JPH05509224A - エンドヌクレアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エンドヌクレアーゼ 本発明は一般的に、核酸を切断することの可能なエンドヌクレアーゼ；エンドヌ クレアーゼをコードするベクター；核酸エンドヌクレアーゼによって改質された 及び／又はそれを含むもしくはコードする宿主細胞及び生物；並びに生体内又は 試験管内での核酸分子の切断及び／又は不活性に関する方法に関する。

標的ＲＮＡの切断を及ぼすことのできるＲＮＡを含んで成る触媒性エンドリボヌ クレアーゼは既に詳細されている。このようなエンドリボヌクレアーゼは一般に ２種類に分類される。第１は、例えばＺｏｕｇら（Ｎａｔｕｒｅ、第３２４巻、 ４２９−４３３．１９８６）に詳細されている、生物テトラヒメナのミトコンド リア介在配列（ＩＶＳ）ＲＮＡに基づく、エンドリボヌクレアーゼの第２分類は 、植物ウィルスＲＮＡの自己切断領域に基づ＜　ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａ ｃｈ（Ｎａｔｕｒｅ、第３３４巻、５８５−５９１．１９８８　）による研究の 成果である。

本発明は今迄知られていなかったエンドヌクレアーゼに関する。

本発明の第一の観点において、次式（１）のエンドヌクレアーゼを提供する： Ｘ−Ｍ−Ｙ　（１） （式中、Ｘ及びＹは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはそ れらの組合せ又はそれらの誘導体を含んで成るヌクレオチド配列を示し：ここで このヌクレオチド配列は、このエンドヌクレアーゼによる切断が所望される標的 核酸配列に対するハイブリダイゼーシヨンが可能な十分なる長さであり；そして 式中、Ｍは次式（ｎ）の触媒領域を表わし：よるケトの置換；炭素＝炭素結合の 飽和化；及びノエードゥリジンにおけるＣ−グリコジル結合の導入がありうる。

チオケト誘導体の例は６−メルカプトプリン及び６−メルカプトグアニンである 。

塩基は種々の基、例えばハロゲン、ヒドロキシ、アミン、アルキル、アジド、ニ トロ、フェニル等によって置換されていてよい。

ヌクレオチドの糖成分は当業的によく知れている方法に従って改質されうる（Ｐ ｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ及 びＣＲＣＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、前記を参照のこ と）０本発明はヌクレオチドの糖成分の種々の改質を包含し、このような改質は エンドヌクレアーゼの切断活性を失わせないことも条件とする。改質された糖の 例は、第２ヒドロキシル基のハロゲン、アミノ又はアジド基による交換；２′− メチル化；構造変異、例えば０２′　−ヒドロキシル基がグリコジルＣ１−Ｎ結 合に対してシス配向してアラビノヌクレオシドを提供すること、及びα−ヌクレ オシドを提供する炭素Ｃｉでの構造異性体等が含まれる。

ヌクレオシドのリン酸成分も、当業界によく知られている誘導又は改質にかけら れる。例えば、酸素の窒素、硫黄又は炭素誘導体による交換はそれぞれホスホラ ミデート、ホスホロチオエート及びホスホネートを提供する。酸素の窒素、硫黄 又は炭素誘導体による置換は架橋又は非架橋部位において行なわれうる。ホスホ ジエステル及びホスホロチオエート誘導体が、細胞レセプターとのその結合にお そらく基づいて細胞に効率的に侵入しうる（特に長さが短いとき）ことは、アン チセンスオリゴヌクレオチドを包含する研究によってよく確立されている。メチ ルホスホネートはその電気的中性の性質により、おそらく細胞によって容易に取 込まれるであろう。

本明細書に述べているデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドは、エン ドヌクレアーゼの切断能力を破壊しない前記した１又は複数種の改質を包含する 。

触媒性領域の塩基及び／又はヌクレオチド１〜１１は、その他の化学物質、例え ばアミノ酸側鎖もしくはリンカ−であってその他の成分、例えば酸性もしくは塩 基性基を含むもしくは含まないものによって置換されていてよい０例えばＧ３は チロシンにより、そしてＣ′又はＡ　Ｉ　＋はヒスチジンによって置換されてい てよい。ある場合において、機能的に重要な化学物質（例えばヌクレオチド又は アミノ酸側鎖）を欠失させ、そしてこれを基質の一部として、又はこのエンドヌ クレアーゼをトランス作用させる補助因子として提供することが可能であること が実証されうる。エンドヌクレアーゼ活性を保有するこのような誘導体は本発明 の範囲に属する。

エンドヌクレアーゼは、このエンドヌクレアーゼをその基質とインキュベートし 、次いでこの基質の切断が起きたかどうかを評価することによって容易に、ＮＩ ｌに且つ日常的に試験される０例えば、標的＋＊ＲＮＡの切断はトリヌクレオチ ド配列Ｘ’　ＵＹ’　（Ｘ’及びＹ′は任意のりボヌクレオチドを表わし、そし てこれらは同一でも異なっていてもよく、そしてＵは塩基ウリジンを有するリボ ヌクレオチドを表わす）の後方で行われる。好ましい切断部位にはＧＩＪＣ，Ｇ υυ。

ＧＵＡ及びＵＵＣが含まれる。例えば、適切な反応条件は約り℃〜約６０’Ｃ（ 好ましくは約２０〜５５°Ｃ）の温度、約７．０〜約９．０のｐＨ２及び約１〜 約１００　ｍＭ　（好ましくは１〜２０ｍＭ　）の塩類（例えばＭｇ２°）より 構成される。エンドヌクレアーゼ配列Ｘ及びＹにおける相補性ヌクレオチドと基 質の重？ｊ［（デュープリケーション）を補助するため、群Ｘ及びＹのそれぞれ において、式（Ｉ）の群Ｘ及びＹのそれぞれの中に少ない数のヌクレオチドを含 むエンドヌクレアーゼ（例えば４個のヌクレオチド）は低い温度、例えば約り０ ℃〜約２５℃で一般にインキュベートしてよい、このエンドヌクレアーゼは一般 にこの基質と等モル比又はそれより過剰とされるであろう。しかしながら、この エンドヌクレアーゼは酸素として働いて、消費されることなく基質を切断するこ とができるので、エンドヌクレアーゼと基質の比は重要ではない。

前記した適切な切断部位、例えばＧＵＣ部位を含む標的ＲＮＡは、エンドヌクレ アーゼであって例えばその触媒領域内に１又は複数の改質を含みうるものとイン キュベートされうる。弐ｒのヌクレオチド配列Ｘ及びＹは、この標的ＲＮＡにお ける切断部位に隣接する（フランキング）ヌクレオチド配列に対して相補性（即 ち、塩基対合を形成することができる）であるものとして選ばれる。このエンド ヌクレアーゼとその基質のインキユバ−ジョンに基づいて、酸素／基質複合体が このエンドヌクレアーゼにおける相補性ヌクレオチドとその基質との塩基対合の 結果として形成される。弐（Ｔ）のヌクレオチド配列Ｘ及びＹ、並びにこの基質 における切断部位に隣接するヌクレオチド配列は、塩基対合の結果として二本鎖 を形成する。この塩基対合音当業界、おい、よく知られ、いる（　Ｓａｗｂｒｏ 。２１１．ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅ ｓｓ、　１９８９　；これは本明細書に参考として組入れている）。

相補性ヌクレオチド間の二本鎖の形成はハイブリダイゼーションと称されている （Ｓａ糟ｂｒｏｏｋら、前記）。エンドヌクレアーゼとその基質とのハイブリダ イゼーション又は二本鎖の形成は、例えば片方又は両方の成分を例えば放射性標 識体によってラベルし、次いでこの反応混合物を非変性条件のもとてポリアクリ ルアミドゲル電気泳動にかけることによって容易に評価されうる（Ｓａｉｗｂｒ ｏｏｋら、前記）。

もしこの標的がエンドヌクレアーゼとのインキュベーションによって切断された ら、これは活性であり、そして本発明の範囲に属する。

従って、ヌクレオチド誘導体を含むエンドヌクレアーゼは、日常的な手法におい てエンドヌクレアーゼ活性について簡単に試験されうる。

本発明が関連する業界における研究者によって容易に理解されうる通り、標的Ｒ Ｎ＾の切断は当業界によく知られる種々の方法によって容易に評価されうる（例 えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記を参照のこと）。

切断は、例えばこの反応生成物（ここで基質は放射活性的にラベルされている） をアクリルアミド、アガロース又はその他のゲルシステムに泳動させ、次いでこ のゲルをオートラジオグラフィー又はその他の分析技術にかけて切断フラグメン トを検出することによって評価されうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前記）。

群Ｐが結合を表わしているとき、これはヌクレオチドＡ７とＱｌの間の化学結合 、又は原子もしくは相互連結原子の群でありうる。

ヌクレオチド間の結合は塩基又は糖成分の間、即ち、糖と糖、塩基と糖、又は塩 基と塩基である。塩基内架橋は例えば本明細書に参考として組入れたＰｅｔｒｉ ｃら（１９９１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ、　Ｒｅｓ、＋　１９　：　５８ ５に詳細されている。この結合は塩基又は複環上の任意の位置から、又は塩基又 は複環上の任意の官能基から、このエンドヌクレアーゼが基質を切断することが 可能であることを条件として、伸びていることができる。

弐（ＩＩ）の群Ｐは、１又は複数個のヌクレオチドを表わすことができ、このヌ クレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、あるいはｌもしく は複数個のデオキシリボヌクレオチド又は１もしくは複数個のりポヌクレオチド の組合せ、又はその誘導体でありうる。この誘導体は前記した通りである。Ｐが ヌクレオチド配列を含んで成るとき、このヌクレオチド配列リボヌクレオチド配 列又は１もしくは複数個のりボヌクレオチドと１もしくは複数個のデオキシリボ ヌクレオチドの組合せを含んで成ることができ、その中でどの塩基も対合をなし ていないか、又は少なくとも一個の塩基が塩基対合をなしていることもできる（ 即ち、このことは全ての塩基が塩基対合をなしていること、及びどの塩基も対合 をなしていないことを含む）、他方、群Ｐは、どの塩基も対合をなしていないか 、又は少なくとも一個の塩基が対合しているデオキシリボヌクレオチド配列を含 んで成りうる（繰り返すが、このことは全ての塩基が塩基対合をなしていること 、及びどの塩基も対合をなしていないことを含む）、ヌクレオチド配列Ｘ及びＹ がリボヌクレオチドのみを含んで成り、そして群Ｐがリボヌクレオチドのみを含 んで成るとき、群Ｐのリボヌクレオチドは互いに塩基対合していない、任意的に 、ヌクレオチド配列Ｘ及びＹがデオキシリボヌクレオチドのみを含んで成り、そ して群Ｐがデオキシリボヌクレオチドのみを含んで成るとき、群Ｐのデオキシリ ボヌクレオチドは塩基対合をなしていないであろう。

出願人は、群Ｐにおける塩基対合は、標的ＲＮＡの切断にとって必要でないこと を発見した。従って、ヌクレオチド配列Ｘ及びＹがリボヌクレオチドのみを含ん で成り、且つ群Ｐがリボヌクレオチドのみを含んで成るとき、群Ｐのリボヌクレ オチドは標的ＲＮＡの切断を及ぼすこと以外の目的のために塩基対合しているこ とができる。このような目的には、細胞因子、例えばＲＮＡ結合性タンパク質又 はその他の細胞因子の結合を可能にすることを含んでいる。同様に、ヌクレオチ ド配列χ及びＹがデオキシリボヌクレオチドのみを含んで成り、且つ群Ｐがデオ キシリボヌクレオチドのみを含んで成るとき、群Ｐのデオキシリボヌクレオチド はエンドヌクレアーゼ切断に包含されること以外の目的、例えばＤＮＡ結合性タ ンパク質及びその他のタンパク質との相互作用であって、例えばエンドヌクレア ーゼの細胞分析を及ぼしうる目的のために塩基対合していることがある。

デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、それらの組合せ、及びそれらの 誘導体が塩基対合していないと言及されているとき、当業者はこのことが、周知 のヌクレオチド塩基対合、即ちワトソンークリック塩基対合及びツーブステン（ Ｈｏｏｇｓｔｅｎ）塩基対合等（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ａｃ１ｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、前記）に従ってヌクレオチドが他のものと塩 基対合をなしていないことを意味すると理解するであろう。

塩基対合がないことは本発明の好都合な特徴であり、なぜなら最少の数のヌクレ オチドを含んで成るエンドヌクレアーゼが以降に詳細な標準的な方法に従って製 造されうるからである０本出願人は驚くべきことに、群Ｐの中のヌクレオチド間 の塩基対合は、本発明のエンドヌクレアーゼがその標的基質を切断することを可 能とするのに必要ではないことを発見した。従って、群Ｐは任意の数の非塩基対 合ヌクレオチド、例えば２個のヌクレオチド（例えばＴＴ）、４個のヌクレオチ ド（例えばＡＡＡＡ、　ＵＵＵＵ、　ＴＴＴＴ他）又は５個のヌクレオチド（例 えばＴＴＴＴＴ）を含んで成りうる。このような条件のもとでの群Ｐのヌクレオ チド配列は重要でなく、且つヌクレオチドの数も重要でない、一般に、群Ｐは１ 〜２０個の非塩基対合ヌクレオチドを含んで成り、そしてより好ましくは２〜６ 個の非塩基対合ヌクレオチドを含みうる。注目すべき主たる概念は、得られるエ ンドヌクレアーゼが基質を切断することができることにある。これは前記した通 り、適当な標的ヌクレオチド配列に基づく標準的な切断アンセイにおいて、めん どうな実験を伴うことな（容易に測定できうる。

式（ＩＩ）における群Ｐはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又は 少なくとも１個のデオキシリボヌクレオチド及び少なくとも１個のりポヌクレオ チド、又はそれらの誘導体を含んで成ることができ、ここで前記した通り全ての ヌクレオチドは塩基対合をなしているか、又は一部のヌクレオチドが塩基対合を なしていることができる。式（１１）のヌクレオチドＡ７及びＧ８に連結してい るヌクレオチド配列Ｐにおける相補性ヌクレオチドは、ワトソンークリック塩基 対合、ツーブステン塩基対合、又はその他の当業界に知られる塩基対合をなして いることができる。群Ｐのヌクレオチド配列が部分的に塩基対合しているとき（ 即ち、全てでないヌクレオチドが塩基対合している）、塩基対合した領域と１又 は複数の一本鎖領域、例えば塩基対合したステムと塩基対合していないヌクレオ チドのループが提供されうる０例えば、ステム七ループの構造はＨａｓｅｌｏｆ ｆとＧｅｒ　１ａｃｈ　（前記）により詳細され、そして以下の配列を有する： 本発明に関する、このようなステム／ループ構造を形成する配列はデオキシリボ ヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はデオキシリボヌクレオチドとりボヌクレ オチドの組合せを含んで成る。

以上にもかかわらず、群Ｐのヌクレオチドは塩基対合していないことが好ましい 。塩基対合構造がないことは、このエンドヌクレアーゼとその基質又はその他の 核酸配列との立体障害を低め（従って、エンドヌクレアーゼ活性を高める）、そ して望ましくない塩基対合相互作用の可能性を低めうる。

式（ＩＩ）の群Ｐは、１又は複数個のりボヌクレオチド及び／又はデオキシリボ ヌクレオチドが、隣接するヌクレオチドを連結せしめるリンカ−によって変換さ れている前記したヌクレオチド配列を含んで成ることができる。任意の化学リン カ−１即ち任意の相互連結した原子の群を、ヌクレオチドＡ７とＧ８、又はヌク レオチドＣ′〜、へ７のうちのいづれかとヌクレオチドＧ８〜Ａ”のいづれかと を連結させるために用いることが、このエンドヌクレアーゼが基質を切断する限 りできる。このようなリンカ−の例はＰｅｔｒｉｃら、前記によって詳細されて いる。基質切断は前記した通り、エンドヌクレアーゼをその基質と簡単にインキ ュベートすることによって容易に評゛価されうる。

群Ｐの１又は複数個のりボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオチドは 、例えば任意的に置換されたポリホスホジエステル（例えばポリ（１−ホスホ− ３−プロパツール））、任意的に置換されたアルキル、任意的に置換されたポリ アミド、任意的に置換されたグリコール等と交換されていてよい、任意的な置換 基は当業界によく知られ、そしてそれにはアルコキシ（例えばメトキシ−エトキ ン及びプロポキン）、直鎖又は分枝鎖低級アルキル（例えばＣＩ−〇、アルキル ）、アミン、アミノアルキル（例えばアミノＣ，−Ｃ。

アルキル）、ハロゲン（例えばＦ、ＣＬ及びＢｒ）等が含まれる。任意的な１換 基の性質は、得られるエンドヌクレアーゼが基質を切断できる限り重要ではない 。

更に、適切なリンカ−はポリ環状分子、例えばフェニル又はシクロヘキシル環を 含むものを含んで成りうる。このような化合物は一般に、ヌクレオチドの反応基 を介して結合を可能とする適当な官能基を含んで成るであろう。

群Ｘ及びＹのヌクレオチドは、前記した通り標的ＲＮ＾における相補性ヌクレオ チドとハイブダイゼーンヲン形成できる十分なる任意の長さ及び配列でありうる 。このヌクレオチドは前記した通り、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオ チド、デオキシリボヌクレオチド　リボヌクレオチドバイブリド、又はその誘導 体の形態でありうる。これらの隣接配列は、エンドヌクレアーゼの分解からの安 定性を最適にするように選ばれうる０例えば、デオキシリボヌクレオチドはりポ ヌクレアーゼの作用に耐性である。ヌクレオチドの改質された塩基、塘又はリン 酸結合、例えばヌクレオチド配列のリン酸主鎖におけるホスホラミデート又はホ スホロチオエート結合もヌクレアーゼの攻撃に対する耐性を提供しうる。結合親 和性も、特定の条件において、ヌクレオチドを単にリボヌクレオチド、デオキシ リボヌクレオチド又はそれらの組合せの形態に施すことによって最適化されうる 。ある条件において、標的ＲＮＡの切断性を高めるため、群Ｘ及びＹの組成を最 適化することが必要でありうる。標的配列とハイブリダイズし、且つ全体的にデ オキシリボヌクレオチドより構成されている隣接ヌクレオチド配列を有するエン ドヌクレアーゼの切断活性はある条件において低い活性を有する。このような条 件における最適化は、このヌクレオチド配列Ｘ及びＹの中にデオキシリボヌクレ オチドとりポヌクレオチドの混合を施すことが含まれうる。

例えば、標的ＲＮＡの中の切断部位に近接するエンドヌクレアーゼの中のヌクレ オチドはりボヌクレオチドの形態でありうる。式（ＩＩ）のヌクレオチドＡ　” 及びｐＪ　＋　１は、剪断部位に隣接する標的配列と相互作用し、ここでＡ　Ｉ 　ｌは標的配列Ｘ’　ＵＹ’　（Ｘ’及びＹ′は前記した通り）のＵと相互作用 する。ヌクレオチドＮＩＺはＸ′で表わされているヌクレオチドと相補するよう に選ばれる。このようなヌクレオチド又は５′方向にあるヌクレオチドは例えば りボヌクレオチドの形態でありうる。標的配列が本発明のエンドヌクレアーゼの 一定の形態に対して比較的に耐性であることが示されているとき、ヌクレオチド 配列Ｘ及びＹを部分的又は完全にリボヌクレオチドの形態に施すことが必要であ りうる。以下に詳細のヌクレアーゼ攻撃からの保護が所望されるときがある。

群Ｘ及びＹの対応の５′及び３′末端は、エンドヌクレアーゼを分解から安定化 するために改質されうる０例えば末端ヌクレアーゼ攻撃、特に３’−５’へと進 行するエキソヌクレアーゼ活性を防ぐためにブロッキング基が加えられうる。例 えば、ブロッキング基は任意的に置換されたアルキル、任意的に置換されたフェ ニル、任意的に置換されたアルカノイルから選ばれうる。任意的な置換基はＣ１ −Ｃ，アルキル：ハロゲン例えばＦ、ＣＬ又はＢｒ；ヒドロキシ；アミノｉｃ＋ 　Ｃｓアルコキシ等より選ばれうる。他方、ヌクレオチド類似体、例えばホスホ チオエート、メチルホスホネートもしくはホスホラミデート、又はヌクレオチド 誘導体（例えばリポース成分のα−アノマー）であって、ヌクレアーゼに耐性で あるものが末端プロンキング基として利用されうる。

他方、エンドヌクレアーゼ分子のその他のヌクレアーゼに対する恩愛性を変化せ しめうる基をこのエンドヌクレアーゼの３′及び／又は５′末端に挿入すること ができる０例えば、エンドヌクレアーゼに連結された９−アミノ−アクリジンは 、エンドヌクレアーゼ分子にヌクレアーゼ攻撃に対する耐性を発生せしめるため の末端プロンキング基として及び／又はエンドヌクレオ溶解活性（ｅｎｄｏｎｕ ｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｃｔｉｖｉｔｙ）を補助するための挿入剤として働きうる ０種々のその他の基、例えばスペルミン又はスペルミジンが関連の手法において 用いられうろことが既に明らかであろう。

本発明のエンドヌクレアーゼは親和剤、例えばタンパク質、ステロイド、ホルモ ン、脂質、核酸配列、挿入分子（例えばアクリジン誘導体、例えば９−アミノア クリジン）等と共有又は非共有結合して、基質ヌクレオチド配列に対する結合親 和性が改質されうる、又は標的細胞に対する親和性もしくは細胞画分における局 在性等が高まりうる。例えば、本発明のエンドヌクレアーゼは、このエンドヌク レアーゼが標的核酸と並列することを補助して標的配列のハイブリダイゼーショ ン及び切断を行うようになるＲＮＡ結合性ペプチド又はタンパク質と結合してい ることがありうる。基質に対する親和性を高めるために、ヌクレオチド配列を群 Ｘ及びＹの５′及び３′末端に付加することができる。このような付加ヌクレオ チド配列は標的配列と三重へリノクスを形成することがあり（Ｓｔｒｏｂｅｌ、 　Ｓ、　Ａ。

ら（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ　３５０　：　１７２−１７４及び参考として含 まれている文献）、このことは分子内的に折りたたまれた基質との相互作用を可 能にする。他方、この付加ヌクレオチド配列内の改質塩基（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｓ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｒｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、前記に詳細の非天 然又は改質塩基）であって、−末鎖又は二量体ＤＮＡと一緒になって、基質にお けるヌクレオチドと塩基対合、二重鎖、又は四重鎖相互作用しうるちのが利用さ れうる。適切な塩基にはイノシン、５′−メチルシトシン、５′−ブロモウラシ ル及び例えば前記のＰｒ１ｎｃｉｐｌｅｓｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　５ ｔｒｕｃｔｕｒｅに詳細されている当業界によく知られているその他の塩基が含 まれるであろう。

本発明の他の観点に従い、前記した式（Ｉ）のエンドヌクレアーゼであって、前 記ヌクレオチド配列Ｘ又はＹのいづれかが、エンドヌクレアーゼによって切断さ れる標的ポリヌクレオチドを含んでいるものを提供する。このようなｕｐＪは標 的ＲＮＡの切断に基づいて活性ＲＮＡ　フラグメントの遊離をもたらすことがで き、このフラグメント自体エンドヌクレアーゼ活性を保有する。

本発明は他の観点に従い、次式（ｒＶ）のポリ−エンドヌクレアーゼを提供する ： Ｙ−Ｍ−Ｙ　−（Ｘ−Ｍ−Ｙ）　ｎ （式中、 Ｘ、　Ｙ及びＭは前記した通りであり、そしてｎは１〜１００の整数である）。

ポリエンドヌクレアーゼはアンチセンス分子（Ｈｅｌｅｎｅ、　（：、及びＪ− ＪＴｏｕ１ｍｅ’（１９９０）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ、　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃ ａ、＾ｅｔａ　１０４９　：　９９−１２５）及びエンドヌクレアーゼとして働 く能力を有する。「アンチセンス」とは、標的配列の相補性塩基とアンチセンス オリゴヌクレオチドとの塩基対合の結果としての二量体又は二本鎖配列の形成で あって、この二重鎖の形成の結果として、又はハイブリダイズしたＩ？ＮＡ及び ＤＮＡの配列のＲＮＡ成分を切断するのに働く細胞性リボヌクレアーゼ、即ち、 Ｉ？Ｎａ５ａ　Ｈによる切断に止っての鋳型の発生の結果として、前記配列の翻 訳が阻止されることを意味する。アンチセンスとして働く可能性は、本発明のエ ンドヌクレアーゼの群Ｘ及びＹが有意な数のヌクレオチド、例えば３０個以上の ヌクレオチドを含むときにも生ずる。このようなエンドヌクレアーゼと標的配列 として形成された二本鎖は周囲条件のもとでは解離又は容易に融解しないであろ う。

本発明の更に他の観点に従い、有効量の前記した弐（１）のエンドヌクレアーゼ を単独で、又は１又は複数の薬学的、獣医学的もしくは農業学的に受け入れられ ている担体又は賦形剤と一緒に含んで成る製剤を提供する。

弐（Ｉ）のエンドヌクレアーゼの有量な量又は治療的に有効な量とは、標的ＲＮ Ａの切断及び／又はその不活性化をもたらしく例えば、ヌクレオチド配列Ｘ及び Ｙが有意な数のヌクレオチドを含んで成り、これによってこのエンドヌクレアー ゼがこの標的に本質的に不可逆的に結合することを条件として）、これによって 人間、動物又は植物対象体における疾患を改善しめるのに有効な量である。どの くらいが有効な量のエンドヌクレアーゼを構成するかは、処置すべき疾患の性質 、対象体へのこのエンドヌクレアーゼの通用方法、対象体の重量、及び薬効に関 連する薬学業界によく知られているその他の要因に依存して変わりうる（Ｔｈｅ 　Ｐｈａｒ＊ａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｓ、第４版、Ｌｅｗｉｓ　Ｓ、　Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ａｌｆｒｅｄ　Ｇ１ １ａ＋ａｎ。

１９７０、　Ｔｈｅ　Ｍａｃｍｉｌｌａｎ　Ｃｏ＋ｗｐａｎｙ　、を参照のこと ）、あらゆる特定の状況においてどのくらいが治療的に有効な投与量を構成する かは薬学業界に知られている標準的な手順に従って容易に決定されうる（Ｔｈｅ 　Ｐｈａｒｖａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉ ｃｓ　、前記を参照のこと）０例えば、力価実験が採用でき、これは毒性及び薬 効を決定するために組織培養物においてエンドヌクレアーゼの効果を検査する。

次いで、毒性、薬効、投与の好ましい方法等を決定するため、動物試験を行い、 次いで人間患者で試験を行う。このような調査は前記した通り薬学業界において 日常であり、それ故エンドヌクレアーゼの治療的に有効な量は、医薬又は獣医学 目的のためにめんどうな実験を伴わないで容易に決定されうる。

本発明のエンドヌクレアーゼの治療的に有効な量は、投与形態、例えば局所適用 のためのクリーム、滅菌注射可能製剤、又は非経口投与に関するその他の製剤に おいては、一般的に約１ｎＭ〜約ＩＩＩＭの濃度を占めるであろう。局所製剤に 関して、約５０μＭ〜約５００μＭのエンドヌクレアーゼを利用することが一般 的に好ましい。ヌクレオチド誘導体であって、この誘導体が化学修飾基を包括す るもの、例えばボスホロチオエート又はメチルホスホネート誘導体を含んで成る エンドヌクレアーゼは、ナノムラ−濃度において活性でありうる。このような濃 度は毒性を避けるためにも採用されうる。

本発明のエンドリボヌクレアーゼを利用する疾患の処置を包括する治療的手段は 、一般にアンチセンス手法に含まれているもの、例えばａｎｔｉ　−５ｅｎｓｅ 　ｂｉｂｌｉｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　Ｃｈｒｉｓｌｅｙ、　Ｌ、　Ａ、（＋９９ ］）　ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ＋ｍｅｎ ｔ、　ｌ　：　６５　１１３（この文献及びその中に含まれている全て文献は本 明細書に参考として組入れる）に詳細されているものと同しである。特に、利用 するエンドヌクレアーゼの濃度、投与の方法、並びに関連の製剤はアンチセンス 適用にとって利用されているものと同しでありうる。

例示にすぎないが、本発明の治療製剤はｌ型及び２型ヘルペス単純ウイルス、乾 廚、頚部プレネオプラジア（ｃｅｒｖｉｃａｌ　ｐｒｅｎｅｏｐｌａｓｉａ）、 バピロマ病、並びに細菌性及び原核生物感染に対して利用されうる。

このような処１には、例えば疾患部位へのエンドヌクレアーゼの局所的な適用が 含まれる。例えばヘルペスウィルス傷害の処！において、エンドヌクレアーゼは 、これをｌｎＭ−１ｍ−の濃度りむクリームへと製剤化することができる。この クリームを感染部位に１〜１４日間適用することでこの感染の症状を改善せしめ ることができる。

ヘルペスウィルス感染の処置に関する局所製剤の最終開発の前に、このエンドヌ クレアーゼ及びそれを含む製剤の薬効及び毒性は、例えば動物モデル、例えば乱 切したマウスの耳に例えば２Ｘ１０’個のプラーク形成ユニットのウィルス粒子 を加えることに基づいて試験されうる。処置後のこの耳の中の感染性ウィルス粒 子の力価は、処置の効果、必要とするヌクレアーゼの量及び類似の概念を調べる ために検査されうる。

人体実験の前の動物モデルにおける類似の調査も行われ、それは例えば乾廚、パ リコマ病、頚部プレ不オブラジア、並びに灰色、例えばＨＩＶ感染症、細菌又は 原核生物感染症、ウィルス感染症及び種々の腫瘍性症状（これは有害ＲＮＡ物質 を含む）の処置に注目して行われうる。

薬学的及び獣医学的に受け入れられる担体及び賦形剤は当業界によく知られ、そ れには担体、例えば水、食塩水、デキストロース及び種々の糖溶液、脂肪酸、リ ポソーム、オイル、皮膚／！！透剤、ケル形成剤等、例えば本明細書に参考とし て組入れたＲｅ＋＊ｉｎｇｔｏｎ’　５Ｐｈｏｒ＋ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃ ｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、＋Ｅａｓｔ ｏｎ。

Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ、　０ｓｔｏｌ　ら編に詳細されているものが含まれ る。

局所適用にとっての製剤は一般にクリームの形態にあり、この場合本発明のエン ドヌクレアーゼを粘性成分と混合してよい。このようなｗ４様において、本発明 のエンドヌクレアーゼはリポソーム又はその他のバリアー型調製物の中に含まれ ていてよく、これによってこのエンドヌクレアーゼはヌクレアーゼ攻撃又はその 他の分解剤（例えばエンドヌクレアーゼ及び有害な環境条件、例えばＵｖ光）よ り遮断されている。　。

製剤は単位投与体、例えばカプセル（例えばゼラチンカプセル）、錠剤、座薬等 として提供されうる。注射用製剤は、食塩水、デキストロース又はその他の媒体 の中のエンドヌクレアーゼ無菌溶液の形態でありうる。経口投与にとっての製剤 は懸濁物、溶液、ンロノプ、カプセル、錠剤等の形態ありうる。エンドヌクレア ーゼは特効性製品、含浸包帯、パッチ等の形態においても提供されうる。本発明 において利用できうる薬品薬剤は例えばＲｅ＊ｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａ ｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、前記に詳細されている。

本発明のエンドヌクレアーゼは１又は複数種の抗−ウイルス、抗−カビ、抗菌、 抗生、抗原生動物又は駆虫薬、殺虫剤、農薬等、例えばＭｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ （１９８９）　、第１１版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、に詳細のものを 伴う製剤において提供されうる。

農学的に受け入れられている担体及び賦形剤は当業界によく知られ、それには水 ；界面活性剖；清浄剤；特に生物分解性清浄剤；タルク；無機及び／又は有機栄 養溶液；に物土壌及び粘土；炭酸カルシウム；石膏；硫酸カルシウム；肥料、例 えば硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム及び尿素；並びに植物源例えば穀類 、ミール及び小麦粉、ハークミールの天然生成物等が含まれる。

本発明のエンドヌクレアーゼは、本質的に全てのＲＮＡ配列がこのエンドヌクレ アーゼによって切断されうるという事実から広がる広範囲にわたる用途を有する 。標的ヌクレオチド配列ＧＬＩＣは、ランダムをヘースとして６４塩基ごとに約 １個の割合で見られる。一般的なエンドヌクレアーゼ切断部位Ｘ’　ＵＹ’　（ Ｘ’及びＹは任意のヌクレオチド）は、ＲＮＡ０中にウラシルが存在している限 り見られ、従って全ての標的ＲＮＡが本発明のエンドヌクレアーゼを用いること で、種々の効率ではあるが切断されうる。

試験管内利用に関して、本発明のエンドヌクレアーゼを一般に１又は複数個の適 当な切断部位を含む標的Ｒ）ＩＡと反応させる。任意的に、この標的１１ＮＡは 精製又は実質的に精製されていてよい９本発明のエンドヌクレアーゼのヌクレオ チドＸ及びＹは、特異的にハイブリダイズするか、又は標的ＲＮＡと二本鎖ＤＮ Ａ二量体を形成し、その後切断が行われることができるように選ばれる。従って 、標的ＲＮＡはその他のＲＮＡの存在下において特異的に試験管内で切断され、 その他のＲＮＡ　自体は本発明のエンドヌクレアーゼによって切断されないであ ろう。

このエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ操作を促進せしめるＲＮＡの特異的な切断に 関する制限エンドヌクレアーゼとＩ！（以の手法において利用されうる。このよ うな操作にとって必要とされる全ては、切断すべき標的ＲＮＡがウラシル塩基を 含み、それ故適切な切断部位を含むことにある。

本発明のエンドヌクレアーゼは診断手法、例えばＲＮＡの地図化又はフィンガー プリンティングに利用されうる。特に、本発明のエンドヌクレアーゼはＲＮＡの 地図化を可能とし、それ故ＲＮＡ配列における突然変異の検出に利用されうる。

このような手法は探索において用いることができ、そして法医学及びその他の診 断用途も有する。

試験管内でのＲＮＡ切断生成物は、例えばアクリルアミド又はアガロースゲル上 での識別化によって容易に検出され、この場合、切断されたＲＮＡ０量は分離及 びヌクレオチド識別剤例えば臭化エチジウムとの反応の後に直接識別されるよう に十分に大きいものである。

他方、切断された標的ＲＮＡが微量で存在しているとき、例えば数多くのＲＮＡ を含むサンプル中のとき、切断生成物は例えばこの標的配列に相補性な配列の放 射性標識化プローブを用いることにより、又は増幅技術例えばＰＣＲを用いるこ とによって検出されうる（　５ａａｒｂｒｏｏｋら、前記）。

試験管内での切断にとっての標的ＲＮＡは任意の起源に由来してよく、そしてそ れは動物、ウィルス、細菌、植物、合成的又はその他の起源でありうる。　ＲＮ Ａは全ての既知の生存生物に共通しているため、本発明は前記した適切な切断部 位を有する全てのＲＮＡ物貿の切断に利用されうる。

標的ＲＮ＾の試験管切断は、精製された、半端製された、もしくは精製されてい る状態における標的ＲＮ＾と、又は標的ＲＮＡを含むサンプルと、有効量のエン ドヌクレアーゼとの、ＲＮＡ切断を促進せしめる反応条件のもとで反応させるこ とによって簡単に行われうる。適切な反応条件には、約４°Ｃ〜約６０°Ｃ（好 ましくは約２０〜５５°Ｃ）の反応温度、約７．０〜約９．０のｐＨ１及び約Ｉ ＩＩＭ〜約１００　ｓ＋Ｍ　（好ましくは１〜２０１１Ｍ　）のＭ　ｇ　Ｚ　゛ を含んでいる。このエンドヌクレアーゼは、この基質と等モルの比において、又 はそれより過剰において存在していてよい。本発明のエンドヌクレアーゼは酵素 として働き、各エンドヌクレアーゼは複数の標的配列を切断するため、このエン ドヌクレアーゼは標的ＲＮＡに対して等モル比以下において提供されてよい。

本発明の観点に従い、試験管内での標的ヌクレオチド配列の切断のため方法を提 供し、この方法は、前記標的ヌクレオチド配列又は前記標的ヌクレオチド配列を 含むサンプルを、エンドヌクレアーゼと反応させることを、含んで成る。このヌ クレアーゼのヌクレオチド配列Ｘ及びＹ前記した通り、この標的ＲＮＡの特定の 切断部位に隣接するヌクレオチド配列と相補するように選ばれ、従ってこのエン ドヌクレアーゼの標的ＲＮＡへのハイブリダイゼーションに基づいて前記標的Ｒ ＮＡがこの特定の切断部位にて切断される。

ヌクレオチド配列Ｘ及びＹが有意な数のヌクレオチド、例えば３０個以上のヌク レオチドを含むとき、このエンドヌクレアーゼとその相補性標的との反応に基づ いて形成された二量体は容易に解離せず、従ってこのような標的ＲＮＡは切断に よってのみ不活性化されるのではなく、所望のタンパク質生成物への翻訳の阻止 、ＲＮＡ消化及び／又はその他のＲＮＡ　との相互作用の阻止によって不活性化 されうる。

本発明のエンドヌクレアーゼは原核生物及び真核生物細胞の両方における生体内 でのＲＮＡ切断のために利用されうる。

本発明のエンドヌクレアーゼは、前記した切断部位Ｘ’　ＵＹ’を含む、細胞内 における全てのＲＮＡを切断するのに利用されうる。従って、本発明のエンドヌ クレアーゼを利用することにより、本質的に全ての細胞性ＲＮＡが標的となりう る。

細胞、例えば細菌細胞、酵母細胞もしくは動物細胞における標的ＲＮＡの切断、 又は生体、例えば植物もしくは動物の細胞における標的ＲＮＡの切断は、表現型 改質又は疾をもしくは感染症の処置をもたらしうる。

植物細胞又は植物における表現型の変化は、耐乾性、耐塩性、カビ、ウィルスも しくは細菌に対する耐性；成長特性の改質；不実性；果実の生産；花づけ；老境 等を含む０表現型の決定に関与する、又は複数種のＲＮＡが同定できたなら、こ のようなＩＩＮＡは本発明のエンドヌクレアーゼを用いる切断によって不活性化 され、それ故この植物又は植物細胞の表現型を変えることができることが明らか である。

表現型に関与する標的１１８Ａの切断、それ故不活性化によって行われうる動物 （ある用途においては人間も含む）におけるの表現型改質には、動物の成長特性 、繁殖力、皮膚／美容的改質、再生特性、疾患耐性等が含まれる。真人な数の用 途が、前記した通り、動物及び植物における表現型改質に関して挙げられる。一 定の表現型に関与する１又は複数種のｌ？ＮＡが同定でき、そしてその配列が決 定されたなら、その後の表現型改質を伴うこのようなＲＮＡの不活性化のため、 エンドヌクレアーゼがこのようなＲＮＡが標的とするようにすることができる。

原核生物又は真核生物細胞培養物を、本発明のエンドヌクレアーゼによる処理に よって表現型改質させることができる。例えば、食品成分（例えばチーズ、パン 及び乳製品）及びアルコール飲料製品の製造に含まれる細菌培養物又は酵母培養 物を処理して、酵素内容物、風味の発生、細胞増殖率、培養条件等を改質するこ とができる。

本発明のエンドヌクレアーゼは人間、動物、植物又は原核生物もしくは真核生物 細胞における疾患又は感染症の処置にも利用されうる。疾患又は感染症の処置能 力は、本発明のエンドヌクレアーゼが、適当な切断部位（例えば前記した通り、 一般的な切断部位Ｘ’　ＵＹ’〔ここでＸ′及びＹ′は任意のヌクレオチドを表 わす〕によって定義される切断部位；好ましくはここでの切断部位はＧＵＣであ る）を含む全てのｌ？ＮＡを切断できる事実に基づく。はとんどのＲＮＡが１又 は複数の適当な切断部位を含むであろう。

処置時間は処置すべき特定の疾患に依存し、これは医師によって容易に決定され うる。一般的に処置は、処置すべき疾患が改善される迄行われうる。

本発明のエンドヌクレアーゼによって処置されうる人間及び動物の疾曇の例には 、ヘルペス単純ウィルス感染症（例えば初期遺伝子４及び５の切断を標的とする ）、乾廚、頚部プレネオブラジア、パピロマ病、ＨＩＶ　ｉ染症（例えば旧Ｖ− １ｇａｇ転写体及び旧Ｖ−１５’　ｌｔｒスプライス部位を標的とする）、細菌 及び原核生物感染症、ウィルス感染症及び異常１７ＮＡの生産に関与する種層性 症、例えば慢性骨髄性白血病が含まれる。本発明のエンドヌクレアーゼによる、 植物において処！されうる疾患又は感染症には２．力、ビ感染、細菌感染（例え ばクラウン−ゴール（Ｃｒｏｗｎ−Ｇａｌｌ）病）及び植物ウィルス感染に関与 する疾患が含まれる。

培養物中の真核生物及び原核生物細胞は、例えばマイクロプラズマ感染、ファー ジ感染、カビ感染などに関与する感染症又は疾患より保護されうる。

人間、動物、植物並びに真核生物及び原核生物細胞における本発明のエンドヌク レアーゼの生体内適用、例えば表現型改質及び疾患の処置に関して、細胞の中に このエンドヌクレアーゼを導入し、標的ＲＮＡを切断することが必要でありうる 。細胞の中へのＲＮＡ及びＤＮＡ配列の導入、並びに原核生物及び真核生物細胞 におけるその発現に関する方法は、例えばＣｏｔｔｅｎ、　Ｍ、　（１９９０） 　Ｔｉｂｔｅｃｈ　８　：　１７４　１７８；及びＦｒｉｅｄｍａｎ、　Ｔ、　 （１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ　２４４　：　１２７５　１２８０　（両方とも 本明細書に参考として組入れる）に詳細され、その方法は当業界によく知られて いる。この広く知られている方法が本発明において利用されうる。

本発明のエンドヌクレアーゼを直接的な細胞取込みによって細胞の中に含ませる ことができ、この場合、本発明のエンドヌクレアーゼは細胞外環境から細胞膜又 は細胞壁を通過する。細胞取込みを高めるために試薬、例えばリポソーム又は親 油性ビヒクル、細胞浸透剤、例えばジメチルスルホキシドが深層されうる。

本発明のエンドヌクレアーゼ配列の維持、複製及び転写のため、本発明のエンド ヌクレアーゼはＤＮＡもしくはＲＮＡ転移ベクター又はその組合せの一部として 、細胞に含まされ、そして発現されうる。

本発明のエンドリボヌクレアーゼを発現する転移ベクターは、エンドヌクレアー ゼ配列の安定的な発現のために宿主細胞の中で複製されることができうる。他方 、本発明のエンドヌクレアーゼをコードする転移ベクターは宿主細胞の中で複製 することができず、それ故エンドヌクレアーゼ配列の一過性発現をもたらしうる こともある。

ＤＮＡ及びＩ？ＮＡ転移ベクター、例えばプラスミド及びウィルス作製体の製造 方法は当業界によ（知られ、そして例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（前記）に詳細さ れている。

転移ベクターは一般に、本発明のエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド 配列であって、プロモーター及び発現にとって必要なその他の調節配列に作動連 結しているもの、並びに任意的に原核生物及び／又は真核生物細胞における複製 起点を含んで成りうる。

植物、動物、細菌及びその他の種類の細胞における転移ベクターの維持及び発現 にとって適切であるプロモーター及びｔ１１節配列は当業界によく知られ、そし て例えば本明細書に参考として組入れる、Ｈｏｇａ＋＋＋　Ｂ、ら（１９８６） 　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｏ＋ｂｒｙｏ、　Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ 　；及び５ｃｉｅｎｃｅ（１９８９）　２４４　：　１２７５−１３７に詳細さ れている。

本発明のエンドヌクレアーゼをコードする又は含んで成る転移ベクター又は核酸 配列は、当業界によく知られている方法（例えばＣｏｔｔｅｎ　ａｎｄ　Ｆｒ１ ｅｄＩＩａｎ（前記）に詳細されている方法）、例えばマイクロインジェクショ ン；エレクトロポレーション；レセプター中介エンドサイトーノス；コンピテン ト細胞例えば金属イオン、例えば塩化カルシウム、陽イオンもしくはその他のリ ポソーム、ウィルスもしくはソユードウィルス、ＤＥＡＥ−デキストランによっ て処理せしめたプロトプラスト又は細菌細胞の形質転換；あるいは細胞壁に侵入 するプロジエクチルを用いて所望の核酸配列を導入することによって、宿主細胞 の中に含まされることができうる。

本発明の更なる観点に従い、本明細書に記載のエンドヌクレアーゼをコードする ヌクレオチド配列をコードする転移ベクターを提供する。

本発明のエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、その後の発現の ために真核生物又は原核生物宿主細胞のゲノムの中に組込まれることができる（ 例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前記に詳細）。ゲノムへの組込みは、宿主ゲノムに 組込まれる転移ベクターによって促進されうる。このようなベクターはヌクレオ チド配列、例えばゲノムの組込みを促進せしめるウィルス又は調節起源を含みう る。宿主ゲノムの中へのヌクレオチド配列の挿入方法は例えば前記したＳａｍｂ ｒｏｏｋら及びＨｏｇａｎ　らに詳細されている。

本発明のエンドヌクレアーゼをコードする、ゲノム的に組込まれた核酸配列は一 般に、本発明のエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列と作動連結し たプロモーターを含んで成り、そして真核生物（例えば動物もしくは植物細胞） 又は原核生物（例えば細菌）宿主細胞の中で前記エンドヌクレアーゼを発現させ ることが可能である。

本発明のエンドヌクレアーゼは遺伝子治療技術、例えば疾患、例えば旧Ｖに苦し む人間由来の細胞を患者から取り出し、この感染性因子を該エンドヌクレアーゼ によって処理して不活性化せしめ、その後耐性細胞と一緒に標的部位を再集団化 （ｒｅｐｏρｕ　ｌａ　ｔｅ　）するためにこれを患者に戻すことに関与する。

ＨＩＶの場合、ＨＩＶウィルスを不活性化できる本発明のエンドヌクレアーゼを コードするヌクレオチド配列をリンパ球のゲノムの中に組込むか、又は本発明の エンドヌクレアーゼを発現することのできる転移ベクターを細胞の中に存在させ てもよい。このような細胞はＨＩＶ感染に耐性であり、そしてその子孫自体もこ のような耐性が授かっているであろう。

本発明の観点に従い、標的ヌクレオチド配列と前記した有効量のエンドヌクレア ーゼを反応させることを含んで成る、生体内又は試験管内のいづれかでの標的核 酸配列の切断のだめの方法を提供し、ここで前記エンドヌクレアーゼは前記標的 の特異的な切断を特定の部位、例えばこの標的核酸配列を切断して不活性化せし める部位にて行うことができる。

本発明の他の観点に従い、有害なＲＮＡの存在に関連する、人間、動物、植物又 は原核生物もしくは真綿生物細胞における疾患又は感染症の処置のための方法を 提供し、この方法は、前記人間、動物、植物、原核生物又は真核生物細胞を、前 記した有効量のエンドヌクレアーゼ単独で、又は薬学的、獣医学的もしくは農学 的に受け入れられている担体又は賦形剤と一緒に処理することを含んで成り、こ のエンドヌクレアーゼは前記有害ＲＮＡを切断、それ故事活性化できる。

上記に関する組換ＤＮＡ操作は当業界に知られ、そして例えば前記のＳａｍｂｒ ｏｏｋらに詳細されている。

本発明の他の観点において、本明細書記載のエンドヌクレアーゼによって改質さ れた、又はそれを含む、コードする及び／もしくは発現するｌ又は複数の細胞を 含んで成る動物又は植物を提供する。

本発明のエンドヌクレアーゼはヌクレオチド合成技術によって製造されることが でき、これは当業界によく知られ、そして例えばＣａｒｒｕ　ｔｈｅｒｓら（Ｍ ｅＬｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｖｏｌｏｇｙ（１９８７）　１５４　：　２８７ −３１３）、Ｆｏｅｈｌｅｒら（Ｎａｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ　（１９８６）　１４　：　５３９９−４０７）及び５ｐｒａｔ　ら　（Ｏｌ ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　−Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ（１９８４）　Ｍ、　Ｊ、　Ｇａｌｔ編、 頁５３−ｔｉｓ）に詳細され、これら全て本明細書に参考として組入れた。一般 にこのような合成手順は、保護されたヌクレオチド鎖を得るだめの活性化且つ保 護されたヌクレオチド塩基の連続カップリング、その後の適切な処理による保護 基の除去を含む、他方、本発明に関するエンドヌクレアーゼは、宿主細胞、又は 酵素、例えばＴ３．　ＳＦ３もしくはＴ７　ＲＮＡ−ポリメラーゼを用いる無細 胞系の中での前記エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の転写によ って製造されうる（Ｓａ■ｂｒｏｏｋら、前記）。

本発明のエンドヌクレアーゼの触媒性Ｍ　ＳＮ域は、従来の技術における知識よ り必要である考えられていたものよりもサイズが小さい。

本発明のエンドヌクレアーゼの態様により提供される、常用の塩基対合ステム構 造がないことは、このエンドヌクレアーゼとその基質又はその他の核酸構造体と の立体的障害を低め、そして更には望ましくない塩基対合相互作用の可能性を低 めうる（特に、このエンドヌクレアーゼが、切断することを特徴とする特定の標 的の他に大量の核酸を伴うことのある生体内背景にあるとき）。

本発明の一定の態様におけるこのエンドヌクレアーゼ構遺体の中にデオキシリボ ヌクレオチドを含ませることは、リボヌクレアーゼ分解に対する保護を授けるこ とができる。更に、ＲＮＡ／ＤＮＡを含んで成るエンドヌクレアーゼは、あるア ンチセンス用途を損わせる巻き戻し／改質酵素にとっての基質を提供しない。当 業界に知られているその他のエンドヌクレアーゼと比べての本発明のエンドヌク レアーゼの種々の１！欅のサイズの小ささは、このエンドヌクレアーゼの合成の 費用を改善し、そして更にはこのエンドヌクレアーゼの宿王細胞の中への導入の し易さ及び効率性を高めるのに働きうる。

本明細書記載のポリ−エンドヌクレアーゼは、触媒性ドメインに連結している隣 接領域Ｘ及びＹの中において切断配列を有するようにデザインされうる。このよ うなポリ−エンドヌクレアーゼは細胞の中で自己触媒的に複数の個々のエンドヌ クレアーゼを遊離させ、それ故エンドヌクレアーゼの局所濃度を高めることがで きる。

式（１）の化合物のオリゴヌクレオチド主鎖（即ち、ホスホジエステル結合）は 種々の方法、例えばＤＡＮアンチセンスオリゴヌクレオチドと同し方法において 改質されうる。メチルホスホネート、ホスホチオレート及びホスホラミデート結 合が常用のホスホジエステル結合にとって代わるように利用されうる。更に、リ ボヌク１７オチドを改質されたヌクレオチド及び／又は塩基、例えば前記した２ ′メトキシリボヌクレオチド又は〔α〕チアンーによって置換してよい、このよ うな改質はエンドリボヌクレアーゼにヌクレアーゼ耐性を授け、そして生物学的 半減期及び／又は細胞取込みを向上せしめうる。ホスホロチオエート結合は、Ｒ ＮＡ／ＤＮＡ二量体のＲＮＡ成分にＲＮＡａｓｅ　Ｉ＋感受性を授ける。メチル ホスホネート結合はこの同し成分にＲＮａｓｅ　Ｈ耐性を授ける。

本発明の種々の態様を以下の実施例において、限定としてでなく詳細する。

例１ エンドヌクレアーゼの合成： 全てのエンドヌクレアーゼは、２−シアノエチルホスホラミジ。

ト試薬を用いて、アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅＩＩｓ）３８０又は３９１のいづれか又は両方によって合成した。ＤＮＡモノ マー及びＲＮＡモノマーであって、その２′位がｔ−ブチルジメチルシリル基に よって保護されているものを商業的供給者より入手した。５′−トリチル基を除 去した全てのオリゴヌクレオチドは以下の通りに処理した：オリゴヌクレオチド を３：１のＮＨ，ＯＨ／エタノールにおいてカラムから切断し、そして５５°Ｃ で一夜熱した。この溶液をほぼ乾燥するまでエバポレートし、３：１のＨ２０／ エタノールに含ませ、そして乾かし、これを繰り返した。物質の量はＵν呼吸を 測定することによってこの段階で評価した。２′基はＴ）ＩＰ中のＩＭのテトラ ブチルアンモニウムイオリド（１０μＬ　１０ｎ、、。）による−夜の処理によ って脱保護した。これを、Ｎａ”状態にあるＤｏｗｅｘ　５０Ｘ　８　２００（ 商標）陽イオン変換カラムに２回通してテトラブチルアンモニウムイオンを除去 し、溶出液の容量を２−ブタノールによって減少させ、そしてオリゴヌクレオチ ドを酢酸ナトリウム及びエタノールによって沈殿させた。次にこのオリゴヌクレ オチドを、７Ｍの尿素を含む１０−２０％（長さに依存）のアクリルアミドゲル 上での電気泳動によって精製した。対象のバンドをＵｖシャドイング又は臭化エ チジウム染色によって識別化し、切り出し、そして水に浸した。このオリゴヌク レオチドｉ容液をゲルスライスから取り出し、２−ブタノールによって′ａ縮し 、フェノール／クロロホルム及びエーテルで洗った。

次にこのオリゴヌクレオチドを酢酸ナトリウム及びエタノールによって沈殿させ 、低温の８０％エタノールで洗い、１０ｍＭのトリス−Ｃ１４、ｐＨ８，０，２ ｍＭのＥＤＴＡに再溶解し、ＵＶ光度計により定量し、そして凍結させた。オリ ゴヌクレオチドの純度は、５′末端を３２ｐリン酸によって標識し、そして変性 ゲルに流し出すことによって決定した。

標準の条件を用いてオリゴヌクレオチドをリン酸化せしめたが、ただし数ユニ、 トの膵臓リボヌクレアーゼインヒビターをこの反応混合物に加えた。標識せしめ た物質の濃度は、このリン酸化手順からの廃棄物を全てプールし、乾燥さセ、そ して標識化オリゴヌクレオチドの既知の両分と一緒にゲルに流し１次いでハンド を切り出して計算し、そしてこれＳこよりリン酸手順において失われた物質の量 をもとめ、そして標識されたオリゴヌクレオチドの濃度を決定することによる。

反応条件： 典型的な反応は、５０Ｍのトリス、　ＨＣＬ　、ｐＨ８，０，１０ｍＭのＭｇＣ １，の中で３７゛Ｃで行った；全での反応において、基ｆ濃度は１００　ｎＭ、 そしてエンドヌクレアーゼ濃度は１００又は６００　ｎＭとした。この反応は３ ０μＬ容量の中で３０分〜４時間の範囲にわたって行った。エンドヌクレアーゼ と基質のモル比は１：１又は６：ｌとした。このエンドヌクレアーゼ及び基質（ ”Ｐｌｆｆｉ化）を別々に反応緩衝液の中で７０“Ｃで３分間熱し、次いで混合 及びその後のインキユベーシヨンの前に急冷却した。このエンドヌクレアーゼ中 介切断反応の温度／活性プロフィール、マグネシウム依存性、並びにｐＨ依存性 及び代謝回転（ターンオーバー）の測定を目的とする実験において必要とされる 標準条件から逸脱を行った。サンプルを次に、変性剤として７Ｍの尿素を含む１ ５％のアクリルアミドゲルにおける電気泳動によって分析した。基質及び切断生 成物をオートラジオグラフィーによって識別化し、そしてそれらの位置に対応す るゲルスライスを切り出し、そしてＣｅｒｅｎｋｏｖ計測によって定量した。

例２ 成長ホルモンＲＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼ：塩基配列、図解及び種々 のエンドヌクレアーゼの名称を以下に記載する。保存性リボヌクレオチドはボー ルド（太字）体及び太い線分で示す。その他のりポヌクレオチドは上部の文字及 び細い線分で示す、デオキシリボヌクレオチドは下部の文字及び波状線分で示す 。

エンドヌクレアーゼの名称は以下の通りである：Ｒはへリノクス■を含むリボザ イムを示し、Ｍはへリノクス■を含まないエンドヌクレアーゼを示し、そしてＭ Ｓは同一・分子内におけるエンドヌクレアーゼ及び基質を示す、数字及びヌクレ オチド記号はコネクターの中の塩基を示し、そしてＲＮＡ又はＤＮＡは基質とへ リノクスｌ及び■を形成するアームの中のヌクレオチドに関する。ダブルへリノ クス■。

■及び■はＦｏｓｔｅｒ　ａｎｄ　Ｓｙｍｏｎｓ（Ｃｅｌｌ　（１９８７）　４ ９　：　２１１　２２０）に詳細されている。

更なるシリーズの成長ホルモンＲＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼをＭ、ｔ 、　ＤＮＡ作製体に基づいて合成し、これらはコネクターの中に異なる数及び種 類のヌクレオチドを有する。これは以下の通りである： 門、ｔ、　ＤＮＡ 門、ｔ、　ＤＮＡ Ｍｓｔ、　ＤＮＡ Ｍｔｔｃｔ、　ＤＮＡ 門ｔｔＰＤｔ、　ＤＮＡ ＰＤはヌクレオシドの代わりに用いた１、３−プロパンジオールである。

エンドヌクレアーゼＲ４Ｕ、　ＤＮＡも合成した。このエンドヌクレアーゼは前 記したＲ４υ、　Ｉ？ＮＡと同一であるが、ただしＲＮＡ隣接配列がＤＮＡによ って変換されている。

基質： ラット成長ホルモン２１マー（七ツマ−）：上記のエンドヌクレアーゼ全てを、 ラット成長ホルモン遺伝子の一部に相当し、且つ以下の配列を有するリボヌクレ オチド配列と反応させた。

Ｇｌ（Ｓｌ　５’　ＡＣ（：ＵＧＣＧＧＧ［ＪＣ”　ＡＵＧＡＡＧＩＪＧＵＣ３ ’ＧＨ５Ｉに相当するが、じ以外の全てのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオ チドである第二基質（ＧＨ５ｚ）も合成した。エンドヌクレアーゼＭ４Ｕ、　Ｒ ＮＡ、及びＭ２Ｏ，ＤＮＡをこの基質と反応させた。

フラノベル（Ｋｒｕｐｐｅｌ　ＲＮＡ）　：エンドヌクレアーゼＭ４ｔ、　ＤＮ Ａ＝　Ｋｒ　１０７９（３４個のヌクレオチドを含んで成り、且つ、クランペル 標的ＲＮＡにハイブリダイズするようにデザインされたＤＮＡの隣接配列を有す る）を、２１ヌクレオチドの短い合成ＲＮＡ　ＴｘＮ及び約１．９６１１＋のｌ ？ＮＡ基質であって両者とも同一の切断部位を有するものに対して試験した。

Ｋｒ　ＲＮＡ転写体は、Ｋｒ転写体をコードするｃＤＮＡをＴ７ＲＮＡポリメラ ーゼプロモーターを含むプラスミドに挿入することによって調製した。

Ｋｒ転写体を次にＴ７−ポリメラーゼによって転写した。

合成２１マーは化学合成されたものであり、そして長いＩ？ＮＡ転写体と同し切 断部位を含む。この２１マーは以下の配列を含んで成る：ＡＩＩＵＩＩＧＣＧＡ ＧＵＣ′″ＣＡＣＡＣ［ＩＧＧＡＧ（ここでＣ１はリボヌクレオチドである）。

抗−クランペルエンドヌクレアーゼの活性の試験管内試験は２．３Ｋｂ　ＲＮＡ のフラノベル転写体を不活性化させるための合胞体の胞胚葉の段階前のンヨウジ ョウハエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）胚のマイクロインジェクションにより行うこ とができ。胚（クチクラ層化胚）は、卵を産んだ１〜２日後の異常な体節パター ンについてアッセイされうる。

血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）　： エンドヌクレアーゼパｔｔｃｔ、　ＤＮＡ、　ＰＤＧＦ　（３０マー、ＰＤＧＦ 標的ＲＮＡ　とハイブリダイズするようにデザインされた隣接ＤＮＡ配列を有す る）を、人間由来のＰＤＧＦ　Ａ遺伝子のエキソン２及び６に相当する６６６塩 基のＲＮＡ転写体と反応させた。６６６塩基のＲＮＡ転写体はＴ、ポリメラーゼ を用いてＰＤＧＦ遺伝子フラグメントから試験管内転写させたものＡ、全ての成 長ホルモンＲＮＡを標的とするエンドヌクレアーゼは種々の活性を伴ってＧＨ５ Ｉを切断した。　ＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅ１ａｃｈ　（前記）のエンドリボヌク レアーゼ及びその他の研究者のそれに注目すると、どのエンドヌクレアーゼもこ の反応時間にわたって生成物を１００％切断しない。エンドヌクレアーゼ、門４ Ｔ、　ＤＮＡ　、　ｌＩ４１］、　ＲＮＡ　、門４１１．　ＤＮＡ；１４Ａ、　 ＤＮＡ　；　Ｍ２Ｏ，ＲＮＡ　；　Ｍ３Ｔ、　ＤＮＡ　；　Ｍ５Ｔ、　ＤＮＡ； 及びＭＴＴＣＴ、　［］Ｎへの全ては、その反応時間にわたって基質の約５０〜 ６０％を切断し、これはコントロールＲ４Ｕ、　ＲＮＡとほぼ同じであった。コ ネクター（式（ＩＩ）の群Ｐに担当）の中に４個以下のヌクレオチドを含むエン ドヌクレアーゼはこの試験アッセイにおいて幾分活性が低かった。

代表的なミニザイムｌ’１４Ｔ、　ＤＮＡ及びＨａｓｅｌｏｆｆとＧｅｒｌａｃ ｈ（前記）エンドリボヌクレアーゼに相当する対照コントロール、Ｒ４ｔｌ、　 ＲＮ＾の酵素代謝回転、温度活性プロフィール、マグネシウム依存性及びｐｉ（ 依存性を調べる実験を行った。これらの実験は、両方のエンドヌクレアーゼが代 謝回転を示す酵素としてふるまい、ｐＨ７，５，３７℃そして１ｍＭ以上のＭｇ ２゛にて標的配列の切断を行うことを示した。

これらの結果より、標的基質を切断できる機能的なエンドヌクレアーゼはＤＮＡ 　もしくはＲＮＡ　、又はそれらの組合せを含んで成るハイブリダイズアーム（ 弐（Ｉ）の群Ｘ及びＹに相当）：非塩基対合ＲＮＡもしくはＤＮＡ配列、又は部 分的に塩基対合したＲＮＡ配列を含んで成るコネクターを含むことがあり、そし てこのコ不りティング配列の中のヌクレオチドの数及び性質は重要ではない。

エンドヌクレアーゼＭｔｔＰＤｔ、　ＤＮＡは活性であり、そしてこのヌクレオ チドはエンドヌクレアーゼ活性の損失を伴うことなく化学連結基により変換され うることを示した。この実験に基づき、コネクター配列（式（ｎ）の群Ｐに相当 ）の中のヌクレオチドは明らかにリンカ−配列によって変換されることができる 。

Ｂ、基質ＧＨ５２はＩＩＭＵ、　ＲＮＡによって切断される力＜？Ｉ４Ｕ、　Ｄ ＮＡによってはされない、なぜ４ＭＵ、　ＤＮＡエンドヌクレアーゼがこの基質 に対して活性でないかは不明であるが、ＤＮＡ−ＲＮＡ二量体の構造は同じ配列 のＲＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−ＤＮＡ二量体のそれとは有意に異なることが明ら かに示唆され、従って活性部位の構造の変化の可能性があり、それ故エンドヌク レアーゼは不活性となるのであろう。

エンドヌクレアーゼ４Ｍυ、　ＲＮＡは、中心のりボヌクレオチドを除き全体的 にＤＮＡより成る基質を切るため、切断反応に必要とされる基質上の２′ヒドロ キシルのみが切断すべきヌクレオチド上にあることが明らかとなった。

エンドヌクレアーゼの隣接配列（弐（［Ｉ）の群Ｘ及びＹに担当）のヌクレオチ ド組成も変えることにより、適切な切断部位を含む全てのヌクレオチド基質が切 断されうる。前記に定義した隣接ヌクレオチドの最適化は切断を促進するために 必要とされ、これは４ＭＯ，ＲＮＡが、塩基Ｃを有する中心リボヌクレオチドを 除き全体的にＤＮＡより成る１＆質を切断し、エンドヌクレアーゼ４ＭＬｌ、　 ＤＮＡがこの基質を切断しない事実によって示されている。

１．９６ＫｂクランベルＲＮＡ及び合成２１マーＲＮＡ　ｊａ的バイブリドの切 断はＭ４ｔ、　ＤＮＡ、にｒ１０７９エンドヌクレアーゼによって観察された。

１．９６ＫｂクラノペルＲＮＡ転写体の切断は、大きいＲＮＡが所望の切断部位 で選択的に切断されうろことを示す。

Ｃ０同様に、個々のエンドヌクレアーゼは長いＰＤＧＦ　ＲＮＡ転写体の効率的 且つ特異的切断を及ぼした。

標的配列ＭＳ４Ｕ、　ＲＮＡにシスにおいて連結している合成ＲＮＡも、ナノモ ラー濃度にて、その濃度に依存しない速度で、予測の標的配列の有効な特異的切 断において活性であった。このことは、このエンドヌクレアーゼが切断を及ぼす ために重合体又は高分子量構造体を形成せず、むしろ個々のヌクレアーゼが標的 ヌクレオチド配列の触媒的切断を及ぼすことができることの実証を提供する。

本発明のエンドヌクレアーゼが、適切な切断部位（例えばＧＵＣ）を含み、且つ そのヌクレオチド配列が既知である任意の標的ＲＮＡの切断のために選択的に利 用できうろことが上記の実施例より明らかでぁる。従って、本発明のエンドヌク レアーゼは生体内及び試験管内での標的ＲＮＡの選択的不活性において広い用途 を有し、そして例えば人間及び動物における灰色の処！、動物及び植物における 表現型の改質、並びにその他真人な数の用途に利用されうる。

要約書 本発明は標的ヌクレオチド配列を切断することのできる触媒性分子を提供する。

より詳しくは、本発明は、切断することを所望される標的ヌクレオチド配列とハ イブリダイズすることが可能な十分な長さであるヌクレオチド配列を有するエン ドヌクレアーゼを提供する。このエンドヌクレアーゼは、リボヌクレオチド及び ／もしくはデオキシリボヌクレオチド、又はそれらの誘導体を含んで成る触媒性 領域を含む、これは基質ヌクレオチド配列のホスホジエステル結合を切断するの に働く、この触媒性領域はヌクレオチド又はその誘導体を含んで成り、これはヌ クレオチド、デオキシリボヌクレオチドもしくはその組合せを含んで成りうる連 結基によって連結されている。

本発明のエンドヌクレアーゼは人間及び動物における疾懲に関与する標的ＲＮＡ の切断において、並びに真核生物及び原核生物細胞におけるＲＮＡ転写体の不活 性化において、更には試験管内でのＲＮＡ転写体の切断において有用である。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成４年１２月１８日

Claims (45)

【特許請求の範囲】
1. １．次式（Ｉ）のエンドヌクレアーゼ Ｘ−Ｍ−Ｙ（Ｉ） （式中、Ｘ及びＹは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はそれら の誘導体を含んで成るヌクレオチド配列を示し；ここで前記ヌクレオチド配列は 、前記エンドヌクレアーゼによる切断が所望される標的核酸配列に対するハイブ リダイゼーションが可能な十分なる長さであり； そして式中、Ｍは次式（ＩＩ）の触媒領域を表わす：５′Ｃ′Ｕ２Ｇ３Ａ４Ｎ５ Ｇ６Ａ７−Ｐ−Ｇ８−Ａ９Ａ１０Ａ１１Ｎ１２３′（ＩＩ）、 〔式中、Ａ，Ｇ，Ｃ及びＵはそれぞれ塩基、即ちアデニン、グアニン、シトシン 及びウラシルを表わし、これらはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド 又はそれらの組合せの形態にあり；そしてＮ１２は塩基、アデニン、グアニン、 シトシン、ウラシル又はチミンのいづれかより選ばれ； そして式中； Ｐは１又は複数個のヌクレオチドであるか〔このヌクレオチドはデオキシリボヌ クレオチド、リボヌクレオチド、又は１もしくは複数個のデオキシリボヌクレオ チドと１もしくは複数個のリボヌクレオチドの組合せであることができ、ここで もし前記ヌクレオチドがリボヌクレオチドのみを含んで成り、且つ群Ｘ及びＹが リボヌクレオチドのみを含んで成るとき、群Ｐのこのリボヌクレオチドは互いに 塩基対合をなしていない〕；あるいは結合、又はヌクレオチドＡ７とＧ８を連結 する任意の原子もしくは相互連結した原子の群である〔これらはこの触媒性領域 の切断能力を破壊せず、そしてこれはヌクレオチドのみを含んで成るものではな い〕）。
2. ２．Ｘ及びＹが、リボヌクレオチド又はリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレ オチドの組合せを含んで成るヌクレオチド配列である、請求の範囲１に記載のエ ンドヌクレアーゼ。
3. ３．Ｘ及びＹが、デオキシリボヌクレオチドのみを含んで成るヌクレオチド配列 である、請求の範囲１に記載のエンドヌクレアーゼ。
4. ４．群Ｐが、非塩基対合リボヌクレオチド配列を含んで成る、請求の範囲２又は ３に記載のエンドヌクレアーゼ。
5. ５．群Ｐがリボヌクレオチド配列を含んで成り、このヌクレオチド配列の中の一 又は複数個の塩基が塩基対合している、請求の範囲２又は３に記載のエンドヌク レアーゼ。
6. ６．Ｐが、１又は複数個のリボヌクレオチド及び１又は複数個のデオキシリボヌ クレオチドを含んで成る、請求の範囲２又は３に記載のエンドヌクレアーゼ。
7. ７．群Ｐの１又は複数個の塩基が塩基対合している、請求の範囲６に記載のエン ドヌクレアーゼ。
8. ８．前記ヌクレオチド配列が少なくとも部分的に塩基対合している、請求の範囲 ６に記載のエンドヌクレアーゼ。
9. ９．Ｐが、塩基対合していないデオキシリボヌクレオチド配列である、請求の範 囲３に記載のエンドヌクレアーゼ。
10. １０．群Ｐが１〜２０個のリボヌクレオチドを含んで成る、請求の範囲４〜９の いづれか１項に記載のエンドヌクレアーゼ。
11. １１．群Ｐが、２〜６個のリボヌクレオチド又はその誘導体を含んで成る、請求 の範囲９に記載のエンドヌクレアーゼ。
12. １２．前記ヌクレオチド配列が２〜６個のヌクレオチドを含んで成る、請求の範 囲１１に記載のエンドヌクレアーゼ。
13. １３．群Ｐの１又は複数個のリボヌクレオチド及び／又はデオキシリボヌクレオ チドが、隣接するヌクレオチドを連結せしめるリンカーによって変換されている 、請求の範囲４〜１１のいづれか１項に記載のエンドヌクレアーゼ。
14. １４．前記リンカーが、任意的に置換されているホスホジエステル、任意的に置 換されているアルキル、任意的に置換されているポリアミド又は任意的に置換さ れているグリコールより選ばれる、請求の範囲１３に記載のエンドヌクレアーゼ 。
15. １５．前記の任意的な置換基が、アルコキシ、直鎖又は分枝鎖低級アルキル、ア ミン、アジド、アミノ、アミノアルキル及びハロゲンより選ばれる、請求の範囲 １４に記載のエンドヌクレアーゼ。
16. １６．Ｐが、ヌクレオチドＡ７とＧ８を連結させ、そしてヌクレオチドを全っく 含まないリンカーである、請求の範囲１に記載のエンドヌクレアーゼ。
17. １７．前記リンカーが、１又は複数個の任意的に置換されているポリホスホジエ ステル基、任意的に置換されているグリコール基又は任意的に置換されているア ルキル基を含んで成る、請求の範囲１６に記載のエンドヌクレアーゼ。
18. １８．前記の任意的な置換基が、アルコキシ、直鎖又は分枝鎖低級アルキル、ア ミン、アミノ、アミノアルキル及びハロゲンより選ばれる、請求の範囲１７に記 載のエンドヌクレアーゼ。
19. １９．ヌクレオチド配列Ｘ及びＹの５′及び／又は３′末端が、ヌクレアーゼ攻 撃に耐性であるブロッキング基を含む、請求の範囲１に記載のエンドヌクレアー ゼ。
20. ２０．前記ブロッキング基が、任意的に置換されているアルキル、任意的に置換 されているフェニル、任意的に置換されているアルカノイル、ホスホロチオエー ト、ホスホラミデート、メチルホスホネート又はヌクレオシド誘導体であるヌク レアーゼ攻撃に耐性であるもの、スペルミンもしくはスペルミジンを含んで成る 、請求の範囲１９に記載のエンドヌクレアーゼ。
21. ２１．前記ヌクレオチド配列Ｘ及び／又はＹが、相補性のヌクレオチド配列との ハイブリダイゼーションを促進せしめる、又は標的細胞もしくは細胞画分に対す る親和性を高める１又は複数種の因子によって置換されている、請求の範囲１に 記載のエンドヌクレアーゼ。
22. ２２．前記の親和因子がタンパク質、炭水化物、ホルモン、脂質、ヌクレオチド 又は押入剤分子より選ばれる、請求の範囲２１に記載のエンドヌクレアーゼ。
23. ２３．前記ヌクレオチド配列Ｘ、又はヌクレオチド配列Ｙが、切断される標的ポ リヌクレオチドを含む、請求の範囲１に記載のエンドヌクレアーゼ。
24. ２４．１又は複数個のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドが それぞれ、デオキシリボヌクレオチド誘導体及びリボヌクレオチド誘導体の形態 にある、請求の範囲１に記載のエンドヌクレアーゼ。
25. ２５．生体内又は試験管内のいづれかでの標的核酸配列の切断方法であって、こ の標的ポリヌクレオチドを請求の範囲１〜２２のいづれか１項に記載の有効な量 のエンドヌクレアーゼと反応させることを含んで成り、前記エンドヌクレアーゼ が前記標的ポリヌクレオチドの特定の切断部位で特異的な切断を及ぼすことがで きる方法。
26. ２６．前記エンドヌクレアーゼを、前記標的ポリヌクレオチドを含む細胞又は生 物の中に導入する、請求の範囲２５に記載の方法。
27. ２７．前記エンドヌクレアーゼに相当するヌクレオチド配列が、前記細胞におけ る前記エンドヌクレアーゼの転写を及ぼすためのプロモーターに作動連結してい る、請求の範囲２５に記載の方法。
28. ２８．前記エンドヌクレアーゼに相当する前記ヌクレオチド配列が、前記細胞又 は生物の中に挿入される転移ベクターの一部を形成し、そしてこのベクターが前 記エンドヌクレアーゼを複製及び発現することができる、請求の範囲２６に記載 の方法。
29. ２９．前記ヌクレオチド配列が真核生物又は原核生物細胞のゲノムの中に組込ま れる、請求の範囲２６に記載の方法。
30. ３０．請求の範囲１〜２３にいづれか１項に記載のエンドリボヌクレアーゼを含 む及び／又は発現する宿主細胞。
31. ３１．転移ベクターを含み、このベクターがプロモーターに作動連結している請 求の範囲１〜２３のいづれか１項に記載のエンドヌクレアーゼに相当するヌクレ オチド配列を含んでいる、宿主細胞。
32. ３２．プロモーターに作動連結している請求の範囲１〜２３のいづれか１項に記 載のエンドヌクレアーゼに相当するヌクレオチド配列を含んで成るベクター。
33. ３３．有害なＲＮＡの存在に関連する人間、動物、植物又は原核生物もしくは真 核生物細胞における疾患又は感染症の処置のための方法であって、前記人間、動 物、植物又は原核生物もしくは真核生物細胞を、単独で又は薬学的に受け入れら れている担体もしくは賦形剤と一緒となっている請求の範囲１〜２３のいづれか １項に記載の有効量のエンドヌクレアーゼであって、前記有害ＲＮＡを切断し、 それ故不活性化することのできる該エンドヌクレアーゼによって処置することを 含んで成る方法。
34. ３４．前記エンドヌクレアーゼを単独で、又は薬学的に受け入れられている担体 もしくは賦形剤と一緒に非経口投与する、請求の範囲２３に記載の方法。
35. ３５．前記エンドヌクレアーゼに相当するヌクレオチド配列が１又は複数個の真 核生物細胞のゲノムの中に組込まれているか、又は前記１又は複数個の細胞の中 に染色体外因子として保有されている、請求の範囲３３に記載の方法。
36. ３６．人間におけるＨＳＶ，ＨＩＶ，ＣＭＵ、細菌性又は原核生物疾患の処置の ための方法である、請求の範囲３３に記載の方法。
37. ３７．人間又は動物の腫瘍性症の処置のための方法である、請求の範囲３３に記 載の方法。
38. ３８．原核生物又は真核生物細胞における標的ＲＮＡの不活性化のための方法で あって、前記真核生物又は原核生物細胞の中に、請求の範囲１〜２３のいづれか １項に記載のエンドヌクレアーゼであって前記標的ＲＮＡにハイブダイズし且つ 不活性化することのできるエンドヌクレアーゼを導入することを含んで成る方法 。
39. ３９．前記エンドヌクレアーゼが、前記真核生物又は原核生物細胞の細胞膜を通 過する、請求の範囲３８に記載の方法。
40. ４０．前記エンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列が、前記エンドヌ クレアーゼの発現のために動物、植物又は宿主細胞のゲノムの中に組込まれてい る、請求の範囲３８に記載の方法。
41. ４１．前記エンドヌクレアーゼが、前記原核生物又は真核生物細胞における染色 体外因子の発現に基づいて生産され、ここで前記染色体外因子は、前記エンドヌ クレアーゼに相当するヌクレオチド配列に作動連結しているプロモーターを含み 、且つ前記原核生物又は真核生物細胞において前記エンドヌクレアーゼを発現さ せることができる、請求の範囲３８に記載の方法。
42. ４２．植物又は動物細胞における所望のＲＮＡの不活性化のための方法である、 請求の範囲３８〜４１のいづれか１項に記載の方法。
43. ４３．次式のポリエンドヌクレアーゼ Ｘ−Ｍ−Ｙ−（Ｘ−Ｍ−Ｙ）ｎ （式中、Ｘ及びＹは請求の範囲１に定義した通りであり；そしてｎは１〜１００ の整数である）。
44. ４４．単独で、又は薬学的に受け入れられている担体もしくは賦形剤と一緒に、 請求の範囲１〜２４のいづれか１項に記載の有効な量のエンドヌクレアーゼを含 んで成る製剤。
45. ４５．１又は複数種の抗−ウィルス・抗−カビ、抗菌、駆虫、抗原虫類、駆虫、 殺虫又は除草剤と一緒に請求の範囲１〜２４のいづれか１項に記載のエンドヌク レアーゼを含んで成る製剤。