラナ ーゼ成分以外の宿主微生物に由来するタンパク質およびポリペプチド類が変性さ れる。しかしながら、プルラナーゼ成分は高熱安定性酵素であるのでこのような 処理に容易に耐えられる。

天然のタンパク質類は、数秒間、とりわけ数分間（例えば、２〜５分後）で変性 されるが、本発明のプルラナーゼ成分は数時間の煮沸に安定である（実施例７の 熱安定性の測定を参照のこと）、こうして細胞融解に伴う細胞内タンパク質をは じめとする培養物中に存在する大部分のタンパク質は、遠心により容易に分離で き、そして酵素活性の活性に関しても精製操作は完全に行われた（すなわち、組 換えプルラナーゼは他の汚染酵素活性を伴うことなく回収された）。

澱■Ω五止処理 金属イオンの不存在下での基質特異性と高い熱安定性により、本発明のプルラナ ーゼは澱粉を各種糖へ工業的に転化するための他の酵素と組み合わせて使用する のに適する。脱分校酵素であるピロコツカス由来のプルラナーゼは、熱安定性α −アミラーゼによる澱粉の液化後にそれらの活性の相当部分が残る糖化条件下で の糖化に使用する上で特に有利である。α−アミラーゼ活性が糖化中に存在する 場合には、低分子の分枝オリゴ垢の蓄積が生じ糖化処理における最終収率を低下 するからである。当該技術分野で従来既知の十分な熱安定性を有するプルラナー ゼは、それらの低分子物質に対して活性を示さなかった（Ｆｒｏｍｏｚｙｍｅ　 （商標）　、　Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ）　。

糖化処理は、実質的にヨーロッパ特許出願公開第６３．９０９号明細書に記載さ れるような常法により行うことができる。好ましい酵素用量は、乾物１ｇ当りプ ルラナーゼ１〜ｌＯＯμｇ、より好ましくは乾物１ｇ当り１〜２０μｇの範囲で ある。

また、本発明の高い熱安定性のプルラナーゼは、同時の液化／脱分岐化処理での 使用にそれらを適するものとし、一般的でないこの酵素活性（α−アミロース分 解性とプルラン分解性）の組み合わせの利点は、澱粉スラリーの流体粘度のさら なる低減が達成されることにより糖化工程中の澱粉濃度の増大が可能になること である。

同時の液化／脱分校処理で好ましい酵素用量は、乾物１ｇ当りプルラナーゼ１〜 １００μｇ、より好ましくは乾物１ｇ当り１〜２０μｇの範囲である。他の条件 に関しては、通常の液化および糖化処理による（例えば、米国特許第３．９１２ ．５９０号、ヨーロッパ特許出願公開第２５２．７３０号および同６３，９０９ 号、ならびに国際特許出願罰９０／１１３５２号明細書を参照のこと）。

以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するためのものである。

実施例Ｉ Ｐ・ボイセイおよびＰ・フ１オサスの量立Ｐ・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ、３７７ ３）およびＰ・フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ、３６３８）を、それぞれ３００Ｌの ステンレス鋼の発酵槽で、表３に記載した複合栄養培地−ＩＩＩにより培養した 。９０℃で１４〜２４時間生産した後、細胞を採取した。約７０〜１２０　ｇ　 （湿重量）の細胞を３０ＯＬの細胞懸濁液から得た。

細胞内酵素の他、プルラナーゼ活性は培養液中でも検出できる。

細胞内プルラナーゼと細胞外プルラナーゼとの間には有意な差は見られなかった 。上澄を２０．０００カツトオフ膜を使用してＳ縮した。

細胞は、５０１１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６，０）　５０ｓＬと混合し、次いで圧力 ８ＭＰａのフレンチプレスで細胞を破砕した０次いで、懸濁物を３７°Ｃで３時 間ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼと共にインキュベーションした。細胞残渣を酵素 含有上澄から１２．０ＯＯＸ　ｇで２０分間遠心することにより分離した０次に 、プルラナーゼとアミラーゼの両方を含む酵素試料を上記緩衝液で透析した。ア ミラーゼ活性はその基質（澱粉またはデキストリン）の不存在下では不可逆的に 不活化されるので、この工程後アミラーゼ活性は徐々に低下した。この工程後の 試料（６０ｓＬ）は、約１０２Ｕのプルラナーゼ（１７０００／Ｌ）と５９Ｕの アミロース分解活性（９９０Ｕ／Ｌ）を含んでいた。従って、酵素の比活性は、 プルラナーゼが０．０７Ｕ／ｍｇでアミラーゼが０．０４Ｕ／−ｇであった。酸 素の存在はこれらの酵素活性に影響を及ぼさなかった。

ブルーノ　”　のア・セイ プルラナーゼ活性は次の手順で測定した。０．５％プルランと５０ｍＭ酢酸ナト リウム含有溶液（ｐＨ６，０）　２００μＬに酵素試料５０μＬを加えた。混合 物を１００°Ｃで５．１５または３０分間インキエベーシッンした。

混合物を氷／水浴（０°Ｃ）に移すことによりインキュベーションを停止した。

試薬Ａ（下記参照）２５０μＬをさらに加えた後、混合物を５分間１００’Ｃで インキュベージランした。脱イオン水２．５ｓＬを加え、５４６ｎＩｌにおける 吸光度を測定した。

拭１Δ： ３．５−ジニトロサリチル酸　１．０ｇ２　Ｎ　ＮａＯＨ１０ｓＬ 酒石酸−に、Ｎａ塩Ｘ　ｏｚｏ　３０．Ｏｇ脱イオン水　１００■Ｌ １単位（Ｕ）は、上記のような条件下で標準としてマルトースに対して測定され る１分間に１マイクロモルの還元糖を放出する酵素量として定義されている。

α−アミロース　” α−アミラーゼ活性は次の手順で測定した。１％（Ｗ／Ｖ）澱粉含有酢酸ナトリ ウム緩衝液（ｐＨ５，０）　２５０μＬに１００μＬ以下の酵素液を加え、９５ ℃で１．５時間インキュベーションを続けた。ＩＵのα−アミラーゼ活性は、標 準としてのマルトースから１分間に１マイクロモルの還元糖を放出する酵素量と 定義されている。

実施例２ ブルー　−ゼの −セフ　ロースクロマ　グーフィー：実施例１で得た細胞を除去した抽出物２０ ｓＬ　（タンパク質４６■ｇ）を、Ｑ−セファロースのファースト・フロー・カ ラム（５Ｘ４０ｃａ＋）にのせ、タンパク質を２０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ ８，０）とＮａＣ１グレージエント（０〜５００ｍＭ）の流速３−１７分により 溶離した。　１０ｓＬずつの百分を集めた。プルラン分解活性を含む主画分は、 ３６０〜４００ｍＭ　ＮａＣ１で溶離された。また、副ピークが４７０〜４８５ ５Ｍ　ＮａＣ１で溶離された。３度繰り返した後、プルラン分解活性を含む両分 を集め、１０，０００ロａカツトオフ膜を使用して濃縮した（１．４＋ｓｇ／ｍ Ｌ含有する、総量１６．５ｓＬ）　、表４のデータを参照試料をモノＱカラム（ ＦＰＬＣ：　ＨＲ５１５）に１分当り１ｓＬの速度で適用した。ｌ実験当り２− Ｌを使用した。平衡化と溶離に使用した緩衝液は、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐ ｕ　７．０）であった、プルラン分解活性を含む両分は、ＮａＣｌグレージエン ト（２００〜５００ｍＭ）が使用された後に溶離した。主画分は３６０〜４２０ ５Ｍ　ＮａＣ１により溶離された。８回の実験後、プルラン分解活性を含む画分 を集め、次いで−ａ縮した。この工程後、プルラナーゼは１５倍に精製された０ 表４のデータを参照のこと。

ヱ土ま遇■匹：前工程で濃縮された試料（各２００μＬ、６８０μｇ／腸Ｌ）を 、スーパロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２カラムを使用するゲル濾過にかけた 。使用した緩衝液は５０ｉ＋Ｍ酢酸ナトリウム（１００ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ５ ，５）であった、タンパク質は流速０．４ｍＬ／分で溶離された０表４を参照の こと。

表−■ １火七吐ｍ製 細胞抽出　６０　１３８０　１０２　０．０７　１　１００Ｑ−セファロース　 １６．５　２３．０　８．０　０．３４　５　７．８モノＱ　１．５　１．１　 １．１　１．０６　１５　１．０スーパロース１２　１１　０．０？　０．４５ 　６．３０　９０’　０．４細胞１０ｇに５０ａ＋Ｍ酢酸ナトリウム緩衝ｅ５０ ａ＋Ｌを加え、細胞をフレンチプレスで破砕した。

実施例３ １ＥＪｉｉ　１−２　Ｔ’　−ｔ＋？；ニア’ｚｂ　−−二」四１Ｌ１至通１度 酵素活性を４０と１３０°Ｃとの間で測定した。使用した緩衝液は５０ｍＭ酢酸 ナトリウム（ｐＨ５，５）であった、酵素のアッセイは、５および１５分間行っ た。結果は図１に示す。

酵素は、４０から１３０°Ｃを越える温度範囲でプルラナーゼ活性を有し、至適 温度は８５〜１１５°Ｃ１より具体的には１００〜１１０°Ｃの範囲を示す。

１」１徂 酵素活性をｐＨ３，５と８．０との間で測定した。使用した緩衝液には、それぞ れ５０５Ｍの酢酸カリウム、リン酸カリウムおよびトリスを含めた。アッセイは ９５°Ｃで５および１５分間行った。結果は図２に示す。

これらの酵素は、ｐＨ３，５から８を越えるｐｉ範囲でプルラン分解活性を有し 、ｐＨ５〜７に、より具体的にはｐＨ５，５〜６．５に至適ｐＨを示した。ｐＨ ８では、約５５％のプルラン分解活性が測定可能である。

竺支主ユ これらの酵素を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，５）中、基質と金属 イオンを加えることなくインキュベージジンした。１００℃で６時間インキュベ ーション後、酵素活性の低下は観察されなかった。

１００°Ｃで１２時間、２４時間後および４８時間後に、それぞれ酵素活性の約 ９１％、６５％および３５％が測定された。１１０℃で２０分後に酵素活性の４ ４％が測定され、１時間後に酵素活性の１０％が測定された。１２０°Ｃで５分 後に酵素活性の１０％が測定された。結果は図３に示す。

基１称異立 １．３Ｕ／ｍＬのプルラナーゼ調製物の存在下で、５０ｓ＋Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ ６，０）　中１％（Ｗ／Ｖ）基質をインキュベーションした。インキュベージジ ンは１００″Ｃで行った。５００μＬの試料を採取し、イオン交換体（Ｓｅｒｄ ｏｌｉｔ　ＭＢ）で処理し、次いでＨＰＬＣ（炭水化物用カラムＡｍ１ｎｅｘ　 ＨＰＸ−４２Ａ）で分析した。

プルランはエンド型で加水分解され、ＤＰ３．ＤＰ６およびＤＰ９を形成する。

１時間後８０％のＤＰ３が生成した。ＤＰ３がマルトトリオースであることを同 定する目的で、酵母由来のα−グルコシダーゼと共にＤＰ３をインキュベーショ ンした。ＤＰ３は、完全にグルコースに転化した。したがって、プルラナーゼの 作用によりマルトトリオースが生したことは明らかである。デキストランはこの 酵素系により作用を受けない。

Ｇ２　Ｇ２−β−サイクロデキストリン（Ｎｏｖｏ　Ｎｏｒｄｉｓｋ　Ａ／Ｓよ り入手）は作用を受けた６マルトースが高濃度で形成された。

１．６−結合を含む最も小さい基質を見い出す目的で、部分精製プルラナーゼを パノースと共にインキュベージジンした。興味深いことに、既知の微生物由来の プルラナーゼと異なり、速度は遅いとはいえ、パノースも作用を受けた。この加 水分解生成物はＤＰＩとＤＰ２であった。ＤＰ２はＴＬＣによりマルトースと同 定された。したがって、パノースのα−１，６−結合も本発明の酵素により加水 分解される。

これらの基質に加え、本発明のプルラナーゼは、α−アミラーゼと澱粉のインキ ュベーションにより実験室的に調製された分枝オリゴ糖も攻撃できた。次に、形 成した分枝オリゴ垢をＢｌｏ−Ｇｅ１カラムで分離した０分枝オリゴ垢の８０％ 以上がＤＰ５以下に分解されていた。

実施例４ ピロコツカス・ボイセイ　のプルラナーゼ゛　−のクローニングピｔｌ１７カス ・ポイセイの染色体ＤＮＡを、Ｐｉｔｃｈｅｒら、　（１９８９）　。

匡旦ユ匣−１−ルｃｒｏｂｉｏ１．．　８　、　１５１〜１５６　、に従い単離 し、次いで５ａｕ３Ａで部分消化した。Ｐ−ポイセイ　ＤＮＡ　１００μｇが、 ３７℃で１０分間５ａｕ３Ａの２０単位で消化された。消化反応は、フェノール ：クロロホルム抽出により停止し、次いでＤＮＡをエタノール沈殿させた。連結 反応は染色体ＤＮＡを使用して行った。すなわち、ｐｓＪ９３３（ＢａｍＨＩに より消化した、５．８ｋｂの最大の断片を単離した）を、１：３の割合で１０μ Ｌ当りＤＮＡ　４μｇを使用し、Ｔ４リガーゼ２単位を加えて４時間室温でイン キュベージジンを行った。（プラスミドｐｓＪ９３３は、ＮＣＩＭＢにＥ・コリ 　５Ｊ９８９株としてで寄託されており、プラスミドの遺伝子地図は図４に示さ れている）、連結したＤＮＡでＥ・コリＭＣ１００Ｏ株を形質転換し、クロラム フェニコール１０μｇ／ａ＋Ｌ含有の２％寒天を加えたルリア（Ｌｕｒｉａ）培 地に接種し、３７℃でインキュベージジンした。インキュベージジンの１６時間 後、プレート上に約１４，０００個のクロラムフェニコール耐性コロニーが観察 された。これらのコロニーヲ、２％寒天、６μｇ／■Ｌのクロラムフェニコール と０．１％の染色プルランを含む新たな１＆ｌのルリア培地にレプリカし、次い で１夜生育させた。（染色プルラン：プルラン（Ｈａｙａｓｈｉｂａ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　５０　ｇとＣ１ｂａｃｈｒｏｓ 　Ｒｏｔ　Ｂ（Ｃｉｂａ　Ｇｅｉｇｙ）　５　ｇとを０．５Ｍ　ＮａＯＨ５００ ｍＬ中で懸濁し、混合物を室温で１６時間一定に撹拌しながらインキュベージジ ンした。ｐＨは４　Ｎ　Ｈ１ＳＯ４で７．０に調節した。

その後遠心により染色プルランを回収し、このプルランを蒸留水で３度洗浄し、 次いで適当量の蒸留水中に懸濁させた）。

次に、これらのプレートを６０゛Ｃで４時間インキュベートしたところ、コロニ ーの１つの周囲に、染色プルランの分解によりハローが現われた。この最初の１ 組のルリア培地プレート上の対応するコロニーを、単離し、プラスミドの内容に ついて分析した。単離したコロニーＰＬ２１１８をルリア培地１０ｍＬ中で生育 し、Ｋｉｅｓｅｒら（Ｐｌａｓｍｉｄ　１２　：１９、１９８４）に記載される 方法でプラスミドを単離した。このプラスミドを制限７２ピングにより分析した ところ、約４．５ｋｂのピロコツカスＤＮＡのインサートが見られた。

実施例５ 旦ＪｉＪ 実施例４の菌株をボートン型（Ｐｏｒｔｏｎ　ｔｙｐｅ）の発酵槽２Ｌ中で培養 した（ｐＨは６．５〜７．０に維持し、温度は３７℃とし、通気は１．ＩＬＺ分 で、振盪は、１０００ｒｐ−であった）。

接種は、クロラムフェニコール６■ｇ／Ｌ含有ＬＢ寒天プレート上で３７°Ｃ１ 夜生育させた培養物を生理食塩溶液に再！％！濁して行った。採取は接種から５ ０時間目に行った。

培養は、下記培地組成物による回分発酵として行った。

グリセロール　６０　ｇ　／　Ｌ トリプトン（Ｂａｃｔｏ）　２７　ｇ　／　Ｌ酵母エキス（Ｂａｃｔｏ）　４　 ｇ　／　ＬＮａＣＩ　１．３　ｇ　／　Ｌ Ｋ！１ＩＰＯｎ　５．３　ｇ　／　Ｌ ＫＨｉＰＯｎ　’　１．３　ｇ　／　ＬＬＳＯａ　３．５　ｇ　／　Ｌ ＣａＣｌｔ　４２Ｈｚ０　１７ｍｇ／　ＬＭｇＳＯａ　・７ＨｘＯＯ，６７ｇ　 ／　ＬＭｉｋｒｏｓｏｙ”　２０ｍＬ／　Ｌ ブルロニフタ　１ｍＬ／Ｌ ｐＨを７．０にｍ節し、培地は発酵槽中で１２１℃、４０分間オートクレーブし た。

滅菌後、培地組成物１リットル当り５０−Ｌ中１５ｇのグルコースと６−ｇのク ロラムフェニコールを加えた。

”　Ｍｉｋｒｏｓｏｙ　： Ｇ／Ｌ Ｈａ３ｃｉｔｒａｔｅ　１０ Ｂｏｒａｘ　（ＮａｔＢｎＯｔ　Ｈ１０ＨｔＯ）　１．０Ｍｎ５Ｏａ　・ＨｔＯ Ｏ，５ ＰｌＩＳＯ４・７ＨｚＯ２，０ ＣｕＳＯａ　・５ＨｚＯＯ，２ ＢａＣ１ｇ　・２）１ｔｏ　０．１ 実施例６ １１Ｍ 実施例５に従って調製して得られた培養プロスを、５ｅｒｖａｌｌ　ＲＣ−３Ｂ 遠心分離機による４０００ｒｐ＊／５ｅｒｖａｌｌ　Ｈ６０００＾で３０分間遠 心した。

ペレットを５０１１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，０）に培養物が最終容量の１０％ となるように再懸濁した。リゾチームを最終濃度２ｇ／Ｌまで加え、４０℃で１ 時間インキュベーションし、次いでＵｌｔｒａｔｏｒｒａｘ／１ｙｐｅ　ＴＰ１ ８／１０　；　１８Ｎ　；　１７０Ｗを懸濁液中に入れ３分間処理した。

次いで、懸濁液を１時間無溝させ、５ｅｒｖａｌｌ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機で４ ℃３０分間、９０００ｒｐｍ／５ｓｒｖａｌｌ　ＧＳ３で遠心分離した。

上澄のプルラナーゼ活性は、室温でのＤＤＳ／ＧＲ８１ＰＰ膜による限外濾過で ２．８倍に濃縮された（限外濾過前に５ｍＭＮａＮ３を加えた）。

実施例７ 聾−決定 実施例６により調製されたプルラナーゼ試料を、至適ｐＨ１至適温度、熱安定性 および基質特異性に関して、プルラナーゼ活性の特性決定に供した。

玉！！且立 プルラナーゼ試料を下記のようにインキユベートした。

緩衝液：　５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ａｌｌ　５．０）　、最終濃度。

基　質＝２％ｗ　／　ｖプルラン、パノースまたは可溶性澱粉（Ｍｅｒｃｋ　） 、最終濃度。

温度：６０℃。

時　間：２４時間。

酵素反応の停止：０℃における警、冷。

ＴＬＣ分析から上記プルラナーゼは、プルランをほぼ完全にマルトトリオースに 分解し、パノースをほぼ完全にグルコースとマルトースに分解し、可溶性澱粉を 加水分解生成物として、ＤＰ＋およびそれ以上のすべてのグルコースオリゴマー 含むものに分解した。プルランの加水分解速度は著しく速い。

愁玉定性 ガラスアンプル中に封入した少量のプルラナーゼ試料を、１２１℃で１０．３０ もしくは９０分間、または１００°Ｃで３０分、１．　２、もしくは４時間イン キュベーションした後、急冷した。６０℃、ｐＨ５，０における残存プルラナー ゼ活性を実施例８に記載されるように測定した。

ブルー　−ゼ・　０ 至１匹 各種のインキュベーシッンｐＨ／Ｗｋ衝液を使用したこと以外、実施例日に記載 されるように６０゛Ｃでプルラナーゼ活性を測定した。

緩衝液； ｐＨ３，５〜５．５　：ｏ、ｏｓＭ酢酸ナトリウム（最終濃度）＝　（Ａ緩衝液 ）ｐＨ５，５〜？、５　：　０．０２５　Ｍクエン酸ナトリウム（Ｈａｓ）と０ ．０２５ＭにＨｚＰＯｎ　（最終濃度）　（ＣＰ緩衝液）インキュベーションｐ Ｈ３，５４，５５，５５，５６，５７，５緩衝液　Ａ　Ａ　Ａ　ＣＰ　ＣＰ　Ｃ Ｐ活性（％）　５　９１　１００　１００　６３　３工ｍ！ ａｌｌ　５．０におけるプルラナーゼ活性は、各種インキュベーション温度を使 用したこと以外、実施例８に記載されるように測定した。

インキュベーション温度（”Ｃ）　６０　７０　８０　９０　１００　１０５　 １２１活　性（％）　１８　３８　４１　５４　９８　１００　４８実施例８ ブルー　−ゼ　の ０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，０）中プルラン４％（ｗ／ｖ）１ｍＬを、０ °Ｃで希釈酵素液（プルラナーゼ試料が、ＮａｚＣ０３緩衝液添加後インキュベ ーション混合物ＩＬ中最大０．２ｇグルコース当量を生じるように希釈されてい る）に加えた。

インキュベーション混合物量１ａ＋Ｌを３０分間６０℃でインキュベーションし た。インキュベーション混合物量１ｍＬを３０分間０°Ｃでインキュベーション した。それぞれに、０．５Ｍ　ＮａｚＣ島緩衝波緩衝液１０．０）１．５ｄを加 え、次いで混合物を急冷した。

両試料中の還元糖の量をネルソン／ソモギ（Ｎｅｌｓｏｎ／Ｓｏ■ｏｇｏｉ）法 （Ｎｅｌｓｏｎ　Ｎ、（１９４４）、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　１５３．３ ７５〜８０、および３３υ！９」（λ１４−Ｍ、　（１９５２）、　Ｊ、Ｂｉｏ ｌ、Ｃｈｅｓ、、　１９５．１９〜２３）により測定した。ブライド値（０℃） を差し引いた後の活性は、次のように表される。

形成されたマイクロモルのグルコース当量骨×培養ブロスのＬ　（ＰＩ／Ｌ） 実施例９ 皿夏夾定 本発明のプルラナーゼの分子量は、ファーストゲルグレージエント（Ｐｈａｓｔ ｇｅｌ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ）　８−２５にファルマシアファーストシステム（Ｐ ｈａｒｓａｃｉａ　Ｐｈａｓｔ　５ｙｓｔｅ＋ｗ）ファイルＮｏ、１１０に従う ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより測定した６分子量９５，０００　（＋／−１０，０００ ）が測定された。

プルラナーゼとＭ１４−９５，０００バンドとの間の同定は、０．１％染色プル ランとゲルを重ね合わせ、４時間６０”Ｃでインキユベーションすることにより 行った。プルラナーゼ活性を有する唯一のバンドが検出されただけである。

ピロコツカス由来の口ＨＡゼインートが単に４．５ｋｂであるにすぎないので、 そのＤＮＡインサートはプルラナーゼの１種以上をコードしないようである。

活性（％） ＦＩＧ、１ 活性（％） ＦＩＧ、２ 活性（％） ＦＩＧ、３ 要約書 本発明は熱安定性酵素の分野に属する。より具体的には、本発明はピロコツカス （ｈ匹匹匹■）属に属する菌株から得ることのできる新規熱安定性プルラナーゼ 類およびこれらの酵素の製造方法に関する。また、本発明は同一種のプルラナー ゼ成分から実質的になるピロコツカス（ｈ匹並匹旦）属に属する菌株のゲノムに 由来するプルラナーゼをコードするＤＮＡの組換え法で生産されたプルラナーゼ 調製物にも関する。さらに本発明は汚染酵素活性を含まないプルラナーゼ成分の 高発現生産方法に関する。さらにまた、本発明は澱粉の転化、ならびに液化およ び／または糖化工程でのプルラナーゼの使用に関する。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年２月　（日

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ピロコッカス・ボイセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｅｓｅｉ）（ＤＳＭ 　Ｎｏ．３７７３）またはピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　 ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ＤＳＭ　Ｎｏ．３６３８）生来のプルラナーゼと同等また は部分的に同等の免疫化学特性を有することを特徴とするプルラナーゼ。
2. ２．（ａ）至適ｐＨがｐＨ５〜７の範囲内にあり、（ｂ）至適温度が８５〜Ｈ５ ℃の範囲内にあり、（ｃ）基質とカルシウムの存在下でインキュベーションした 後に測定される残存活性が、１００℃で４時間後に９０％を越え、そして１１０ ℃で２０分後に３０％を越える、 特性を有することを特徴とするプルラナーゼ。
3. ３．パノースに対してα−１，６−結合開裂活性を有する請求の範囲第２項のプ ルラナーゼ。
4. ４．ピロコッカス属に属する１菌株またはその突然変異体もしくは変種の１菌株 から得ることのできる請求の範囲第２項または第３項のいずれかのプルラナーゼ 。
5. ５．ピロコッカス・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ．３７７３）またはピロコッカス・ フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ．３６３８）から得ることのできる請求の範囲第４項 のプルラナーゼ。
6. ６．ピロコッカス属に属するプルラナーゼ生産菌株を、炭素源および窒素源なら びに無機塩類を含有する適当な栄養培地で培養する工程、次いで所望の酵素を回 収する工程、を含んでなる請求の範囲第１〜５項のいずれかのプルラナーゼの製 造方法。
7. ７．ピロコッカス属に属するプルラナーゼ生産菌株を、元素硫黄を含まず、そし て混濁しない栄養培地で培養し、かつＮ２／ＣＯ２またはＮ２を連続的に補給し ながら培養を行う請求の範囲第６項の方法。
8. ８．Ｐ・ボイセイ（Ｐ．ｗｏｅｓｅｉ）またはＰ・フリオサス（Ｐ．ｆｕｒｉｏ ｓｕｓ）の１菌株が培養される請求の範囲第６項または第７項のいずれかの方法 。
9. ９．Ｐ・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ．３７７３）またはＰ・フリオサス（ＤＳＭ　 Ｎｏ．３６３８）またはそれらの突然変異体もしくは変種が培養される請求の範 囲第８項の方法。
10. １０．ピロコッカス属に属する１菌株に由来するプルラナーゼをコードするＤＮ Ａで組換え的に生産された実質的同種のプルラナーゼ成分から実質的になるプル ラナーゼ調製物。
11. １１．ピロコッカス・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ．３７７３）またはピロコッカス ・フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ．３６３８）に由来するプルラナーゼと同等または 部分的に同等な免疫化学的特性を有する同種のプルラナーゼ成分から実質的にな るプルラナーゼ調製物。
12. １２．プルラナーゼ成分がタンパク質１ｍｇ当り少なくとも６Ｕ、好ましくはタ ンパク質１ｍｇ当り少なくとも２０Ｕのプルラン分解活性を有する請求の範囲第 １０項または第１１項のいずれかのプルラナーゼ調製物。
13. １３．みかけの分子量が９５ＫＤで、ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより測定した場合に、 実質的に均質なバンドを示し、かつ前記バンドがプルラン分解活性を有する請求 の範囲第１０〜１２項のいずれかのプルラナーゼ調製物。
14. １４．プルラナーゼ成分が、４．５〜６．０の範囲内の至適ｐＨ、８５〜１１５ ℃の範囲内の至適温度、ならびに１００℃で４時間後に６０％を越える残存活性 を有する請求の範囲第１０〜１３項のいずれかのプルラナーゼ調製物。
15. １５．プルランをマルトトリオースに、パノースをグルコースとマルトースに、 そして澱粉をＤＰ１以上の各種グルコースオリゴマーに分解できる請求の範囲第 １０〜１４項のいずれかのプルラナーゼ調製物。
16. １６．プルラナーゼ成分がピロコッカス属の１菌種、例えばＰ・ボイセイまたは Ｐ・フリオサスにより生産されうる請求の範囲第１０〜１５項のいずれかのプル ラナーゼ調製物。
17. １７．プルラナーゼ成分がＰ・ボイセイ（ＤＳＭ　Ｎｏ．３７７３）またはＰ・ フリオサス（ＤＳＭ　Ｎｏ．３６３８）により生産されうる請求の範囲第１６項 のプルラナーゼ調製物。
18. １８．請求の範囲第１０〜１７項のいずれかのプルラナーゼの高発現製造方法で あって、プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片を単離する工程、そのＤＮＡ断片 を適当なプラスミドベクターの適当な発現シグナルと組み合わせる工程、そのプ ラスミドベクターを自律複製プラスミドとして適当な宿主に導入するかまたは染 色体に組み込む工程、プルラナーゼを発現する条件下で前記宿主微生物を培養す る工程、次いで培養物からプルラナーゼを回収する工程、を含んでなる方法。
19. １９．宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ） またはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ ｕｓ）属もしくはストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する１ 菌株である請求の範囲第１８項の方法。
20. ２０．プラスミドがｐＢＲ３２２もしくはｐＡＣＹＣまたはそれらの誘導体であ り、そして宿主微生物がＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である請求の範囲第１８項の 方法。
21. ２１．プラスミドがｐＵＢ１１０，ｐＣ１９４またはｐＥ１９４であり、そして 宿主微生物がバチルス種である請求の範囲第１８項の方法。
22. ２２．宿主微生物がＢ・ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ・リケニホル ミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ・アミロリクエファシエンス（Ｂ ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）またはＢ・レンタス（Ｂ．ｌｅｎｔｕ ｓ）である請求の範囲第２１項の方法。
23. ２３．発酵プロスを煮沸することにより生来のタンパク質の変性を起こし、次い で発酵プロスの遠心によりすべての汚染酵素活性を除いた上澄からプルラナーゼ を回収する発現されたプルラナーゼの精製工程をさらに含む請求の範囲第１０項 の方法。
24. ２４．澱粉転化工程における請求の範囲第１〜５項のいずれかのプルラナーゼま たは請求の範囲第１０〜１７項のいずれかのプルラナーゼ調製物の使用。
25. ２５．澱粉をグルコースおよび／またはマルトース含有シロップに転化する方法 であって、請求の範囲第１〜５項のいずれかのプルラナーゼまたは請求の範囲第 １０〜１７項のいずれかのプルラナーゼ調製物と、グルコアミラーゼ、α−グル コシダーゼ、β−アミラーゼまたは他の糖化酵素から選ばれる１種以上の酵素と の存在下で澱粉加水分解物の糖化を行う工程を含んでなる方法。
26. ２６．糖化が４．０〜６．０のｐＨ範囲の６０〜８０℃の温度範囲で、乾物１ｇ 当り１〜１００μｇのプルラナーゼ用量で行われる請求の範囲第２５項の澱粉転 化方法。
27. ２７．澱粉をグルコースおよび／またはマルトース含有シロップに転化する方法 であって、請求の範囲第１〜５項のいずれかのプルラナーゼまたは請求の範囲第 １０〜１７項のいずれかのプルラナーゼ調製物の存在下で同時の液化／脱分枝化 を行い、次いでグルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−アミラーゼまたは 他の糖化酵素から選ばれる１種以上の酵素の（場合によってプルラナーゼも一緒 に）存在下で糖化を行う工程を含んでなる方法。
28. ２８．同時の液化／脱分枝化が乾物重量当り２５〜４５重量％の澱粉スラリーに 対して、４．０〜６．０のｐＨ範囲の９５〜１３０℃の温度範囲で、乾物１ｇ当 り１〜１００μｇのプルラナーゼ用量と乾物１ｇ当り１〜２０μｇの熱安定性α −アミラーゼ用量で行われる請求の範囲第２７項の澱粉の転化方法。