JPH05509093A - インターロイキン―７を用いた選定免疫療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターロイキン−７を用いた選定免疫療法見方０枝玉分野 本発明は癌またはウィルスの感染のある個体分治療するための、特定の抗原に予 めさらした抹消り〉′バ球のサンプルを得ること、そのリンパ球中でＣＴＬ活性 を活性化させるのに十分な濃度でインターロイキン−７（ＩＬ−７）ポリペプチ ドまたはその誘導体を含む培養培地中でリンパ球を生体外で培養すること、およ び活性化したリンパ球を個体に投与することがら成る選定免疫療法のための方法 に関する。

杢光咀り重量 正常なマウスから得た増殖していないリンパ球をインターロイキン−２（ＩＬ− ２）またはインターロイキン−４（ＩＬ−４＞存在下で試験管内で培養すると、 ！瘍細胞に対して細胞毒性のあるリンパ球の集団が生ずることが示されている。

これらの細胞は一般的にリンフ才力インによって活性化されたキラー細胞（ＬＡ Ｋ）と呼ばれる。ＩＬ−２およびＩＬ−４は別個のＴｍ胞に由来するサイトカイ ン、すなわちより具体的にはリンフ才力インである。ＩＬ−２およびＩＬ−４は いくつかの重複する活性をもつことが示されている９例えば、ＩＬ−２は最初は Ｔ細胞成長因子として同定されたが、それ以来Ｂ細胞、単核細胞、表皮性ランゲ ルハンス細胞、乏突起膠細胞およびＮＫ細胞のような様々な細胞のタイプに結合 して増殖または機能を促進することが示されている。さらにＩＬ−４はＢ細胞の 増殖および成熟によって誘導されることによって主に機能すると本来考えられて いたが、ＩＬ−４はそれ以来造血幹細胞、マクロファージ、肥満細胞、およびＴ 細胞と相互作用することが示されている。

哺乳類のインターロイキン−７（ＩＬ、−７）は辺前はリンフォボエチン−１と 呼ばれた。ヒ１−およびマウスＩＬ−７のクローニングおよび発現は１９８８年 １０月７日に出願された米国特許出願第０７．／２５５，２０９号に記述されて おり、その開示はこの言及によって本明細書中に含まれるものとする。インター ロイキン−７は、骨髄中でＢおよびＴ［胞の先祖力生長を刺激する能力と利用し て最初に単離されたクローニングされたリンパ球生成のための生長因子である。

公開されたＰ　ＣＴ出願第ＷＯ８９、”’　０３８８４号（１，９８９年５月５ 日）および第ＥＰ−Ａ−０３１４．４１５号（１９８９年５月３日）は、Ｄ　Ｎ 　Ａ、ベクターおよび組換えＤＮＡ技術によって唾！Ａ類のＩ　Ｌ　−７ポリベ ブチドを生産づる。？ｊめの同速した過程に言及している。これらの発表さ＃１ ？、：特許出願、７）関連した開示はこの言及によって本明４１１１１：ｌに含 まれるものとする。ネズミＩＬ−７のクローニングは学術誌中にナース＞（Ｎａ ｍｅｎ）らによってＮ旦土旦工旦　ユユユ巻：５７１ページ（１９８８年）に最 初に報告され、そしてヒ）−ＩＬ−７はゴツトウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）らによ ってＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ−、ＡＣａｄ、Ｓｃ　ｉ　、ＵＳＡ８６巻＝３０２ ページ（１９８９年）に報告された。形質転換した骨髄間ｖｉａ胞系列の上清か ら精製したネズミＩＬ−７は約２５．０００ダルトンの見かけ力分子量を示した （例えばナーメン（Ｎａｍｅｎ）ら、法、旦Ｗ１Ｍ旦旦、上旦ユ巻＝９８８ペー ジ（１９８８年）と見よ）。ナーメン（Ｎａｍｅｎ）らおよびゴツトウィン（Ｇ ｏｏｄｗｉｎ）らによって報告されたクローニングされたＤＮＡは、任意の配糖 化を除けばネズミおよびヒトＩＬ−７ポリベブチドの最小分子量がそれぞれ１４ ，８９７および１７．３８７ダルトンであることを示唆する。

ＩＬ−７のクローニング、特性決定および十分な量の発現によって、その生物学 的活性のスペクトルの同定を始めるための十分な組換えポリペプチドを提供する ことができるようになった。ＩＬ−７は、長期間の骨髄培養に由来する前Ｂ細胞 （Ｂ２２０”）の増殖を刺激する能力によって当初は定義された（ウイントロン ク（Ｗｈｉｔｌｏｃｋ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　６ユ巻。

３５５−６９ページ（１９８４年）を見よ）、シかしＩＬ−７は成熟したＢ細胞 の増殖を刺激すること、または前Ｂ細部の表面１ｇ’細胞への分化を誘導するこ とは不可能である（リー（Ｌｅｅ）ら１．Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４２巻：　３ ８７５−８３ページ（１９８９年））。

さらに新しい文献にはＴ細胞の系統細胞がＩＬ−７に応答することが示されてい る０例えば大部分の表面の表現型の増殖していない胎児のおよび成熟した胸腺細 胞は、ＩＬ−２，ＩＬ−４またはＩＬ−６と無関係にＩＬ−７に応答して増殖す る（コンロン（Ｃｏｎｌｏｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ　１１巻：　１３６８−７３ペー ジ（１９８９年））。さらに、成熟した抹消Ｔ細胞は最適状態に及ばない濃度で １）有争分７Ｊ促進物質の存在下でＴＬ−７に応答する（チャセン（Ｃｈａｚｅ ｎ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８６巻、５ｃ）２ ３　２７ベージ゛（１９８９年））。モリ七イ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）ら、ユ、 旦Ｎ■■二」　１旦２巻ニア０７−１６ページ（１９８９年）の文献は、ＩＬ− ７はＩＬ−２の生産と誘導することによって、精製したネズミＴ細胞のＣ０ＮＡ への試験管内での増殖の応答のための共同して刺激する信号を提供することがで きることを示している。さらに、チャセン（Ｃｈａｚｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６−巻　５９２３−２７ページ（１９８９年）の 文献は、Ｐ　Ｍ　、Ａと組みかわせてＩ　ｌ−−７は、池のサイトカインのメン センジャーによる介入なしてＴ細胞の活性化を直接刺激することができることを さらに示している。ＩＬ−７およびＰＭＡめ組み合わせに対する応答はＩＬ−２ またはＩＬ−４に対する中和のための杭木を高濃度で用いることでは阻害されず 、そしてＣｓＡの免疫抑制効果にはかなり耐性と示したのだが、ここでＣｓＡは ＩＬ−２、■＋＝　−４およびインターフェロン−７−登コードする遺伝子を含 む多くのリンフ才力インの遺伝子の転写を阻害する薬物である。

ネズミの細胞系列および主な細胞系列の多くがＩＬ−７レセプターを示す。これ らの細胞系列はリンパ球および骨髄と起源とする細胞と含む。したがってサイト カインＩＬ　７は広範囲の細胞のタイプに対して広範囲の活性ともつ可能性があ る。

リンパ球の一連の細胞の分化は、複雑で現在まだよく解明されていない一連ので きごとを含む、共通の前駆細胞または幹細胞がＢおよびＴリンパ球になると信− られているが、分化の過程に含まれる段階はわかりにくいままである。初期ＣＤ ４−′ＣＤ８−胸ｌｌ！細胞は放射線にさらされた受容者の胸腺に再びとどまる ことができて、櫟りな胸腺細胞の特定生物型群に分化できる。分化の過程にどの 因子が含まれるのかはわかっていない。

コンＵｌ：ｚ　（Ｃｏｎ　ｌ　ｏｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ　７４巻　１３６８−７３ ページ（１９８９年）の文献にはオ・ズミの胸腺細胞のネズミｒＬ−７への増殖 の応答について言及している。ＩＬ−７単独では胸腺細胞に対する細胞分裂泥道 性があり、そしてｃ　ＯＮ　Ａ　２用いたＩＬ−７の応答とさらに増加させた。

コンロン（Ｃｏｎｔｏｎ）らは、ＩＬ−７が、最小に分ｔした胸腺細胞の特定生 物型群であると信しられているものと代表するＣＤ４−、／ＣＤ８−細胞の増殖 を刺激したことをさらに実証した。さらに胸Ｒ４［ｌｌ胞のＩＬ−７への応答は 、ＩＬ−２およびＩＬ−４のような他の既知のＴｉ胞生長因子の生産のためであ るようには見えなか−）な。このＩＬ−７の活性はＩＬＩまたはＩＬ−６のよう な他のリンフ才力インの活性とは対照的であり、後者はＩＬ−２，ＩＬ−４の生 産によって、または■［、−２レセプターの活性化によってまたは両方によって Ｔ細胞の応答性を増強することが示されている。

選定免疫療法およびその様々な変法の技術は、例えばローゼンベルグ（Ｒｏｓｅ ｎｂｅｒｇ）、５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　６２−６９ベージ（ １，９９０年５月）に記載されている０選定免疫療法のモデルはＩＬ−！を用い て最初に発展した９手ｊ頃はマウスを用いて発展した。簡潔に説明すると、まず 健康な同系のマウスから牌臓を取り出して、リンパ球を単離して、ＩＬ−２と含 む培養培地中で単離したリンパ球牙培資する。ＩＬ−２は培養中に細胞溶解性で 腫瘍殺傷性になるある種のリンパ球およびＮＫ細胞を誘導する。癌の免疫療法の 方法として活性化したリンパ球およびｒ　Ｌ−２＠腫瘍の生じたマウスに注射す る。

ヒトの臨床の研究では、患者の血液の全体からリンパ球を単離して、ＬＡＫ活性 を誘導するためにリンパ球’）ＩＬ−２とともに培養して活性化させて、ヒトＩ Ｌ−２とともに静注された５００億個のＬＡＫ＃ｙ！Ｆｌを用いて患者を治療し ている。

様々な臨床の研究から、活性化させたリンパ球とともにＩ　Ｌ−２５，、注射す ることの必要性が明らかになった。

ローゼンベルグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）および彼の同僚はＩＬ−２と組み合わせ た活性化させたＬＡＫ細胞でおよびＩＬ−２単独で投与して様々なな癌を治療す ることを試みた。現在までの結果ては、ＩＬ−２および活性化させたＬＡＫ細胞 の組み合わせでは１７７人の患者の中で１４人に完全な癌の軽減が見られ、ＩＬ −２単独では１３０人中４人であることが示されている０部分的な軽減の場合分 考えると、活性化させたＬＡＫ細胞およびＩＬ−２と投与された患者の２５％は 改善されて、ＩＬ−２単独？投与された患者の１７？６が改善された。

ＩＬ−２によって活性化されて、ＩＬ−２とともに投与されたリンパ球を用いる 選定免疫ｇｌ法の技術には副作用が報告されている。副作用は、生きている器官 の機能を妨げる組織中でのリンパ球の増殖分含む、ＩＬ−２を投与すると血液が ら組織への体液の漏れが起こり、その結果体重が増加する。

したがって当該分野においてＩＬ−７ポリベブチドの正確な生理学的および免疫 学的機能をより良く特徴づける必要がある。異なる放射線にさらした条件下で、 異なる組み合わせでおよび異なる薬物動力学のパラメーターで異なるサイトカイ ンを用いた免疫療法の技術に改良を加えるべき必要が当該分野にはまだある。本 発明は、Ｉ　１．、、−７ポリペプチド単独でのまたは池のサイトカインまたは 池の因子との組みきわせに対する最良の免疫療法の使用を見い出す努力としてい る中から生まれた。

凡盟凶！豹 本発明は、ＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体の存在下で活性化されたＣ′ ｒｌ−ｓ＜細胞イ容解性Ｔリンパ球）を用いた選定免疫療法による、癌またはウ イルスカ怒染のある個体を治療するための方法（、Ｓ関する５本方法は、！ｌ瘍 細胞の集団又はウィルスのｊ５染（すなわち、特定の抗原）に予めさらした同系 の抹消リンパ球？得ること、りンバ球中てＣＴＬ活性と誘導するのに十分な量の 同種のＩ　Ｌ−７ポリベプヂドまたはそれの誘導体を含む培養培地中でリンパ球 を生体外で培養するごと５およびＣＴｌ−活性を示すリンパ球を個体に投与する ことがら成る。

培養培地はさらに約３ｎｇ　ｍｌ：ｉでの同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはそ の誘導体および７′または約１０　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌまでの同種のＩＬ−４ポリ ペプチドまたはその誘導体と含むことが好ましい。

同系の抹消リニパ球は腫瘍またはウィルスに感染した場所に隣接した排膿するリ ンパ節から得ることが好まＩ−い。ヒトのＭ自にはその場で生まれたリンパ球を 用いることが一番好ましい。その場で生まれたリンパ球は後にその細胞で治療さ れる同じ人から得る。

細胞溶解性Ｔ白血球（ＣＴＬ）ＥＩＬ−７羊独またはＩＬ−７およびＩ　Ｌ−２ の組み合わせを用いて生木外の培養によって活性化させて、腫瘍細胞３特異的に 溶解する活性を用いた癌の選定免疫療法のために使用することができる。さらに 細胞のＣＴＬ活性を増強するために生木外の培養に有糸分裂を阻害した腫瘍細胞 をさらに加えることが可能である。

さらにＣＴＬ活性と示すリンパ球の個体への投与の段階は個体へのサイトカイン の投与から成ってもよく、その場合にはＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体 、ＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体またはＩＬ−４ポリペプチドまたはそ の誘導体と組みきわせたＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体の組み合わせお よびＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体の組み合わせ、およびＩＬ−２ポリ ペプチドまたはその誘導体、ＩＬ−４ポリベブナドまたはその誘導体からなる群 からサイトカインと選択する。サイトカインの好ましい１日の投与量はＩＬ−２ では約１０から約２０００μｇ７′ｋｇ、・′日、ＩＬ−４およびＩＬ−７では 約４から約１０００μｇ、′ｋｇｉ’日分含む。ＩＬ−２の１日の投薬は１日当 たり３回力別々の投与とし、ＩＬ−４およびＩＬ−７では１日当たり２回（ｂｉ ｄ）とするのが最も好ましい。

癌の選定免疫療法のための同系のリンパ球の集団を得ることができる。同系のリ ンパ球の集団は抹消リンパ球から得られるのだが、特定の腫瘍の場所な排膿して いる抹消す〉′バ球から得るのが好ましい。同系の抹消リンパ球を、リンパ球中 でＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量の同種の）Ｌ−７ポリベプナドまたはその 誘導体中で生体外で培養し、その際ＣＴＬ活性はＣＤ８陽性Ｔ細胞によって同定 する。培養培地はさらに約３ｎｇ／ｍ＋までの同種のＩＬ−２ポリペプチドまた はその誘導体および、′またはＩＬ−４ポリベアチドまたはその誘導体および有 糸分裂を阻害することが可能なｍ瘍細胞から成ることが好ましい。

本発明は、特定の抗原と示す標的細胞（例えば、腫瘍細胞またはウィルスに感染 した細胞）をｎ異的に溶解する。増殖させて活性化させた細胞溶解性Ｔリンパ球 力集団を含む９本発明で用いる細胞は、腫瘍細胞の集団またはウィルスの感染に 予めさらした同系の抹消リンパ球を得ること、およびリンパ球中でＣＴＬ活性を 誘導するのに十分な量の同種のＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体と含む培 養培地中で生体外でリンパ球と培養することから成る過程によって生体外で生産 される０本発明で用いる細胞は癌およびウィルスの感染の選定免疫療法において 有用である６本発明で用いる細胞はＣＤ８陽性Ｔ細胞の集団および実質的にＮＫ ４１ｉ１胞を欠損していることでさらに特徴づけられる。培養培地中に約３　ｎ 　ｇ　、、’ｍｌまでの同種のＩ　Ｌ−：２ポリペプチドまたはその誘導体およ び有糸分裂を阻害することが可能な腫瘍細胞をさらに含むことが好ましい。Ｉ　 Ｌ、−７ポリベブチドまたは等しい効力分もったものまたは活性のあるその誘導 体３培貢培地に加えるときの好ましい量は約２．５ｒ＋ｇ、’ｍｌがら約２０　 ｎ　ｇ／’ｍ　１である。ｒＬ−７ポリベブチドまたは等しい効力をもったもの または活性のあるその誘導体の量は約１０　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌであることが最も 好ましい。

区ム同星な訊朋 図１は排膿するリンパｉ細胞（ＤＬＮ）またはコントロール力リンパ節細胞（Ｃ ＬＮ）について培地中に２．５．１０または２０　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌのＩＬ、− ７の存在下またはＩＬ−７なしくコントロール〉で培養された様々なエフェクタ ーの標的化細胞力価の比較を説明する。データはコントロールのＣＬＮｓ、２０ 　ｎ　ｇ、７ｍ１のＩＬ−７でインキュベートしたＣＬＮ、コントロールのＤＬ Ｎ、または２゜５．１０または２０　ｎ　ｇ　、４ｍ　ＩのＩＬ−７でインキュ ベートしたＤＬＮて試験管内で処理されたときめ１０２４個の腫瘍細胞の溶解の パーセントと比較している。

これらのデータは、ＤＬＮをＩＬ−７中でインキュベートしたときに標的細胞に 対する一定のエフェクター細胞の溶解の量が最大に達することを示している。

図２では、脛ｆＩ１１ｍ胞で攻撃して、そして２ｏｎ　ｇ　％’ｍ　ｌの組換え ネズミＩＬ−７中で培養したＣＬＮおよびＤＬＮの様々な構成物で処理したマウ スの生体内での腫瘍の生長速度と、培地単独で培養したＣＬＮおよびＤＬＮで処 理したものとの比較として比較している。ＩＬ−７でインキュベートしたＤＬＮ ｓは最も良い抗腫瘍治療活性を示した。２０ｎｇ、・′ｍｌのネズミＩＬ−７で 予めインキュベートした３″−′１０’ｉたは６〜１０’ｌ［ｌ、７）ＤＬＮ細 胞と注射されたマウスでは完全な腫瘍の緩解が見られた。

図３では、１．　Ｏｎ　ｇ、４ｍ　ＩのＩＬ−７中で培養した幾通りかの濃度の ＣＬＮｓまたはＤＬＮて処理もしたＣ　３　Ｈマウス中へ腫瘍細胞分注射してが ら数日後の腫瘍の大きさの平均の比較て′あり、培地のみで培養したＣＬＮｓお よびＤＬＮｔ用いたときと比較させて説明している。これらのデータは、刺激さ れた細胞毒性のＴリンパ球の腫瘍殺傷の性質の比較ご説明する。ＩＬ瘍の太きさ め完全な緩解は、１０　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌのＩＬ−７で予めインキュベートした ６　Ｘ　１０’ｌｌＷのＤＬＮ４１ｉ１胞をマウスに注射したときにのみ起きた 。

図４て゛は、２．５ｎｇ／’ｍｌのＩＬ−７分含む培地中で培養したＤＬＮ細胞 を用いて腫瘍牙攻撃してから数日後の生体内での腫瘍の大きさの平均を、Ｉ　Ｌ −７を含まない培地中で培養した細胞と用いたときと比較させて説明する。

図５−１４では、２ン’１０’個の生存できる１０２４腫瘍細胞〈マウス１四ツ たり）を注射した８日前のＣ３Ｈマウスから排膿しているリンパ節（ＤＬＮ＞４ １１１胞を得たときの実験のデータを説明する。ＤＬＮｉｉ［ｌ胞はＴＬ−２， ＩＬ−７またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせのいずれかを含む培地中で 生体外で培養した０ｍ瘍をさらしていないＣ３Ｈマウスから得たコントロールの リンパ節（ＣＬＮ）を用いて同時に行う培養３計画して、培地のみでまたはＩＬ −２またはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせを含む培地中で生体外でインキ ュベートした。培養してから４日後に、５１４”ｒ放出でアｌ七イしたときの試 験管内での抗１１瘍細胞溶解活性および単一の埋木の腫瘍の緩解と測定すること による試験管内での抗腫瘍活性について細胞集団を評価した。この実験のデータ は図５−１４に示す。

図５では、サイトカインなしまたは２　ｎ　ｇ　／　ｍ　ＩのＩＬ−２存在下で 培養したＤＬＮまたはＣＬＮ細胞の集団の溶解活性を説明する。これらのデータ は、ＤＬＮはＣＬＮよりも優れた溶解活性をもち、そしてＩＬ−２でインキュベ ートしたＤＬＮはこの集団の中では最良の溶解活性をもつことを示している。

図６ではＣ３Ｈマウスに注射した１０２４腫瘍の腫瘍の大きさの平均を比較して いる。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２またはサイトカインなしで予めインキュベートし たＣＬＮまたはＤＬＮを治療に適した濃度含何通りが変えて、マウスに投与した 。これらのデータはＤＬＮｉ［ｌＩ胞はＣＬＮ細胞よりも優れた抗腫瘍活性をも つことを示す、ＤＬＮＩＩＢ胞の培地中にＩＬ−２を加えてもＤＬＮ細胞の抗腫 瘍活性を実質的に増強しなかった。

図７には、２０ｇ７′ｍｌのＩＬ−７または２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２および１０ ｎ　ｇ、、’ｍ　ｌのＩＬ−７の組み合わせでインキュベートしたＤＬＮおよび ＣＬＮの溶解活性と示す。

これらのデータは、加えるべきサイトカインを加えずに培養したＤＬＮと比較す るど２　ｎ　ｙ４　′ｍ　ｌのＩ　Ｌ−−−７の存在下て培養したＤＬＮはより 優れた溶解活性をもつことを示している。

図８には、ｌｌ−−７”たはＩＬ−２およびＩＬ−７の組み合わせでインキュベ ートシた４Ｉ！りな細胞の生体内での抗腫瘍活性の比較を説明する。腫瘍の大き さの平均は腫瘍の攻撃から数日ｔ＋に比較した。これらのデータは、加えるべき サイトカインを加えずにインキュベートしたＤＬＮまたは、ＩＬ−７またはＩＬ −２およびＩＬ−７の組み会わせでイ〉キュベートしたＣＬＮと比較して、ＩＬ −７でインキュベートしたＤＬＮが優れた腫瘍殺傷活性をもつ二とが実証された ことを説明している。

図９では、サイトカインなしでまたは１０　ｎ　ｇ／ｍ　ｌの濃度のＩＬ−７を 存在させてインキュベートしたＤＬＮまたはＣＬＮの溶解活性を比較している。

ＩＬ−７でインキュベートしたＤ　Ｌ　Ｎはこの試験管内でのモデルにおいて優 れた溶解活性ともつことを実証した。

図１０では、サイトカインなしでまたは１０　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌのＩＬ−７の存 在下でインキュベートしたＤ　Ｌ　ＮまたはＣＬ　Ｎの生木内での腫瘍殺傷溝性 分比較している。完全にＭ瘍が治癒する段階の優れた腫瘍殺傷活性は、ＤＬＮと １０　ｎ　ｇ、’ｍＩのＩ　Ｌ−７の存在下で、４日間培養した１褒６Ｘ　１０ 　’個のＤＬＮ細胞をＣ３１−１マウスに注射することによって証明された。

図１１には、サイトカインの非存在下でまたは２０ｎｇ７′ｍｌのＩＬ−７また は］、　Ｏｎ　ｇ％ｍ　ｌのＩＬ−７を加えた２ｎｇ　ｉ”ｍ　：のＩＬ−２で 培養したＤＬＮおよびＣＬＮの試験管内での溶解活性を比較するデータを示す、 優れた溶解活性は、より高濃度のＩＬ−７の存在下で培養したＤＬＮと用いて証 明された。

図１２では、サイトカインなしでまたは２０ｎｇ、’ｍｌのＩＬ−７の存在下で 培養したＤＬＮおよびＣＬ　Ｎの腫瘍殺（Ｓ活性を比較する生木内でのデータを 示す優れた腫瘍殺傷活性は、ＩＬ−７でインキュベートしたＤ　Ｌ　Ｎ　’：用 いるときに得られた。

図１３ては、１０　ｎ　ｇ　、’ｍ　Ｉの１１−−７を加えた２ｒ＋ｇ、’ｍｌ のＩＬ−２でインキュベートしたＤＬＮを用いたときの優れた試験管内ての溶解 活性を比較するデータ？示す。

図１４では、様々なりＬＮおよびＣＬＮの生体内でのＩｇ！殺傷活性を比較する データを示す、ＩＬ−７を加えたＩＬ−２の組み合わせの存在下で培養したＤＬ Ｎは最良の抗！！瘍活性と示した。

図１５−　Ｌ　８ではサイトカインな補給した長期間の培養条件で維持したＤ　 Ｉ−ＮおよびＣＬＮの生体内での抗腫瘍活性および試験管内での溶解活性を比較 する実験から得たデータを示す。培養培地にサイトカインを加えないおよそ１週 間内にリンパ球が死に絶えるので、細胞を長期間の培１ｔＱ件下で維持すること ができなかった。長期間の培養には、放射線にさらした特定の腫瘍細胞（ガンマ −線を２０００ラド照射したＢ１０．５１！Ａ胞）なさらに含めてもよい。

図４５にはＤＬＮおよびＣＬＮの生体内で力抗腫瘍活性の比較を示す。これらの データは、特定の腫瘍（ＢＩｏ、５）のみを、特定の（Ｂ１０．５＞腫瘍に予め さらされたＤＬＮの短期間の培養によって除去することができたが、交差反応性 のない腫瘍（Ｂ］、０．２）にさらされたときは除去できなかったことを示して いる。

図１６には、示したサイトカインを用いた、ＤＬＮａ胞の長期間（５週間）の培 養の試験管内での溶解活性を示す。特異的な溶解活性は、非特異的なり１０゜２ 腫瘍細胞に対するよりもむしろ特異的な８１０．５Ｗ１１ｉ細胞に対して示され た。

図１７には、示したサイトカインと用いて長期間の培養条件下で維持したＤＬＮ 細胞のフローサイトメトリー分析を示す、ＩＬ−７を用いて維持したＤＬＮ細胞 はＣＤ８陽性のＴ細胞と多く含む集団になった。

図１８には、示したサイトカインな用いた長期間の培養条件下で維持したＤＬＮ の生体内での抗腫瘍のデータを示す、ＩＬ−７を含む培地中で長期間培養したＤ ＬＮ！胞は免疫療法において、特定の（ＢＩｏ、５）腫瘍と攻撃して除去するの に有効だったが、非特異的な（ＢＩｏ、２＞腫瘍き攻撃して除去するのには有効 ではなかった。

図１９には、同時に培養した９週週間後の同じマウスＤＬＮ細胞の写真を示す。

図１９ａにはマウスＩＬ−７を用いて生長させたＤＬＮ細胞と示し、図１９ｂに はマウスＩＬ−７およびマウスＩ　ｒ−−２ｔ、用いて生長させた細胞を示し、 そして図１９ｃにはｒＬ−２のみを用いて生長させた細胞を示す。細胞に加える べきサイＩ−カイン分力■えないならば、３枚の写真で示した９週間の時点まで 生き残れないだろう。

主兄明Φ詳」なＲ朋 本発明は、特定の抗原に予めさらしなＴ細胞の集団な生物学的に効果のあるＩの ＩＬ＝−７ポリペプチドまたはその誘導体に接触させることから成る、特定の抗 原を提示する細胞に対する溶解活性ともつ活性化された哺乳まの細胞溶解性のＴ リンパ球力集団を形成するための方法に関する。哺乳類の細胞障害性Ｔリンパ球 はヒトの細胞であり、そして固型癌のような腫瘍の場所を奪い去るまたはウィル スの感染した場所を奪い去る抹消の排膿しているリンパ節から得るのが好ましい 。

排膿しているリンパ節細胞は、特定の抗原へ予めさらしなＴリンパ球の集団を含 む、特定の抗原は、腫瘍細胞、またはウィルスが感染した細胞上に、またはウィ ルスによって提示される。

哺乳類の細胞毒性のＴリンパ球の集団は、ウィルス、ウィルスが感染した哺乳類 の細胞またはＩｌ！瘍細胞によって示される特定の抗原に予めさらしておく必要 がある。Ｍ瘍の生長またはウィルスの感染の場所の下流（血流またはリンパの排 膿によって）排膿しているリンパ節はＤＬＮ　（排膿しているリンパ￥Ｂ）細胞 と含むだろう、ＤＬＮ細胞と生体外で本発明の過程によって活性化させる。特定 の抗原に予めさらされなかった同系のＣＬＮ（コントロールのリンパ節）細胞は 、本発明の方法にしたがってＩＬ−７ポリベアチドまたはその誘導体と用いて生 体外で活性化させた後に効果がより低いだろう。ＣＬＮ細胞は、特定の抗原に予 めさらしていない細胞として実験のコントロールに用いることができる。

特定の抗原に予めさらしな哺乳類の細胞溶解性Ｔリンパ球は排膿しているリンパ 節から得るのが好ましい。特定の抗原にさらした抹消血液リンパ球３得ることも 可能である。本開示の目的のために、特定の抗原に予めさらした任意の補乳謬の Ｔリンパ球は、それがどこでまたはどのようにして得られたのかにかかわらずに 、特定の抗原に予めさらしたＤＬＮ細胞と考えられるだろう。ＤＬＮ細胞は、生 物学的に有効なＩのＩ　Ｌ−７ポリペプチドまたはその誘導体′！：含む培養培 地中でインキュベートすることによって生体外の培養中で増殖する培養培地は、 約３ｎｇ　７ｍ　ｌまでのｒＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体、および７・ ′または特定の抗原を提示している有糸分裂の阻害された特定の腫瘍細胞の集団 をさらに含んでもよい。例えば少なくとも５００ラドの、好ましくは２０００ラ ドのガンマ−線を照射することによって腫瘍細胞の有糸分裂を阻害してよい。別 の量または型の放射線の照射で効果的に腫瘍細胞の有糸分裂を阻害でき、腫瘍細 胞は細胞分裂は不可能だが、しかしまだ代謝は活発なままであるようになる。特 定のＷ瘍細胞力有糸分裂分阻害するための別の手段はマイトマイシンＣのような 化学薬品で迅埋する。二とである。

培養培地は、ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む。本発明に調和した 使用のために、当該分野で既知の方法で記述されるように、例えば哺乳類細胞系 列または原核生物中ての発現によるような、任意の都きの良い方法によってＩＬ −７と生産することができる。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体は同種で あるべきてあり、すなわち、活性化されたＤＬＮ細胞を受容されるであろう特定 の生物種のＩＬ−７ポリペプチドとアミノ酸配列が実質的に同じであるべきであ ることシ意味している。これはヒトに使用するｔ％きには、異物としてサイトカ インが認識される可能性が最小となるように、ＩＬ−７ポリペプチドまたは他の サイトカインは実質的にはヒトのものの配列をもつべきであることと意味してい る。

ＡＳＰ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＩＬＥ　にＬＵ　５（：ＬＹ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＧＬ Ｙ　ＬＹＳ　ＩＩ；ＬＮ　ＴＹＲＣＬＵ　ＳＥＲＶＡＬ　ＬＥＵ　ＭＥＴ　ＶＡ Ｌ　ＳＥＲＩＬＥ　２０＾ＳＰ　ＧＬＮ　ＬＥＵ　ＬＥＵ　ＡＳＰ　ＳＥＲＭＥ Ｔ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＩＬＥ　ＧＬＹ　ＳＥＲＡＳＮ　ＣＹＳ　ＬＥＤ　３５Ａ ＳＮ　ＡＳＮ　ＣＬＵ　ＰＩＥ　ＡＳＮ　ＰＨＥ　ＰＩＥ　ＬＹＳ　ＡＲＣ；　 ｌｌｌ５　ＩＬＥ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＡＬＡ＾ＳＮ　５０ＬＹＳ　ＧＬＵ　にＬ Ｙ　ＭＥＴ　ＰＩ（Ｅ　ＬＥＵ　Ｐ旺＾Ｒｔ、　ＡＬ＾＾Ｌ＾＾ＲＧ　ＬＹＳ　 ＬＥＤ　ＡＲに　（ＬＮ　６５ＰＩＥ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＭＥＴ　ＡＳＮ　ＳＥ ＲＴ）ＩＲにＬＹ　ＡＳＰ　Ｐ旺＾ＳＰ　ＬＥＤ　Ｉ（ＩＳ　ＬＥｔｌ　ＬＥＵ 　８０ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＳＥＲＧＬＵ　にＬＹ　ＴＩＥＲＴｌ（ＲＩＬＥ　Ｉ、 ＥＵ　ＬＥＤ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＴＨＲＣ；ＬＹ　ＧＬＮ　９５ＶＡＬ　ＬＹＳ 　ＧＬＹ　ＡＲに　ＬＹＳ　ＰＲＯＡＬＡ　Ａ１．Ａ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＧＬＩ Ｉ　ＡＬＡ　ＣＬＮ　ＰＲＯＴｌＴＲ１１０ＬＹＳ　ＳＥＲＬＥＵ　にＬＵ　Ｇ Ｌｔｌ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＳＥＲＬＥＤ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　［；ＬＮ　ＬＹＳ　 ＬＹＳ　ＬＥＤ　１２５＾ＳＮ　ＡＳＰ　ＬＥＵ　ＣＹＳ　ＰＦＩＥ　ＬＥＵ　 ＬＹＳ　ＡＲ（：　ＬＥＤ　ＬＥＵ　ＣＬＮ　にＬＵ　ＩＬＥ　ＬＹＳ　ＴＨＲ １４O ＣＹＳ　ＴＲＰ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　ＭＥＴ　［：ＬＹ　ＴＨＲ ＬＹＳ　ＣＬＯＨＩＳ　１５２表２：ネズミＩＬ−７ ＧＬＵ　ＣＹＳ　ＨＩＳ　ＩＬＥ　ＬＹＳ　５ＡＳＰ　ＬＹＳ　Ｉｌ：Ｌｔｌ　 ＧＬＹ　ＬＹＳ　ＡＬＡ　ＴＹＲＧＬＵ　ＳＥＲＶＡＬ　ＬＥＤ　）４Ｅ丁　Ｉ ＬＥ　ＳＥＲＩＬＥ　２０ＡＳＰ　ＧＬＵ　Ｉ、Ｅｌｌ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＭＥ Ｔ　ＴＨＲ（：ＬＹ　ＴＦＩＲＡＳＰ　ＳＥＲＡＳＮ　ＣＹＳ　ＰＲＯＡＳＮ　 ３５ＡＳ）１　［；ＬＵ　ＰＲＯＡＳＮ　ＰＩＥ　ＰＨＥ　ＡＲＣ；　ＬＹＳ　 Ｈｌｓ　ＶＡＬ　ＣＹＳ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲ１，ＹＳ　５O ＣＬＵ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　Ｐ）ＩＥ　ＬＥＤ　ＡＳＮ　ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＡＬＡ 　ＡＲに　ＬＹＳ　ＬＥＵ　１．ＹＳ　ＧＬＮ　ＰＩ（Ｅ　U５ ＬＥＵ　ＬＹＳ　１４ＥＴ　ＡＳＮ　ＴＬＥ　ＳＥＲ［；１１１　（：ＬＵ　Ｐ 旺ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＩＩＴｓ　ＬＥｔｌ　１．ＥＩＩ　ＴＨq８０ ＶＡＬ　ＳＥＲｆｌ：ＬＮ　Ｃ１、Ｙ　ＴＨＲＧＬＮ　丁１１ＲＬＥＩＪ　ＶＡ Ｌ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　Ｔ）ＩＲＳＥＲＬＹＳ　ＧＬＵ　９５Ｇ１、Ｕ　ＬＹＳ　 ＡＳＮ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＣＬＩＩ　（：ＬＮ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＡＳ Ｐ　ＡＬＡ　ＣＹＳ　ＰＩ（Ｅ　ＬＥ［h　１１０ ＬＹＳ　ＡＲ（：　ＬＥＤ　ＬＥＤ　ＡＲＣＣＬ［Ｉ　ＩＬＥ　ＬＹＳ　ＴＨＲ ＣＹＳ　ＴＲＰ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＩＬＥ　ＬＥＵ　１２５ＬＹＳ　（：ＬＹ　 ＳＥＲＩＬＥ　１２９前述のポリペプチドの様々な生物学的に活性のある誘導体 または類縁体も本発明の方法および組成物のために使用できるだろう。ここで使 用するように、同種のＩＬ−７ｉたはその誘導体は、そカ特定の晴孔丁の種の本 来のＩＬ−７ポリベブチドと実質的なアミノ酸配列の相同性をもちそして実質的 に同等の生物学的な活性をもつポリペプチドを指す、ｆ！ＩＩえば同種のヒトＩ Ｌ−７ポリペプチドまたはポリペプチドの誘導体はヒトの本来のＩＬ−７ポリベ ブチドと実質的に〕似なアミノ酸配列をもち、受容者の免疫系によって異物とし て認識されないようにするべきである。実質的に同等力生物学的な活性とは、標 準的なバイオアノ七イまたはＩ　Ｌ−７レセアターに結きする親和性？測定する ためのアッセイにおいて顕似力結果分示すことを意味する。Ｉｌ、、−７誘導体 は、ＩＬ−７の生物学的な活性分示す様々な非ペプチド性の化き物もさらに含む 。これらの化な物はＩＬ−７レセプターのアゴニストを含む、ＩＬ−７レセプタ ーはボッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら、ｑ皇−、！　！、−−６す巻　９４１ ペ一ジ１９９０年の文献中に記述されている。

ＴＬ−７，１？リペアチドを組換えＤＮＡ技術によって生産するのが好ましい。

組換えＤＮＡ、７）発現系は、Ｉ　Ｉ−−７の生物学的な活性ともつ同系のＩＬ −７ポリベアチドまたはポリペプチドのその誘導体をコードするクローン３発現 ベクター中に挿入したものである。発現ベクターと宿主細胞へ導入する。宿主細 胞のタンパクの合成のための機構によって組換えＩＬ−７ポリベブチドを合成す る。

組換え発現ベクターは、ＩＬ−７ポリベブチドまたは生物学的な活性のあるその 誘導体をコードする合成またはｃＤＮＡに由来するＤＮＡ断片を含む、ＩＬ−７ ポリベブチドまたはその誘導体をコードするＤＮＡは、明乳雇、微生物、ウィル スまたは昆虫の遺伝子に由来するもののような適切な転写のまたは翻訳の制御を するヌクレオチド配列または構造遺伝子のヌクレオチド配列に適当な方法でつな げる。制御配列の例は、例えば遺伝子発現において凄制御の役割をもつ遺伝子の 配列（例えば、転写のプロモーターまたはエンハンサ−）、転写と制御するため の予備的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡ上のりボゾーム結合サイトをコー ドする配列、転写および翻訳の開始および終結を制御する適当な配列を含む。制 御配列な構造遺伝子に機能的に関連させるときには、ヌクレオチド配列を適当な 方法でつなげる。例えば、ＩＬ−７ポリベブチドの分泌に関与する前駆体Ｊ）ア ミノ酸配列としてシグナルペプチドを発現させるならば、シグナルペプチド（分 泌のための先頭配列）のためのＤＮＡ配列をＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘 導体のための構造遺伝子のＤＮＡ配列に適当な方法で結きさせることができる。

さらに、プロモーターのヌクレオチド配列が構造遺伝子のヌクレオチド配列の転 写を制御するならば、プロモーターのヌクレオチド配列をタンパクをコードする 配列（例えば構造遺伝子のＤＮＡ）に適当な方法で結きさせる。さらには翻訳を 促進させるためにリボゾーム結きサイトとベクター内に入れるならば、リボゾー ム結きサイトを構造遺伝子のヌクレオチドがアミノ酸をコードする配列（例えば 工Ｌ−７ポリベブチド）に適当な方法で結合させてよい。

同種のＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体の発現のための適当な宿主細胞は 適当なプロモーターの制御下で原核生物、酵母または高等な真核生物の細胞があ る。原核生物は例えば大腸菌またはバチルスのようなグラム陰性またはダラム陽 性の生物を含む。形質転換のために適当な原核生物の宿主細胞は、例えば大腸菌 （Ｅ、ｃｏｌｉ）、バチルス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ１１ 旦）、サルモネラ　チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ＩＬｔ紅１ユ旦ｒ ｉｕｍ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、ストレプトマ イセス（Ｓｔｒｅ　ｔ、ｏｍｖｃｅｓ）、およびスタフィロコッカス（多」」Ｌ ２山工Σｊ９　Ｃ−生−ｑ五」ｌ−Σ）属の中の探マな池の種？含む。高等な真 核生物の細胞は下に記述したように？ｔ”ｉ’ｌ頂３起源とする確立された細胞 系列を含む。本明細書中に開示したＤＮＡヅ）Ｉｌｌｌｌ築山来するＲ　Ｎ　Ａ を用いて、哺乳顕の同種のＩＬ−７ポリベブチドまたはその誘導体を生産するた めに無細胞系の翻訳系ら使用することができるだるう。バクテリア、真菌、酵母 、および哺乳まの細胞の宿主を部用するときの適当なりローニングおよび発現ベ クターは例えば、パウエルズ（Ｐ　Ｏｕｗ６１ｑ）ら、クローニングベ、フタ− ；　Ω１ｏｒ１１ｎｓＶ　ｅ　ｃ　ｔ　ｏ　ｒ　ｓ　；ΔＬａｂｏｒａｔｏ工ｖ 　Ｍａ　ｎ　ｕ　ａ　Ｉ　、エルセピア−（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、ニューヨーク 、１９８５の文献に記述されている。

Ｉ　ｉ、、−７ポリベブチドまたはその誘導体を酵母を宿主細胞として発現させ るときには、ＩＬ？ポリペプチドまたはその誘導体の発現のためにコードするヌ クレオチド配列（例えばｉ造遺伝子）は先頭配列を含んでよい。先頭配列を用い ることによって、酵Ｑを宿主細胞と１−なときめ翻訳したポリペプチドの細胞外 への分泌を改善することが可能である。

あるいは、大腸菌力ような原核生物Ｊ）宿主細胞においでは、原核生物の宿主細 胞におけろ組換えポリペプチドの発現と促進させるために、Ｎ末端にメチオニン 残基を含めてよい９Ｎ末端、′７１メヂオニシ残基は発現させた組換えＩＬ−７ ポリペアチドまたはその誘導体から切断されるがもじれない。

さらには、広範な夕〉′パフ分解またはジスルフィド結きを形成する過程を・ビ 要と１〜ｆｊ：い７１、−７ポリベブチドまたはその誘導体の発現のために原核 生物の宿主細胞を使用してよい９ 組換えＴＩ＝−７！１１造遺伝子力スクレオチド配列またはその誘導体を含む組 換え発現ベア々−を、適当な宿主の微生物または哺乳頂め細胞系列の実質的に均 一な培貢にトランスフェクトさせるがまたは形質転換させる。適当な宿主細胞の 例は、大腸菌のようなバクテリア、Ｓ、セレビシアエ（Ｓ、ｃｅ　ｒｅｖ　ｉ　 ｓ　ｉ　ａｅ）のような酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨ○）細 胞のような哺乳顕の細胞系列？含む。

形質転換された宿主細胞とは、ＴＬ−７またはその誘導体の構造遺伝子のヌクレ オチド配列で形質転換したまたはトランスフェクトさせた細胞のことである。

宿主細胞または宿主細胞への挿入された遺伝子の構築物の性質に依存して、発現 したＩＬ−７ポリベブチドは宿主細胞Ｊ）中に存在し、および′または培養土清 中に分泌される。

原核生物の宿主細胞にトランスフェクトさせる発現ベクターには１つ以上の表現 型として現れる選択マーカーが一般には含まれる。表現型として現れる選択マー カーとは例えば、抗生物質に対する耐性を与える、または自主栄養の要求？提供 するタンパクとコードする遺伝子および宿主内での増殖を保■するための宿主が 認識できる複製起源である。原核生物の宿主細胞のための池の有用な発現ベクタ ーには市販されているプラスミドに由来するバクテリアを起源とする選択マーカ ーが含まれる。二の選択マーカーはクローニングへフタ−であるＰＢＲ３２２（ ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子の成分を含めることができる。ｐＢＲ３２２はア ンビシリ〉およびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含んでおり、形質転換 した細胞と同定する簡星な方法を提供する。ＰＢＲ３２２の「骨格」の部分な適 当なプロモーターおよびＩＬ−７の構造遺伝子の配列に結きさせる。他の市販さ れているベクターには例えば、ＰＫＫ２２３−３　（ファルマシア　ファインゲ ミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウプサラ（ Ｕｐｐｓａｌａ）、プロモータ〉）およびｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　１　（プロメガバイ オチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）、マジソン（Ｍａｄｉ　５ｏｎ）　 、ライスコンシン州、アメリカ合衆国）が含まれる。

原核生物を宿主細胞とする組換え発現ベクターを使用するためにプロモーター配 列を一般に使用する。よく用いられるプロモーター配列は、β−ラクタマーゼ（ ベニシラーゼ）、ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら、Ｎ、ａ ｔｕｒｅ　ｇヱ旦巻：６１５ページ、１９７８年、およびゲーデル（Ｇ　ｏ　ｅ ｄｄｅ　ｌ　）ら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１巻＝５４４ページ、１９７９年）、ト リプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ゲーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら、Ｎｕ ｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、８巻：４０５７ページ、１９８０年：およびＥＰＡ３６゜ ７７６）およびｔａｃプロモーター（マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｍｏ１ ｅ　ｃ　ｕ　Ｉ　ａ　ｒ　二四立葺」：ΔＬａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｕｕａｌ、 コールド　スプリング　ハーバ−ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）４１２ページ、１９８２年）を含む。特に有 用な原核生物を宿主細胞とする発現系はファージλＰＬプロモーターおよびｃＩ ８５　”、　ｔ−ｓの熱に不安定なリプレッサー配列と用いたものである。λＰ Ｌ１０モーターの誘導体を寄託されているアメリカンタイプカルチャーコレクレ ヨンがら入手できろプラスミドには、プラスミドｐＨＵＢ２　（大腸菌菌株Ｊ　 Ｍ　Ｂ　９中に導入しである（ＡＴＣＣ３７０９２１’）およびｐＰＬｃ２８　 ＜大１ｊｉ菌ＲＲ１中に導入しである（ＡＴＣＣ５３０８２）　）が含まれる。

同種の哺乳類のＩＬ−７ポリペプチドおよび誘導体のポリペプチドと酵母の宿主 細胞、好ましくはサン力ロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｖｃｅｓ）属（例えば Ｓ、セレビジアエ（Ｓ　ｃｅｒｅｖｉｓａｅ））のイーストの宿主細胞中で発現 させる。二とができる。ビチア（ｐｉｃｈｉ；ｉ）またはクルイベロマイセス（ Ｋｌｕｖｖｅｒｏｍ　ｃｅｓ）のような池の属のイース１〜も使用できる。酵母 のベクターには、２μ酵母アラスミドに由来する複製起源の配列、自律的ｆｆ製 配列（ＡＲＳ）、プロモータ一部分、ポリアデニル化のための配列、および転写 終結のため力配列がしばしば含まれる。酵母ベクターには復製起源のための配列 および選択マーカーが含まれるのが好ましい。酵母ベクターのための適当なプロ モーター配列には、メタロチオネイン、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのアロ モーター（ヒンツェマン（Ｈｉｎｔｚｅｍａｎ）ら、Ｊ、Ｂｉｏ　１．Ｃｈｅｍ １旦二巻　２０７３ベージ゛、１９８０年）、エノラーゼ、グリセルアルデヒド −３−リン酸、デヒドロゲナーゼ、ヘキ゛／キナーゼ、ピルビン酸デカルボキシ ラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３− ホスホグリセリンＭノ、ターゼ、ビｌレビン酸キナーゼ、トリオ−、スリン酸イ ソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼのような他 の解糖の酵素のアロモーター（ヘス（Ｈｅ　ｓ　ｓ　）ら２．Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎ ｚｖｍｅ、　＆立盈　ヱ巻：　１４９ページ、１９６８年、およびハランド（Ｈ ｏ　ｌ　ｌ　ａｎｄ）ら、Ｂｉ。

ｃｈｅｍ、１７巻：４９００ページ、１．９７８年）が禽まれる。酵母での発現 において使用する池の適当なベクターおよびプロモーターはヒソツエマン（Ｈｉ ｔｚｅｍａｎ）、ＥＰ−Ａ−７３，６５７中にさらに記載されている。

例えば、大腸菌中での選択および複製のためのｐＢＲ３２２に由来するＤＮＡの 配列（、Ａ　ｍ　ｐ　’遺伝子および複製起源）を用いて、酵母ベクターと組み 立てることができる。酵母中での発現のための構築物に富めることができる池の 酵母のＤＮＡ配列は、グルコースによって抑制できるＡＤＨ２プロモーターおよ びα−因子分泌リーダーを含む。ＡＤＨ２プロモーターは、ランセル（Ｒｕｓｓ ｅｌｌ）ら、（Ｊ、　Ｂ　ｉ　ｏ　ｌ　Ｃ１〕ｅｍ、　ｇ旦旦巻：　２６７４ペ ージ、１９８２年）およびベイアー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３ｉｆ１ 巻・７２４ページ、１９８２年）に記述されている。ゴース１〜α−因子先頭配 列によって外来のポリペプチドの分泌を促進する。プロモーター配列および構造 遺伝子配列力量にα−因子先頭配列をしばしば挿入する。例えば、クルヤン（Ｋ ｕｒｊａｎ）ら、Ｃｅ１１３０巻、９３３ページ、１９８２年：およびビター（ Ｂｉｔｔｅｒ）ら、Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　旦１巻：５３３０ページ、１９８ ４年の文献を見よ、１つ以上の制限サイトを導入するために先頭配列の３′末端 付近と修飾できる。これによって先頭配列と構造遺伝子に容易に結きさせること ができる。

当業者は酵母な形質転換させる技術と知っている。１つのそのようなプロトコー ルは、ヒネ７（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＣａｄ、Ｓｃ　 ｉ。

旦ＳＡ　二二巻：１９２９ページ、１９７８年の文献に記述されている。ヒネン （Ｈｉｎｎｅｎ）らのプロトコールでは選択培地中でＴ　ｒ　ｐ　”形質転換体 を選択するものであり、その際、選択培地は０．６７％酵母窒素塩基、０　５％ カザミノ酸、２°ｇグルコース、１０μｇ、’ｍｌアデニンおよび２０μｇ／ｍ ！ウラシルから成る。

ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターによって形質転換された酵母の宿主細 胞と、発現を誘導するために「栄養の豊富な」培地中で生長させてよい。栄養の 豊富な培地の例は、８０ノ、ｔｇ、／ｍｌアデニンおよび８０μｇ、′ｍｌウラ シルと添加した１？１．酵母エキス、２％ペプトン、および１？６グルコースか ら成る培地である。培地からグルコースが消責されつくすと、Ａ、　Ｄ　Ｈ２プ ロモーターの作用は抑制される。

組換えＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を発現させるために、哺乳類また は昆虫の宿主細胞の培養系も使用できるだろう。適当な哺乳類の宿主細胞系列の 例は、サル腎細胞の（＝Ｏ８−７系列（グルツマシ（ＧＩｕｚｍａｒ＋ン、Ｃｅ １１λ旦巻　１７５ページ、１９８１年）、Ｃ１２７細胞、３７３細胞、チャイ ニーズハムスター卵巣（ｃ　ＨＯ）細胞、ヒーラ細胞、およびＢ　）ｌ　Ｋ細胞 系列と含む。

適当な哺乳類の発現ベクターには、複製起源、プロモーター配列、ｉｌｌ造遺伝 子に連結させたエンハンサ−のような非翻訳成分、リポ−シーム結きサイト、ポ リアデニル化サイト、スプライシングのためのドナーおよびアクセプターサイト 、および転写終結配列のような他の５°または３°に近接する非翻訳配列が含ま れる。

哺乳Ｍｅ宿主細胞とする発現ベクター中で転写または翻訳と制御する配列？ウィ ルに源から入手できる。例えば、哺乳類の細胞のためのよく用いられるプロモー ター配列および工〉ハンサー配列はポリオーマ、アデノウィルス２、シミアンウ ィルスＪＯ（ＳＶ４０）、およびヒトサイト、メガロウイルスに由来する。例え ばＳＶ４０複製起源、初期および後期プロモーター、エンハンサ−、スプライシ 〉グサイトおよびポリアデニル化サイトのようなＳＶ−！Ｏウィルスのゲノムに 由来するＤ　Ｎ　Ａ配列を、哺乳類の宿主細胞において構造遺伝子の配列を発現 させるときに必要な他の遺伝−ｉ！−力成分を提供するために使用してよい。ウ ィルスの初期および後期プロモーターは、ウィルスの複製起源も含むかもしれな い断片ヒしてウィルスのゲノムから簡単に得られるので（フィアーズ（Ｆｉｅｒ ３）ら、Ｎ」ユｔ　ｕ　ｒ　ｅ　旦ニュ巻　１１３ページ、１．９７８年）、こ れらは特に有用である。

ＳＶ４０ウィルスの複製起源中に位ＩするＨｉｎｄｌｌ！サイトからＬＬＬＩサ イトへ伸びる約２５０ｂρの配列′５：含むならば、より小さなまたはより大き なＳＶ４０の断片も用いてよい。

さらには、同種の哺乳類のゲノムのＩＬ−７プロモーター、制御および／′また はシグナル配列を利用してよいのだが、ただしそのような制御配列は選択した宿 主細胞と組みきわせで不都合がないときに利用できる。典型的なベクターはオカ ヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびバーブ（Ｂｅｒｇ）によって発表されたように（ 鼠旦工、　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、３巻＝２８０ページ、１９８３年）構築できる 。

ＩＬ−２ポリペプチドおよびそのポリペプチド誘導体およびＩＬ−４ポリペプチ ドオ〕よびそのポリペプチド誘導体は、ＩＬ−７ポリペプチドについて本明細書 中で記ｉしたちのとほぼ同じ方法で、生産できる。さらにＩＬ−２誘導体は、Ｔ Ｌ−２レセプターのアゴニストとして作用できる非ペプチド性の化合物を含む。

ＩＬ−２レセプターは例えば、１９８４年７月２日に出願された米［Ｅｌ特許出 願第６２６．６６７号および１９８８年９月２３日に公告されたヨーロッパ特許 出願第ＥＰ　Ａ−０１６２６９９号に記述されており、この言及により前者の内 容は本明細書中に含まれるものとする。

［１ｉ乳顕のＤＬＮまたはＣＬＮ細胞は、正常な培養条件下では７から１０日を 越えて細胞培養中の試験管内で生き残ることはて′きない。ＩＬ−７ボυベプナ ドまたはそ力誘導体と培養培地に加えることにより、同一のまたは謬似の培養条 件下で長期間生き残れるようになり、１０日と越えてよく生長できるようになる 。さらには、同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体またはＩＬ−４ポリ ペプチドまたはその誘導体をさらに加えても、細胞の生存を伸長させるＩＬ−７ の効果を抑止しない。マウスのＤＬＮの培養にマウスＩＬ−２を加えると、細胞 の長期間の生存は伸長したが、罪微鏡てａ察すると、細胞は不健康で、見た目に は凝集しているように見える。さらには、培養時閏含伸ばすためにＩＬ−２のみ を用いて生体外で培養したＤＬＮ細胞は有意なＣＴＬまたはＬＡＫ活性を示さず 、加えるべきサイトカインとして最少のＩＬ−７を用いて長期間の培養中で維持 したＤＬＮ細胞は対照的である。さらに、有糸分裂を不活性化した腫瘍細胞群を 、ＩＬ−７ポリペブナドが存在するカルチャーに添加しても、逆にＤＬＮ細胞の 生存には影響しない。実際、ＤＬＳは細胞培養中に、特異抗原を提示する添加さ れた腫４細胞に対してしばしば細胞溶解性であり、有糸分裂を阻害された特異腫 瘍細胞の添加がＤＬＮ細胞の培養中の生存と培養されたＤＬＮ＃胞の増Ｎと誘導 することによって強めることを見いた出した。

増殖した哺乳類の細胞溶解性のＴリンパ球は、特定の抗原分提示している細胞（ 例えば、腫瘍細胞）に対して特異的な溶解性をもっている。細胞溶解性のＴ細胞 は、特定の抗原に予めさらした排膿しているリンパ節または池の供給源（例えば 抹消血液または膵臓）から得る。ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を含む 培養培地へ生体外でさらした後に、細胞溶解性Ｔ細胞は活性化された状態になり 、特定の抗原分提示する標的細胞に対する溶解の特異性を保持する。培養培地中 にＩＬ−７またはその誘導体を存在させてインキュベートして活性化させて増殖 させたＣＬＮｉ胞の溶解活性は、培養培地中にＩＬ−２ポリペプチドき加えてイ ンキュベートした同じ細胞よりもかなり強い、ＩＬ−７の存在下でインキュベー トしたＣ　Ｌ　Ｎ４１ｉ１胞はＣＤ８°ＬＡＫ活性を示す。しが〔特定の抗原と 認識するＴ細胞が好ましい、ＩＬ−７ポリペプチドの存在下でインキュベートし たそのような細胞の長期間の培養によって、ＬＡＫ（リンフ才力インによって活 性化されたキラー）活性を最小にして、そして特定の抗原を提示している標的細 胞（例えば、性は、ＩＬ−２め活性化に特有であり、ＩＬ−２によって活性化さ れたリンパ球の主要な活性である０本発明のＩＬ−７によって活性化された細胞 溶解性の７４１１１胞は、ｍ瘍細胞のような標的細胞に対する抗原の特異性によ って特徴づけられる、主要なＣＴＬ活性をもつ。ＩＬ、−２ポリペプチドまたは その誘導体および７′またはＩ　Ｌ　−，４ポリペプチド：ｊ、ｆＳはその誘導 体を培養培地へさらに加えることでＣＴＬ活性が増強される。しかし、Ｉ　ｉ、 、　−２および２．′またはＩＬ−４をさらに加えることで増強される治療的な 効果は最小である〈例えば、２倍）、さらに有糸分裂分阻害しｔ：特定の腫瘍細 胞をさらに加えることで、細胞溶解性のＴリンパ球３培貢中で増殖させるのを促 進するための特定の抗原の供給源を提供することができる。これ（こよって培養 におけるＤＬＮ細胞のＣＴＬ活性をさらに増強させることができる。

リンパ球？特定ｆ）抗原へさらす機会を与えた漫に、個体から同系の抹消リンツ マ球（例えばＤ　Ｌ　Ｎ細胞）を得る。そのような４＋ＩＩ胞を、例えば、Ｍ瘍 またはウィルスが感染しｔ：場所で排膿しているリンパ節のような、排膿してい るリンツマ節がら得ることができる。抹消リンパ球は、例えば、排膿しているり ンｊ　＜７ｉＥ２吸引または除去してさらに切開することによって得てよい、排 膿しているリンパ節から得たリンパ球を、ふるいのような機械的な手段によって リンパ球の単一の細胞憇濁液へ入れてよい。望ましくない繊維芽細胞を除去する ために細胞と細胞選別機で分まして、次にＴ　Ｌ、−７ポリペプチドまたはその 誘導体と含む培養培地へ入れてよい。

排膿しているリンパ節から得た細胞は一般に、特定の抗原に予めさらしなＴ細胞 の集団を含む、標準的な培養培地（例えば、ＲＰＭ１１６４０．１ｍＭピルビン 酸ナトリウム、２ｍＭグルタミン、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、５０ｕ／ｍｌペ ニシリン、５０ｕ／ｍｌストレプトマイシン、１０５１４胎児の牛の血清、およ び５　ｘ　１０−’Ｍ　２−メルカプトエタノール）を細胞へ加える。標準的な 培養培地の別の例は最小必須培地である。加湿したインキュベーター中で、空気 中で６％のＣＯ□、約３７℃のような、培養粂件は細胞の生存および増殖に最適 なものである。

ＩＬ−７ポリペプチドまたはＩＬ−７の生物学的な活性をもつその誘導体を培養 培地へ加える。加えるＩＬ−７ポリペプチドの量は、培養するリンパ球中でＣＴ Ｌ活性を誘導するのに十分な量にする。培養培地へ加えるヒトＩＬ−７の量は約 ２．５％ｇ７’ｍｌから約２０　ｎ　ｇ、’ｍ　Ｉまでが好ましい。加えるＩＬ −７ポリペプチドの量は約１０　ｎ　ｇ　７’ｍ　ｌであることが最も好ましい 。培養中での細胞の生存を増強させて、モしてＣＴＬ活性化を増加させるために 、他の化合物を培養培地へ加えることがてきる。培養培地へ加えるＩＬ−７誘導 体の量は誘導体の比活性に依存している。例えば、野生型のヒトＩＬ−７とほぼ 等しい有効性のある誘導体の場合には、重量を基準にして濃度になるように加え るだろう。他の化合物は、同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体および ／または同種のＩＬ−４ポリペプチドまたはその誘導体、および／または抗定の 抗原をもつ有糸分裂と阻害させた腫瘍細胞の集団を含む。加えるサイトカインの 培養での濃度は、Ｉ　Ｌ−２においては、約０．５から約２０　ｎ　ｇ、、−’ ｍ　ｌまでが好ましく、Ｉ　Ｌ−４においては約１から約２０ｎｇ／ｒｒ＋ｌま でが好ましい。

同種のＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体は、ＩＬ−２の生物学的な活性を 示す任官のポリペプチドまたは他の有機分子である。ＩＬ−２の生物学的な活性 は、ＩＬ−２レセプターのポリペプチドに特異的な生物種への結き能力によって 特徴づけられる。ＩＬ−２の生物学的な活性は、ＣＴＬＬまたはＨＴ２細胞の試 験管内での増殖の刺激によって測定することもできる。ＣＴＬＬおよびＨＴ２の 両細胞系列の生存は、培地中でのＩＬ−２活性の存在が依存する。

有糸分裂を阻害させた腫瘍細胞の集団から、リンパ球に予めさらしたのと同じ特 異性の抗原が生産される。有糸分裂の阻害とは、１１瘍細朧は「生きている」が （すなわち細胞の代謝および呼吸は可能である）、シカ化細胞５を裂およびコロ ニーの生長は実質的に不可能てｊｌ）ることと意味する。したがって、有糸分裂 を阻害したｌ１４Ｍ胞は、細胞溶解性の１９２８球および他の細胞Ｊ）型を培養 中で圧倒するまたは過剰に生長させる能力はもたず、培養培地への特定の抗原の 供給源となる。

本明細暑中で記述した培養条件下で生長させた本発明の細胞は、加えるべきＩ　 Ｌ−７の生物学的活性を加えなかったときよりも、Ｉ　Ｔ−−−７ポリベプ千ド またはそ力誘導体を培養培地に存在させたときに、かなりより長期間の生存がで きる。

培養！７たリンパ節細胞まｔ：は１９２８球は、加えるべきＨ−−７の生物学的 な活性を加えなか−）なときには最適な培養条件下でせいぜい７から１０日間は 試験管内て′生存することかて゛きるのみである。対照的に、同じ細胞がＩＩ、 −７の生物学的な活性の存在下で少なくとも１８週間は連続して培養できる。図 １９に印刷［。

ブこ写真は、マウスＩ　Ｉ−−＝２、マウスＩ　Ｌ−７またはマウスＩ　１．− −２およびマウスＩ　Ｌ−−−７の組みきわせの存在下で培養したマウスＤＬＮ ＋７１９週間後の培養のば微鋺写真を示す、Ｉ　Ｌ−７の存在下で（ＩＬ−２の 存在下または非存在下で）培養Ｌｆ［胞のみが活動的なままであり、培費カウエ ルの基部へ付着するための仮足をより多く示し、よりｆ！異的な（すなわち抗原 に特異的な）細胞溶解性の活性を維持しｔ二。ＩＬ−２またはＩ　ｌ−−２を加 えずに培養した細胞は生存てきず、研究て゛きないだろう。

排驕するリンパ節から得て、生体外で培養した細胞の集団はＣＴＬ活性を示し。

特定の抗原をもつ細胞に向けられたＣＤ８陽性Ｔ＠胞によって、およびＮＫ細胞 に特徴的なく非特徴的な溶解活性によって媒介される）非特異的なＬＡＮ活性を 相対的に欠損していることによって特徴づけられる。ＣＴｌ−活性は、特定の抗 原を提示するこれらの４１１１１胞にのみ向けられた溶解活性を示す、抗原特異 的な細胞溶解性のＴｌ胞によって媒介されると考えられている。ＣＴＬ活性は標 的細胞または抗原に特異的なので、Ｌ　Ａ　Ｎ活性よりもより好ましい溶解活性 の型である。したがって、ＣＴＬ活性をもつ細胞を用いた免疫療法では、非特異 的なＬ　Ａ　Ｎ活性をもつ細胞を用いたときの同等の溶解活性を利用するよりも 副ｆ％用とより低くする二とができるだろう。

ＩＬ−７ポリペプチドまたは生物学的に活性のあるそ１７＋誘導体を生物学的に 効果のある量で存在させて培養して活性化させた培養した１９２８球を選定免疫 療法の盟で個体へ投与する。生体外て細胞内めＣＴＬ活性を活性化させるために 用いた特定のサイトカイン（例えばＩＬ−７およびあるいはＩＬ−４および／ま たはＩＬ−２）を細胞とともに投与することができる。サイトカインの１日当た り力投４量は、ＩＬ−２のＭＩ５会には約１０から約２０００μｇ　／ｋ　ｇ、 ・７日、ｌｌ−−４および■Ｌ−７のＰ５合には約４から約１０００μｇ　／’ 　ｋ　ｇ　、７日を含むことが好ましい。ＩＬ−２の１日当たりの投与量は３回 の投与に分け、ＩＬ−４およびＩＬ−７の堝きには２回に（ｂｉｄ）分けるのが １番好ましい。

リンパ球細胞は、ＩＬ−７ポリベプナドまたはその誘導体の存在下で少なくとも ４日間培養して活性化させることが必要である。活性化させた細胞の集団と個体 へ静脈注射によって、または腫瘍の部位へ直接注射によって投与する。活性化さ せた細胞の集団を他の可能な投与方法を用いて投与してもよい。

特定の抗原ご提示する細胞は、ＣＴＬ活性の標的である。特定の抗原は、例えば 、！Ｉｌ瘍細胞の特定の集団によって提示される抗原であり、または、ウィルス に感染された宿主細胞の集団によって提示されるウィルスの抗原である。既知の 腫瘍の抗原の例にはＭｅｔｌｉＡ、腫瘍Ａ５、およびＰ　８１５　ＷＫＡ　ｓが 含まれ、既知のウィルスの抗原にはインフルエンザ、ワクシニア、およびリンフ オコリオメニンギチスウイルスが含まれる。特定の抗原を提示する細胞は活性化 させたリンパ球のＣＴＬ活性の標的細胞になる。

以下の例では、本発明の様々な面を説明することをめざした。

！立型１ この例では、ＤＬＮの試験管内の培養培地へＩＬ−７ポリペプチドと加えたとき の効果を説明する。培養培地へのｒＬ−７の投与は、試験管内での抗腫瘍ＣＴＬ 活性、および生体内での抗腫瘍の治療の効力を増強する。ＣＨ３マウスへ３×１ ０’ｆ［Ｉの１０２４１１瘍細胞を注射した。１０日後に無菌条件下で排膿して いるリンパＢｉ　（ＤＬＮ）　ｔ−手術して取り出して、分離して単一の細胞懸 濁液とし、組織培養中へ１いた。１９８８年１０月７日に出願された米国特許出 願第０７７７２５５．２０９号に記述されたように、組換えヒトＩＬ−７を培養 培地中に０（コントロール）、２．５，１０．および２０　ｎ　ｇ／”ｍ　Ｉの 濃度で加えた。なお、前述の特許出願の内容はこの言及によって本明細書中に含 まれるものとする。

１０２４Ｉｌ瘍に予めさらさなかったＣＨ３マウスがら得たコントロールのリン パ節（ＣＬＮ）細胞を同時に培養したものを同じ培養培地へ１いた。

培養を始めてから４日後に、試験管内での細胞溶解活性について培養の一部分を アッセイした。リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１１旦巻：１５ ２１ページ、１９８６年の文献に記述されているように、細胞溶解活性は６時間 書の５１（’、−放出アッセイによって決定した。２０　ｎ　ｇ、”ｍ　ＩのＩ 　Ｌ−７ｐ用いて培養したＣＬＮ４１［１胞は、ＩＬ−７によって誘導されて残 存するネズミＬＡＫ活性に一致したわずかなそして「適度な」細胞溶解活性を示 した。培地のみで培養したＤＬＮ細胞は、培養培地へ加えるべきＩＬ−７を加え なかったときの抗腫瘍細胞溶解活性を示した。し力化、ｍ胞溶解活性は、培養培 地へのｒＬ−７の添加によってかなり増強された。細胞溶解のデータを図１に示 す。図１では、ＩＬ−７なしで培養したＣＬＮ、２０ｎｇ、／ｍｌのＩＬ−７を 用いて培養したＣＬＮ、ＩＬ−７なしで培養したＤＬＮ、および異った濃度のＩ Ｌ−７を用いて培養したＤＬＮについての、標的細胞に対するエフェクター細胞 のいくつかの比における細胞溶解活性（すなわち、溶解のパーセント）と比較す る。ＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮは、標的細胞に対するエフェクターの全て の比において最も大きい溶解活性を示した。

培養した細胞の生体内での効力は、数を数えたＤＬＮ細胞（１〆１ｏ“、３×１ ０６、または６Ｘ１０’細胞）を、ＩＬ−７の存在下または非存在下で培養して ＣＨ３マウスの集団（１集団当たり４匹のマウス）へ選定的に（静注によって） 移すことによって決定した。もともと備わっている初期免疫応答を起こさせない ために、マウスに予め致死量に近いの量の（５００ラド）の放射線を照射した。

コントロールのマウス（５００ラドと照射した）には細胞ご注射しないまたは２ ０　ｎ　ｇ　、／’　ｍ　ｌのＩＬ−７の存在下または非存在下の培養培地中で ４日間培養した６１−４１０’個のＣＬＮａ胞を注射した。全ての処理をする集 団のマウスには５メ１０″個の生存能力のある１０２４１１瘍細胞を皮肉へ注射 して免疫性をテストした。腫瘍の生長速度を、腫瘍の大きさくｍｍＪを測定する ことで、その後の３６日間以上の期間にわたって決定した。

ＩＩ瘍の攻撃は、細胞を注射しなかった、または２０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ｌのＩ Ｌ−７を用いて培養した６Ｘ１０’個のＣＬＮ＃１Ｉｉ２！を注射した、放射線 を照射したマウスにおいて同じ速度で生長したく図２）。ＩＬ−７の非存在下で 培養した、Ｉ　Ｘ　１０’。

３Ｘ１０’または６Ｘ１０’ｌｌｌのＤＬＮｔｓ胞を注射したマウスにおいては ｍ瘍の生長速度がかなりより遅かったが、しかし！瘍細胞は検出されなかった（ 図２）。

２０　ｎ　ｇ２−’ｍ　ＩのＩＬ−７中で培養した３　ニー’　ｌ　Ｏ’または ６Ｘ１０’個のＤＬＮ４１胞を注射したマウスでは、全ての例において腫瘍の攻 撃を拒絶することが明らかになった。２０　ｎ　ｇ７”ｍ　ｌのＩＬ−７中で培 養したＩ　Ｘ　１０’個のＤＬＮ４１胞を注射したマウスにおいては、培地のみ で培養した６Ｘ１０’個のＤＬＮ細胞を注射したマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃 が生長した。これらのデータは、Ｉ　Ｌ−７の非存在下で培養した同じＤＬＮ＃ Ｉ１ｍよりも、ＩＬ−７を用いて培養したＤＬＮ細胞は約６＠の生体内での治療 効果があることを示している。

図３および図４には、培養培地にそれぞれ１００ｇ、／ｍｌおよび２．５ｎｇ、 ／ｍｌのＩＬ−７を含めたときの同じ腫瘍の生長速度をＩＩＩ察したときの結果 を示す。

これらのデータ（図１−４中の）は、抗腫瘍性の細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ ）の活性を用いた治療の効力は、培地のみでＤＬＮ細胞の培養と比較して、ＩＬ −７を含む培養培地中でのＤＬＮ細胞の生体外での培養によって約６倍に増強さ れる。２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を用いて培養したＣＬＮ細胞を注射したマウス では、ＩＬ−７の非存在下で培養したＣＬＮ細胞を注射したコントロールのマウ スと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したので、ＤＬＮ［ｌ胞を培養したときに用い たＩＬ−７の生体内での抗Ｍ瘍の効果を、ＩＬ−７が誘導した非特異的なＬＡＫ 活性のためであるとは考えられない。

寒應男ス この例では、細胞溶解性のＴｍ１ｌａを生体外で培養する際に、ＩＬ−７ポリペ プチドとともに培養培地へＩＬ−２ポリペプチドを加えるときの効果を説明する 。

実施例１で記述したように、ＤＬＮおよびＣＬＮをＣＨ３マウスから得た。８日 前にＤＬＮ４１１胞を２Ｘ１０’個の生存能力のある１０２４１！瘍細胞へさら した。

ＤＬＮおよびＣＬＮ４１１１胞を分離して単一な細胞懸濁液にして、完全ＲＰＭ １１６４０培地中で培養した。培養培地には、（Ａ）加えるべきサイトカインを 加えないコントロール培地、（Ｂ）２ｎｇ、′ｍｌ　ＩＬ−２、（Ｃ）２０ｎｇ 、／ｍｌＩ　Ｌ−７、（Ｄ＞Ｌｏｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−７、（Ｅ）２ｎｇ／ｍｌ　 ＩＬ−７、または（Ｆ）２ｎｇ、／ｍｌ　ＩＬ−２＋１０ｎｇ、／ｍｌ　ＩＬ− ７の中め任意の１つを補った。実施例１で記述したように、培養を始めてから４ 日後に、６時間の”Ｃｒ放出アッセイを用いて各培養から採ったｍ胞の一部分を 、抗Ｊｌ瘍性の細胞溶解活性についてアッセイした。

図５には、サイトカインを含まない培地中で培養したＣＬＮａｌ胞を用いると、 抗腫瘍性のエフェクター細胞の活性が検出されず、そして２　ｎ　ｇ／ｍ　ｌの ＩＬ−２３含む培地中で培養したＣＬＮ細胞を用いると、低いレベルのＬＡＫ活 性が検出されたことを示す、培地のみで培養したＤＬＮ細胞を用いると抗腫瘍性 のＣＴＬ活性があり、そして２　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌのＩＬ−２（Ｂ）を培養培地 へ加えたときに、このＣＴＬ活性はかなり増強されたく図５）。

生体内での治療の効力は、実施例１と同じ方法で１０２４腫瘍の大きさを測定す ることによって測定した０図６には、加えるべきサイトカインを加えない培地中 で生長させたＣＬＮ細胞および２ｎｇ、／ｍｌのＩＬ−２（Ｂ）を用いて生長さ せたＣＬＮ細胞を注射したマウスでは、細胞を注射しながったコントロールの放 射線を照射したマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したことを示す０図６では 、この実験において、サイトカインの非存在下で培養した６Ｘ１０’個のＤＬＮ 細胞では、コントロールの集団と同じ速度で腫瘍が生長したので、培養したＤＬ Ｎ細胞の治療の効力は無視できたことをさらに説明しでいる。より少ない数のコ ントロールのＤＬＮ細胞を注射したマウスでは、コントロールの集団で観察され たのと同じ速度で、またはコントロールの集団で観察されたよりも速く、腫瘍の 攻撃が生長した。Ｉ　Ｌ−２（２ｎｇ／ｍ　ｌ　）を用いて培養したＤＬＮ！胞 では、コントロールの集団よりもｍ瘍の攻撃の生長は遅かった（図６）。

図７．９および１１では、２．１０または２０　ｎ　ｇ７”ｍ　ｌのＩＬ−７の それぞれを含む培地中で培養したＤＬＮ４Ｂ胞では、培地のみで培養したＤＬＮ ４１Ｂ胞と比較して、抗腫瘍性の細胞溶解活性が著しく増強されたことを示す。

（数を数えたエフェクター細胞を注射したマウスにおける腫瘍の生長速度によっ て決定した）ＤＬＮ＄１［１胞集団の生体内での治療の効力は、２　ｎ　ｇ／ｍ 　ＩのＩＬ−７および１００ｇ　／’　ｍ　ｌのＩＬ−７を用いて培養したＤＬ Ｎ細胞を使用すると約６倍に、そして２０　ｎ　ｇ、−’ｍ　ｌのＩＬ−７を用 いて培養したＤＬＮ細胞を使用すると約１２倍に増強されることが見い出された く図８．１０および１２を見よ、）。Ｌｏｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２ｒＩｇ ７′ｍｌのＩＬ−２中で培養したＣＬＮ細胞は、生体内での任意の検出できる治 療効果を媒介しなかったが、試験管内での重要な腫瘍殺傷性のＬＡＫ活性をもつ ことが明らかになった（図１３）、Ｌｏｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２　ｎ　ｇ ｙ’ｍ　］のＩＬ−２中で培養したＤＬＮ細胞では、培地のみで培養したＤＬＮ 細胞と比較して、治療の効力が１２倍に増強されるのが明らかになった（図１４ ）。

これらのデータは、４日間の生体外での培養期間中にＤＬＮ細胞の集団から生じ る抗腫瘍性のＣＴＬ活性による治療の効力は、ＩＬ−７またはＩＬ−７を主とし てＩＬ−２を加えた組み会わせと含む培養培地中でＤＬＮ＃胞を培養することに よって、約６倍から約１２倍までに増強できることを説明している。しかし、加 えるべき唯一のサイトカインとしてＩＬ−２を用いて（ＩＬ−７を用いずに）培 養培地中で培養したＤＬＮ細胞は、生体内でわずかにより強い治療上の活性を示 した。２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２またはＬｏｎｇ／ｍｌのＩＬ−７および２ｎｇ／ ｍｌのＩＬ−２中で培養したＣＬＮ細胞の投与では、細胞で処理しなかった、ま たはサイトカインの非存在下で培養したＣＬＮ細胞で処理した、放射線を照射し たコントロールのマウスと同じ速度で腫瘍の攻撃が生長したので、治療の効力の 増加はＬＡＫ活性のためとは考えられない。

Ｘ旌凹旦 この実施例では、長期間の培養条件下で維持したＤＬＮおよびＣＬＮ細胞によっ て与えられる抗腫瘍性のＣＴＬ活性を説明する。Ｂ１０マウスにＢＩｏ、５腫瘍 細胞を注射した。９日後にＤＬＮｍ胞を得た。　８１０．５１１瘍細胞にさらさ ないＢＩＯマウスからＣＬＮ細胞を同時に得た。リンパ球を単一な細胞の懸濁液 中に置き、そして４日間完全ＲＰＭ１１６４０培地中で培養した。加えるべきサ イトカインを加えない培養条件で４日間培養した後に、示したような加えるべき サイドア′ｒ代、ｊ’−ｉ　＋、ｉび　；：′；′″：（１丈右糸４＞裂を阻害 マーを二魁ヤ１ら噸胞を用いｌ、へ異なる培邪、嬶・ｆ↑へＴ−）　Ｌ　ｌ’ｉ ご団）・ｊ、を（１；１．グー。−合糸シチク混で阻′占［−ｔ・腔席細胞は加 ころが、ＩＪ口ｇ−ろべき（サイドブ１イ）ター！ｎ、＋ｅ寸″に（＞、、　、 ”：、べ一用〜１プニ１月、Ｎ細胞、グ）培羨は　過剰Ｃ１，生几して脛癌肥胞 に１・・／′Ｉ′：、、逆に、加ズ、ろべ”：、Ｔ　Ｌ、−７ｊ；よび有基５Ｆ ’ＱＪを阻害し、たＩ瘍細胞ｔ：＋、Ｉ−びあるいは他の）フィトカイ：・を用 いてイン４．　フ、　／＼−１＝　１．−たＤＬＮ細胞の培養はＩ−）ｌ−Ｎ　 Ｍ胞の培覧の：！ま／ど−）た。特異的なりｌ−０，５腫瘍細胞才）よび交差反 応性０）ないＢｌＯ，２腫瘍細胞系列を用いた、実績例１および２と同じ方法で 、腫瘍の大きさを測定することによ−）で、生木内での抗腫瘍の効力分決定した 。

図１５には、Ｄ　Ｌ　Ｎ細胞は８１０．５１！ｉ瘍細胞の攻撃を拒絶したが、Ｂ １０２腫傷の攻撃を拒絶しなか−）たこと分示す。期待されたように、ｃｔ−Ｎ ｉ胞は、いずｈｙ４ｆｌｆｔ細胞系列の拒絶も媒介しなかった。

Ｂ１０マウスから得た細胞で長期間のＤＬＮおよびＣＬＮ培養を確立した。

（２０００ラドで）放射線を照射したＢ１０５の特異的な腫瘍細胞な各培地へ、 応答細胞、刺？ｒ１．細胞の比が５．１になるように加えた。培養培地はサイト カインの補給、または５ｎｇ、’ｍｌのＴＬ−２、ｌ　Ｏｎ　ｇ／ｍ　ｌのＩＬ −７または１０ｎｇ、、’ｍｌ力Ｉ　Ｉ−、−７及び２　ｎ　ｇ、’ｍ　ｌのＩ Ｌ−２の補給のいずれかをなされなかった。明射睡瘍ｍ胞を各ＤＬＮ培葺ノ＼添 加した。放射線の照射量（２０００ラド）は、！ｌ瘍細胞の有基分スを完全に阻 害するためには不十分である。加えるべきサイトカインを加えないＤＬＮの培養 は完全に過剰な生長分して１１ｆ！！！細胞になった。ある方法て゛サイトカイ ンを加えた他力ＤＬＮ培！では、加えたｌ１１１ｉ細胞を殺して、増殖を続けた 。サイトカイン分同じ濃度で用いてＤＬＮ培黄を維持したが、］、かし、放射線 を照射した腫瘍細胞？用いた？麦の試験管内での刺激は行わなかった。

加える八、きサイト・カインを加えたＤ　Ｌ　Ｎ培養を５Ａ間続けて、そして試 験管内での細胞溶解活性についてアノ七イした。図１（って、培養を始めてから ５週間漫力全ての場自に、抗腫瘍性の特異的なＣＴ　Ｉ−活性が検出されたこと 分示す。Ｂ１０２（非特異的な）腫ｆｔＩＩ細胞を用いて攻撃したときに、細胞 溶解活性は検出されなかった。これらのＤＬＮ細胞の集団ご）フローサイトメト リック分析（図１７）かｔ゛２、これらはｒｒ、）Ｓ’Ｔ細胞が支配的である二 とがわかった。

長ｊ引ｍ１の培にて惟持しｆ■−）Ｌ心１相胞が生体内７．１フ）−１の拒朝汁 ！く７介テ二゛きるがと７うカラ決定した９同系Ｊ１　Ｂ　］、　Ｏ’Ｘ　’７ ７４．−５００５トノｌｉｚ射線３丁照射１１．を二。長１男１１；Ｉ（５週間 ）のｒ）Ｌ、　ｐ＋細胞に２・ｊ０６綱胞）の培覧をｕｉ鴇計４射−１゛′　力 妹・ｉ繍を照射したマウスノ＼投与した。皮肉注射によっ゛Ｑ投与Ｌし’ｓ５　 ’！　１０’個の肥瘍絽胞て′マウスを攻撃した。腫瘍の生長は、腫瘍、７）大 きさ分渡ｊ定することて・決定した。■３］、０．５（特異的な）」−たζ、ｔ 、８１０．２（非１Ｙ異的な）腫瘍細胞をＸ５０撃に用いｌ、二。

Ｉ　Ｌ−７ｇ古む培蓑培地中で維持したＤＬＮａｌ胞のみが、特異的なくすな・ わぢ、Ｂ１．０．５）腫瘍の攻撃ご拒絶てきたが　Ｌ７がし非特異的な（すなわ ち、Ｂ１．０．２）腫瘍の攻撃は拒絶できなかったく図１８）、培養培地へさら にＴＬ−２を加えても、ＩＬ−７の有益な効果を損わながっ１５−０これらのデ ータは、治療上有効な抗腫瘍性のＣＴＬ活性は、ＩＬ−７単独で、またはＩＬ− ７およびＩＬ−２の組みきわせ分含む培養培地中で生来外で時間分延長して（少 なくとも５週間）維持することができることを示す。ＩＬ−２のみを含む培地中 で培養したＤＬＮ細胞は、生体内て′の免疫療法の効力をテストするのに十分な 程度までのリンパ球の生長を維持できなかったので、最も重要な要素は、ｒＬ− ７を培養培地中へ加えることのように見える。

浄書（内容に変更なし） Ｊｆｆ、ｆＯＺ４ＣＴｂｅＣ３Ｈ１：ＪｔｆろＭ’ｉＥｌニー％−λｂｌＣ−１ 例切茶＋　ｉｏ　１００ １７Ｌクター禰的のｔｊ 浄書（内容に変更なし） ｆｌ！偽ｎＪ欠ｌＰ後０９枚 浄書（内容に変更なし） 脛毒の攻撃イ身−日数 浄書（内容に変更なし） ｆｆ４の戊撃復３日　数 浄書（内容に変更ない τル々史官内？−／ｊｆｆ−１０２４ＣＴＬｎｉ度に」ｉλろＩＬ−２１ｎ効果 Ｉ）１クター、゛半欺ｈす＃比 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更なし） エフェクター３０艮的ｎｔｔ 浄書（内容に変更ない ［ｌＬ−７１−２ｎｇ／ｍ１　９７％　ｓ　攻９４＆　）ａ　表浄書（内容に変 更なし） エフェクター二Ｊｔ的のｉＬ 浄書（内容に変更なし） ［１Ｌ−７］−１０ｎｇ／ｍｌ　ｎ、１％ａ攻１ｑＦｌｉｓａ牧ＦＩＧ、１０ 浄書（内容に変更なし） エフエクター　Ｊ電的θｒし 浄書（内容に変更なし） ＩＬ−７］−２０ｎｇ／ｒｎｌ　脛ａｓ　Ｊｌ　’Ｉ　＃＆の日型浄書（内容に 変更なし） エフェクター：ａ的−辻 浄書（内容に変更なし） 浄書（内容に変更ない 浄書（内容に変更ない 式１突１ｒ内ζ゛周り慕りチ要４１２表陛符１ろ浄τ（内容に変更なし） 日ＴＣ−ＣＤａ化Ｏｇｔｏ） ＦＩＧ、１７ 浄書（内容に変更ない ＦＩＧＵＲＪＥ　ｉｇ 要約書 癌またはウィルス感染を有する個体の免疫療法であって１、予め＃ｆ異抗原にさ らされたリンパ球を得、リンパ球をｌ：Ｌ−７またはそれらの機能性誘導体の有 効１と接触させてＣＴＬ活性を１月ツバ球中に誘導させ、特異抗原を提示する細 胞についてＣＴＬ活性を有するリンパ球を個体に投与することから成る。

補正音の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　５年　１月２５ζ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．特定の抗原を提示する特定の腫瘍細胞て形成された癌を有する個体を治療す るための免疫療法であり：特定の抗原にさらしたリンパ球を得ること；リンパ球 中でのＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量のＩＬ−７ポリペプチドまたはそめ誘 導体を含む培養培地中で生体外でリンパ球を培養すること；そしてＣＴＬ活性を 示すリンパ球を個体へ投与することから成る方法。
2. ２．特定の抗原を提示する細胞に対して特異的な溶解性をもつ哺乳類の細胞溶解 性のＴリンパ球の増殖させた集団を形成するための方法であり、特定の抗原に予 めさらしたＴ細胞の集団を、生物学的に有効な量のＩＬ−７ポリペプチドまたは その誘導体を含む培養培地と接触させることから成る方法。
3. ３．培養培地にＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体をさらに含む請求項１ま たは２に記載の方法。
4. ４．ＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の濃度が約２．５ｎｇ／ｍｌから約 ２０ｎｇ／ｍｌまでである請求項１または２に記載の方法。
5. ５．ＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体、ＩＬ−４ポリペプチドまたはその 誘導体、有糸分裂を阻害した特定の腫瘍細胞の集団、およびこれらの組み合わせ から成るグループから選択した、有効量の細胞溶解刺激剤を培養培地にさらに含 む請求項１または２に記載の方法。
6. ６．さらに抗腫瘍性を示す量のＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体を個体へ 投与することから成る請求項１に記載の方法。
7. ７．癌の免疫療法のための活性化させたリンパ球の集団で、少なくとも２ｎｇ／ ｍｌのＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の存在下での生体外の培養中で少 なくとも１０日間生存するリンパ球の培養から成り、ここで同系のリンパ球がＣ Ｄ８隔性Ｔ細胞を特徴とするＣＴＬ活性を示す培養から成る集団。
8. ８．特定の抗原を提示する特定の腫瘍細胞から形成される癌の選定免疫療法のた めの、活性化させたリンパ球の集団で；特定の抗原にさらしたリンパ球を得るこ と；リンパ球中でのＣＴＬ活性を誘導するのに十分な量のＩＬ−７ポリペプチド またはその誘導体を含む培養培地中で生体外でリンパ球を培養すること、によっ て生産される集団。
9. ９．培養培地中でのＩＬ−７ポリペプチドまたはその誘導体の濃度が約２ｎｇ／ ｍｌから約２０ｎｇ／ｍｌまでである請求項８に記載のリンパ球の集団。
10. １０．ＩＬ−２ポリペプチドまたはその誘導体、ＩＬ−４ポリペプチドまたはそ の誘導体、有糸分裂を阻害した特定の腫瘍細胞の集団、およびこれらの組み合わ せから成るグループから選択した、有効量の細胞溶解の刺激剤を培養培地にさら に含む請求項８に記載のリンパ球の集団。