JPH05509092A - 血流からの生活性物質の改善された浄化を行う組成物 - Google Patents

血流からの生活性物質の改善された浄化を行う組成物

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JPH05509092A JP3512515A JP51251591A JPH05509092A JP H05509092 A JPH05509092 A JP H05509092A JP 3512515 A JP3512515 A JP 3512515A JP 51251591 A JP51251591 A JP 51251591A JP H05509092 A JPH05509092 A JP H05509092A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 を含んでなる医薬または診断組成物。
２、捕捉剤が血流から迅速に除去される剤である請求の範囲第１項の組成物。
３、捕捉剤が単一官能性であり、そしてリガンドまたはリガンド類縁体が前記捕 捉剤に結合しうるように変性されている請求の範囲第２項の組成物。
４、捕捉剤が単一官能性であり、そして生活性物質およびリガンドが実質的に同 一である請求の範囲第２項の組成物。
５、生活性物質が血流から迅速に除去される物質である請求の範囲第１項の組成 物。
６、捕捉剤が単一官能性であり、そして生活性物質が前記！′！ｌ捉剤に結合し うるように変性されているリガンドまたはリガンド類縁体と異なる請求の範囲第 ５項の組成物。
７、捕捉剤が二官能性であり、そして生活性物質がリガンドまたはりガント類縁 体と異なる請求の範囲第５項の組成物。
８、リガンドまたはリガンド類縁体が捕捉剤に結合しうるように変性されている 請求の範囲第７項の組成物。
９、捕捉剤が単一官能性であり、そして抗体もしくは細胞レセプター（特異的リ ガンド結合性レセプターを除く）または生活性物質に対する結合部位を含むそれ らの断片を含んでなる請求の範囲第２または４項の組成物。
１０、捕捉剤が単一官能性であり、そしてリガンドまたはりガント類縁体が抗体 （抗イデイオタイプ抗体を含む）、細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセ プターを除（）または前記捕捉剤に対する結合部位を含むそれらの断片を含むよ うに変性されているか、あるいはリガンドまたはリガンド類縁体が生活性物質ま たは前記捕捉剤に結合性のそれらの誘導体もしくは断片で変性されている請求の 範囲第３または６項の組成物。
１１、捕捉剤が二官能性であり、そして（ａ）２つの特異性を有する抗体、 （ｂ）抗体と、細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプターを除く）もし くは生活性物質に対する結合部位を含んでなるそれらの断片、−末鎖オリゴヌク レオチド、細胞間接着性分子または結合剤（例えば、ビオチン、アビジン、レク チンもしくは医薬）との抱合体、あるいは （Ｃ）細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプター以外）または生活性物 質に対する結合部位を含んでなるそれらの断片と、−末鎖オリゴヌクレオチド、 細胞間接着性分子または結合剤（例えば、ビオチン、アビジン、レクチンもしく は医薬）との抱合体を含んでなる請求の範囲第７項の組成物。
１２、リガンドまたはりガント類縁体が抗体、細胞レセプター（リガンド結合性 レセプターを除く）もしくは捕捉剤に対する結合部位を含むその断片、−末鎖オ リゴヌクレオチド、細胞間接着性分子または結合剤を含むように変性されており 、かつそれらの各々が生活性物質を結合しない捕捉剤部分と抱合体を形成できる 請求の範囲第１１項の組成物。
１３、前記剤が標識を提供されている請求の範囲第１〜１２項のいずれかの組成 物。
１４．標識が放射活性同位体、磁性粒子および常磁性原子からなる群より選ばれ る請求の範囲第１３環の組成物。
１５、細胞レセプターが肝臓のレセプター、＊ｔｉのレセプター、骨髄のレセプ ター、肺のレセプター、腎臓のレセプター、皮膚のレセプターまたは胎盤のレセ プターである請求の範囲第１〜１４項のいずれかの組成物。
１６、生活性物質が医薬（麻薬を包含する）、例えばジゴキシンもしくはモルフ インのようなアルカロイド、または抗うつ薬（三環式抗うつ薬を包含する）、ア セチルサリチル酸、パラハタモール、抗てんかん薬、β−レセプターブロッカ− １神経弛緩薬、交怒神経作用薬、トキシン（例えば、エキソトキシンもしくはエ ンドトキシン（ＬＰＳ）　）　、ヘビ毒、カビ毒（例えば、ムスカリン）、重金 属（例えば、鉛、カドミウム、水ｗ＆）のような無機路、アルカロイド（例えば 、ニコチン、スコポラミン、アトロピン）のような有機前、場合によって新生物 細胞上に存在する腫瘍に随伴する抗原、新生物細胞により生産される物質、活性 化白血球、活性化リンパ球、血漿細胞、細胞により生産される表面もしくは循環 性物質、抗体（特に、自己抗体）、血栓（もしくはその成分）または病原体（例 えば、ウィルス、細菌、糸状Ｗ）もしくはその成分（例えば、表面抗原）である 請求の範囲第１〜１５項のいずれかの組成物。
１７、リガンドまたはリガンド類縁体が成長因子、ペプチドもしくはポリペプチ ドホルモン、サイトカイン、解毒化トキシン、ビタミン、ステロイドホルモン、 中枢神経系に作用する物質、ヒアルウロン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンタ イプ■のＮ−末端ペプチド、マンノース末端化グリココンジュゲート、グリコシ ド（生活性物質に結合した）または組織プラスミノーゲンアクチベーターである 請求の範囲第１〜１６項のいずれかの組成物。
】８．血流から生活性物質の迅速な浄化を行う方法であって、それを必要とする 被検者に対し、 （ａ）生活性物質と、細胞レセプターに結合しうるリガンドまたはリガンド類縁 体とに結合性の捕捉剤の有効量を投与する工程、次いで適当な間隔後に、 （ｂ）細胞レセプターと前記捕捉剤とに結合性のリガンドまたはリガンド類縁体 の有効量を投与する工程、を含んでなる方法。
１９゜病的症状の迅速な生体内検出方法であって、（ａ）問題の病的症状に特有 の生活性物質を結合できる捕捉剤と、細胞レセプターに結合できるリガンドまた はリガンド類縁体との有効量を投与する工程、次いで適当な間隔後に、（ｂ）細 胞レセプターと、前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体の有 効量を投与することにより、血流から捕捉剤の迅速な浄化を行う工程、 を含んでなる方法。
２０、血流から生活性物質の迅速な浄化を行う医薬組成物の製造のための、生活 性物質と細胞レセプターに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体とに結合性 の捕捉剤の、細胞レセプターと前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガン ド類縁体との組み合わせ使用。
２１、血流から捕捉剤の迅速な浄化を行うことで問題の病的症状の迅速な検出を 行う診断組成物の製造のための、病的症状に特有な生活性物質と、細胞レセプタ ーに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体とを結合できる捕捉剤の、細胞レ セプターと前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体との組み合 わせ使用。
明細書 血流からの生活性物質の改善された浄化を行う組成物発明の分野 本発明は、被検者に投与された場合に、血流からの生活性物質の改善された浄化 を行いうる医薬または診断組成物に関する。さらに本発明は、診断または治療目 的でかかる改善された浄化を行う方法に関する。
発明の背景 抗体または抗体と診断上のもしくは治療上の活性物質の抱合体を使用して生物学 的に活性な物質、例えばトキシン（例えば、リポ多糖・例えばＳ、Ｓ、　？１ａ ｒｔｉｎｙら、Ｃｒ１ｔ、　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ、　１６．１９８８．６２９〜６ ３９ページ参照）を中和、または生体の特定症状の診断（例えば、Ｊ、Ｆ。
Ｃｈａｔａｌ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ　Ｉｓｓ ＋ｕｎｏｓｃｔｎｔｉｇｒａｐｈｙ＋　ＣＲＣＰｒｅｓｓ＋　Ｆｌｏｒｉｄａ、 　ＬＩＳＡ＋　１９９０）、または特定抗原を発現する細胞、例えば腫瘍細胞に 対して医薬を選択的に向けることは知られている（例えば、米国特許第４，３５ ７，２７３号、ヨーロッパ特許第３３６，４０５号または同２６９．１８８号明 細書参照）０診断目的でのこのような抗体の使用は、血流からの抗体（抱合体） の浄化または除去速度が適当な時間より一般的に遅すぎるので循環性の診断剤に 由来するバックグランド活性が高すぎて、問題となる症状の正確な診断ができな いとの短所を有する。当然なことに、このことは迅速な診断と処置を必要とする 急性症状の場合には特に欠点となる。同様に、抗体または抗体抱合体が、例えば 毒素または薬物の中和のような治療目的で投与される場合であって、その活性物 質の中和化が最適なものより劣るときには、血流から活性物質が有意に早く除去 されることが寛質的に有利であろう（これはリポ多糖に・ついて記載されている 、例えば、Ｌ、Ｓ、　Ｙｏｕｎｇら、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、１１ ．５ｕｐｐ１．７．１９８９＋Ｓ　１５６４〜Ｓ　１５７１ページまたはＢｊ、 　Ａｐｐｅｌｍｅｌｋら、Ｍｉｃｃｒｏｂ　ａｔｈｏ　ｅｎ旦、　１９８８．２ ５１〜２５７ページ参照）。
ヨーロッパ特許第３０８，２０８号明細書では、腫瘍または感染性病変から生じ るマーカーに結合できるように変性された抗体の抱合体の使用ならびに腫瘍およ び感染性病変の診断または処置の目的でグリコシド残基が肝細胞アシアログリコ プロティンレセプターに結合できることを示唆する。血流からの前記抱合体の浄 化は、同じレセプターへの結合により前記抱合体の結合を妨げる阻害剤の連続注 入により遅延する可能性がある。
ヨーロッパ特許第３０８，２０８号明細書で示唆されている向上した浄化を提供 する方法は、阻害剤の注入が停止されたときでさえも、それが影響を受けなくな るまで（すなわち、肝細胞がブロックされなくなるまで）に一定時間がかかる短 所を伴なう。このことが迅速な診断と処置が必須の緊急な症状で前記抱合体の使 用の適性を低下させる。さらに、数日以内の期間阻害剤の連続注入を受けるよう に抱合体が投与される患者にとって不便である（これは、特に腫瘍の診断および ／または処置の場合に該当する）。
本発明の目的は、血流からの生活性物質のより迅速な浄化を提供する改善された 組成物および方法を提供することにある。
発明の要約 したがって、本発明は、別個の容器に、（ａ）生活性物質と、細胞レセプターに 結合しうるリガンドまたはリガンド類縁体とを、結合しうる捕捉剤、ならびに（ ｂ）細胞レセプターと、前記捕捉剤に結合しうるリガンドまたはリガンド類縁体 、 を含んでなる医薬または診断組成物に間する。
本発明の文脈上、「捕捉剤」の語は、生活性物質に結合することにより問題の生 活性物質を極在化、中和および／または除去できるように作用する物質を表わす のに使用されている。「生活性物質」の語は、ヒトまたは動物の身体に生物学的 な機能を示すがもしくは生物学的な影響を及ぼすか、あるいは生物学的なプロセ ス（例えば、病理学的な進行であってもよい）に応してヒトまたは動物の身体で 形成されるか、あるいは生物学的なプロセスに応じて血流に放出されるいずれか の物質を表わすのに使用されている。「リガンド」の語は、事実上、特定の細胞 レセプターに結合しうる物質を表すのに使用されており、一方、「リガンド類縁 体」の語は、同じ細胞レセプターに同様に結合しうる物質を表わすのに使用され ている。リガンド類縁体は、問題の細胞レセプターへのもとのリガンドの結合能 を保持したそのリガンドの誘導体であることができる。
「細胞レセプター」の語は、リガンド結合性を有する細胞外ドメインを含む細胞 表面上に位置するレセプターを表わすのに使用されている。一定のレセプターは 、細胞膜中にレセプターを固定するトランスメンブランドメインとりガントの結 合に応答する細胞のシグナルを発生する細胞質ドメインを有する。さらに他のレ セプターは、それらの脂肪ＩＩにより細胞膜内に固定されている糖脂質である。
レセプター媒介性のエンドサイト−シスのプロセスでは、レセプターへのリガン ドの結合が細胞表面上を覆った穴にリガンドとレセプターの抱合体の取込みを誘 発する０次いで、これらは陥入してリソシームで覆われた溶解した小胞を形成し 、その後小胞の含有物は酵素転換される（１．Ｈ，Ｐａ５ｔ、ａｎおよびＭ、Ｃ ，Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。
ハｎ力±、す、　１９８１．２３９〜２５０ページ参照）、また、細胞質小胞は 、形質膜上の未被覆領域からも形成される（Ｂ、　Ａｌｂｅｒｔｓら、…ＬＭｏ ｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、　Ｇｅｒｌａｎｄ　Ｐ ｕｂｌ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＆　Ｌｏｎｄｏｎ＋　１９８３参照） 、さらに、食作用は特定のレセプターへの結合により誘発されうる（上記Ａｌｂ ｅｒｔｓら、参照）、シたがって、不溶性の免疫複合体は、ＩｇＧ−Ｆｃレセプ ターを介してタッパ−細胞に蓄積される（Ｂ、　５ｓｅｄｓｒｏｄ　ら、Ｂｉｏ ｃｈｅｗ、　Ｊ、　２６６、１９９０．３１３〜３２７ページ、Ｓ、Ｍ、　Ｖａ ｎ　ｄｅｒ　Ｌａａｎ−Ｋｌａｍｅｒら、５ｃａｎｄ、　Ｊ、　Ｉｎ＋ｍｕｎｏ １．２３＋　１９８６＋４４１〜４４７ページ参照）。
捕捉剤とリガンドまたはリガンド類縁体との間の結合は、リガンドまたはりガン ト類縁体を結合する手段として捕捉剤を提供するか、あるいは捕捉剤を結合する 手段としてリガンドまたはりガン１゛類縁体を提供することにより行うことがで きる。別法として、捕捉剤とリガンドまたはリガンド類縁体との間の結合は、捕 捉剤とリガンドまたはリガンド類縁体との双方を相補的に結合する手段を提供す ることにより行ってもよい。
別のａ様では、本発明は、血流からの生活性物質の迅速浄化を行う方法に関し、 この方法は、投与の必要な被検者へ、（ａ）生活性物質と、細胞レセプターに結 合しうるリガンドまたはリガンド類縁体とに結合しうる捕捉剤の有効量を投与す る工程、次いで適当な間隔をおいて、 （ｂ）細胞レセプターならびに前記捕捉剤に結合しうるリガンドまたはリガンド 類縁体の有効量を投与する工程、を含んでなる。
本発明の方法は、捕捉剤に次いで、リガンドまたはリガンド類縁体を投与する間 隔を、十分量の生活性物質と捕捉剤が結合するのに必要とみなされる時間に応じ て変えることができる利点を有する。
さらに、本発明の方法は、生活性物質が除去されるレセプター細胞に対して自由 度が高いので、通常、生活性物質が排泄される特定の器官（例えば、腎ＩＩ）へ の負荷を避けることができる。さらに、この処置を受ける患者はこの方法の適用 によりそれほど不便さを被らない。
各事例毎に、レセプター結合と細胞の取り込みを介して身体から生活性物質が除 去される必要がないことは注目に便する。むしろ細胞は、血流への生活性物質の 遅延放出をもたらす生活性物質の貯蔵器としても作用しうる。この方法では、排 泄器官（例えば、腎Ｎ）または普通の代謝器官（例えば、甲状腺）に対する急性 毒性が有意に低減できる。
さらに本発明は、病的症状の迅速な生体内検出方法に関する。この方法は、 （ａ）問題の病的症状に特有の生活性物質と、細胞レセプターに結合しうるリガ ンドまたはリガンド類縁体とに結合しうる捕捉剤の有効量を投与する工程５、次 いで適当な間隔をおいて（ｂ）細胞レセプターに結合しうるリガンドまたはリガ ンド＊縁体ならびに前記捕捉剤の有効量を投与して血流から捕捉剤の迅速な浄化 をもたらす工程、 を含んでなる。
捕捉剤を血流から除去し、た後、生活性物質に結合した捕捉剤の可視化は生体内 診断に適するいずれかの手段により行えばよい。この方法の利点は、捕捉剤の循 環に起因するバックグランド活性による妨害が短時間で実質的に除去されるので 、迅速処置を必要とする症状の診断にこの方法が特に有用である点にある。
米国特許第４．６２４，８４６号明細書は、腫瘍マーカーに対する放射能標識さ れた抗体を注入し、次いで、腫瘍によるその抗体の取り込みを可能にする適当な 期間後に、放射能標識された抗体に対する抗体を注入して２〜７２時間以内に循 環している放射能標識された抗体レベルを１０〜８５％まで低減する腫瘍の位置 確認方法を公表する。この浄化速度は、本発明の組成物により達成できる浄化速 度より遅いので、米国特許第４，６２４，８４６号明細書の方法は迅速診断にと ってはあまり通さない。
米国特許第４．６３４，５８６号明細書は、白血球表面分子及びＥＤＴＡまたは ｏｒｐａ＝導体でキレート化した放射性同位体と反応性の抗体抱合体を注入し、 次いで前記抱合体に対する抗体を注入して前記抱合体／抗体の複合体を細網内皮 系を介して除去することにより白血球の放射線画像形成方法を公表する。イヌの 研究では、前記抱合体の注入後に注入された多量の抗抱合体抗体が１５分内に９ ０％の抱合体の浄化をもたらしたと報告されている。しかし、イヌ血流からの除 去はいずれの速度においてもヒト血流からの除去より早いことに注目する必要が ある。さらに、その後に注入される抗抱合体抗体は前記抱合体と特異的に反応し ない場合には、放射性同位体を有する抗体の抱合体はそれが注入される種に対し て外来のものであらねばならないことを付言しておく、これは、本発明の組成物 と方法では起こらないので、好ましくない免疫反応の可能性を有意に低減し、捕 捉剤およびリガンドとしての物質をヒトへ利用可能（または人間性化）にする。
さらなる態様では、本発明は、生活性物質ならびに細胞レセプターに結合しうる リガンドまたはリガンド類縁体の結合性捕捉剤を細胞レセプターならびに前記捕 捉剤の結合性リガンドまたはりガント類縁体と組み合わせて、血流から生活性物 質の迅速な浄化を行う医薬組成物の製造への使用に関する。
またさらなる１！様では、本発明は、病的症状に特有の生活性物質ならびに細胞 レセプタ・−に結合しうるリガンドまたはリガンド類縁体の結合性捕捉剤を細胞 レセプターならびに前記捕捉剤の結合性リガンドまたはりガント類縁体と組み合 わせて、血流から捕捉剤の迅速な浄化することにより問題の病的症状の迅速検出 を行うための診断組成物の製造への使用に関する。
発明の詳細な開示 本発明の−の態様では、血流からの捕捉剤の迅速な浄化が意図される。これは、 特に、捕捉剤が生活性物質と結合したときに、血流中に残存する捕捉剤を迅速に 除去して過剰のバックグランド障害を避けることが実質的に有利である診断目的 に本発明の組成物が使用される事例である。
この態様では、捕捉剤は、いわゆる１種の物質にのみ結合しうる単一官能性であ ることができる０本発明の診断方法が実施可能であるには、リガンドまたはりガ ント類縁体が捕捉剤ならびにレセプターと結合しうるように変性されている必要 もある。また、生活性物質とりガントは実質的に同一である。後者の例では、循 環する場合には特定の細胞レセプターと結合するりガントとして作用しうる生活 性物質の投与、次いで捕捉剤の投与が血流から未結合捕捉剤の浄化をもたらす、 これとは異なり、捕捉剤は２種の物質（典型的には、生活性物質と別のリガンド またはリガンド類縁体）に結合しうろことを意味するものと解される二官能性で あることができる。また、捕捉剤が二官能性である場合には、リガンドが捕捉剤 と結合しうるように変性されていてもよい。
本発明の別のＬＱ樺では、血流からの生活性物質の迅速な浄化が意図される。こ れは、特に、本発明の組成物を、生活性物質のすべての活性を捕捉剤に対する結 合が中和しないか、または捕捉剤に対する結合の親和性が重要な内容物に対して 遊離の生活性物’ｉｔｓ度を低減するには十分でない処置目的で使用する例であ る。かかる例では、結合された生活性１１ｆｆ質の血流からの浄化が重要であろ う。
この！ｌ欅では、捕捉剤が単一官能性であることができ（上述のように）、この 場合には、リガンドまたはリガンド類縁体が捕捉剤および特定の細胞レセプター の双方に結合しうるように変性されている必要がある。生活性物質はリガンドま たはリガンド類縁体と異なっていてもよい、また、捕捉剤は二官能性であること もでき（上述のように）、この場合には、生活性物質とリガンドまたはリガンド 類縁体とは一般に異なる。また、捕捉剤が二官能性である場合には、リガンドが その捕捉剤と結合しうるように変性されていてもよい。
捕捉剤が単一官能性である場合、それは生活性物質と反応性の抗体または生活性 物質に対する結合部位を存する細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプタ ーを除（）もしくはその断片を含むことができる０次に、リガンドまたはりガン ト類縁体は、抗体（抗イデイオタイプ抗体を包含する）、細胞レセプター（特異 的リガンド結合性レセプターを除（）または捕捉剤に対する結合部位を包含する それらの断片を含むように変性されていてよく、あるいはリガンドまたはリガン ド類縁体は捕捉剤の結合性を有する生活性物質またはその誘導体もしくは断片で 変性されていてもよい。
本発明の文臘上、「抗体」の語は抗原にさらした応答としてヒトまたは動物の体 内で形成されるか、あるいはヒトまたは動物細胞により産生されるいずれかの物 質を表わす目的で使用されている。抗体はポリクローナル抗体もしくはモノクロ ーナル抗体であるか、または組換えＤＮＡ法によりＳｊｉ製されたものであって もよい、また、この術語は、Ｆａｂ　’　、　Ｆ（ａｂ’　）ｔまたはＦＶ断片 ならびに単一ドメイン抗体のような抗体断片も包含する。
モノクローナル抗体は、例えば、Ａ、　ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＦｌ、　Ｔｈ ｏｒｐｅ。
Ｉｗｓ＋ｕｎｏｃｈｅ紅ｓｔｒ　’ｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第２版（Ｂｌａｃｋ ｗｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）　＋　１９８７． ３５〜４３ページに記載されているように周知の方法により得ることができる。
１１換えＤＮＡ法により調製される場合には、抗体は抗体またはそれらの断片を コードするＤＮＡ配列を適当な細胞（例えば、微生物、植物、動物またはヒトの 細胞）へクローニングし、次いで問題の抗体または断片の生産を行う条件下で細 胞を培養した後、培養物から抗体またはその断片を回収することにより生産でき る。クローン化された抗体の調製を可能にする方法は、例えば、Ｌ、　Ｒ４ｅｃ ｈｉｗａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、　３３２．１９８８年３月２４日、３２３ペー ジ、（ラットの可変領域とヒトの不変領域のキメラ抗体の調製を記載する）　； 　Ｍ、　Ｂｅｔｔｅｒ　ら、５ｃｉｅｎｃｅ、　２４０．１９８８年５月２０日 、１０４１ページ（マウス−ヒトのキメラＦａｂ断片の調製を記載する）ＨＡ、 ５ｈａｒｒａおよびＡ、　Ｐｌ’＋；ｃｋｔｈｕｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４ ０．１９８８年５月２０日、１０３８〜１０４０ページ（抗原結合性可変ドメイ ンを含む免疫グロブリンＦν断片のクローニングを記載）；ならびにＥ、Ｓ、　 Ｈａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４１．１９８９年１０月１２日、５４４〜５４ ６ページ〔単離された抗原結合性可変ドメイン（単一ドメイン抗体）のクローニ ングを記載〕で検討されている。
「抗イデイオタイプ抗体」の語は、他の抗体のエピトープ結合部位と反応性の抗 体を意味する。抗イディオタ・ｆブ抗体は、上記方法のいずれかにより調製でき る。
リガンドまたはりガント類縁体が生活性物質で変性されている一定の事例では、 変性されたりガントの投与から生じる悪影響を受ける可能性を低減するように生 活性物質を変性することが必要なこともある。したがって、生活性物質が未変性 であるときにヒトや動物にとって毒性を示す場合には、それらの解毒性誘導体（ 例えば、それらの解毒性断片）の使用が適することがある。いずれの場合でも、 変性されたりガント分子の大きさを小さくするような生活性物質の断片を使用す ることが好ましい。
本発明の組成物の捕捉剤が二官能性である場合、それは２つの特異性を有する抗 体、すなわち２種の抗原またはエピトープと反応性の抗体からなるものが適する 。２つの特異性を有する抗体は、例えば、ハイブリッド抗体を形成するように、 異なる特異性の交差結合性抗体または抗体の反応性に応答しうる少なくとも１つ のエピトープ結合部位を含む抗体断片を、リガンドまたはりガント類縁体と抗体 の反応性に応答しうる少なくとも１つのエピトープ結合部位を含む他の抗体断片 とを組み合わせることにより化学的に合成できる（例えば、ヨーロッパ特許第１ ７９，８７２号明細書参照）、別法として、２つの特異性を有する抗体は、２種 以上のハイブリドーマ（例えば、ポリドーマ）を融合するか（例えば、オランダ 国特許第８６−１５４２号、ヨーロッパ特許第６８．７６３号もしくは同３３８ ．４９７号明細書参照）、または岨換えＤＮＡ法（例えば、Ｗ、Ｄ、　Ｈｕｓｅ ら、５ｃｉｅｎｃｅ＋　２４６．１９８９゜１２７５〜１２８１ページまたはＥ 、Ｓ、　Ｗａｒｄ　ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４ｊ、　１９８９．５４４〜５４６ ページ参照）により形成できる。
二官能性捕捉剤はまた、抗体と細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプタ ーを除（）の抱合体または生活性物質、−末鎖オリゴヌクレオチド、細胞間接着 性分子もしくは結合剤（例えば、ビオチン、アビジン、レクチンもしくは医薬） に対する結合部位を含んでなるそれらの断片、ある（は細胞レセプター（特定の りガント結合性レセプター以外）または生活性物質に対する結合部位を含んでな るその断片と一末鎖オリゴヌクレオチド、！ｉＩ胞間接着性分子もしくは結合剤 （例えば、ビオチン、アビジン、レクチンもしくは医薬）との抱合体、を含むこ とができる。
さらにこの場合には、リガンドまたはりガント類縁体は、抗体、らの各々は生活 性物質を結合しない捕捉剤部分と抱合体を形成しうる）を含むように変性されて いてもよい。
したがって、捕捉剤が一本鎖オリゴヌクレオチドを含む場合には、リガンドまた はりガント類縁体は、典型的には相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドで変性され うる。同様に、捕捉剤が細胞間接着性分子または結合剤を含む場合には、リガン ドまたはリガンド類縁体は、それぞれ細胞間接着性分子および結合剤（例えば、 捕捉剤がビオチンであるときにはアビジンまたはストレプトアビジン、捕捉剤が アビジンであるときにはビオチン、捕捉剤がレクチンであるときには炭水化物、 など）を結合しうる物質で変性されていることが普通である。適当なレクチン類 は、植物Ｒ（Ｈ，ＬｉｓおよびＮ、　５ｈａｒｏｎ、　Ａｎｎ。
Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅ請、　４２．１９７３＋　５４１〜５５１ページ参照） または哺乳類源（Ｂ、　Ｓｍｅｄｓｒｏｄ　ら、Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｊ、　瓢、 　１９９０．３１３〜３２７ページまたはＭａｇｎｕｓｓｏｒ＋　ら、Ｂｉｏｅ ｈｅｍ、　Ｊ、　２５７．１９８９．６５１〜６５６ページ参照）から誘導され うる。
診断目的では、捕捉剤は［ｍされていることが通する。捕捉剤を標識するのに使 用される物質は、例えば、Ｉｎ−１１１，丁ｃ−９９ｍ、　ｌ−１３１゜１−１ ２５またはｌ−１２３のような放射性同位体であることができる（米国特許第４ ゜３５７，２７３号、ヨーロッパ特許第３３６　、４０５号または同２６９．１ ８８号明細書参照）、また、捕捉剤は、磁気共鳴画像形成に利用できる物質で標 識されていてもよい、このような物質の例は、Ｓ、　Ｃｅｒｄａｎら、勧ｌ徂ｔ ｉｃ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１２．１９８９．１５１ 〜１６３ページに記載されるような抗体で被覆され、その後に画像形成に使用さ れる磁性粒子、あるいは常磁性原子（例えば、Ｃ１０もしくはガドリニウム）で ある（例えば、Ｊ、Ｃ，５ａｃｅａｖｉｎｉら、Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｒａｄｉｏ！ 、＋５ｕｐｐｌ、　１．１９８９．５２９２〜５２９３ページまたはＰ、５ｈｒ ｅｒｅおよび＾０Ｍ。
Ａ１５ｅｎ、　Ｍａ　ｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｎａｎｃｅ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ　３．１９８６＋　３３６〜３４０ページ参照）。
捕捉剤に結合後にリガンドまたはりガント類縁体が結合する細胞レセプターは、 体内に見られるいずれのレセプターであってもよいが、通常、体内の老廃物が除 去される器官（例えば、肝臓、膵臓、骨髄、肺、腎臓、皮膚または胎盤）に見ら れるレセプターが好ましい。
肝臓は体内のスキャベンジャ−として重要な機能を有する。（上記、Ｂ、　５ｓ ｅｄｓｒｏｄ　ら、参照）、肝臓では、内皮細胞とタッパ−細胞の集団が、それ ぞれナノ粒子および粒状物をはじめとする各種巨大分子の取り込みに応答できる 肝臓の細網内皮系を構成する（Ｅ、　Ｗｉｓｓｅら、　（４り、Ｃｅ１ｌｓ　ｏ ｆ　ｔｈｅ　Ｈｅ　ａｔｉｃ　５ｉｎｕｓｏｉｄ、　Ｖｏｌ　２＋　Ｔｈｅ　Ｋ ｕｐｆｆｅｒｃｅｌｌ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　［ｌｉｊｓｗｉｊｋ、　ｔｈ ＠Ｎｅｔｈ＠ｒｌａｎｄｓ、　１９８９、参照）、こプロペプチド）、マンノー ス／Ｎ−アセチルグルコサミン、補体、アシアログリコプロティンおよびＩｇＧ 　Ｆｃレセプターが挙げられる（上記、［１，５１１１Ｂｄｓｒｏｄら参照）、 これらのレセプターにリガンドが結合すると、リガンド−レセプター複合体を含 む小胞がリソソームと融合し、次いで分解されることでレセプター媒介性のエン ドサイト−シスが起こる。実質細胞へのトランスサイト−シスは、粒状物を分離 するタッパ−細胞の食作用に向けられるような別の可能性を有する（上記、Ｂ、 　５ａｅｄｓｒｏｄ　ら参照）、さらに適するレセプターは、組織プラスミノー ゲンアクチベーターに対する肝のレセプターである。
また、同一もしくは類似の細網内皮細胞は、肺臓、肺、骨髄または胎盤のような 別の器官に存在する可能性がある。これらの器官の細胞は、器官に特有の特定の レセプターを備えている可能性がある。
他のタイプのレセプターとしては、下記表Ｉに示されるペプチドもしくはポリペ プチドホルモンおよび成長因子に対するレセプターが挙げられる。
表１ 成長因子（上皮増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インスリン欅増殖因 子、血小板由来増殖因子、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、 インターロイキン−２、コロニー刺激因子、Ｔ−インターフェロン、神経成長因 子、腫瘍壊死因子）に対するレセプター ペプチドホルモン（Ｔ３．Ｔ４、オキシトシン、ヒスタミン、パップレシン）に 対するレセプター ポリペプチドホルモン（成長ホルモン、インスリン、グルカゴン、甲状腺刺激ホ ルモン、黄体形成ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、側甲状腺ホルモン、プロラ クチン、リボトロピン、コレシストキニン、カルシトニン、セクレチン、心房性 ナトリウム利尿因子、エンドセリン、バソアクティブ・インテステイナル・ポリ ペプチド、トランスフェリン、タキキニン）に対するレセプター細胞間接着性因 子（細胞間接着性分子１−１内皮０血球接着性分子ｌ、血管細胞接着性分子１） 対応するりガントがこれらのレセプターに結合したとき、細胞内シグナルが応答 を起こす、このようなレセプターを生活性物質の除去に使用する場合には、レセ プターに対する生活性物質、捕捉剤およびリガンドの抱合体の結合が総体的に生 理学上の著しい影響を与えるような程度まで細胞内シグナルを生じさせないよう に注意する必要がある。
レセプターの他のグループは、生として疎水性リガンドを結合する細胞内に位置 するものである。このようなレセプターの具体例は下記表■に示される。
表■ ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ、レチノイン酸）に対するレセプター 脂肪酸誘導体（プロスタグランジンＢｌ、Ｄ２．Ｅｌ、Ｅ２．Ｆ２、ロイコトリ エン、トロンボキサンＢ２）に対するレセプターステロイドホルモン（テストス テロン、プロゲステロン、コルチゾル、エストラジオール、アルドステロン）に 対するレセプターレセプターの第三のグループは、神経系の細胞上に位置するも の、例えば、α−アドレナリン、β−アドレナリン、エピネフリン、アドレナリ ン、ドパミン、アヘン誘導体（例えば、モルフイン、エンケファリン、エンドル フィン）、アンギオテンシン、アデノシン、ベンゾジアゼピン、プラジキニン、 コリン、ムスカリン、コリン作動性ニコチン、ＧＡＢＡまたはセロトニンレセプ ターである。これらのレセプターは、ある場合には、それらが十分に豊富であっ て、血液脳関門により保護されていないとの条件の下、生活性物質の除去に使用 できる。さらに、この場合には、生理学的なレセプターの応答が身体に全体とし て著しい影響を及ぼさないことも重要である。
肺臓は細網内皮浄化系部分を形成し、それ自体は肝臓の類洞について上記したも のに類似の細胞を含む、しかし、肺臓はまた、肝臓のものと異なる特異なレセプ ターも含む、この一般的な浄化機能とは別に、！ｌＩＩ［ｌｌは老化した赤血球 を分離する。ｓｍ中に赤血球が保持されるためのシグナルは知られていない（Ｍ 、Ｒ，Ｃ１ａｒｋ、　Ｐｈ■ｔｏｌ。
むＬ−餞、　１９８８．５０３〜５５４ページ）が、しかしバンド３タンパク質 由来の老衰抗原がその抗原に対する自己抗体と一緒になって存在すると、例えば Ｆｃレセプターを介する分離を引き起こすシグナルとなる可能性があるＣＭ、Ｍ 、Ｂ、　Ｍａｙ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅ４　ＵＳＡ　８ １＋１９８４、５７５３〜・５７５７ページ）。
これらのレセプターと異なる他のレセプター、例えば、副腎皮質刺激ホルモン放 出因子レセプター、Ｆｃレセプター、心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター 、インターフェロンレセプター、サブスタンスＰレセプターおよびタキキニンレ セブターがＮｉｌに見い出されている。
腎臓に見い出されるレセプターとしては、アンギオテンシンレセブター、バンプ レシンレセプター、神経ペプチドレセプター、ブラジキニンレセプター、バソア クティブ・インテステイナル・ペプチドレセプター、エンドセリンレセプター、 プロスタグランジンＥ２レセプター、鉱質コルチコイドレセプター、α−アドレ ナリンレセプター、ドパミン−ルセブター、セロトニンレセプター、β−１イン テグリンレセブターまたはチアジン利尿藁レセプターが挙げられる０選択的排出 機構は、生活性物質、捕捉剤およびリガンドの抱合体の特定の腎臓レセプターへ の結合、細胞内分解または変性、次いでその後の分泌を伴う尿細管細胞への放出 からなる。
肺は、すべての器官の中で最大の血流を有するので、蒸発可能な物質の排出には よく適合する。この様式で生活性物質の浄化に適する可能性のある肺レセプター は、ヒスタミンレセプター、エンドセリンレセプター、β−アドレナリンレセプ ター、インターロイキン−ルセブター、インターフェロン−γレセプター、肺バ ソアクティブ・インテステイナル・ペプチドレセプター、ムスカリンレセプター 、アデノシンレセプター、サブスタンスＰレセプター、ベンゾジアゼピンレセプ ター、心房ペプチドレセプターまたはロイコトリエンレセプターである。
本発明の目的に利用できる骨髄レセプターの具体例は、ＦｃガンマＲ１，ＲＩＩ およびＲｍのＩ／セブター、インターロイギン１および２のレセプター、エリス ロポイエチンレセプター、トランスフェリンレセプター、ロイコトリエンレセプ ター、ベンゾジアゼピンレセプターまたはソマトスタチンレセプターである。
皮膚の非常に大きな表面積に起因し、それは損傷を受けることなく他の器官から 排出できない毒性成分を蓄積するのに特に適する標的である。蓄積された毒性成 分は、血流へ徐々に再循環されるか、または他の器官に損傷を起こさない程十分 少量の用量で他の器官（典型的には肝臓）を介して排出されうる。汗腺は、その 汗腺内に存在する適当なレセプターを介して直接排出する経路を提供する（例え ば、バソアクティブ・インテステイナル・ポリペプチド様レセプター、’ｐｉ、 　Ｋｕｍｍｅｒ　ら、Ｎｅｗｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔｔ、　Ｊｉｏ、　１９９０． ２３９〜２４３ページ参照）０本発明の目的に適する可能性のあるケラチノサイ トおよび皮膚線維芽細胞上のレセプター類の具体例は、低密度リポプロティンレ セプター、トランスフェリンレセプター、インターロイキン１および２のレセプ ター、ヒスタミンＨ１およびＲ２のレセプター、グリココルチコイドレセプター 、ビタミンＤレセプター、レチノイン酸もしくはレチノイン酸ガンマレセプター 、フィブロネクチンに対するインスリンレセプター、コラーゲンレセプターまた はラミニンレセプターである。
子宮内胎児の疾患の処置は、胎盤に多量に存在するレセプターの１つを利用する ことにより、本発明の浄化方法で実施できるものと信じられる。かかるレセプタ ーの具体例は、Ｆｃ−Ｔレセプター、ＬＤＬレセプター、ヘモベキシンレセプタ ー、トランスフェリンレセプター、α２−マクログロブリンレセプター、フェリ チンレセプター、インスリンレセプター、心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプ ター、プロゲステロンレセプター、エストロゲンレセプター、グリココルチコイ ドレセプター、カルシトニンレセプター、顆粒球コロニー刺激因子ルセブター、 アデノシンレセプター、β−アドレナリンレセプター、エンドセリンレセプター 、インターフェロン−γレセプター、上皮細胞増殖因子レセプター、インスリン 様増殖囚子レセプター、アヘン誘導体レセプターまたはトロンボキサンレセプタ ーである。
上記カテゴリーのレセプターは、また、リガンドまたはリガンド類縁体の変性に 使用できるか、あるいはそれらが上記のように捕捉剤の一部を形成できる。
したがって、適当なリガンドまたはリガンド類縁体は、成長因子、ペプチドもし くはポリペプチドホルモン、サイトカイン、解毒化トキシン、ビタミン、ステコ イドホルモンまたは中枢神経系に作用する物質、例えば上記に列挙したレセプタ ーのいずれか１つに結合しうる物質からなる群から選ばれる。他の可能なりガン トとしては、ヒアルウロナン（上記、Ｂ、　Ｓｍｅｄｓｒｏｄら、参照）、コン ドロイチンｇ＃（上記、Ｂ、　Ｓｍｅｄｓｒｏｄ　ら、参照）、コラーゲンタイ プ■のＮ−末端１０ペプチド（上記、８．　Ｓ曽ｅｄｓｒｏｄら、参照）、マン ノース末端化グリココンジュゲート（上記、Ｂ、５ａｅｄｓｒｏｄら、またはＢ 。
Ｓｍｅｄｓｒｏｄら、Ｔｈｒｏｓｂ、　Ｈａｅ＊ｏｓｔａｓ、　５９＋　１９８ ８＋　４８０〜４８４ページ参照）、捕捉剤に結合しうる生活性物質に結合され たグリコシド（肝細胞のアシアログリコプロティンレセプターに結合するグリコ シド）または組織プラスミノーゲンアクチベーターを挙げることができる。
特殊の場合には、特定のレセプターと結合しないが、特定の器官に結合する物質 （例えば、腎臓に見られるアプロチニン）をリガンドとして使用することも予期 されている。
本発明の方法により検出または除去されうる生活性物質は、医薬（麻薬を包含す る）、例えばジゴキシンもしくはモルフインのようなアルカロイド、または抗う つ薬（三環式抗うつ薬を包含する）、アセチルサリチリ酸、パラセタモール、抗 てんかん薬、β−レセプターブロッカ−１神経弛緩薬、交感神経作用薬、毒素（ 例えば、工牛ソトヰシンもしくはエンドトキシン（ＬＰＳ））　、ヘビ毒、カビ 毒（例えば、ムスカリン）、重金属（例えば、鉛、カドミ、水１！りのような無 機毒物、アルカロイド（例えば、ニコチン、スコポラミン、アトロピン）のよう な有機毒物、場合によって新生物細胞上に存在する腫瘍に随伴する抗原、活性化 白血球、活性化リンパ球、血漿細胞、細胞により産生される表面もしくは循環性 物質、抗体、特に自己抗体、血栓（もしくはその成分）または病原体（例えば、 ウィルス、細菌、糸状菌）もしくはそれらの成分（例えば、表面抗原）であるこ とができる。
特定の！！様の記述 ■、血管系血栓の検出 ヒトフィブリンのβ鎖の最初の７個のアミノ酸に特異的な抗体を注入することに より血管系血栓を迅速に検出できる。これらのアミノ酸は、抗体がフィブリン（ フィブリノーゲンでない）と反応することを妨げるフィブリノーゲンにさらされ ていない（に、Ｙ、　ｆＩｕｙら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２．１９８３．１１２ ９〜１１３２ページ参照）。
より具体的には、フィブリン特異性抗体は、上記Ｈａｙらに記載される方法で調 製され、次いで実画的にはＨｎａｔｏｗｉｃｈ＋　Ｊ、　ｌ５ｓｕｎ、　Ｍｅｔ ｈ、　６５．１９８３．１４７〜１５７ページに記載されるように１１１■、で 標識される。この抗体の注入により血流中に存在するいずれかのフィブリン（例 えば、深窪の血栓もしくは肺塞栓）が抗体により標識される０次いで、′約１時 間後、上記フィブリンβ鎖へブタペプチドと結合された２〜ｌＯ倍過剰モルの組 織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）が注入される。これがｔ−ＰＡ の肝レセプターへの結合に起因して肝臓を通過する血液中の標識された抗体のバ ックグランド活性の迅速な除去をもたらすので、有意な程度まで標識された抗体 の標的−血液比率を改善する。
■、血管系血栓の診断 ｔ−ＰＡと、さらにフィブリンβ鎖へブタペプチドと反応性の２つの特異性を有 する抗体を注入して、バックグランド活性が未変性ｔ１．ＰＡにより除去される 以外は上記の方法と同様に血管系血栓の診断もできるや より具体的には、フィブリンβ鎖へブタペプチドと反応性のモノクローナル抗体 は上記Ｂｕｙらに記載されるように調製される。ヒトｔ−ＰＡに反応性のモノク ローナル抗体は、ＤＫ４０８２／８９に記載されるように調製される。２つの特 異性を有する免疫反応性抗体は、ヨーロッパ特許第１７９．８７２号明細書に記 載される方法による２つのモノクロ−カル抗体から調製され、次いでＨｎａｔｏ ｗｉｃｈ、　Ｊ、■ｌｌ５ｕｎ、　Ｍｅｔｈ。
ｆｉｇ、　１９８３．１４７〜１．５７ページに実質的に記載されるようにｌ１ ｌｉｎでＩａ！Ｊｌされる。
２つの特異性を有する抗体の注入により、血流中に存在するいずれかのフィブリ ン（例えば、深窪の血栓もしくは肺塞栓）がその抗体により標識される０次いで 、約１時間後、２〜１０倍モル過剰の未変性ｔ−ＰＡ　（Ａｃｔｉｌｙｓｅ　（ 商標）　、Ｂｏｅｈｒｔｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｓより入手可）が注入され る。これがｔ、、ＰＡの肝レセプターへの結合に起因する肝臓を通過する面液中 の標識された抗体のバックグランド活性の迅速な除去をもたらすので、存意な程 度まで標識された抗体の標的−血液比率を改善する。
■、腫瘍の位置確認 放射能標識された抗体による腫瘍の位置ｆＩ認方法は、確立された技法である（ 例えば、Ｃｈａｔａｌ、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｉｎ Ｉｍｗｕ　ｏｓｃｉｎｔｉ　ｒ　ｈ　、　ＣＲＣ，Ｆｌｏｒｉｄａ、　１９８９ 、参照）、診断の高い感度を得るには、抗体のバックグランド活性を低減（すな わち、高い標的−血液比率を達成）することが重要である。したがって、この方 法では循環している標識された腫瘍のレベルが自然除去により低減されるまで腫 瘍の検出が遅らされてきた。標識された抗体の浄化は、腫瘍特異性抗原とｔ−Ｐ Ａとに反応性の２つの特異性を有する抗体の注入、次いでその抗体が腫瘍に結合 した後のｔ−ＰＡの注入により促進できる。
より具体的には、ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に反応性のモノクローナル抗体は 、標準的な方法（Ｊ、Ｐ、　Ｍａｃｈら、Ｉ＋ｎ＋ｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　２゜ １９８１、２３９〜２４２ページ参照）に準じて調製される。ヒトｔ−ＰＡに反 応性のモノクローナル抗体は、Ｄに４０８２／８９に記載されるように調製され た。２つの特異性を有する免疫反応性抗体は、上記２種のモノクローナル抗体か らヨーロッパ特許第１７９，８７２号明細書に記載される方法により調製される 。この２つの特異性を有する抗体は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ、　Ｊ、　Ｉｍ＋ｉｕ ｎ、　Ｍｅｔｈ、　６５．１９８３．１４７〜１５７ページに実質的に記載され るように１１１１ｎで標識される。
次に、標識された２つの特異性を有する抗体を大腸癌にかかった患者に注射して 約３０分間循環させ、次いで２〜１０モル過剰のヒトｔ−ＰＡ　（Ａｃｔｉｌｙ ｓｅ　（商標）　、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｓｉ−から入手可）の 注射を行った。これがシンチグラム上で腫瘍が明瞭に目視されるレベルまで血流 から標識された抗体の迅速除去をもたらす（放射能標識された抗−ＣＥＡ抗体を 用いる試験により測定される場合には、もとのレベルの約ｌＯ〜２５％下履わる レベル）。
■、ジゴキシン中毒の処置 中毒をもたらすジゴキシンの過剰投与は、現在のところその薬剤に有効な解毒薬 が存在１〜ないので、深刻な臨床上の問題を提起する。
ジゴキシンに特異的な抗体の非経口投与は、その遊Ｍ薬剤濃度を低減する目的に ついてずでに示唆されている。（例えば、Ｄ、Ｈ，Ｓｍ１ｔｈおよびＶ、Ｐ、　 Ｂｕｔｌｅｒ、　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ　５０．１９７１．１７３８ 〜１７４４ベージ；　Ｈ，Ｃ１ａｒｋｅおよびＥ、Ａ、　Ｒａ５ｉｏｓｋａ、　 Ａｓ、Ｊ、Ｅ閣ｅｒｊ、　Ｍｅｄ、旦（５）。
１９８８、４６５−４７０ページ参照）。これらの処置の臨床上の効能は変動し ている（Ｓ、Ｓ、　Ｍａｒｔｉｎｙら、Ｇｒｉｔ、　Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ、　１６ （６）、　１９８８．６２９〜６３５ページ）、この処置の主な短所は、抗体の 注入後の相当時間、生命を維持するジゴキシン処理が開始できない可能性がある ことである。
循環ｔ７ている抗体−ジゴキシン複合体のより有効な除去は、血流中の遊離のジ ゴキシン濃度を迅速に低減することであると考えられる。このような除去は、ま ず、中４にがかった患者の血流中ヘジゴキシンとｔ−ＰＡ２″に反応性の２つの 特異性を有する抗体を投与することに３４、り行われる。約１０〜３０分後に、 抗体の２〜１０倍モル過剰のｔ−ＰＡを注射する。次に、ジゴキシン、抗体およ びｔ−ＰＡの複合体（ならびに抗体とｔ−、、ＰＡ！よジゴキシンに結合しない ）を肝臓のｔ−ＰＡレイごブタ−に結合させ（１１，Ｃ，１ｉｉｊｋｅｎ　ら、 Ｔｈｒｏｈｈ、　Ｒｅｓ、、　５７．５ｕｐｐｌ。１０゜１９９０６３〜７１ペ ージ参照）ると、それらから排出される。
より具体的ムニは、ヒトｔ、−ＰＡに反応性のネズミモノクローナル抗体がＩ） Ｋ４０８２／８９に記載される方法により調製される。ジゴキシンに対するポリ クロ−ナル抗体は、上記［＋、＋１．５ｓｉｔｌ＋およびＶ、Ｐ、　Ｂｕｔｌｅ ｒ　＆７より記載さイ１４るよっに調製される。２つの特異性を有する免疫反応 性抗体は、上記２種の抗体からヨーロッパ特許第１７９．８７２号明細奮に記載 される方法により調製される。
本発明の方法の治療効果を試験するために、５日間治療用量のジゴキシン（ＮＥ Ｎ、　ＤｕＰｏｎｔ）で４羽のウサギを処置し、その後それらを３Ｈ−標識され たジゴキシ’／　（ＮＥＮ、　ＤｕＰｏｎｔ）の過剰用量の投与により中毒を起 こさゼた。６時間後、ウサギの２羽を抗−ジゴキシン抗体だけで処置し、一方、 他の２羽のウサギを等価な用量の２つの特異性を有する抗体を投与し、次いで、 約３０分後に２〜１０モル過剰のｔ−ＰＡ　（例えば、Ａｃｔｉｌｙｓｅ　（商 標）　、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｓより入手可）を投与した。
処置からしばらくして各ウサギの群から採取された血漿試料の放射能力ウトを比 較したところ、２つの特異性を有する抗体で処置し、次いでｔ−ＰＡを注射した ウサギのジゴキシン含量は著しい低減を示すことが期待される。
■、血流からのＬＰＳの除去 エンドトキシン（ｉ、ＰＳ）は、グラムネガ敗血症の病原体の重要な部分として 作用する（丁、Ｂ、　Ｃａ５ａｌｅ　ら、Ｊ、　Ａ１１ｅｒ　Ｃ１１ｒ＋、　ｌ ｍ５ｉｕｎｏｌ。
１１５、１９９０．４５〜５１ページ参照）、成功の程度は異なるが、ポリクロ ーナルまたはモノクロ−＝ｔル抗−ＬＰＳ抗体の投与にょるＬＰＳの中和ば既に 試みられている（Ｌ、Ｓ、　Ｙｏｕｎｇら、Ｒｅｖ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ 、　１１．５ｕｐｐｌ。
７、１９８９．５１５６４〜５１５７１ベージ；　Ｂ、Ｊ、　Ａｐｐｅｌｍｅｌ ｋら、Ｍｉｅｒｏｂ。
ハ」超並互、　１９８８．２５１〜２５７ページ参照）、この方法の主要な障害 は、殆どの抗−ＬＰＳ抗体が＋、ｐｓ毒性を保護しないことにある。肝臓による １、ｐｓの除去が、ＬＰＳとｔ−ＦＡとに反応性の２つの特異性を有する抗体の 投与、次いで適当量のｔ−ＰＡの投与により増大することが期待される。
より具体的には、１．Ｐｓに反応性のモノクローナル抗体は、標準的な方法に準 じて調製される（Ｍ、Ｎ、　Ｎｙｓら、Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１６ ２゜１９９０、１０８９〜１０９５ページ参照）、ヒトｔ−ＰＡに反応性のモノ クローナル抗体は、ＤＫ４０８２／８９に記載されるように調製された。２つの 特異性を有する免疫反応性抗体は、上記２種のモノクローナル抗体からヨーロッ パ特許第１７９．８７２号明細書に記載される方法により謂製される５、次に、 この２つの％異性を有する抗体Ｖ、敗血症患者（こ注射され、ｉ’Ｊ３Ｏ〜６０ 分間循！８れ存在するエンドトキシンの殆どと結合させ、次いでヒｔ□　ｔ、− ＰＡ　（Ａｅｔｔｌｙｓｓ　（商標）　、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈ ｓｉａ＋より入手可）の２〜１０倍過剰モルが注射される。こうして、ＬＳＰ／ 抗体／ｌ、−１’Ａ複合体の血流からのより迅速な除去がもたらされる。
図面の簡単な説明 図１は、続いてｔ−ＰＡ注入を行った場合と行わなかった場合のＩｎ−１１１標 識抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）の血漿における総放射能活性を示 すグラフである。
図２は、続いてｔ−ＰＡ注入を行った場合と行わなかった場合のＩｎ−１１１標 識抗ｔ−ＰＡ　ＭｏＡｂの免疫活性部を示すグラフである。
図３は、Ｉｎ−１１１標識抗ｔ−ＰＡ　ＭｏＡｂ単独とそのｔ−ＰＡとの複合体 のウサギにおける器官分布を示すシンチグラムである。
図４は、ｔ−ＰＡ注入前後におけるＩｎ−１１１標識抗ｔ−ＰＡのヒト血漿の総 放射能活性を示すグラフである。
図５は、ｔ−ＰＡ注入後のＩｎ−１１１標識抗し−ＰＡ　ＭｏＡｂのヒト器官に おける分布変化を示すグラフである。
図６は、右脚の血管床におけるＩｎ−１１１標識抗ｔ−ＰＡの初期の増大した蓄 積を示す下腿領域（Ａ）とｔ−ＰＡ注入後に病巣の血栓部（右脚の上部）を明ら かにする下ｌ１ｌｉ域（Ｂ）との２つのシンチグラムを示す。
図７は、２つの特異性ををする抗ｔ−ＰＡ／抗ウサギ抗体のゲル濾過を示すグラ フである。すべての百分は０Ｄｔｌｌ１１で試験し、そしてｔ−ＰＡ活性は酵素 イムノアッセイ（ＥＩＡ）で試験した。すべての両分は、ＥＩＡ系で試験する前 に１　：　２５０００希釈した。
図８は、ｔ−ＰＡの注入を行った場合（口で示す）と行わなかった場合（Δで示 す）のウサギ血漿中の２・つの特質性を存する抗ｔ−ｐｆＩ、’抗ウサギ抗体の 濃度（ＥＩＡで測定）を示すグラフである６図９は、ｔ−ＰＡの注入を行った場 合（口で示す）と行わなかった場合（Δで示す）のビオチン化された２・つの特 異性を有する抗ｔ、−ＰＡ／抗つザギ抗体の総量（ＥＩＡで測定）を示すグラフ である。
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、特許請求に係る本発明の 範囲をいずれかの態様に限定することを意図するものでない。
実１１１１ 単一官能性捕捉剤 （ａ）ｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の生産辷ハ五１ｑ葺Ｉ マウスの免疫感作に使用するｔ−ＰＡは、Ｒｉｊｋｅｎ、　Ｄ、Ｃ，およびＣｏ １１ｅｎ。
Ｄ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５６．　Ｌ９８１．７０３５〜４１ ページに記載されるように精製された。銀染色ＳＯＳポリアクリルアミドゲル電 気泳動により測定したところ、精製物は９５％を越える純度のｔ−ＰＡを含んで いた。
ｔ−ＰＡによるＡＫＲマウスの　格 上記のようにＬ７で得た精製ｔ−ＰＡを、０．０１％（ｖ／ｖ）　Ｔｗｅｅｎ８ ０含有の０．１５Ｍ　ＮａＣ１に対して透析し、次いで濃度を１０Ｍｇ／ｍＬに 調節した。
ＯＲマウスを２適間隔で３度免疫感作した。初めの２回の免疫感作では、フロイ ント不完全アジュバント５０ｔｌＬ（マウス１匹当りｔ−ＰＡ５μｇに相当）で 乳化したｔ−ＰＡ　５０μＬを各マウスに皮下注射した。最後の免疫を作は、皮 下でな（腹腔内に供給したこと以外、初めの２回と同じであった。２箇月後、フ ロインドアジュバントを含めていないｔ−ＰＡ　９０μＬの静脈内ブースター注 入をマウスに行った。
菫惣七毛１−ば出１１音！ 静脈内ｔ−ＰＡブースター後３日目に、肺臓を摘出し、肺臓を慎重に切開し、破 砕して肺臓細胞懸濁液を調製した。得られた膵臓細胞を、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｌ 、Ｃ，ら、　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ　５ヱ（２ ）、１９８７゜２０５〜２１１ページに記載されるように細胞融合に使用した。
機運すれば、膵臓細胞をポリエチレングリコール溶液の存在下でＸ６３−Ａｇ８ −　−６．５．３　ミエローマ細胞と融合させた。融合後、１０枚の９６９４ウ エルマ　ノイクロタイターセルプレートに接種した。生育２通後に抗原として　 １ｔ−ＰＡを使用するエンザイム・リンクド・イムノソルベント・ア・ンセイで ハイブリドーマの上澄をスクリーニングした。モノクローナル性を担保する目的 で陽性クローンを限界希釈法により数度再クローン化した０次に、この細胞系を ２％ＢＭＣ（Ｇｉｂｃｏ、　ＵＫ）を含むＲＰＭ１１６４０　（Ｇｉｂｃｏ、　 ＵＫ）を含むＲＰＭＩ　１６４０　（Ｇｉｂｃｏ、　ＵＫ）からなる培地のＮｔ ｌＮＣ由来の「セルフアクドリー（ｃｅｌｌ　ｆａｃｔｏｒｉｅｓ）　Ｊ中で大 規模に生成した。
モノクローナル　の　１ 上記ハイブリドーマ上澄液を濃縮した。　ｐＨを８．３に調節した後、４℃でプ ロティンＡのゲル上への咬着によりモノクローナル抗体を精製した。溶離は、ｐ Ｈ４，５のクエン酸緩衝液で行った。
Ｆ（ａｂ）フーグメントの 精製されたモノクローナル抗体（サブクラスＩｇＧ＋）を、３７℃の１６時間、 ｐＨ４，３０で酵素／基！（１：１００）のペプシンにより消化した。
固体トリス（Ｔｒｉｓ）で反応混合物のｐ［ＩをｐＨ８，５に調節することによ り反応を停止した。　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ　４４カラムにより未消化Ｉｇ Ｇと低分子生成物からＦ　（ａｂ）　ｔを分離した。抗体の精製、ペプシン消化 およびＦ　（ａｂ）　ｚの精製は、銀染色５Ｏ５−ゲルでモニターした。
インジウムによるＦ（ａｂ）の Ｈｎａｔｏｌｌｉｅｈ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　６５＋　１４ ７〜１５７ページ（１９８３）　）の方法に忠実に従って精製Ｆ　（ａｂ）　ｚ を標識した。抱合体の免疫活性は、抗原としてＬ−ＰＡを使用するイムノソルベ ント法によるＥＬＩＳＡで確認した。
標識された抗体の免疫化学的な純度は、ｔ−ＰＡを結合させたセファロース（Ｐ ｈａｒ■ａｃｉａ　ＡＢ、　Ｓｗｅｄｅｎ）カラムに結合しうる抗体の放射能活 性のパーセンテージとして測定された。抱合体の免疫化学的な純度は、一定の標 識された抗体が免疫学的に非反応性であったので、放射化学純度より低かった。
この抗体の免疫化学的な純度は９３％であった。
（ｂ）生物学的バックグランドの低減−動物実験辷ハ 実験に使用したｔ−ＰＡは、Ｂｏｅｈｒｔｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉ−から入 手したＡｃｔｉｌｙｓｅ　（商標）であった。
１豆肚貞 ２羽のウサギに抗体を用量／ｋｇで静注し、次いで比放射能活性を実施例２に記 載されるヒトの実験と比較した。ウサギ１は１−０分に抗体を投与した。その後 ｔ−ＰＡは投与しなかった。ウサギ２は、１−０分に抗体を投与した。ウサギ２ は、ｔ−１２０分に１分かけてｔ−ＰＡを静脈内投与した。　ｔ−ＰＡの投与量 は、投与された抗体の３倍モル濃度であった。
１１孟二 血液試料は、抗体投与後ｔ−０，１０，２０，４０および６０分、ならびに２， ４，６．１２および２４時間に採取した。ウサギ２では、さらなる試料をｔ−Ｐ Ａ投眸後５．１０．２０．４０および６０分に採取した。
各試料について全血漿性をカウントし、回帰分析〔フリーランス・ｙ′クラスバ ー　（Ｆｒｅｅｌａｉｉｃｅ　１ｉｉｕｓ　ｖｅｒ）　３．０１）によりこれら のデータタ指数曲陀ｒこち”ｒｌｌ、１：め、全生物学的半・滅期を計算した７ 示されるすべての曲線は、物理的崩＠について補正した。結果を図１に示す。
抗体のＴＩ／＊は１０．３時間であった。
ｔ−ＰＡ＄：ｔ、　＝　２時間に添加した場合、血漿活性の劇的な低下が観、察 された。１０分以内に９２％の低減がみられた。
血漿中の放射能標識された免疫反応性抗体の生物学的半減期は、ｔ−ＰＡ結合活 性の半ｉｊ！期と１７で測定された。結果を図２に示す。
ｔ−ＰＡの１．＝２￥ｆ間注入後１０分以内に、免疫反応性抗体の活性の９９％ より多くが血漿から除去された。この除去の半ｌｆ２期は１分である。
活性のわずかな増大（１，６％以下）が初期除去後の数時間内にみられた。この ことは、血管外抗体プールの再分配に起因することが明らかである。
金見Ω蛮五 ２４時間徒にウサギを殺した。ウサギの全身のシンチグラムを観察した。結果を 図３に示す、　ｔ−ＰＡと複合体を形成しない抗体は主として腎臓に位置するが 、ｔ−ＰＡと複合体を形成した抗体は殆ど肝臓だけにみられた。
これらの実験から、ｔ−ＰＡ／抗ｔ、−ＰＡ　ＭｏＡｂ複合体は抗ｔ−ＰＡ＊＠ よりも器官における半減期が相当短かいことが判明する。さらに、これらの実験 は、生体内で迅速なｔ−ｐ＾／抗ｔ−ＰＡ　ＭｏＡｂの浄化を行いうるごとを示 す、これらの実験の結果は、肝臓のｔ−Ｐ＾レセプターが抗体浄化における上記 増大の原因であることを示唆する。
総放射能活性の減衰は、抱合体が１００％免疫化学的に活性でない場合には、ｔ 、−ＰＡ結合放射能活性の低減より小さい。
２施舅（ 生物学的バンクグランドの低減−ヒトの実験右肩の顕著な水腫のため′１７１″ ′の婦人を入院さゼ・た。鮮鋭な゛７ントラストの静Ｎ図：・求、右肩の側下度 静脈の支・つに血栓の徴候を示１．．．．　ｆ：Ｔ、　、、実施例１に記載され るように調製された放射能梗膳（・、ツクローナル抗体を使用してシ〉′チグラ フイーを実施し５た。放射化？的純度は、わずか６７％であった。
放射能標識抗体の注入後１時間目にｔ、−ＰＡ　（Ａｃｔｉｌｙ！ｌｅ、　Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｏｒＩｎｇｅｌｈｓｉｓ）　５　ｍｇを注入した。
皇ｌ蛮二 ｔ−ＰＡ注人後、一定間隔で血液試料を採取した。各試料について、全血漿の放 射能活性を高性能ガンマ−カウンターでカウントし、時間に対してプロットした （図４）、指数回帰分析をフリーランス・プラス・バール３．０１で行った。初 期相のＴ、７８は４．８時間であった。
ｔ−ＰＡ注入後、血漿活性の実質的な低減がみられた。　１７分以内に５０％の 低減が観察された。
シンチグーフィー 生体分布 ｔ−ＰＡ注入を通じて肝臓と心ｌＩ領域の動的な獲得を１５秒優に連続する６０ フレームのガンマカメラにより行った。血液（心ｉ１ｔｉＭ）と肝臓の活性を算 出し、時間に対してプロットした。注入後の循環血流活性から肝臓までの分布シ フトを図５に示す。
血栓の検出 最初、下腿にうっ血の徴候がみられた。しかし、血栓の正確な位置は検出できな かった。ｔ−、ＰＡ注人後、膨張した血管床が縮小し、血栓領域が検出された（ 図６）。
生物学的バックグランドの減少が画像形成技法を向上させることを示し、数時間 以内に血栓の検出を可能にする。
天１に 官能性捕捉剤 （ａ）ｔ−ＰＡに対するモノクローナル抗体の生成堕五厘Ω舅Ｉ。
マウスの免疫感作に使用するｔ、−ＰＡは、Ｒｉｊｋｅｎ、　Ｄ、Ｃ，およびＣ ｏ１１ｅｎ。
Ｄ、、　Ｊ、　Ｂ’ｏ１．　Ｃｈｅｗ、　２５６．１９８１．７０３５〜４１ペ ージに記載されるように精製した。銀染色５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動により測定したところ、精製物は９５％を越える純度のｔ−ＰＡを含んでい た。
ｔ−ＰＡによるＩＩＲＦ則１眠とん悲灸交惠作上記のように得られた精製ｔ−Ｐ Ａを、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０を含有する０、１５Ｍ　ＮａＣ１ に対して透析し、濃度を１０Ｍｇ／ＩＩＬに！８１ＷＪ１．．た。
ミエローマ　７、の　− モノクローナル抗体の３Ｆ１の生成に使用するミエローマ細胞はアデノシンホス ホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＲＰＴ−）およびヒボキサンチンホスホリボ シルトランスフェラーゼ（ＨＲＰＴ−）の選択性酵素マーカー遺伝子座の失火す るＦＯＸ−ＮＹミエローマ系であった。このミエローマ細胞系は、「非生産性（ ｎｏｎ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）　Ｊ細胞系（すなわち、いずれの免疫グロブリン 鎖の分泌も合成もしない）、である。
勤予■１λ起Ｉ ＲＢ（８，１２）５Ｂｎｒローバートソン転座クロモシームを含有するＲＢＦ／ Ｄｎ株マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋　Ｂａｒ　Ｉ’１ａｒ ｂｏｒ＋　Ｍａｉｎｅ、　ＵＳＡ、から入手）を使用してモノクローナル抗体を 生産した。
主段Ｓ二Ｒス塁鳳金 ＲＢＦ１０ｎ株マウスを２週間おきに３度精製ヒトｔ−ＰＡで免疫感作した。
抗原はマウスの免疫感作前にフロイント不完全アジュバントで１：ｌに乳化した 。各マウスに各免疫感作で１０Ｍｇの抗原を合計容量２００μＬで投与した。最 後の免疫惑後１箇月目にヒトｔ−ＰＡ　１０Ｍｇでマウス１匹をブースター処理 した。さらに３日後、マウスを殺し、次いでミエローマ細胞との融合用に肺臓を 摘出した。
１匹のマウスに由来する牌ｍａｒ胞（１０，２Ｘ１０’細胞）　ＦＯＸ−ＮＹ細 胞系の２．５　Ｘ　１０’細胞と融合した。融合細胞を、アデニン（７，５Ｘ１ ０−’Ｍ）、ヒボキサンチン（８Ｘｌ０−’Ｍ）　、アミノプテリン（８Ｘ１０ −’合計１０枚の９６ウエルマイクロタイタープレート中のＢＡＩ、Ｂ／株マウ スマクロファージ支持細胞上に接種した。したがって、ＡＲＰＴ活性を要求する 培地への細胞融合混合物をさらすと、（ＡＲＰＴ”選抜）未融合ＡＲＰＴ−ハイ ブリドーマとが除去される。これが免疫グロブリン生産性バイブリドーマの向上 した安定性をもたらす（Ｒ，Ｔ、τａｇｇａｒｔおよび１．Ｍ、　Ｓａｍｌｏｆ ｆ　：　５ｃｉｅｎｃｅ　２１９（１９８３）、　１２２８〜１２３０ページ） 。
２週生育した後、ハイブリドーマ上の上澄を、抗原としてｔ−ＰＡを使用するエ ンザイム・リンクド・イムノソルベント・アッセイでスクリーニングした０次に 、細胞系を２％ＢＭＳ（Ｇｉｂｃｏ、　ＬＩＫ）とＲＰＭ１１６４０（Ｇｉｂｃ ｏ、　ＬＩＫ）からなる培地中でＮＵＮＣの「細胞ファトリー（ｃｅｌｌｆａｃ ｔｏｒｙ）　Ｊにより大規模生育した。
モノクロ−ル　の 上記ハイブリドーマ上澄液を濃縮した。ｐＨを８．３に調節した後、４℃でプロ ティンＡのゲル上への吸着によりモノクローナル抗体を精製した。溶離はｐＨ４ ，５のクエン酸緩衝液で行った。
Ｆ（ａｂ）フーグメン　の 精製されたモノクローナル抗体（サブクラスＩｇＧ＋）を、３７℃の１６時間、 ｐＨ４，１０で酵素／基質（１：１００）のペプシンにより消化した。
固体トリス（Ｔｒｉｓ　）で反応混合物のｐＨをｐＨ８，５に調節することによ り反応を停止した。プロティンＡカラムで未消化１ｇＧからＦ（ａｂ）ｚを分離 し、さらにＵｌｔｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ　４４カラムで精製した。抗体の精製、ペ プシン消化およびＦ　（ａｂ）　ｔの精製はクーマシー染色ｓＤｓゲルでモニタ ーした。
ウサギ　グロブリンのＵ ウサギ血清をｐ）１７．５に調節した後、４℃でウサギ免疫グロブリンをプロテ ィンＡゲル上への吸着により精製した。溶離は、Ｐｆ１３．５のクエン＃緩衝液 で行った。
ウサギＦａｂ）フーグメン　の ３７℃で１６時間、ｐｔ（４，５０の酵素／蟇賀（１：１００）において精製し たウサギ免疫グロブリンをペプシンで消化した０反応は、固体トリスで反応混合 物のｐＨ１ｐ８８．５に調節することにより停止した。二〇Ｆ（ａｂ）アをプロ ティンＡカラムにより未消化ＩｇＧから分離し、さらに旧ｔｒｏｇｅｌ　ＡＣＡ 　４４カラムで精製を行った。抗体の精製、ペプシン消化およびＦ　（ａｂ）　 ｚの精製は、クーマシー染色ＳＤＳゲルでモニターした。
−７１土免長ｊ痕Ｌｆ悲ｙ！す辷（九三止化−精製したウサギＦ　（ａｂ）オを 、ビオチニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンアミドエステル（ ｂｉｏｔｉｎ−ｘ−Ｎｌ５）（Ｃａｌｂｉｏｅｈｅｍ　２０３１８８）でビオチ ニル化した。使用直前にｂｉｏｔｉｎ−ｘ−Ｎｌ（Ｓ　４ｔＤＭＳＯニ溶解され る。コノビオチニル化は、２０”Ｃ（７）ｐＨ７，２のＰＢＳ緩衝液中、ｂｉｏ ｔｉｎ−ｘ−Ｎｌ５／Ｆ（ａｈ）＊のモル比１００＋１で行った。ビオチニル化 工程は、２時間後に１０％（ｖ／ν）のイミダゾール緩衝液（０，５Ｍ。
ｐＨ７，３）の添加により停止した。
＝、１創リ−Ｑ段ｌｐＩ製 二官能性抗体の調製は、Ｇｌｅｎｎｉｅ、　Ｍ、Ｊ、ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ 、　ｖｏ１１３９、２３６７〜２３７５ページ、１９８７、にそのまま従って行 った。
ビオチニル　ウサギＦ（ａｂ）の　− 精製したビオチニル化ウサギＦ（ａｂ）ｔｌ■Ｌ（濃度１０ｍｇ／ｍＬ）を、窒 素を通しながら１０５Ｍ　ＤＴＥで４℃で３０分分間光し、次いで２０℃で６０ 分間保持した。　ＤＴＢからのＦａｂの分離は、２ｍＭＥＤＴＡを含む５０−Ｍ 酢酸緩衝液（ｐＨ５，３）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５ Ｘ１５ｃｍ）で行った。溶離したＦａｂを集め、使用するまで氷上に保存した。
゛ズミＦ（ａｂ）の　−とマレイミドカブ１ング精製したモノクローナル抗ｔ− ＰＡ　Ｆ（ａｂ）ｘ　１ｍＬ　（濃度１０ｍｇ／ｓＬ）を、窒素気流下のｌＱｓ ＋Ｍ　ＤＴＥで４℃にて３０分分間光し、次いで２０°Ｃで６０分間保持した。
　ＤＴＥからのＦａｂの分離は、２ｍＭＥＤＴ＾を含有する５０−Ｍ酢酸緩衝液 （ｐＨ５，３）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラム（１，５Ｘ１５ｃｓ ＋　）で行った。溶離したＦａｂを集めた。濃度１．５５５ｇ／＋＊ＬのＦａｂ ３．２轟りに、冷ジメチルホルムアミドに溶解した１２ｍＭの０−フェニレンジ マレイミド（ｏ−ＰＤＭ、　ＳＩＧＭＡ）　１．６ｍＬを加えた。　３０分後、 マレイミド化されたＦａｂ□【を反応混合物の他の溶質から、２ＭＭＨＤＴＡ含 有の５０−Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，３）で平衡化したセファデックスＧ−２ ５カラム（２，５Ｘ１５ｃ＠）を通過させることで分離した。
ビオチニルウサギＦａｂとネズミＦａｂｌＩ、のカブＴング０．４１ｍｇ／ｍＬ 　（８２ナノモル）濃度のＦａｂ　１ｌａｔ　ｘｉ　ｓＬを０．４１ｍｇ／ｍＬ （１０７ナノモル）濃度のビオチニル化ウサギＦａｂ　３．３ｍＬと混合した。
反応混合物を、冷却アミコンチャンバー中のアミコン（Ａ皺１ｃｏｎ）　Ｙに一 １０メンプラン（Ａｍｉｃｏｎ　Ｌｔｄ）の使用による窒素雰囲気下の限外濾過 で２　ｍｇ１社まで濃縮した。
２つの　る　の−１，・・ 反応混合物を、５ｓＭＥＤＴＡ含有の０．２Ｍリンｉ！！′緩衝液（ｐＨ６，０ ）で平衡化した旧ｔｒｏｇｅｌ　ＡｅＡ４４カラム（１，５Ｘ　１００ｃｍ）で ゲル濾過した。流速は８　ｍＬ／時とし、画分は１１．であった。
ケ’　）Ｌ’ｊｌｊＬ通−貝ｔ１２−へ性異立玉ｊ１ｊ」」ゾ琲Ｙ＾二弐読−す べての両分をＥＩＡでアッセイした。９６ウエルのブＩ／−）は、室温で１６時 間濃度１μｇ／■Ｌのヒトｔ−ＰＡを塗布した。プレートのブロッキング後、す べての両分をこのＥＸＡでアッセイした。これらの両分は、１％ＢＳＡを補強し た０、０２％Ｔｗｅｅｎ　２０含有のＰＢＳ　＠衝液による１：５００および１ ：２５０００希釈状態で試験し７た。１時間インキュベーシッン後プレートを洗 浄した。次いで、これらのプレートを、０．５Ｍ　ＮａＣ１補強ＰＢＳ　１３１ 衝液による１　：　２００００希釈状態のスｌ＝レプトアビジンーベルオキシダ ーゼ（Ｋｉｒｋｅｇｉｒｄ　ａｎｄ　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。
Ｉｎｃ）でインキュベージジンした。最終的な洗浄後、ウェルを５分間蟇１ｒＷ Ｉ衝液（クエン酸塩−過ホウ酸塩緩衝液、ＰＨ５，５、オルソ−フェニレンジア ミン０．８ｗｇ／ｍＬ含有）１００μＬでインキュベージジンした。その後反応 を、各ウェルへ２Ｍｇ酸１００μＬを添加することにより停止した。プレートを ４９ｈｍで読み取った。
結果を図７に示す、この図では、１／Ｘ希釈された全両分のＥＩＡによる吸光度 が示されてい２輸 ＥＴＡで推定される２つの特異性を有する抗体を含有する百分を集めた。容量は ６畦であり、抗体！ｆｆ（Ａｉｓ。で測定した場合）は１９８Ｍｇ／ｍＬであっ た。こうして集めた２つの特異性を有する抗体を除去寛験に使用した。
（ｂ）生物学的バックグランドの低減 リ− 実験で使用したｔ−ｐａは、Ｂｏ＠ｈｒｉｎｇｅｒ　ｆｇｅｌｈｅｉｍから得た Ａｃｔｉｌｙｓｅであった。
！腋此Ｉ ４羽のウサギに２つの特異性を有する抗体を用量（ウサギ１羽当り５０μｇ）で 静注した。
ウサギ１と２は、１＝０分に抗体を投与した。　ｔ−ＰＡはその後投与しなかっ た。ウサギ３と４は、ｔ−０分に抗体を投与した。ｔ−６０分にウサギ３と４へ １分かけてｔ−ＰＡを静注した。　ｔ−ＰＡの注入量は、投与した抗体の１２倍 モル濃度とした。
１１五ユ 血液試料は、抗体投与Ｉｔ−０，１０，２０，４０および６０分、ならびに２， ４および６時間に採取した。ウサギ３と４では、さらなる試料をｔ−ＰＡ投与後 ５．１０．２０．４０および６０分に採取した。
２つの特異性を有する抗体の濃度は、ウサギ血漿中の２つの詩興性を有する抗体 の検量線（２００ｎｇ　／糺〜・０．７８ｎｇ／　ｍＬ　）を用い上記ＥＩＡで 測定した。すべての試料を、未希釈および正常ウサギの血漿で１；１０に希釈し て試験した。
結果を図８に示す。図８の各曲線は、２つのつづ・ギ血漿試料の平均値で表わす 、　ｔ−ＰＡを投与しなかった対照ウサギにおける２つの特異性を有する抗体の 半減刺は、約４．５時間であった。　ｔ−ＰＡをｔ＝１時間に加えた場合、血清 中の２つの特異性を有する抗体濃度の劇的な上昇が観察された。　ＥＩＡの結果 により評価すると、１０分以内に２つの特異性を有する抗体のすべてが実質的に 浄化される。
これらの結果は、ウェルをストレブ！・〜アビジンで被覆した一ン゛イクロタイ ターブレートを朋いるビオチニル化抗体の総量を測定するＢＩＡで確認された。
ウサギ血漿中の２つの特異性を有する抗体濃度は、ウサギ血漿中の２つの特異性 を有する抗体の検量曲線（２００ｎｇ／ｍＬ〜・０．７８ｎｇ／ｍＬ）を用いる ＥＩＡにより測定した。この検量線の応答は、高濃度ｔ−ＰＡの添加により影響 を受けない、試料は、未希釈および正常ウサギ血漿で１：ｌＯ希釈してインキュ ベージジンした。キャリブレータ−と試料を１時間インキュベージジンした０次 いで、これらのプレートを、０．５Ｍ　ＮａＣ１補強ＰＢＳ　！ｌ衝液で１８２ ００００に希釈したストレブトアビジ＝／−ペルオキシダーゼ（Ｋｉｒｋｅｇｉ ｒｄ　ａｎｄ　ｆ’ｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｆｉｃｘ、　Ｉｎｃ）とインキユ ベーシツンした。最終洗浄後、これらのウェルを５分間基質緩衝液（オルソ〜） ｊエレンジアミン０．８ｍｇ／ｍ１．補強のクエン酸塩−過ホウ酸塩ｌｌ衝液、 ｐＨ５，５Ｎ００μＬとインキエベーシνンした。その後、反応を各ウェルに２ 　Ｍ！酸１００μＬを添加することにより停止した。これらのブ１／−トを４９ ２ｎ−で読み取った。
結果を図９に示す。図９では、各曲線２つのウサギ血漿試料の平均値を表わす、 すべての抗体濃度はパーセンテージで示しており、１０分後に測定した抗体濃度 を１００％に設定した。　ｔ−ＰＡを投与しなかった対照ウサギにおける２つの 特異性を有する抗体の半減期は、約４時間であった。ｔ−ＰＡ投与後の１０分以 内にほぼ８０％のビオチニル化した２つの特異性を有する抗体濃度の低減がａ測 された。
実験の結果は、図９に示されるように２つの特異性を育する抗体の除去が、ＥＩ Ａプレートの固＃１ｔ−ＰＡに結合できない複合体を形成する２つの特異性を有 する抗体とｔ−ＰＡとの間の反応だけによるものでないことを示す。
これらの実験から、ｔ−ＰＡ／抗ｔ−ＰＡの２つの特異性を有する抗体は、２つ の特異性を有する抗体単独よりも器官における著しく短かい半減期をもつことが 明らかである。さらに、これらの実験は、生体内におけるｔ−ＰＡ／抗ｔ−ＰＡ 　ＭｏＡｂの迅速な浄化を行うことが可能であることも示す。
Ｆｉｇ、　１ Ｆｉｇ、　４ 分 Ｆｉｇ、　５ 寸　へ　の　Ｃｏ　寸　へ 要約書 別個の容器に、（ａ）生活性物質ならびに細胞レセプターに結合しうるリガンド またはリガンド類縁体の結合性捕捉剤と、（ｂ）細胞レセプターならびに前記捕 捉剤に結合性のリガンドまたはリガンド類縁体とを、含んでなる医薬組成物また は診断組成物。この組成物は血流から生活性物質の迅速な浄化を行うのに使用で きる。
補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年１月２５日

Claims (21)

    【特許請求の範囲】
  1. １．別個の容器に、 （ａ）生活性物質と、細胞レセプターに結合しうるリガンドまたはリガンド類縁 体とに結合しうる捕捉剤、ならびに（ｂ）細胞レセプターと前記捕捉剤とに結合 性のリガンドまたはリガンド類縁体、 を含んでなる医薬または診断組成物。
  2. ２．捕捉剤が血流から迅速に除去される剤である請求の範囲第１項の組成物。
  3. ３．捕捉剤が単一官能性であり、そしてリガンドまたはリガンド類縁体が前記捕 捉剤に結合しうるように変性されている請求の範囲第２項の組成物。
  4. ４．捕捉剤が単一官能性であり、そして生活性物質およびリガンドが実質的に同 一である請求の範囲第２項の組成物。
  5. ５．生活性物資が血流から迅速に除去される物質である請求の範囲第１項の組成 物。
  6. ６．捕捉剤が単一官能性であり、そして生活性物質が前記捕捉剤に結合しうるよ うに変性されているリガンドまたはリガンド類縁体と異なる請求の範囲第５項の 組成物。
  7. ７．捕捉剤が二官能性であり、そして生活性物質がリガンドまたはリガンド類縁 体と異なる請求の範囲第５項の組成物。
  8. ８．リガンドまたはリガンド類縁体が捕捉剤に結合しうるように変性されている 請求の範囲第７項の組成物。
  9. ９．捕捉剤が単一官能性であり、そして抗体もしくは細胞レセプター（特異的リ ガンド結合性レセプターを除く）または生活性物質に対する結合部位を含むそれ らの断片を含んでなる請求の範囲第２または４項の組成物。
  10. １０．捕捉剤が単一官能性であり、そしてリガンドまたはリガンド類縁体が抗体 （抗イディオタイプ抗体を含む）、細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセ プターを除く）または前記捕捉剤に対する結合部位を含むそれらの断片を含むよ うに変性されているか、あるいはリガンドまたはリガンド類縁体が生活性物質ま たは前記捕捉剤に結合性のそれらの誘導体もしくは断片で変性されている請求の 範囲第３または６項の組成物。
  11. １１．捕捉剤が二官能性であり、そして（ａ）２つの特異性を有する抗体、 （ｂ）抗体と、細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプターを除く）もし くは生活性物質に対する結合部位を含んでなるそれらの断片、一本鎖オリゴヌク レオチド、細胞間接着性分子または結合剤（例えば、ビオチン、アビジン、レク チンもしくは医薬）との抱合体、あるいは （ｃ）細胞レセプター（特異的リガンド結合性レセプター以外）または生活性物 質に対する結合部位を含んでなるそれらの断片と、一本鎖オリゴヌクレオチド、 細胞間接着性分子または結合剤（例えば、ビオチン、アビジン、レクチンもしく は医薬）との抱合体を含んでなる請求の範囲第７項の組成物。
  12. １２．リガンドまたはリガンド類縁体が抗体、細胞レセプター（リガンド結合性 レセプターを除く）もしくは捕捉剤に対する結合部位を含むその断片、一本鎖オ リゴヌクレオチド、細胞間接着性分子または結合剤を含むように変性されており 、かつそれらの各々が生活性物質を結合しない捕捉剤部分と抱合体を形成できる 請求の範囲第１１項の組成物。
  13. １３．前記剤が標識を提供されている請求の範囲第１〜１２項のいずれかの組成 物。
  14. １４．標識が放射活性同位体、磁性粒子および常磁性原子からなる群より選ばれ る請求の範囲第１３項の組成物。
  15. １５．細胞レセプターが肝臓のレセプター、膵臓のレセプター、骨髄のレセプタ ー、肺のレセプター、腎臓のレセプター、皮膚のレセプターまたは胎盤のレセプ ターである請求の範囲第１〜１４項のいずれかの組成物。
  16. １６．生活性物質が医薬（麻薬を包含する）、例えばジゴキシンもしくはモルフ ィンのようなアルカロイド、または抗うつ薬（三環式抗うつ薬を包含する）、ア セチルサリチル酸、バラハタモール、抗てんかん薬、β−レセプターブロッカー 、神経弛緩薬、交感神経作用薬、トキシン（例えば、エキソトキシンもしくはエ ンドトキシン（ＬＰＳ））、ヘビ毒、カビ毒（例えば、ムスカリン）、重金属（ 例えば、鉛、カドミウム、水銀）のような無機毒、アルカロイド（例えば、ニコ チン、スコポラミン、アトロピン）のような有機毒、場合によって新生物細胞上 に存在する腫瘍に随伴する抗原、新生物細胞により生産される物質、活性化白血 球、活性化リンパ球、血漿細胞、細胞により生産される表面もしくは循環性物質 、抗体（特に、自己抗体）、血栓（もしくはその成分）または病原体（例えば、 ウイルス、細菌、糸状菌）もしくはその成分（例えば、表面抗原）である請求の 範囲第１〜１５項のいずれかの組成物。
  17. １７．リガンドまたはリガンド類縁体が成長因子、ペプチドもしくはポリペプチ ドホルモン、サイトカイン、解毒化トキシン、ビタミン、ステロイド永ルモン、 中枢神経系に作用する物質、ヒアルウロン、コンドロイチン硫酸、コラーゲンタ イプＩＩＩのＮ−末端ペプチド、マンノース末端化グリココンジュゲート、グリ コシド（生活性物質に結合した）または組織プラスミノーゲンアクチベーターで ある請求の範囲第１〜１６項のいずれかの組成物。
  18. １８．血流から生活性物質の迅速な浄化を行う方法であって、それを必要とする 被検者に対し、 （ａ）生活性物質と、細胞レセプターに結合しうるリガンドまたはリガンド類縁 体とに結合性の捕捉剤の有効量を投与する工程、次いで適当な間隔後に、 （ｂ）細胞レセプターと前記捕捉剤とに結合性のリガンドまたはリガンド類縁体 の有効量を投与する工程、を含んでなる方法。
  19. １９．病的症状の迅速な生体内検出方法であって、（ａ）問題の病的症状に特有 の生活性物質を結合できる捕捉剤と、細胞レセプターに結合できるリガンドまた はリガンド類縁体との有効量を投与する工程、次いで適当な間隔後に、（ｂ）細 胞レセプターと、前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体の有 効量を投与することにより、血流から捕捉剤の迅速な浄化を行う工程、 を含んでなる方法。
  20. ２０．血流から生活性物質の迅速な浄化を行う医薬組成物の製造のための、生活 性物質と細胞レセプターに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体とに結合性 の捕捉剤の、細胞レセプターと前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガン ド類縁体との組み合わせ使用。
  21. ２１．血流から捕捉剤の迅速な浄化を行うことで間題の病的症状の迅速な検出を 行う診断組成物の製造のための、病的症状に特有な生活性物質と、細胞レセプタ ーに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体とを結合できる捕捉剤の、細胞レ セプターと前記捕捉剤とに結合できるリガンドまたはリガンド類縁体との組み合 わせ使用。
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