JPH05509231A

JPH05509231A - ウシｒｓウイルスの組換えｄｎａ、タンパク質ワクチン、抗体、および形質転換細胞の使用法

Info

Publication number: JPH05509231A
Application number: JP3514104A
Authority: JP
Inventors: ワーツ，ゲイル　ダブリュ．; ラーチ，ロバート
Original assignee: ザユーエイビーリサーチファンデーション
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-23
Publication date: 1993-12-22
Also published as: EP0540645A1; AU650040B2; EP0540645A4; AU8330391A; US6060280A; HUT67362A; NZ239084A; WO1992001471A1; JP2001258581A; IE912586A1; CA2087853A1; HU9300187D0; JP2001258580A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウシＲＳウィルスの組換えＤＮＡ、タンパク質ワクチン、抗体、および形質転換細胞の使用法１．９本発明は、ウシＲＳ　（ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　；　Ｂ　ＲＳとも言う）ウィルスのタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、並びにそれらから誘導された対応するＢＲＳウィルスタンパク質およびペプチドに関するものである。それは、部分的に、Ｆ、　ＧおよびＮを含む多くのウシＲＳウィルスタンパク質をコードする全長ｃＤＮＡのクローニングに基づいている。ＧおよびＦタンパク質をコードするＤＮＡはワクシニアウィルスベクターに挿入され、これらのベクターが培養下でＧおよびＦタンパク質を発現させるために使用された。また、Ｇタンパク質をコードするベクターは抗つシＲＳウィルス免疫応答を誘発させるために使用された。

本発明の分子はウシＲＳウィルスの安全て効果的なワクチンを製造するのに使用することができる。

ウシＲＳウィルス３９１−２株は、１９８４年の冬から１９８５年にかけてノース・カロライナ州でウシに大流行したＲＳウィルスより単離された。この大流行は５か所の酪農場のウシと、食肉用の子ウシおよび雌ウシの作業所と、さらに肉牛および肥育用去勢牛の飼育者の作業所を巻き込むこととなった（Ｆｅｔｒｏｗ　ｅｔ　ａｌ、、　ＮｏｒｔｈＣａｒｏｌｉｎａ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｇｒｉｃ、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　５ｅｒｖｉｃｅ　Ｙｅｔ。

Ｎｅｗｓｌ、）。

エンベロープをもつ一本鎖のネガティブ−センスＲＮＡウィルスである、ＲＳウィルス（Ｈｕａｎｇ　ａｎｄ　Ｗｅｒｔｚ、　１９８２．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

４３：１５０−１５７；　Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８．　Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ　１０：１３７−１５３）は、最初、チンパンジーから単離された（Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９５６、　Ｐｒｏｃ、　Ｓａｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　９２：５４４−５４９）　。続いて、ヒト、ウシ、ヒツジおよびヤギからもＲＳウィルスが単離された（Ｃｈａｎｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　１９５７．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｈｙｇ、　６６：２８１−２９０；　Ｅｖｅｒｍａｎｎｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　ＡＭ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、４６：９４７−９５１；　Ｌｅｈｍｋｕｈｌ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９８０．　Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　６５：２６９−２７６；　Ｌｅｗｉｓ、　Ｆ、Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９６１゜Ｍｅｄ、　Ｊ、　Ａｕ５ｔ、　４８：９３２−３３；　Ｐａｃｃａｕｄ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｉｅｒ、　１９７０．　Ａｒｃｈ。

Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ　３０：３２７−３４２）。ヒトＲＳ　（ＨＲ８）ウィルスは子供では生後１年の間にかかる重症の下部気道感染症の主な原因となり、流行病が毎年発生している（Ｓｔｏｔｔ　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ。

１９８５、　Ａｒｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、　８４：１−５２）　、同様に、ＢＲＳウィルスはウシに細気管支炎と肺炎を起こし、食肉業界にとって経済的に重大な流行病が毎年冬に発生している（Ｂｏｈｌｅｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｍｏｄ。

Ｙｅｔ、　Ｐｒａｃｔ、　６３：６１３−６１８；　５ｔｏｔｔ　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ、１９８５．　Ａｒｃｈ。

Ｖｉｒｏｌ、　８４：１−５２；　５ｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｈｙｇ、　８５：２５７−２７０）。

ＢＲＳウィルスによって引き起こされる重症の疾患は通常２−４．５月齢のウシに最も高い頻度で発生する。ＢＲＳウィルス３９１−２株の大流行は多くの成熟雌ウシが病気にがかった点て特徴的であり、１つの酪農場のミルク生産を５０　Ｘ低下させ、一部の動物を死亡させたが、若いウシは軽症ですんだ（Ｆｅｔｒｏｗ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ　５ｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ａｇｒｉｃ、ＥｘｔｅｎｓｉｏｎＳｅｒｖｉｃｅ　Ｖｅｔ、Ｎｅｗｓｌ、）。

ＢＲＳウィルスは１９７０年に初めて単離され（Ｐａｃｃａｕｄ　ａｎｄＪａｃｑｕｉｅｒ、　１９７０．　Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　３０：３２７−３４２）、そして宿主（Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ａｍ、　Ｖｅｔ、　Ｍｅｄ、　Ａｓ５ｏｃ、　＋８９：６６ −７０；　Ｃａｓｔｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４６：５５４−５６０；　Ｃａｓｔｌｅｍａｎ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８５．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ、　４６：５４７−５５３）および血清学的研究（Ｂａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｅｓ。

４６：８９１−８９２；　Ｋｉｍｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２５：１０９７−１１０６；　５ｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０．　Ｊ、　Ｈｙｇ、　８５：２５７−２７０）に対するウィルス感染の臨床的（ｖａｎ　Ｎｉｅｕｗｓｔａｄｔ、　Ａ、Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２゜Ｐｒｏｃ、　］２ｔｈ　Ｗｏｒｌｄ　Ｃｏｎｇｒ、　Ｄｉｓ、　Ｃａｔｔｌｅ　ｌ：１２４−１３０；　Ｖｅｒｈｏｅｆｆｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｖｅｔ、　Ｒｅｃ、　１１４：２８８−２９３）および病理学的影響に関心が集中した。このウィルスの分子の詳細については何も記載されていない。１つの研究がＢＲＳウィルス感染細胞に存在するタンパク質とＨＲＳウィルス感染細胞に存在するタンパク質とを比較したにすきない（Ｃａｓｈ　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８２：３６９−３７９）。これに対して、ＨＲＳウィルスについては詳細な分子分析が行われた。ＨＲＳウィルスｍＲＮＡのｃＤＮＡクローンが作製され、これを使って１０の特異なポリペプチドをコードする１ｏのウィルス特異的ｍ　ＲＮ　Ａを同定し、そして１ｏの遺伝子のうち９つの完全なヌクレオチド配列が得られた（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　Ｐ、Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、。

１９８６、ｉｎ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　Ｖｉｒａｌ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ＩＩ　″。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；　５ｔｏｔｔ　ａｎｄ　Ｔａｙｌｏｒ、　１９８５．　Ａｒｃｈ。

Ｖｉｒｏｌ、　８４：１−５２）。

−ロ２つの方面の知見から、ＨＲＳウィルスとＢＲＳウィルスは異なるＲＳウィルスのサブグループに属することが提案された。第一に、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスは様々な種の組織培養細胞に感染する能力が相違している（Ｐａｃｃａｕｄ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｉｅｒ、　１９７０゜Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　３０：３２７−３４２）。１つの例外はあるが、ＢＲＳウィルスはＨＲＳウィルスよりも狭い宿主域を示すことが研究によりわかる。

Ｍａｔｕｍｏｔｏら　（１９７４，Ａｒｃｈ、　ＧｅｓａｍｔｅＶｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　４４：２８０−２９０）は、ＢＲＳウィルスのＮＭＫ７株がＨＲＳウィルスのＬｏｎｇ株よりも広い宿主域をもつことを報告した。他の研究者は他のＢＲ３株でこれと同じ結果を得ることができなかった（Ｐａｃｃａｕｄ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｉｅｒ、　１９７０．　Ａｒｃｈ、　ＧｅｓａｍｔｅＶｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　３０：３２７−３４２；　Ｐｒｉｎｇｌｅ　ａｎｄ　Ｃｒａｓｓ、　１９７８．　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　２７６：５０１−５０２）。ＢＲＳウィルスがＨＲＳウィルスと異なることを示す第二の知見は、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスの主要な糖タンパク質Ｇにおける抗原的差異の証明によりもたらされた（Ｏｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）。モノクローナル抗体を用いた研究は、Ｇ糖タンパク質の関連性に基ついてＨＲＳウィルス株を２つのサブグループに分類した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　１９８５．　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５１：６２６−６３３；　Ｍｕｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

、　１９８５．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６：２１１１−２１２４）　、これらの研究に含まれていたＢＲＳウィルス株のＧタンパク質は、それぞれのＨＲＳウィルスサブグループからのウィルスに対して誘導されたモノクローナル抗体と反応しなかった（Ｏｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、６８：３１２５−３１３５）。

ＢＲＳウィルスは、付着における主要な糖タンパク質Ｇの役割、ＨＲＳウィルスと比べたＢＲＳウィルスの宿主域の制限、および天然宿主において防御免疫応答を誘発するのに必要な個々のウィルス抗原の役割（現在、ＨＲＳウィルスについては簡単に行えない）を研究する機会を提供する。

２．２．　０タンパク質以前の研究から、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスの付着表面糖タンパク質Ｇの間には交差反応性がないのに、他のトランスメンブラン糖タンパク質、融合Ｆタンパク質および主要な構造タンパク質Ｎ、ＰおよびＭの間には交差抗原反応性があることがわかった（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０；　０ｒｖｉｌｌｅ　ｅｔａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）。入手可能な知見によると、ＢＲＳウィルスは培養下のウシ細胞にのみ感染して、比較的狭い宿主制限を有し、一方ＨＲＳウィルスは様々な細胞型と実験動物に感染し得る（Ｊａｃｏｂｓ　ａｎｄ　Ｅｄｉｎｇｔｏｎ、　１９７５．　Ｒｅｓ、　Ｙｅｔ。

Ｓｃｉ、　１８：２９９−３０６；　Ｍｏｈａｎｔｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７６、　Ｊ、ｌｎｆ、　Ｄｉｓ、　１３４：４０９−４１３；　Ｐａｃｃａｕｄ　ａｎｄ　Ｊａｃｑｕｉｅｒ、１９７０．　Ａｒｃｈ、ＧｅｓａｍｔｅＶｒｒｕｓｆｏｒｓｃｈ、　３０：３２７−３４２）ｏ　ＨＲＳウィルスのＧタンパク質はウィルス付着タンパク質であるので（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８＋２５２１−２５２４）　、この観察はＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＧタンパク質の差異がＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルス間で観察された付着および宿主域の相違の原因でありうることを示唆した。

ＨＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの配列解析に基づいて、Ｇタンパク質は３つのドメイン：すなわち内部または細胞質ドメイン、トランスメンブランドメイン、およびこのポリペプチドの４分の３を占める外部ドメインを有すると予想される（Ｓａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ：　１３ニア７９５−７８１２；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　。ＲＳウィルスＧタンパク質はそのアミノ末端がピリオンの内部に向いており、そのカルボキシ末端がピリオンの外部に向いていると示唆されている（Ｏｌｍｓｔｅｄ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．．１．　Ｖｉｒａｌ、　１３ニア７９５−７８１２；　Ｖｉｊａｙａｅｔ　ａｔ、、　１９８８．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　８：１７０９−１７１４；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）。他のパラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）の付着タンパク質と違って、ＲＳウィルスＧタンパク質はノイラミニダーゼと血球凝集活性の両方を欠いている（Ｇｒｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、　１９８３．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

６４＋８２５−８３２；　Ｒｉｃｈｍａｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９７１．　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　２１：１０９９）。ピリオンと感染細胞に見られる成熟Ｇタンパク質は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの泳動に基づいて８０−９０　ｋＤａの概算分子量を有する（Ｄｕｂｏｖｉ、　１９８２．　Ｊ、　Ｖｉｏｌ、　４２：３７２−３７８；Ｇｒｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、１９８３．　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６４：８２５−８３２；Ｌａｍｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｐｏｎ５．１９８３．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１３０：２０４−２１４；　Ｐｅｅｐｌｅｓ　ａｎｄＬｅｖｉｎｅ、　１９７９．　Ｖｉｏｌ、　９５：１３７−１４５）。これに対して、Ｇ　ｍＲＮＡ配列は３２　ｋＤａの分子量を有するタンパク質を予告しく５ａｔａｋｅｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ：　１３ニア７９５−７８１２；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８５、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　、Ｇ　ｍＲＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏで翻訳すると、それは抗Ｇ血清により特異的に免疫沈降する３６　ｋＤａタンパク質の合成へ導く。このポリペプチド主鎖にはＮ結合および広範なＯ結合グリコジル化が存在することがわかった（Ｌａｍｂｅｒｔ、　１９８８．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６４：４５８−４６６；　Ｗｅｒｔｚｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：Ｘ）。グリコシダーゼ（糖付加の阻害剤）とＯ結合グリコジル化を欠損している細胞系を使用した実験から、成熟Ｇタンパク質の分子量の５５％が○結合グリコジル化のためてあり、そして３％がＮ結合グリコジル化のためであるとされた。しかしなから、これらの概算値は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの泳動に基づくものであり、おおよその値にすぎない。Ｇタンパク質の推定アミノ酸配列中のトレオニンとセリン残基の高含有１１　（３０％）は広範なＯ結合グリコジル化の知見と一致する　（Ｓａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ：　１３ニア７９５−７８１２；Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）。トレオニンとセリンはＯ結合オリゴ糖付着のための部位として役立つアミノ酸残基てあり　（Ｋｏｒｎｆｉｅｌｄ　ａｎｄ　Ｋｏｒｎｆｉｅｌｄ。

１９８０、ｉｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄＰｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ″、　Ｌｅｎａｒｚ、　ｅｄ、、　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、　］、−３２）、ＨＲＳウィルスのＧタンパク質ではトレオニンとセリン残基の８５　Ｘが細胞外ドメインに存在する（Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｊ、　Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　。Ｇタンパク質の高含有量のプロリン（１０％）、セリンとトレオニン（３０％）および広範なＯ結合グリコジル化はムチンタンパク質として知られる細胞の糖タンパク質のグループの特徴と類似しているが（前掲）、ウィルスの糖タンパク質の中では特異である。

ＨＲＳウィルスの単離物は、モノクローナル抗体のパネルを使用してＧタンパク質に観察された抗原変異に基づ゛いて、２つのサブグループＡとＢに大別された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌｌ、　１９８５．　Ｊ。

Ｉｎｆ、　Ｄｉｓ、　１５１：６２６−６３３＋　Ｍｕｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

６６：２１１１−２１２４）。しかし、両サブグループのＧタンパク質を認識するモノクローナル抗体も少数存在する（Ｍｕｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５゜Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６：２１１１−２１２４；　０ｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）　、　２−）のサブグループからのＨＲＳウィルスのＧ　ｍＲＮＡの配列解析は、推定Ｇタンパク質問で５４％の全体的なアミノ酸同−を示し、このタンパク質の細胞外ドメインでは４４％のアミノ酸同−を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９）。

２．３．　Ｆタンパク質成熟ＢＲＳウィルスＦタンパク質はジスルフィド橋で結合した２つのポリペプチドＦ１とＦ２から成る（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　’ａ１．．１９８９゜Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）　、　ＢＲＳウィルスとＨ，ＲＳウィルスのＦタンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の移動度には差異がある（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．前掲）。ポリクローナル抗体と大部分のモノクローナル抗体はＨＲＳウィルスとＢＲＳウィルスの両方のＦタンパク質と反応する（Ｓｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４；０ｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７；　Ｋｅｎｎｅｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８．　Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ。

６９：３０２３−３０３２；　Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．前掲）。

パラミクソウィルスの融合タンパク質Ｆは細胞へのウィルスの融合と、周囲の細胞への感染細胞の融合を引き起こす。構造的には、種々のパラミクソウィルスのＦタンパク質は互いに類似している。Ｆタンパク質は前駆体Ｆ。とじて合成され、これは内部疎水領域で加水分解により切断されて２つのポリペプチドＦ１とＦ２を生成し、これらはジスルフィド結合されて活性融合タンパク質を形成する。

Ｆ１ポリペプチドのカルボキシ末端疎水領域は、カルボキシ末端を細胞の内側にアミノ末端を外側にして、Ｆタンパク質をメンプランに固着させると考えられる。Ｆタンパク質はＮグリコジル化される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、　１９８８．　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０：１１３−１３６を参照）。ＨＲＳウィルスのＦタンパク質は典型的なバラミクソウィルス融合タンパク質である。Ｆタンパク質に特異的な抗体は感染細胞の融合を阻止しくＷａｌｓｈ　ａｎｄ　Ｈｒｕｓｋａ、　１９８３．　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、　４７：１７１−１７７；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６１＋２９３−３０１）、さらにウィルスの感染性を中和しうるが（Ｆｅｒｎｉｅ　ａｎｄＧｅｒｉｎ、　１，９８２．　Ｉｎｆ、　Ｉｍｍｕｎ、　３７：２４３−２４９；　Ｗａｌｓｈ　ａｎｄ　Ｈｒｕｓｋａ。

１９８３、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４７：ｌ７ｌ−１７７；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｖ：ｒａｌ。

旧：２９３−３０１）　、付着を阻止しない（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ。

Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：２５２１−２５２４）　ｏ　Ｆタンパク質はポリペプチド前駆体Ｆ。とじて合成され、これは２つのポリペプチドＦ１とＦ２に切断される。これら２つのポリペプチドはジスルフィド結合され、かつＮグリコジル化される（Ｆｅｒｎｉｅ　ａｎｄ　Ｇｅｒｉｎ、　１９８２．　Ｉｎｆ。

Ｉｍｍｕｎ、３７：２４３−２４９；　Ｌａｍｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、１９８３．　Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　６４：８２５−８３２；　Ｌａｍｂｅｒｔ　ａｎｄ　Ｐａｎ５．１９８３．　Ｖｉｒｏｌ、　１３０：２０４−２１４）。

２．４．　ウシＲＳウィルスのワクチンウシＲＳウィルス（ＢＲ８）ワクチンは生きているかまたは不活性化されたウィルス、もしくはウィルスタンパク質を含むものが開発されている。Ｆｒｅｎｎｅｔら（１９８４，Ａｎｎ、　Ｍｅｄ、　Ｙｅｔ、　１２８：３７５−３８３）は、生存ＢＲＳウィルスとウシウィルス下痢ワクチンを混合して投与した子ウシの８１％が野外のウィルス攻撃により誘発される重症の呼吸器症状から防御されたと報告した。５ｔＯｔｔら（１９８４，Ｊ、　Ｈｙｇ、　９３：２５１−２６２）は、不活性化ＢＲＳウィルスワクチン（永続的にＢＲＳウィルスを感染させたグルタルアルデヒド固定ウシ鼻粘膜細胞を含み、オイルアジュバントで乳化した）と２つの生ワクチン（１つはＢＲＳウィルスに対して、他方はＨＲＳウィルスに対して誘導された）とを比較した。５ｔｏｔｔの実験（前掲）で不活性化ウィルスワクチンを投与した１２頭の子ウシのうち１１頭はＢＲＳウィルスの攻撃から完全に防御されたが、全ての対照動物と生ワクチンを投与した動物は感染した。

生ワクチンはＢＲＳウィルス感染を悪化させる可能性がある。

ＢＲＳウィルスと関連した呼吸器疾患の大流行は、子ウシに改変した生存ＢＲＳウィルスを接種した直後に発生した（Ｋｉｍｍａｎ　ｅｔａｌ、、１９８９．　Ｖｅｔ、Ｑ、１１：２５０−２５３）。Ｐａｒｋら　（１９８９，Ｒｅｓ、Ｒｅｐ。

Ｒｕｒａｌ　Ｄｅｖ、　Ａｄｍ、　３１：２４−２９）は、２成分エチレンイミン（ＢＥＩ）−不活性化ＢＲＳウィルスワクチンの開発を報告し、モルモットとヤギでその免疫原性を試験した。血清中和抗体は接種後２週目に検出され、抗体は４週目の追加免疫接種により増加した。

ヤギでは、接種後１２２週目ウィルスで動物を攻撃したときに、ＢＲＳウィルスに対する防御効果が観察された。

Ｔｒｕｄｅｌら（１９８９，Ｖａｃｃｉｎｅ　７：１２−１６）は、ヒト　（Ｌｏｎｇ）とウシ（Ａ−５１９０８）の両方のＲ８株の表面タンパク質をアジュバントＱｕｉｌ　Ａに吸着させて製造し超免疫刺激複合体の中和抗体を誘導する能力について研究した。ウシＲＳウィルスタンパク質から作られた免疫刺激複合体は、それらのヒト対応物よりも中和抗体を誘導する点で有意に効果的であることがわかった。

本発明は、ＢＲＳウィルスタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、ＢＲＳウィルスタンパク質およびペプチド、並びにそれらから製造された組換えＢＲＳウィルスワクチンに関するものである。それは、部分的に、完全なりＲＳウィルスＧ、ＦおよびＮタンパク質をコートする実質的に全長のｃＤＮＡのクローニングに基ついている。Ｇ、ＦおよびＮ　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が決定され、図２　（Ｇタンパク質）、図９　（Ｆタンパク質）および図１７（Ｎタンパク質）に示される。

本発明の特定の態様によれば、ＢＲＳウィルスタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡはＢＲＳウィルス感染を診断するのに使用することかでき、また、発現ベクター（ワクシニアウィルスや細菌、酵母、昆虫または他のを推動物ベクターを含み、これらに限定されない）に挿入することもてきる。これらの発現ベクターはＢＲＳウィルスタンパク質またはペプチドを大量に生産するのに利用され、このようにして得られた実質的に純粋なウィルスタンパク質またはペプチドはサブユニットワクチン処方物中に配合されるか、ＢＲＳウィルス感染の診断や受動免疫感作に利用し得るモノクローナルまたはポリクローナル抗体を生成させるために使用される。別の態様では、本発明により得られたＢＲＳウィルスのタンパク質配列は、サブユニットワクチンやモノクローナルまたはポリクローナル抗体の生産に利用し得る合成ペプチドまたはタンパク質を製造するために使用される。また、非病原性発現ベクターはそれ自体が組換えウィルスワクチンとして利用図１．ＢＲＳウィルスのｃＤＮＡの配列決定戦略。最下部の尺度はＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの５′末端からのヌクレオチドの数を示す。ｃＤＮＡをＭ１３ｍｐ１９複製型（ＲＦ）ＤＮＡに挿入し、Ｍ１３特異的シークエンジングプライマーを使ってジデオキシヌクレオチドシーフェンシングによりヌクレオチド配列を決定した。矢印はＢＲＳウィルスｍＲＮＡ上での合成オリゴヌクレオチドプライマーの伸長により決定されたＧ　ｍＲＮＡ配列の部分を示す。プライマーの配列はＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡ配列の塩基１５４−１６６に相補的であった。クローンＧ４、ＧＩＯおよびＧ３３中のｃＤＮＡはＰｓｔｌとＫｐｎ　Ｉで切りだし、反対側のｃＤＮＡ末端の配列を決定するためにＭｌ　３ｍｐ　ｌ　８ＲＦ−ＤＮＡに挿入した。各クローンに関する直線はそのクローンから決定されたｍＲＮＡの配列を示す。クローンＧ１０と０３３だけが全体的に配列決定された。クローンＧｉＧ７、Ｇ１２、Ｇ５およびＧ３は全て長さが５００ヌクレオチドよりも短く、この理由のために部分的に配列決定された。

図２．ＢＲＳウィルスの完全Ｇ　ｍＲＮＡ配列とＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７のＧ　ｍＲＮＡ配列との整合。整合はＢＲＳウィルスのＧ配列をＨＲＳウィルスＡ２のＧ配列に対して比較し、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈの方法（１９７０，Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３−４５３）により行った。ＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７のＧｍＲＮＡ配列については同一でない塩基のみを示しである。点線で示したギャップはＪｏｈｎｓｏｎら（１９８７，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９）により決定されたＨＲＳウィルスＡ２のＧ配列の配列同一性を最大限にするために使用した。ＨＲＳウイルスのコンセンサス遺伝子開始および遺伝子停止シグナルには上に線が引いである。それぞれのウィルスのＧ　ｍＲＮＡのコンセンサス開始コドンと停止コドンは四角で囲っである。配列の上の点は１０ヌクレオチドごとに配置されており、各列の最後のヌクレオチドの番号は配列の右側に示しである。

図３．ＢＲＳウィルスのＧタンパク質とＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７のＧタンパク質の推定アミノ酸配列の整合。整合はＮｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈの方法（１９７０，Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３− ４５３）により行った。ＨＲＳウィルスＡ２と１８５３７のＧタンパク質の同一アミノ酸は星印で示される。提案されたドメインを配列の上に示す。可能なＮ結合炭水化物付加部位は、ＢＲＳウィルスＧタンパク質については配列の上に黒の三角で、ＨＲＳウィルスＡ２のＧタンパク質については配列の上に黒の菱形で、モしてＨＲＳウィルス１８５３７のＧタンパク質については配列の下に黒の三角で示しである。４つの保存されたシスティン残基は黒丸で示しである。ＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７のＧタンパク質の保存された１３アミノ酸領域は四角で囲っである。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９８７゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８４　：５６２５−５６２９）により記載される、ＨＲＳウィルス１８５３７のＧタンパク質配列に対するＨＲＳウィルスＡ２のＧタンパク質配列中のギャップはダッシュで示しである。配列の上の点は１０アミノ酸残基ごとに配置されており、各列の最後のアミノ酸残基の番号は配列の右側に示しである。

図４．ＲＳウィルスＧタンパク質間のアミノ酸同一性。図３に示した配列整合に基ついて、種々のＧタンパク質問の全体的な同一性と、提案されたそれぞれのドメインでの同一性を示す。

図５．８ＲＳウィルスと、ＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７のＧタンパク質の親水性プロット。Ｇタンパク質の推定アミノ酸配（列に沿った親水および疎水領域の分布は、Ｋｙｔｅ　ａｎｃｌ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのアルゴリズム（１９８２，Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１５７＋１０５−１３２）を用いて決定した。それぞれのアミノ酸の値は９アミノ酸のウィンドーに対して計算した。最下部の目盛りはアミノ末端メチオニンから出発するアミノ酸残基を示す。アミノ酸配列の親水領域は中心線の上に、疎水領域は中心線の下に示される。

図６．ＢＲＳウィルスおよび組換えワクシニアウィルスにより発現されたＧタンパク質のウェスターンプロット分析。ＢＴ細胞に組換えワクシニアウィルス（ｍｏｌ−１０）、野生型ワクシニアウィルス（ｍｏｉ＝１０）　、またはＢＲＳウィルス（ｍｏｉ＝１）を感染させた。

ＢＲＳウィルス（レーンＢ）、野生型ワクシニアウィルス（レーンＶＶ）、ＢＲＳウィルスのＧ遺伝子を前（レーンＧ６４２＋）および逆（レーンＧ４５６７− ）方向に含む組換えワクシニアウィルス、および擬似（レーンＭ）を感染させた細胞からのタンパク質は、ワクシニアウィルス感染細胞では感染の６時間後に、ＢＲＳウィルス感染細胞では感染の３６時間後に細胞を溶解することにより回収した。

タンパク質は非還元条件下にＩＯＸポリアクリルアミド−３ＤＳゲルで電気泳動を行うことにより分離し、第一抗体として抗−３９１−２血清を使ってウェスターンブロッティングにより分析した。結合した第一抗体を同定するために、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウシＩｇＧを使用した。ＢＲＳウィルスのタンパク質を示しである。予備染色したタンパク質の分子量マーカーもそれらの分子Ｉによりキロダルトンで示しである。

図７１組換えワクシニアウィルス感染細胞の表面免疫蛍光。ガラスカバースリップ上で増殖させたＨＥｐ−２細胞に擬似（Ｍ）感染させるか、野生型ワクシニアウィルス（ＶＶ；　ｍｏｉ＝１０）または組換えウィルスＧ６４２　（ｒＶＶ；　ｍｏｉ＝１０）を感染させた。感染の２４時間後に、生細胞を抗−３９１−２血清、次にフルオレセイン結合抗ウシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）で染色した。位相差（左のパネル）および蛍光（右のパネル）顕微鏡写真を示す。

図８．ＢＲＳウィルスＦメツセンジャーＲＮＡのｃＤＮＡの配列決定戦略。最下部の尺度はＢＲＳウィルスＦ　ｍＲＮＡの５′末端からのヌクレオチドの数を示す。ｃＤＮＡをＭＩ３ｍｐ１９複製型（ＲＦ）ＤＮＡに挿入し、Ｍ１３特異的シークエンシングプライマーを使ってジデオキシヌクレオチドシークエンジングによりヌクレオチド配列を決定した。各クローンに関する直線はそのクローンから決定されたｍＲＮＡ配列の部分を示す。矢印はＢＲＳウィルスｍ　ＲＮ　Ａ上でのオリゴヌクレオチドの伸長により決定されたＦ　ｍＲＮＡ配列の領域を示す。

オリゴヌクレオチドはＢＲＳウィルスＦ　ｍＲＮＡの塩基２６７−２８４に相補的であった。

クローンＦ２０　、ＦＢ３およびＦＢ５中のｃＤＮＡもＰｓｔｌとＫｐｎ　Ｉで切りたし、反対側のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ末端の配列を決定するためにＭ１３ｍｐ１８ＲＦ−ＤＮＡに挿入した。クローンＦ２０　、ＦＢ５およびＦＢ３中のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのフラグメントは制限酵素Ｅｃｏｌ？Ｉ　（ＦＢ３．ＦＢ５）、またはＡ］ｗＮＩ　（Ｆ２０）　、ＰｆｌＭｌ　（Ｆ２０）およびＨｐａｌ　（Ｆ２０）およびＥｃｏＲＶ（Ｆ２０）の使用により生成し、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　ｌ　９またはｍｐ１８ＲＦ〜ＤＮＡにサブクローニングしてＦ　ｍＲＮＡの内部領域の配列を決定した。

図９．ＢＲＳウィルスＦ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列。ｃＤＮＡクローンとＢＲＳウィルスｍＲＮＡ上でのプライマー伸長から決定されたＢＲＳウィルスＦ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。配列の上の点は１０ヌクレオチドごとに配置されており、各列の最後の塩基の番号は配列の右側に示しである。主なオープン・リーディング・フレームの推定アミノ酸配列も示しである。各列の最後のコドンの番号をアミノ酸配列の右側に示す。可能なＮ結合グリコジル化部位は四角で囲っである。アミン末端およびカルボキシ末端の疎水ドメインには黒の下線が引いてあり、Ｆ１ポリペプチドの提案されたアミノ末端の疎水領域と同様である。提案された切断配列には灰色の下線が引いである。

図１０、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の親水性プロット。Ｆタンパク質の推定アミノ酸配列に沿った親水および疎水領域の分布は、Ｋｙｔｅ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅのアルゴリズム（１９８２，Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ−１５７：１０５（３２）を用いて決定した。それぞれのアミノ酸の値は９アミノ酸のウィンドーに対して計算した。最下部の目盛りはアミノ末端メチオニンから出発するアミノ酸残基を示す。アミノ酸配列の親水領域は中心線の上に、疎水領域は中心線の下に示される。

図１１．ＢＲＳウィルスのＦタンパク質とＨＲＳウィルスＡ２、Ｌｏｎｇ、　Ｒ３５−２および１８５３７のＦタンパク質との配列整合。整合はＢＲＳウィルスのＦタンパク質を異なるＨＲＳウィルスのＦタンパク質に対して比較し、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｗｕｎｓｃｈの方法（１９７０，Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４８：４４３−４５３）により行った。ＨＲＳウィルスのＦタンパク質については同一でないアミノ酸のみを示しである。配列の下の点は１０アミノ酸ごとに配置されており、各列の最後の残基の番号は配列の右側に示しである。タンパク質の可能なＮ結合グリコジル化部位は四角で囲っである。

５つの全てのタンパク質問で保存されているシスティン残基を三角で示す。アミノ末端およびカルボキシ末端の疎水ドメインには黒の下線がツ匹）であり、Ｆ１ポリペプチドの提案されたアミノ末端の疎水領域と同様である。

提案された切断配列には灰色の下線が引いである。

図１２．ツニカマイシンの存在および非存在下で合成したＢＲＳウィルスおよびＨＲＳウィルス感染細胞からのタンパク質の比較。

ＢＲＳウィルス（Ｂ）　、ＨＲＳウィルス（Ｈ）、または擬似（Ｍ）を感染させた細胞からのタンパク質は、ツニカマイシンの存在（レーンＢＴ、ＨアよびＭ、）または非存在（レーンＢ、ＨおよびＭ）下で［”Ｓ］メチオニンの取り込みにより標識した。ウィルス特異的タンパク質は抗ＲＳウィルス血清を使って免疫沈降させ、１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動により分離した。

ゲルのオートラジオグラフを示す。全レーンは同一ゲルからのものであり、レーンＨとＨｏは他のレーンよりも長く露光した。［”Ｃ］−標識タンパク質の分子量マーカーをそれらの分子量によりキロダルトンで示しである。

図１３．組換えワクシニアウィルス感染細胞からのＢＲＳウィルスＦタンパク質の発現。ＢＴ細胞に組換えワクシニアウィルス（ｍｏｉ−１０）　、野生型ワクシニアウィルス（ｍｏｉ＝ｌｏ）　、またはＢＲＳウィルス（ｍｏ　ｉ　＝　１　）を感染させた。ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を前（レーンＦ４６４＋）および逆（Ｆ１５９７−）方向に含む組換えウィルスおよび野生型ワクシニアウィルスＣＶＶ）からのタンパク質は感染の３−６時間後に［３！ｓ］メチオニンの取り込みにより放射性標識した。ＢＲＳウィルス感染（レーンＢ）、および擬似感染細胞（レーンＭ）からのタンパク質も感染の２４時間後に［”Ｓ］メチオニンを３時間取り込ませて放射性標識した。タンパク質はＷｅｌｌｃｏｍｅ抗Ｒ３血清を使って免疫沈降させ、１５％ポリアクリルアミド−５ＤＳゲルでの電気泳動により比較した。ゲル上でフルオログラフィーを行い、オートラジオグラフを示しである。ＢＲＳウィルスのＦ、Ｎ、ＭおよびＰタンパク質が示される。［”Ｃ］ −標識タンパク質の分子量マーカーをそれらの分子量によりキロダルトンで示しである。

図１４．ツニカマイシンの存在下で合成したＢＲＳウィルス発現Ｆタンパク質と組換えワクシニアウィルス発現Ｆタンパク質の比較。ＢＴ細胞に組換えワクシニアウィルス（ｍｏｉ＝１０）　、野生型ワクシニアウィルス（ｍｏｉ＝１０）またはＢＲＳウィルス（ｍｏｉ＝１）を感染させた。ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を前方向（Ｆ　４６４＝Ｆ）に含む組換えワクシニアウィルス、野生型ワクシニアウィルス（Ｖ）、ＢＲＳウィルス感染（Ｂ）および擬似感染細胞（Ｍ）からのタンパク質は、ワクンニア感染細胞では感染の３時間後に、ＢＲＳウィルス感染細胞では感染の２４時間後に、ツニカマイシンの非存在（レーンＦ、Ｖ、Ｂ、Ｍ）または存在（レーンＦ、、Ｖ、、Ｂ。

、ＭＴ）下で、［”Ｓ］−メチオニンを３時間取り込ませて放射性標識した。タンパク質はＷｅｌｌｃｏｍｅ抗Ｒ３血清を使って免疫沈降させ、１５％ポリアクリルアミド−８ＤＳゲルでの電気泳動により比較した。ゲル上でフルオログラフィーを行い、オートラジオグラフを示しである。ＢＲＳウィルスのＦ、Ｎ、ＭおよびＰタンパク質を示す。［”Ｃ］−標識タンパク質の分子量マーカーをそれらの分子量によりキロダルトンで示しである。

図１５．組換えワタシニアウイルス感染ＨＥｐ−２細胞の表面免疫蛍光。ガラスカバースリップ上で増殖させたＨＥｐ−２細胞に擬似（Ｍ）感染させるか、野生型ワクシニアウィルス（ＶＶ；　ｍｏｉ・１０）、組換えウィルスＦ４６４　（ｒＶＶｆ；　ｍｏｉ＝１０）を感染させた。感染の２４時間後に、生細胞を抗− ３９１−２血清で、次にフルオレセイン結合抗ウシＩ　ｇ　Ｇ　（Ｈ＋Ｌ）で染色した。位相差（左のパネル）および蛍光（右のパネル）顕微鏡写真を示す。

図１６．擬似（Ｍ）、ウシＲＳウィルス（Ｂｏｖ）またはヒトＲＳウィルス（ｆ（ｕ）　Ｋ染ＢＴ細胞からの３Ｈ−グルコサミン標識タンパク質の免疫沈降。パネルＡ、ヒトＲＳウィルスＧタンパク質に特異的な抗血清は、Ｆ（ＲＳウィルスＡ２のＧタンパク質を発現する組換えＶ■ベクター（ｖＧ３０１）　（Ｓｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ。

６０：６０７−６１３）でウサギを免疫することにより製造し、擬似、ＢＲＳウィルス（Ｂｏｖ）またはＨＲＳウィルス（Ｈｕ）感染細胞からの放射性標識タンパク質を免疫沈降させるために使用した。パネルＢ。

ウシＲＳウィルスＧタンパク質に特異的な抗血清は、ＢＲＳウィルスのＧタンパク質を発現する組換えＶＶベクター（ｖｖＧ６４２）でマウスを免疫することにより製造し、擬似、ＢＲＳウィルス（Ｂｏｖ）またはＨＲＳウィルス（ＨＬＩ）　ｇ染細胞からのタンパク質を免疫沈降させるために使用した。パネルＣ１擬似、ＢＲＳウィルス（Ｂｏｖ）またはＨＲＳウィルス（Ｈｕ）感染細胞の細胞質抽出物中に存在する全３Ｈ−グルコサミン標識タンパク質。

図１７．ＢＲｓウィルスＮ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列。

図１８．８ＲＳウイルスＮタンパク質のアミノ酸配列。

５、発明の詳細な説明本発明はウシＲＳウィルス核酸及びタンパク質に関する。本発明を限定するのでなくむしろ開示を明瞭にするために、本発明の詳細な説明は下記のサブセクションに分けられる。

（ｉ）ウシＲＳウィルス遺伝子のクローニング；（ｉｉ）ウシＲＳウィルス・り゛ンパク質の発現；（ｉｉｉ）本発明の遺伝子およびタンパク質；そして（ｉｖ）本発明の有用性５．１．　ウシＲＳウィルス遺伝子のクローニング本発明によると、ＢＲＳウィルスｍＲＮＡのｃＤＮＡ転写物をクローニングし、そして完全長ＢＲＳウィルス・タンパク質をコードする配列を同定することにより、または別法として、プラスミドｐＲＬＧ４１４−７６−１９１．　ｐＲＬＦ２０１２−７６−１９２．またはｐＲＬＮＢ３−７６より得られたプローブを用いて、または図２，９、または１７に示された配列からデザインされたオリゴヌクレオチド・プローブを用いてＢＲＳウィルスのコードする核酸配列を同定することにより、ここでＢＲＳウィルス・タンパク質をコードする核酸配列として定義されている、ウシＲＳウィルス遺伝子を同定することができる。

例えば、限定するものではないが、特定のタンパク質に対応するＢＲＳウィルスｍＲＮＡの完全なオーブン・リーディング・フレームを含むｃＤＮＡは、ＢＲＳウィルスｍＲＮＡ鋳型および第２鎖合成のための特定の合成オリゴヌクレオチドを用いて合成される。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＢＲＳウィルスｍＲＮＡの配列分析により決定される。第１ｍ合成をＤ’　Ａｌｅｓｓｉ。

合成の後、ＲＮＡ鋳型を約３０分間３７℃てＲＮａｓｅＡ　（少なくとも約１μ ｇ／μＪ）を用いて消化する。続いて、得られた一本鎖ｃ　ＤＮＡを、フェノール抽出とエタノール沈澱により単離する。第２鎖合成に用いられるオリゴヌクレオチドは、関心のあるウィルスｍＲＮＡの５′末端部に特異的な配列を有することが好ましく、またクローニングを容易にするために有用な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むことが好ましい。続いて、−末鎖ｃＤＮＡをオリゴヌクレオチド（約５０μｇ／ｍｌ）と混合し、１分間１００℃で加熱し、氷上に置く。続いて、逆転写酵素を用いて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭジチオスレイトール、１．６ｍＭｄＮＴＰおよび１００Ｕの逆転写酵素から成る反応混合物中で５０℃で約１時間インキュベートしてｃＤＮＡの第２鎖を合成する。続いて、フェノール抽出によりｃＤＮＡをタンパク質から分離し、エタノール沈澱により回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にする。続いて、平滑末端ｃＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えば、オリゴヌクレオチドプライマーの切断部位を認識するがタンパク質をコードする配列は認識しないもの）で消化し、フェノール抽出によりタンパク質から分離し、続いて好適なベクターにクローン化する。

また、ウィルスｍＲＮＡより生成したｃＤＮＡをベクターにクローン化し、ＢＲＳウィルスのＧおよびＦタンパク質それぞれにゴヌクレオチドをプローブとして用いて、関心のある核酸配列を担持するクローンを作製する。ウィルスｃＤＮＡライブラリーは、例えばＧｒｕｎｓｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｈｏｇｎｅｓｓ　（１９７５，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

Ｌｌ、　Ｓ、　Ａ、　）に記載された方法を用いてスクリーニングされる。続いて、回収されたクローンを当分野でよく知られた制限フラグメント・マツピングと配列決定法（例えばＳａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９７９．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７２：３９１８−３９２１）により分析する。

または、所望の遺伝子の全て、または一部を図２または９に示された配列に基づいて化学的に合成する。

さらに別の実施態様において、本発明の核酸分子および／または図２または９に示す核酸配列、または図３または１１に示すアミノ酸配列を実質的にコードする核酸配列から誘導されたプライマーをポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）；　５ａｉｋｉｅｔ　ａｌ、、１９８５．５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０−１３５４）に用いて、ＢＲＳウィルス・タンパク質または関係するペプチドをコードする核酸分子を生成する。

ＰＣＲはアンチ・センス鎖プライマーとセンス鎖を必要とする。

従って、ＢＲＳウィルス核酸またはアミノ酸配列の１つのセグメントに対応する縮重オリゴヌクレオチドプライマーを１つのＤＮＡ鎖（例えばセンス鎖）のプライマーとして用い、モしてＢＲＳウィルス核酸またはアミノ酸配列の２番目のセグメントに相同な、もう１つの縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを第２のＤＮＡ鎖（例えばアンチセンス鎖）のプライマーとして用いる。好ましくは、これらのプライマーを既知のアミノ酸配列の連続部分に基づいて選択し、その結果ＰＣＲでこれらのプライマーの使用から生じた関係のあるＤＮＡ反応生成物は予想された大きさである（すなわち、塩基対の数で表した生成物の長さは、２つのプライマーの長さと、２つのプライマーに相当するセグメントによってはさまれたタンパク質のセグメント中のアミノ酸残基の数の３倍との合計に等しい）。続いて、ＢＲＳウィルス核酸配列、好ましくはＢＲＳウィルスのｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡから成る核酸鋳型と共にＰＣＲてプライマーを用いる。

ＤＮＡ反応生成物を、当分野で知られた任意の方法を用いてクローン化する。当分野で知られている多数のベクター・宿主系を用いることができる。可能性のあるベクターはコスミド、プラスミドまたは変異させたウィルスを含むが、それらに限定されない。

しかしベクター系は、用いられる宿主細胞に適合しなければならない。そのようなベクターは、バクテリオファージ例えばラムダ誘導体、またはプラスミド例えばｐＢＲ３２２、ｐＵｃまたはＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ■（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）プラスミド誘導体を含むが、それらに限定されない。組換え分子は形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーション等により宿主細胞に導入する。

ＢＲＳウィルス遺伝子をクローニング・ベクターに挿入し、このベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換する、トランスフェクトする、または感染することができ、その結果遺伝子配列の多くの複製物が生成される。これは、ＤＮＡフラグメントを相補的付着末端を有するクローニング・ベクターにライゲートすることにより達成される。しかしながら、ＤＮＡをフラグメント化するために用いられる相補的制限部位がクローニング・ベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端部を酵素で変更する。また、ヌクレオチド配列（リンカ−）をＤＮＡ末端にライケートすることにより、どんな所望の部位でも生成できる；これらのライゲートしたリンカ−は、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする、特定の、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから成る。

さらに、ＰＣＲ反応に用いられるプライマーは、適当な制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含むように遺伝子工学的に処理できる。

別法において、切断されたベクターおよびＢＲＳウィルス遺伝子をホモポリマー付加により修飾してもよい。特定の実施態様において、単離されたＢＲＳウィルス遺伝子、ｃＤＮＡまたは合成りＮＡ配列を組み込んだ組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換は、多コピー数の遺伝子の生成を可能にする。従って、形質転換体を増殖し、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離し、必要に応じて、単離した組換えＤＮＡから挿入した遺伝子を回収することにより遺伝子を多量に得ることができる。

５．２．　ウシＲＳウィルス・タンパク質の発現ＢＲＳウィルス・タンパク質またはその一部をコードするヌクレオチド配列を適切な発現ベクター（すなわち、タンパク質をコードする挿入配列の転写と翻訳に必要な要素を含むベクター）に挿入する。必要な転写および翻訳シグナルは天然のＢＲＳウィルス遺伝子によっても供給される。様々の宿主・ベクター系を用いてタンパク質をコードする配列を発現させる。これらは、ウィルス（例えばワクシニアウィルス、アデノウィルス等）を感染させた哺乳動物細胞系；ウィルス（例えばバキュロウィルス）を感染させた昆虫細胞；酵母ベクターを含む酵母のような微生物、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤ　Ｎ　Ａで形質転換したバクテリアを含むが、それらに限定されない。これらベクターの発現要素は、その強さおよび特異性が異なる。使用される宿主・ベクター系に応じて、多数の好適な転写および翻訳要素のうちのどれを使用してもよい。

ＤＮＡフラグメントをベクターに挿入するための上記の任意の方法を用いて、適切な転写／翻訳調節シグクナルとタンパク質をコードする配列から成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築する。これらの方法はｉｎ　ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ、合成技術および１ｎｖｉｖｏ組換え（遺伝子組換え）を含む。ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチド・フラグメントをコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列により調節され、その結果ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドは組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主中で発現される。例えば、ＢＲＳウィルス・タンパク質の発現は、当分野で知られている、どのプロモーター／エンハンサ−！素で制御してもよい。ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチド発現を制御するために用いられるプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ　ａｎｄ　Ｃｏｃｋｅｔｔ、　１９８９．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１７：７１１０）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔ　ａｎｄ　Ｃｈａｍｂｏｎ、　１９８１．　Ｎａｔｕｒｅ２９０：　３０４−３１０）、ラウス肉腫ウィルスの３′ロング・ターミナル・リピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８０゜：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９Ｂ２．　Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２）　：原核生物発現ベクター、例えばβ−ラクタマーゼ・プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９９４：の“Ｕｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ”も参照；ツバリン合成酵素プロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３０３：２０９−２１３）またはカリフラワー・モザイク・ウィルス３５ＳＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　１９８１．　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：２８７１）、および光合成酵素、リブロース・ビホスフェートーカルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ｅｔａ＋、、　１９８４．　Ｎａｔｕｒｅ　３１０：１１５−１２０）を含む植物発現ベクター：Ｇａｌ　４プロモーター、ＡＤＣ（アルコール・デヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ　（ホスホグリセロール・キナーゼ）プロモーター、アルカリ・ホスファターゼ・プロモーターのような酵母または他の真菌からのプロモーター要素、および組織特異性を示し、かつトランスジェニック動物中で用いられた下記の動物の転写制御領域：膵臓腺房細胞中で活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８４．　Ｃｅ１ｌ　３８：６３９−６４６；　０ｒｎｉｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、　Ｑｕａｎｔ、　Ｂｉｏｌ、５０：３９９−４０９；　ＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８７．　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ７　：４２５−５１５）；膵臓ベータ細胞中で活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２）、リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（マスト細胞で活性なマウス乳がんウィルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４５：４８５−４９５）、肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、　１　＋２６８−２７６）、肝臓で活性なα−フェトプロティン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｒｆｅｔ　ａｔ、、１９８５．Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、５　：１６３９−１６４８；　Ｈａｍｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、。

リブシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ、１　：］］６ｌ−１７１　、骨髄細胞で活性なβ〜グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎａｔｕｒｅ３１５：３３８−３４０；　Ｋｏｌｌｉａｓ　ｅｔ　ａｌ、。

１９８６、　Ｃｅ１ｌ　４６：８９−９４）　、脳の寡突起神経膠細胞で活性なミニリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８７．　Ｃｅ激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ２３４：１３７２−１３７８）を含むが、これらに限定されない。

ＢＲＳウィルス遺伝子挿入物を含む発現ベクターは３つの一般的アプローチにより同定される：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成、（ｂｌ“マーカー”遺伝子機能の存在または非存在、および（Ｃ）挿入配列の発現。第１のアプローチでは、発現ベクター中に挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたＢＲＳウィルス遺伝子に相同の配列を含むプローブを用いるＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成により検出される。第２のアプローチでは、ベクター中への外来遺伝子の挿入により起こる、特定の“マーカー”遺伝子機能（例えば、チミジン・キナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウィルス中の封入体形成等）の存在または非存在に基づいて組換えベクター／宿主系を同定し選択する。

例えば、ＢＲ３遺伝子をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、ＢＲ８挿入物を含む組換え体はマーカー遺伝子機能の非存在により同定される。第３のアプローチでは、組換え体により発現された外来遺伝子生成物をアッセイすることにより組換え発現ベクターを同定する。

特定の組換えＤＮＡ分子を同定し単離したら、当分野で知られているいくつかの方法を用いてそれを増殖させる。好適な宿主系と成育条件を確立したら、組換え発現ベクターを増殖させそして多量に製造する。上記のように、用いられる発現ベクターは下記のベクターまたはそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない：２．３の例を挙げると、ワクシニアウィルスまたはアデノウィルスのようなヒトまたは動物ウィルス、特にウシ・アデノウィルスおよびウシ・ヘルペスウィルス；バキュロウィルスのような昆虫ウィルス：酵母ベクター：バクテリオファージベクター（例えばラムダ）およびプラスミドとコスミドＤＮＡベクターがある。

さらに、挿入された配列の発現を調整するかまたは所望の特定の方法で遺伝子生成物を修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択してもよい。特定のプロモーターからの発現は特定の誘発物質の存在下で高められる：従って、遺伝子操作されたＢＲＳウィルス・タンパク質の発現を制御できる。さらに、個々の宿主細胞はタンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えばグリコジル化、切断）に関して特徴的かつ特異なメカニズムを有している。例えば、バクテリア系での発現は非グリコジル化コアタンパク質生成物を生成するために用いられる。哺乳動物細胞での発現は異種ＢＲＳウィルス・タンパク質の“天然”のグリコジル化を確実なものにするために用いられる。さらに、異なるベクター／宿主発現系がタンパク質分解切断のようなプロセシング反応を様々な度合で行うことができる。

ＢＲＳウィルス遺伝子を発現する組換え体が同定されたら、遺伝子生成物を分析すべきである。これは、タンパク質の物理的または機能的性質に基づいたアッセイにより達成される。

ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドが同定されたら、タコマドグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、サイズカラムクロマトグラフィー）、遠心、分画溶解を含む標準方法によるかまたはタンパク質精製のだめの他の任意の標準方法により、それを単離し精製する。

本発明のさらに別の実施態様において、ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドを当分野でよく知られている方法を用いて化学合成により製造する。そのような方法は、例えばＢａｒａｎｙ　ａｎｄＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　（１９８０，ｉｎ″Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、”　Ｖｏｌ、ＩＩ、　Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｍｅ：ｅｎｈｏｆｅｒ、　ｅｄｓ、、　Ｊ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、　ｐｐ、１−２８４）に概説されている。

さらに、ウシに感染するが非病原性の組換えウィルス（ワクシニアウィルス、ウシ・ヘルペスウィルスおよびウシ・アデノウィルスを含むがこれらに限定されない）を遺伝子操作し、好適なプロモーター要素を用いてＢＲＳウィルスタンパク質を発現させる。

そのような組換えウィルスを用いてウシに感染させ、これによりＢＲＳウィルスに対する免疫をつけることができる。さらに、ＢＲＳウィルスタンパク質を発現できるが、病原性であり得る組換えウィルスをワクチンの成分として投与する前に不活性化するこれた方法を用いて、下記の核酸配列を決定し、それらに対応するアミノ酸配列を推定した。ＢＲＳウィルス・Ｇタンパク質のｃＤＮＡ配列を決定し、対応するｍＲＮＡ配列を図２に示す。ＢＲＳウィルス・Ｆタンパク質のｃＤＮＡ配列を決定し、対応するｍＲＮＡ配列を図９に示す。ＢＲＳウィルス・Ｎタンパク質のｃＤＮＡ配列を決定し、対応する配列を図１７に示す。これらの配列またはそれらと機能的に等価のものそれぞれを本発明に従って用いる。

本発明は、さらに、少なくとも１０ヌクレオチドを含むＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質をコードする核酸の配列および部分配列に関し、該部分配列は例えば核酸ハイブリッド形成アッセイ、サザンおよびノーザンプロット分析等に用いられる、ＢＲＳウィルスＧ、、ＦまたはＮをコードする核酸配列のハイブリッド形成可能な部分を含む。本発明はまた図３．１１または１８に記載されているアミノ酸配列またはそれらと機能的に等価のものと一致するかまたはＡＴＣＣに寄託されている次のｃＤＮＡクローン：　ｐＲＬＧ４１４−７６−１９Ｌ　ｐＲＬＦ２０１２−７６−１９２、　ｐＲＬＮＢ３−７６によりコードされている、ＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質、そのフラグメントおよび誘導体を提供する。本発明はまた抗原決定基を含むＢＲＳウィルスＧまたはＦタンパク質のフラグメントまたは誘導体を提供する。

例えば、図２．９または１７に記載されている核酸配列は、機能的に等価な分子を生ずる置換、付加または欠失により変更することができる。ヌクレオチドのコード配列の縮重のために、図３．１１または１８に記載されたアミノ酸配列と実質的に同じ配列をコードする他のＤＮＡ配列も本発明の実施に用いられる。これらは、図２．９、または１８に記載されたＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質をコードするヌクレオチド配列であるが、サイレント変異を生しるように配列内の機能的に等価のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換により変更されたヌクレオチド配列の全部または一部からなるヌクレオチド配列を含み、これらに限定されない。同様に、本発明のＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体は、−次アミノ酸配列として、実質的に図３．１１または１８に記載されたアミノ酸配列の全部または一部を含むもの、またはサイレント変異を生しるように機能的に等価のアミノ酸残基て配列内の残基を置換した変更配列を含むｐＲＬＧ４１４−７６−１９１、ｐＲＬＦ２０１２ −７８−１９２、ｐＲＬＮＢ３−７６によりコードされているものを含むが、それらに限定されない。例えば、配列内の１または１以上のアミノ酸残基を、機能的等個物として作用しサイレント変異を生じる類似の極性の他のアミノ酸により置換する。配列内のアミノ酸の置換はそのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選ばれる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。

極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、トレオニン、システィン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラキン酸およびグルタミン酸を含む。翻訳中または翻訳後に、例えばグリコリル化、タンパク質分解切断、抗体分子または他の細胞リガンドとの結合等により示差的に修飾されたＢＲＳウィルス・タンパク質またはそのフラグメントまたは誘導体もまた本発明の範囲に含まれる。

さらに、ＢＲＳウィルス・タンパク質のプロセシングまたは発現を変更するように本発明の組換えＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質をコードする核酸配列を遺伝子操作することもてきる。例えば、限定するものではないが、ＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質をコードする配列の上流にシグナル配列を挿入し、ＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質を分泌させて、それにより収穫または生物学的利用能を容易にする。

さらに、別のｉｎ　ｖｉｔｒｏ修飾を容易にするために、所定のＢＲＳウィルスタンパク質をコードする核酸配列をｉｎ　ｖｉｔｒｏまたはｉｎ　ｖｉｖｏで突然変異させて、翻訳開始および／または終止配列をつくりおよび／または破壊するか、またはコード領域に変異をつくるか、および／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を生成するかまたは既存のものを破壊することがてきる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｊｎｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７８．　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５３：６５５１）、　ＴＡＢ＠１ｉｎｋｅｒｓ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用等を含むがこれらに限定されない、当分野で知られている突然変異誘発のどのような方法でも使用できる。

本発明は、安全てかつ効果的なりＲＳウィルス・ワクチンを製造するために利用できる。本発明によれば、ワクチンの用語は調製物の成分に対して誘導される免疫反応を引き起こす調製物を指すと解釈される。本発明の利点は、ワクチンに用いられるかまたは受動免疫化プロトコルで用いられる抗体を製造するためにＢＲＳウィルス・タンパク質を多量に生産できること、および免疫原性ＢＲＳウィルスタンパク質を生産するが非病原性の組換えウィルス・ワクチンを提供できることにある。これらの選択枝によりＢＲＳウィルスに予めさらされたウシの症状を悪化させることがある改変されたＢＲＳウィルス・生ワクチンの使用を回避できる。

本発明によれば、所望のＢＲＳウィルス・タンパク質が多量に生成されるようにＢＲＳウィルス核酸配列を適切な発現系に挿入する。本発明の特定の実施態様においては、ＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質はサブユニット・ワクチンに用いるためにこの方法で多量に生成できる。本発明の好ましい特定の実施態様において、ＢＲＳウィルスＧ、ＦまたはＮタンパク質はｒＶＶＦ４６４（Ｆタンパク質産生ウィルス）またはｒＶＶＧ６４２　（Ｇタンパク質産生ウィルス）を含むがこれらに限定されない組換えワクシニアウィルスにより発現され、収穫され、続いて好ましい製剤学的担体中のタンパク質サブユニットとして投与される。

または、ワクシニアウィルス、ウシ・ヘルペスウィルスおよびウシ・アデノウィルスおよびウシに非病原性であるがＢＲＳウィルス・タンパク質を発現するレトロウィルスを含むがこれらに限定されない組換えウィルスを用いてウシに感染させ、それにより関連した疾患なしにＢＲＳウィルスに対する免疫を起こさせる。

組換えウィルスを接種した動物でのＢＲＳ　Ｇタンパク質またはその一部または誘導体の生産は、さらにウィルスの細胞への付着を防ぎ、それにより感染を制約する。

本発明のさらに別の実施態様では、ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドをワクチンに用いるために化学合成することができる。

ＢＲＳウィルス・タンパク質のペプチドフラグメントを含むワクチンにおいて、免疫反応を起こしやすいペプチドを選択することが望ましい。例えば、ＢＲＳウィルス・タンパク質のアミノ酸配列をコンピューター分析にかけて、例えば限定するものではないが肝炎ウィルスＢ型表面抗原の抗原性ペプチドの同定に用いて成功しているＨｏｐｐ　ａｎｄ　Ｗｏｏｄｓ　（１９８１，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７８：３８２４−３８２８）に記載されている方法を用いて、表面エピトープを同定する。免疫原性を増加させるために、例えばペプチドを化合的に修飾するかまたはペプチドを担体分子に結合することにより、ＢＲＳウィルス・ペプチドを修飾することが望ましい。

本発明のワクチンは、鼻腔内、口腔内、筋肉内、皮下、または静脈そして好ましく気管内を含むがこれらに限定されない様々な経路によりまたは乱切法により、好適な製剤学的担体と共に投与される。例えば限定するものではないがフロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムのような無機質ゲル、またはりゾレシチンのような表面活性物質、プルロニック・ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールまたはＢａｃｉｌｌｅ　ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍのようなアジュバントと共に本発明のサブユニットワチタンを投与することが望ましい。

防御的および／または長期に持続する免疫を達成するためには複数の接種が必要であるかもしれない。

５、４．２．　ウシＲＳウィルス・タンパク質に対する抗体側の実施態様において、本発明の核酸、タンパク質またはペプチドを用いて、ＢＲＳウィルス・タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を開発できる。ＢＲＳウィルス・タンパク質に対するモノクローナル抗体を調製するために、連続細胞系を培養して抗体分子の生成を提供する任意の方法が用いられる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ　（１９７５，Ｎａｒｕｒｅ　２５６：４９５−４９７）により最初に開発されたハイブリドーマ法を使用できる。

ＢＲＳウィルス・タンパク質に対する抗体の分子クローンは既知の方法により調製することができる。組換えＤＮＡ法（例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照）を用いて、モノクローナル抗体分子またはその抗原結合領域をコードする核酸配列を構築する。

抗体分子は既知の方法、例えば免疫吸着法、免疫アフィニティー・クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）のようなりロフトグラフィー法またはそれらの組合せ等により精製する。

分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の方法により作製できる。

例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ’）、フラグメント；　Ｆ（ａｂ“）２フラグメントのジスルフィド橋を還元することにより生成されるＦａｂ’フラグメント、および抗体分子をパパインと還元剤で処理することにより生成される２つのＦａｂまたはＦａｂフラグメントを含むが、これらに限定されない。

５、４．３．　診断への適用ＢＲＳウィルス・タンパク質をコードする核酸およびタンパク質、ペプチドフラグメントまたはそれらから生成された誘導体およびＢＲＳウィルス・タンパク質とペプチドに対する抗体に関する本発明はＢＲＳウィルス感染を診断するために用いられる。

例えば、本発明の核酸分子を用いて、ノーザンプロット分析（この分析では、動物から得られた核酸調製物をハイブリッド形成が起こる条件下で本発明の相補的核酸分子にさらして、ハイブリッド形成を検出する）を含むハイブリッド形成法によりＢＲＳウィルス感染動物中のＢＲＳウィルス核酸の存在を検出する。例えば、限定するものではないが、全ＲＮＡはＢＲＳウィルスに感染した可能性のあるウシから得られる鼻腔組織のスワブ、気管のスワブまたは任意の上記気道粘膜表面からの単離物から調製できる。続いて、ＲＮＡをノーザンプロット分析（ＢＲＳウィルス核酸から得られ、検出できるように標識（例えば放射標識）したオリゴヌクレオチドプローブをハイブリッド形成可能な条件下でウシＲＮＡを担持するノーザンプロットフィルターにさらす：ハイブリッド形成の後、フィルターを洗浄し、プローブのフィルターへの結合をオートラジオグラフィーにより可視化する）にかける。

または、診断試料中のＢＲＳウィルスのレベルが低い場合、存在するＢＲＳウィルス核酸の量を増幅するために本発明のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ反応に用いてＢＲＳウィルス核酸の存在を検出することが望ましい。本発明の好ましい実施態様では、培養細胞から増幅されたウィルスＲＮＡをドツトプロットハイブリッド形成によりＲＳウィルス配列について分析する。そのようなＰＣＲ反応の生成物中のプライマーにより供給されないＢＲＳウィルス配列の存在はＢＲＳウィルス感染を示すものであろう。

別の実施態様において、本発明のＢＲＳウィルスタンパク質およびペプチドはＢＲＳウィルス感染の診断に用いられる。例えば、限定するものではないが、ＢＲＳウィルスタンパク質およびペプチドは、抗ＢＲＳウィルス抗体の存在を検出するために酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬ　ｌ５Ａ）、免疫沈降法、ロゼツト法またはウェスタンプロット法に用いられる。好ましい実施態様において、抗ＢＲＳウィルス抗体の力価の上昇は活発なりＲＳウィルス感染を示すものである。これらの実施態様によると、血清試料を抗体のタンパク質またはペプチドへの結合を可能にする条件下でＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドにさらして、抗体のタンパク質またはペプチドへの結合を検出する。例えば、限定するものではないが、ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドを固相表面に固定化し、抗体のタンパク質またはペプチドへの結合を可能にする条件下て抗ＢＲＳウィルス抗体を含む可能性のある血清（試験血清）にさらし、続いて抗体のＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドへの結合の検出を可能にする物質、例えば検出可能なように標識した抗免疫グロブリン抗体にさらす。または、ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドをウェスタンプロット分析にかけ、続いてウェスタンプロットを試験血清にさらし、抗体のＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドへの結合を上記のように検出する。本発明のさらに別の非限定的な実施態様において、ＢＲＳウィルス・タンパク質またはペプチドを赤血球の表面上に吸着させ、そのような抗原塗布赤血球を抗ＢＲＳウィルス抗体を含む可能性のある血清にさらす。血清による抗原塗布赤血球のロゼツト形成はＢＲＳウィルスにさらされたことまたは能動的に感染したことを示すものである。

本発明の別の実施態様において、能動的なりＲＳウィルス感染を示すものであろう、ＢＲＳウィルス・タンパク質の存在を検出するために、ＢＲＳウィルスタンパク質を認識する抗体を、ＥＬＩＳＡまたはウェスタンプロット法に用いる。

６、実施例：ウシＲＳウィルスの付着タンパク質Ｇのヌクレオチド配列およびワクシニアウィルスベクターからの発現ＢＲＳウィルス単離体３９１−２．野生型（コペンハーゲン株）および組換えワクシニアウィルス（ｖｖ）ウシ鼻腔こま状（ＢＴ）細胞、ＨＥｐ−２細胞、およびチミジンキナーゼ陰性（ｔｋ−）１４３Ｂ細胞の培養と増殖はＨｒｕｂｙ　ａｎｄ　Ｂａ１１　（１９８１，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４０：４５６−４６４）。

Ｇ特異的ｃＤＮＡクローンの同定ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡをＤ’Ａ１１ｅｓｉｏら（１９８７，Ｆｏｃｕｓ　９　：１−４）に記載されているようにＧｕｂｌｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ　（１９８３，Ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６９）のストランド置換法を用いて合成した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡの末端部を平滑にした（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８２．　ｉｎ　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ）。ｃＤＮＡはＳｍａ　ｌて消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理したＭ１３ｍｐ１９の複製型（ＲＦ）ＤＮＡにライケートし、コンピテントＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａＦ’細胞（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ：Ｈａｎａｈａｎ。

１９８３、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６：５５７−５８０）にトランスフエクトした。

ＢＲＳウィルスＧ特異的挿入物を含むＭ１３＋ｎｐ１９ファージは、ニックトランスレーション（Ｒｉｇｂｙ、　ｅｔ　ａｔ、、　１９７７、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

いたファージＤＮＡのドツトプロットハイブリッド形成　（Ｄａｖｉｓ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８６．　ｉｎ″Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ−１ｏｇｙ、”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、　ＮＹ、　ＮＹ）により同定した。Ｍ１３ｍｐ１９と組換えファージの培養と操作はＭｅｓｓｉｎｇ　（＋９８３゜Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のクレノーフラグメントまたは修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ、　Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いたジデオキシヌクレオチド配列決定を、Ｍ１３配列決定用プライ７−　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、基本的にはＬｉｍおよびＰｅｎｅ　（１９８８，Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、５　：３２−３９）そしてＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ　（１９８７，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：４７４６−４７７１）に記載されているように行った。トリ骨髄芽球症ウィルス（Ａ　Ｍ　Ｖ　）逆転写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅｓ）を用いたＢＲＳウィルスｍＲＮＡ鋳型に対する、ＢＲＳウィルスの塩基１５４−１６６に相補な合成りＮＡプライマーの伸長を行いＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの５′配列を決定した（Ａｉｒ、　１９７９゜して用いたＢＲＳウィルスｍ　ＲＮ　ＡはｃＤＮＡ合成に用いるｍＲＮＡについて記載（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）されているように収穫した。ヌクレオチド配列決定およびプライマー伸長は［ａ　−”Ｓ　］　ｄＡＴＰ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびポリアクリルアミド−尿素勾配ゲル電気泳動を用いてＢｉｇｇｉｎら（１９８３，Ｐｒｏｃ。

Ｎａｊｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、　８０：３９６３−３９６５）に記載されているように行った。ヌクレオチド配列はライスコンシン大学遺伝学コンピューター・グループのソフトウェア−・ノく・ンケージＣＤｅｖｅｒｅｕｘ。

ｅｔ　ａｌ、、１９８４．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３８７−３９５）を用いて分析した。

ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの全オーブン・リーディング・フレームを含むｃＤＮＡは第２鎖合成のための特異的合成オリゴヌクレオチドを用いて合成した。オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列はＢＲＳウィルスｍ　ＲＮ　Ａの配列分析から決定した。第１鎖合成はＤ’Ａｌｅｓｓｉｏ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７，Ｆｏｃｕｓ　９　：１−４）に記載されているように行った。合成の後、ＲＮＡ鋳型をＲＮａｓｅＡ（１８２７μｍ）で３０分間３７℃で消化した。得られた一本鎖ｃＤＮＡをフェノール抽出とエタノール沈澱で単離した。第２鎖合成に用いられたオリゴヌクレオチドは配列：５’　ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣ３’を有し、このオリゴヌクレオチドの５゛側の最初の９塩基はこの遺伝子中のＢａｍ旧制限酵素部位を含む。１末鎖ｃＤＮＡを約５０μｇ／ｍｌの濃度でオリゴヌクレオチドと混合し、１００℃で１分間加熱し、水上に置いた。ＡＭＶ逆転写酵素を用いて、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，０）　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５ｍＭ　ＩＪｇｃＩｚ、ｌ０ｍＭジチオスレイトール、■。

６ｍＭ　ｄＮＴＰ、および１０１００ＵＡ逆転写酵素を含む反応液中で１時間５０℃でインキュベートし、ｃＤＮＡの第２鎖を合成した。ｃＤＮＡをフェノール抽出てタンパク質から分離し、エタノール沈澱で回収し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端にした。続いて平滑末端ｃＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で消化し、フェノール抽出によりタンパク質から分離した。

Ｂａｍ旧とＳｍａ　Ｉで消化し子ウシ腸ホスファターゼで処理したＭ１３ｍｐ２８　ＲＦ　ＤＮＡをｃＤＮＡと溶液中で混合し、エタノール沈澱により回収した。ｃＤＮＡとベクターをライゲートし、Ｈａｎａｈａｎ　（１９８３、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６６：５５７−５８０）に記載されているようニコンビテントＤｔ（５αＦ’細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にトランＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡに対応する、完全なｃＤＮＡクローンＧ４は、ＢａｍＨｌ　とＫｐｎ　ｌで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで処理してｃＤＮＡの末端部を平滑にし、ｐｌＢ］、７６−１９２の唯一のＳｍａ１部位にライケートすることにより、組換えプラスミドｐ１８１７６−１９２にサブクローン化した。プラスミドｐ１８１７６−１９２はＢａ１ｌら（１９８６゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：２４６ −２５０）に記載されティる組換えプラスミドに類似している。ｐｌＢ１７６− １９２はｐｌＢ１７６　（１ｍｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）のＨｉｎｄｌＩ［とＳｍａ　１部位の間に挿入されたワクシニアウィルスの旧ｎｄｍＪフラグメントの塩基対（ｂｐ）ｌ−＋７１０を含む。

ワクシニアウィルスの７．５にプロモーターを含むＤＮＡの２８０ｂｐフラグメントを、ワクシニアウィルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（ＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｊフラグメントのｂｐ５０２−１０７０；　Ｗｅｉｒ　ａｎｄ　Ｍｏ５ｓ、　１９８３．　、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、４６：５３０−５３７）のＥｃｏＲ１部位（旧ｎｄｎＩＪフラグメントのｂｐ６７０）に挿入した。このプロモーターフラグメントの方向は、通常のワクシニアウィルス地図上で右から左に転写を向かわせるような方向であり、ワクシニアウィルスｔｋ遺伝子の転写方向とは逆になった。

ｐ１８１７６−１９２の唯一のＳｍａ　１部位は７．５にプロモーターの主要転写開始部位から下流にある。

ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡ配列を有する組換えワクシニラウィルスの単離は、組換えウィルスをＬａｖｉ　ａｎｄ　Ｅｋｔｉｎ　（１９８１，Ｃａｒｅ野生型および組換えウィルスからのワクシニアウィルスのコアＤＮＡをＥｓｐｏｓｉｔｏら（１９８１，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　２　：１７５−１７９）に記載されているようにサザンプロットのために調製した。制限酵素消化、サザンプロット分析およびニックトランスレーションによるＤＮＡの放射性標識を標準方法を用いて行った（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｊ　ａｌ、、　１９８２．　：ｎ ″Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ＋　ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、。

Ｒｉｇｂｙ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９７７、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１３：２３７−２５１）　、ワクシニアウィルスを感染させた細胞のタンパク質を感染の３時間後に開始して３時間標識した以外は、ＢＲＳウィルスおよび野生型および組換えワクシニアウィルスを感染させた細胞からのタンパク質の代謝標識はＬｅｒｃｈら（１９８９，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）に記載されているように行った。タンパク質の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を標準法を用いて行った。ウェスタンプロット分析のために、感染および非感染細胞からのタンパク質をＬｅｒｃｈら（１９８９，Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）に記載されているように収穫したが、ＢＲＳウィルス感染ＢＴ細胞は感染の３０時間後に、そしてワクシニアウィルス感染ＢＴ細胞は感染の６時間後に収穫した。

抗ＢＲＳウィルス３９１２血清（上記文献）をウェスタンプロット分析に用いた。ガラスカバースリップ上で培養したＨＥｐ−２細胞に免疫蛍光を行った。ＨＥｐ−２細胞に野生型または組換えワクシニアウィルス（感染多重ａ　（ｍｏｉ）＝ｌＯ）を感染させた。感染の４８時間後、細胞を第一抗体として抗ＢＲＳウィルス３９１−２血清を用い、続いてフルオレセイン結合抗つシＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を用いて表面免疫蛍光のために染色した。蛍光をＮ１ｋｏｎ蛍光顕微鏡で観察した。

ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの配列を決定し、アミノ酸配列を推定するために、ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡのｃＤＮＡを作製し、ヌクレオチド配列を９つのｃＤＮＡクローンから決定した。

９つのクローンは、４つの別のｃＤＮＡ合成反応から別々に得られた。ＢＲＳウィルスｍＲＮＡに対する合成りＮＡプライマーのプライマー伸長によるＧ　ｍＲＮＡの５°末端部の直接配列決定も行った。それぞれのクローンからおよびプライマー伸長から決定されたＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡ配列の領域を図１に示す。クローンＧ４は第２鎖合成に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて合成された全長ＢＲＳウィルスＧクローンである。３つの独立したクローン、Ｇ４　（塩基８−８３８）、Ｇ１０（塩基＋９−８２８）およびＧ３３（塩基２３ −８０８）　、をＰｓｔｌとＫｐｎ　ｌで切断し、Ｍｌ、３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡにサブクローン化し、ｃＤＮＡの反対の末端部からの配列決定を可能にした。クローンＧＩＯと６３３は完全に配列決定した。

クローンＧｌ、Ｇ７．Ｇ１２．Ｇ５およびＧ３は全て５００ヌクレオチド長以下であり、このために部分的に配列決定しただけであった。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質のｍＲＮＡはポリアデニル化テイルを除くと約８３８ヌクレオチドであることがわかった（図２）。

ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡ配列を、ＨＲＳウィルスＡ２と１８５３７、それぞれサブグループＡウィルスとサブグループロウィルスのＧタンパク質ｍＲＮＡの公表されているヌクレオチド配列と比較した（図２）　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳｃはＨＲＳウィルスＡ２と１８５３７Ｇ　ｍ　ＲＮ　Ａよりもそれぞれ８１塩基および８４塩基短い。ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡとＨＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡとの間には共通する、いくつかの保存された特徴があった。第１番目のヌクレオチドを除いて、ＢＲＳウィルスＧｍ　ＲＮ　Ａは保存された遺伝子開始シグナル５’　ＧＧＧＧＣＡＡＡＵ、　、　、　３’を有していた。Ｃｏ１１ｉｎｓら（１９８６，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ見い出した。ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの３′末端部もまた全てのＨＲＳウィルス遺伝子の３゛末端に見られる２つのコンセンサス遺伝子配列：のうちのひとつと一致した（Ｃｏｌｌｉｎｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：４５９４−４５９８）。ＢＲＳウィルスＧｍＲＮＡの主要オープン・リーディング・フレームの開始コドンの位置、ヌクレオチド１６−１８はＨＲＳウィルスのＧ　ｍＲＮＡの開始コドンの位置と同一であった（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　、しかしながら、ＢＲＳウィルスｍＲＮＡの３′末端部の非コード領域は、ＨＲＳウィルスＡ２Ｇ　ｍＲＮＡが６塩基であり、ＨＲＳウィルス１８５３７Ｇ　ｍ　ＲＮＡが２７塩基であるのと比較して、４２塩基長であった（Ｊｏｈｎｓｏｎｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８４：５６２５−５６２９；　５ａｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ニア７９５−７８１２；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）。

これは、ＨＲＳウィルスＡ２のＧタンパク質の終止コドンの１１９塩基前にそして１８５３７Ｇ　ｍ　ＲＮ　Ａの終止コドンの９８塩基前にＢＲＳウィルスＧタンパク質の終止コドンが存在することになる。

ひとつのクローンＧ４は塩基８１２．８１９および８２４を欠いており、それらは全て３°非コード領域の終止コドンの後である。ＢＲＳウィルスＧ　ｍ　ＲＮ　ＡはＨＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡに見られる上流のＡＴＧを欠いていた（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ、　８４：５８２５−５６２９；　５ａｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　ＮｕＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡとＨＲＳウィルスＡ２Ｇ　ｍＲＮＡとを整合させた場合、ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡはＨＲＳウィルスＡ２Ｇ　ｍＲＮＡと５１．７％の配列同一性を、そしてＨＲＳウィルス１８５３７Ｇ　ｍ　ＲＮ　Ａと５０．８％の配列同一性を共有していた。

ＨＲＳウィルスＡ２と１８５３７Ｇ　ｍＲＮＡは６７．４％の配列同一性を共有している（Ｊａｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９）　、　ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡをＨＲＳウィルス１８５３７Ｇ　ｍ　ＲＮ　Ａと整合させた場合は、わずかに異なる整合がおこるが、ＢＲＳウィルスのＧｍＲＮＡとＨＲ３Ａ２または１８５３７ウイルスのＧｍＲＮＡとの配列同一性の１％以下の変化となるだけであった。

コンピューター分析を用いて内部欠失がよりよい整合をもたらすかどうか調べたが、見い出されなかった。

６、２．２．　アミノ酸配列と比較ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡは２５７アミノ酸のポリペプチドと予想される主要なオーブン・リーディング・フレームを有していた。このポリペプチドの予想される分子量は２８．６ＫＤであった。ＢＲＳウィルスＧタンパク質の推定アミノ酸配列を示しく図３）、そしてＨＲＳウィルスＡ２および１８５３７Ｇタンパク質の公表されているアミノ酸配列と比較した（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９；　Ｗｅｒｔｚ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　、　ＢＲＳウィルスＧタンパク質は全体的アミノ酸組成においてＨＲＳウィルスＧタンパク質と類似しており、ＨＲＳウィルス１８５３７　（２８，４％）およびＡ２（３０，６％）のＧタンパク質に観察されるそれと比較すると、２５．７％の高いトレオニンとセリンの残基の含有量を有していた。セリンとトレオニン残基はＯ結合炭水化物側鎖付加のための可能な部位となり得る。ＢＲＳウィルスタンパク質中の６６個のトレオニンとセリン残基のうち、５２個（７９％）が提案された細胞外ドメインにある。９個のトレオニン残基（アミノ酸１２．５２．７２、９２．１２９．１３９．１９９．２１０．２１１．２３５）および８個のセリン残基（アミノ酸２．２８．３７．４４．５３．１０２．１０９．１７４）（７）ミが現在マでに調べられている全てのＧタンパク質の予想されたアミノ酸配列間に保存されていた（図３）。〇−結合炭水化物付加となる可能性のある部位に加えて、ＢＲＳウィルスＧタンパク質中にはＮ−結合炭水化物の付加が可能な４つの部位があった。Ｎ−結合炭水化物付加となる可能性のあるどの部位の位置もＢＲＳウィルスとサブタイプＢ　ＨＲＳウィルスとの間には保存されてぃなかった；４つの可能性のある部位のうち２つは、ＨＲＳウィルスＡ２とＢＲＳウィルスＧタンパク質において同してあった。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質は、ＨＲＳウィルスＡ２（１０％）と１８５３７　（８，６％）　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

それと同様に高いプロリン含有量７８％を有していた。６つのプロリン残基は現在まで配列決定されている全てのＲＳウィルスＧタンパク質に保存されていた。

これらのプロリン残基はアミノ酸１４６、　１５５．　１５６．　１７２．　１９４．および２０８であった（図３）。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質の提案された細胞外ドメインには４つのシスティン残基があった。これらの４つの残基は、ＨＲＳウィルスＡ２、Ｌｏｎｇおよび１８５３７て４つのシスティン残基が保存されているように（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓて位置が正確に保存されている（図３）。ざらにＢＲＳウィルス、ＨＲＳウィルスＡ２、およびＨＲＳウィルス１８５３７のＧタンパク質は全て、提案された細胞質ドメイン中のシスティン残基を共有していた（図３）。しかしながら、このシスティン残基はＨＲＳウィルスロング（Ｌｏｎｇ）　Ｇタンパク質中には存在しない。

システィン残基がＢＲＳウィルスＧタンパク質中で保存されているが、サブグループＡとＢ　ＨＲＳウィルスのＧタンパク質に正確に保存されていると以前報告されていた■３のアミノ酸領域は、ＢＲＳウィルスＧタンパク質ては保存されていなかった。ＢＲＳウィルスＧタンパク質のこの領域の１３アミノ酸のうち６つだけが保存されており、これらの６つのうち２つはシスティン残基てあった（図３）。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質およびＨＲＳタンパク質におけるアミノ酸の同一性はＨＲＳウィルスサブグループＡとＢのＧタンパク質問に観察されたアミノ酸の同一性よりもかなり低かった（図４）。ＨＲＳウィルスＡ２と１８５３７Ｇタンパク質の間の全体的アミノ酸の同一性は５３％である。ＢＲＳウィルスＧタンパク質はＨＲＳウィルスＡ２Ｇタンパク質と２９％だけアミノ酸同一性を共有するがＨＲＳウィルス１８５３７Ｇタンパク質とは３０％のアミノ酸同一性を共有した。Ｇタンパク質の３つの仮定されたドメインのそれぞれの中でのアミノ酸同一性の比較は、３つのドメインにおいで同一性のレベルが明確に異なることを示した。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスＧタンパク質の提案された細胞外ドメイン間の同一性は、全体的アミノ酸同一性よりかなり低くかつ２つのＨＲＳウィルスＧタンパク質の細胞外ドメイン間の同一性よりも低かった（図４）。ＢＲＳウィルスＧタンパク質の提案された細胞質とトランスメンブランドメインは、アミノ酸同一性をそれぞれ４３％、５５％有しており細胞外ドメインよりもさらに保存されており、いずれかのＨＲＳウィルスＧタンパク質に対応するドメインに観察された（図４）。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質のどちらのＨＲ３Ｇタンパク質との全体的同一性もＨＲＳウィルスＧタンパク質間質問れより低いが異なるＧタンパク質のヒトロバシーグラフにおいて類似性があった（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

８４：５６２５−５６２９；　５ａｔａｋｅ、　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３ニア７９５−７８１２；　Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ。

Ａ、煕：４０７５−４０７９）。最初に親水性領域、続いてＨＲＳウィルスＡ２、ＨＲＳウィルス１８５３７のＧタンパク質およびＢＲＳウィルスのＧタンパク質の疎水性ピークがあった。これらの２つの領域は共に提案されている細胞質ドメイン（アミノ酸１．−３７）に相当した。

これに続いて提案されているトランスメンブランドメイン（アミノ酸３８−６８）相当する強い疎水性の領域がある。タンパク質の残りの部分は、提案された細胞外ドメイン（アミノ酸６７−２５７．２９２または２９８）に相当し主に親水性であった。この親水性細胞外ドメインは、３つのＧタンパク質の全てが４つの保存されたシスティン残基を含む領域に相当する疎水性の短い領域（アミノ酸１．６６−１８８）により中断されていた。

ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡは、主要オーブン・リーディング・フレームの他に２つのオープン・リーディング・フレームを含んでいた。ひとつのオープン・リーディング・フレームはヌクレオチド２１２で始まり、ヌクレオチド３５２で終了し４６アミノ酸の予想されたポリペプチドをコードしていた。２つのうちのもうひとつの大きい方は１番目と同じコードフレームであるが、ヌクレオチド３８０で始まりヌクレオチド８１４で終了した。このオープン・リーディング・フレームは１４４のアミノ酸の予想されたポリペプチドＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの全主要オーブン・リーディング・フレームを含むｃＤＮＡをワクシニアウィルス組換え体の構築のためにデザインされたプラスミドｐｌＢ１７６−１９２に挿入した。プラスミドｐ１８１７６−１９２は、７．５にプロモーターをチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子に挿入したワクシニアウィルスの旧ｎｄｌｌｌＪフラグメントの一部を含む、以前記載された（Ｂａｉｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３：２４６−２５０）組換えプラスミドと類似している。

しかしながら、ｐ１８１７６−１９２の場合、ＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｊフラグメントの旧ｎｄ■とＰｖｕ　ＩＩ部位間の１７１０塩基対フラグメントはｐｌＢ１７６の旧ｎｄＩＩＩとＳｍａ　１部位間に挿入され、７．５にプロモーターがｔｋプロモーターの逆の方向に転写を指示する。ＢＲＳウィルスＧｍＲＮＡのｃＤＮＡを７．５にプロモーターの主要転写開始部位の下流に挿入した。挿入したＢＲＳ　Ｇ遺伝子を含むＨｊｎｄｍ　Ｊフラグメントを相同的組換え（Ｓｔｏｔｔ、　ｅｔ　ａｌ、、　１９８６．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０：６０７−６１３）によりワクシニアウィルス（コペンハーゲン株）のゲノムに挿入した。チミジンキナーゼ陰性組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ）をＢＲＳウィルスＧ遺伝子に特異的なプローブを用いて組換えウィルスＤＮＡのハイブリッド形成により同定し、３回のブラック精製により選択した。組換えワクシニアウィルスＧ６４２とＧ　４５６７は７．５にプロモーターに対して、それぞれ順および逆方向にＢＲＳウィルスＧ遺伝子を含んでいた。ＢＲＳウィルスＧ遺伝子が組換えウィルスのｔｋ遺伝子内に挿入されたのを確認するために、組換えワクシニアウィルスのゲノム構造をワクシニアウィルスコアＤＮＡ消化物のサザンプロット分析で確認した。

６．２．４．　ＢＲＳウィルスＧ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルスで感染した細胞からのタンパク質の分析ＢＲＳウィルスＧ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルスのＢＲＳウィルスＧタンパク質を発現する能力をＢＴ細胞で調べた。

ＢＲＳウィルス、野生型ワクシニアウィルスまたはＢＲＳウィルスＧ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルスで感染したＢＴ細胞からのタンパク質をＢＲＳウィルス３９１−２特異的抗血清を用いたウェスタンプロット分析で分析した。なぜならＢＲＳウィルスＧアミノ酸配列配列中のアミノ酸が微量であり、かつ３９１ −２抗血清が免疫沈降に働かないという事実もあってＢＲＳウィルスＧタンパク質は、　［３″Ｓ］−メチオニンで容易に標識されない。３９１−２抗血清は、ＢＲＳウィルス感染細胞からのタンパク質のウェスタンプロット分析におけるＢＲＳウィルスＧタンパク質を認識するために以前示された（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）。

血清はｒＶＶ　Ｇ６４２　（順方向）感染細胞（図６、レーンＧ６４２＋）に存在する２つのタンパク質を認識したが、ｒＶＶ　Ｇ４５６７　（逆方向）または野生型ワクンニア感染細胞（図６、それぞれレーンＧ４５６７−とＶＶ）ては認識しなかった。ｒＶＶ　Ｇ６４２感染細胞中に生成された２つのタンパク質はＢＲＳウィルス感染細胞中で抗血清により認識されたタンパク質と共に移動した。

ｒＶＶ　Ｇ６４２感染細胞中のタンパク質のひとつは６８ＫＤと９７ＫＯのタンパク質マーカー間の幅広いバンドとして成熟ＢＲＳウィルスＧタンパク質と共に移動した。もうひとつのタンパク質は約４３ＫＤに移動した。

Ｇタンパク質は感染細胞の表面に発現した糖タンパク質であり、ピリオンの膜に組み込まれる（Ｈｕａｎｇ、　１９８５．　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、２　：１５７ −１７３）。組換えワクシニアウィルス感染細胞中で発現するＢＲＳウィルスＧタンパク質が輸送され、感染細胞の表面で発現されるかどうか決定するために、間接的免疫蛍光染色を組換えウィルス感染細胞について行った。ＢＴ細胞はワクシニアウィルス感染に対して非常に感受性があることがわかった。バックグランド蛍光が高く非常に少数の細胞が染色処理で生き残った。これらの理由により、免疫蛍光染色を組換えウィルス感染ＨＥｐ−２細胞に行った。

組換えＧ６４２で感染したＨＥｐ−２細胞（図７、パネルｒＶＶＧ）は非感染細胞（図７、パネルＭ）または野生型ワクシニアウィルス感染細胞（図７、パネルＶＶ）には存在しない特異的な表面蛍光を示した。

６．３．考案呼吸器ウィルスのＧタンパク質は様々な理由により例外的なウィルス糖タンパク質である。それはＨＲＳウィルスの付着タンパク質として特徴づけられているが（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　６８：２５２２−２５２４）　、バラミクソウィルス材中の他のウィルスの付着タンパク質中に見られるノイラミニダーゼとへマグルチナーゼ両方を欠いている（Ｇｒｕｂｅｒ　ａｎｄ　Ｌｅｖｉｎｅ、　１９８３．　Ｊ、　Ｇｅｎ。

バク質の質量の約５５％が〇−結含オリゴ糖側鎖の付加によると推測される、はなはだしいグリコジル化があることを示唆している（Ｌａｍｂｅｒｔ、　１９８９．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６４：４５８−４６６）　。ＢＲＳウィルスのＧタンパク質はＨＲＳウィルスＧタンパク質からは抗原性上区別ささらに、１報告（Ｍａｔｕｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｒｃｈ、　Ｇｅｓａｍｔｅ　Ｖｉｒｕｓｆｏｒｓｃｈ４４　：２８０−２９０）を除いてはＢＲＳウィルスはヒト起源の細胞に感染することができないがＨＲＳウィルスはヒトとウシの細胞の両方に感染する。ＢＲ８とＨＲＳウィルス間の宿主域の相異は付着タンパク質中に見られるアミノ酸配列の相異を反映している可能性がある。

ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＧタンパク質との間の相異をさらに調べるために、ｃＤＮＡクローンからのＢＲＳウィルスＧタンパク質ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定した。ＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡは、ＨＲ，ＳウィルスのＧ　ｍＲＮＡよりも小さく、現在までに配列決定されたＨＲＳウィルスのＧ　ｍＲＮＡと５１％の配列同一性を共有した。ＨＲＳウィルス遺伝子に見られる共通のウィルス遺伝子開始および終了配列は、ＨＲＳウィルスＧｍＲＮＡの開始コドンに対する開始コドンの位置のようにＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡ中で保存されていた。ＢＲＳウィルスＧｍＲＮＡは大きな３′非コード領域を有するものであってその領域がＢＲＳウィルスＧ　ｍＲＮＡの小さなサイズと結合（７，２５７アミノ酸で２８ＫＤａの推定分子量を有するポリペプチドをコードする主要なオープン・リーディング・フレームとなる。これを、それぞれＨＲＳウィルスサブグループＡおよびサブグループＳウィルスのＧ　ｍＲＮＡによりコードされ、各々約３２ＫＤａの推定分子量の２９８および２９２アミノ酸のポリペプチドと比較する。推定ＢＲＳウィルスＧポリペプチドのサイズを感染細胞に見られる成熟ＢＲＳウィルスＧタンパク質の推定サイズと比較した場合、ＢＲＳウィルスＧポリペプチドの著しい修飾があることを示唆した。

エンドグリコシダーゼ、炭水化物付加のインヒビターおよび〇−結合グリコシル化欠損細胞系を用いた研究はＨＲＳウィルスＧタンパク質がＮ−および〇−結合炭水化物側に著しくグリコジル化があることを示した（Ｌａｍｂｅｒｔ、　１９８８．　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６４：４５８−４６６）。

感染細胞からの成熟ＢＲＳウィルスＧタンパク質がグリコジル化されていることが示され、９０ＫＤａ　ＨＲＳウィルスＧタンパク質と類似した電気泳動移動度を有し、一方ポリペプチドの推定アミノ酸配列は２８ＫＤａのタンパク質であることを示した（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、。

質もまたＨＲＳウィルスＧタンパク質のように著しくグリコジル化されていることを示唆している。ＢＲＳウィルスの０−グリコジル化の可能性のある部位の実際の数（６６）はＨＲＳウィルスサブグループＡに見られる可能性のある部位９１よりも低いが（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９；　５ａｔａｋｅ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１３ニア７９５−７８＋２；Ｗｅｒｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８５．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）　Ｂ　ＲＳウィルスＧタンパク質の推定アミノ酸配列は、ＨＲＳウィルスＧタンパク質（サブグループＡとＢはそれぞれ３０％と２８％）のレベルと同様にセリンとトレオニンのレベルが高かった（２５％）。推定ＢＲＳウィルスＧアミノ酸配列配列中リンとトレオニンの高い含有量はＢＲＳウィルスＧタンノくり質もまた著しい〇−結合グリコシル化の可能性があることを示唆している。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質の全体的アミノ酸組成はＨＲＳウィルスＧタンパク質のそれと類似していたが、ＢＲＳウィルスＧアミノ酸配列配列ブグループＡまたはＳウィルスのＨＲＳウィルスＧタンパク質の有する全体的アミノ酸同一性レベルより低かった（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４５６２５−５６２９）。ＢＲＳウィルスＧタンパク質とサブグループＡまたはＢ　ＨＲＳウィルスのＧタンパク質との間ではほんの２９−３０％の同一性であるがＨＲＳウィルスサブグループＡとサブグループＳウィルスのＧタンパク質を比較した場合、５３％のアミノ酸同一性がある（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８７．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、　Ａ、　８４：５６２５ −５６２９）。高いレベルのアミノ酸同一性は、提案されている細胞質およびトランスメンブランドメイン中のＢＲＳウィルスＧタンパク質とＨＲＳウィルスＧタンパク質との間に存在するが、このレベルはまたサブグループＡとＢのＨＲＳウィルスのＧタンパク質のそれらの領域を比較した場合に見られる程高くはない（図４）。ＢＲＳウィルスＧタンパク質アミノ酸配列がＨＲＳウィルスサブグループＡまたはＢのどちらのＧタンパク質アミノ酸配列とも顕著な程密接に関係していないという事実は、ヒトおよびウシ呼吸器ウィルスがＨＲＳウィルスＡおよびＢサブグループの出現する前に分岐しそしてそれらが別の肺炎ウィルスサブグループに分類されていることを示唆する。

ＢＲＳウィルスＧタンパク質の推定されたアミノ酸配列はＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＧタンパク質が２９−３０％しかアミノ酸同一性を共有しないことを示した。これらの相異にもかかわらず、２つのタンパク質のヒトロバシーグラフは強い類似性を示し、全体的構造的特徴の類似する可能性を示唆するＪｏｈｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：５６２５−５６２９）は、ＨＲＳウィルスのＧタンパク質の細胞外ドメインに見られる保存された１３アミノ酸領域がレセプター結合部位候補であり得ると示唆した。この保存された領域がＢＲＳウィルスのＧタンパク質中で保存されていないという事実は、ＢＲＳウィルスの宿主特異性と関係し得る。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスの両方のＧタンパク質中に見られる４つの保存されたシスティン残基は、宿主特異性を変える保存領域中において特性の違いを有するＧタンパク質に類似した２次構造をつくり得る。回復期にある小ウシ血清はＢＲＳウィルスがＨＲＳウィルスのように抗原的にサブグループを有する可能性を示唆した（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、邦：８３３−８４０）。

ＢＲＳウィルスＧ遺伝子のｃＤＮＡ挿入物を含む組換えワクシニアウィルスは、ＢＲＳウィルスＧタンパク質を発現した。このＢＲＳウィルスＧタンパク質は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて、ＢＲＳウィルス感染細胞からのＧタンパク質と類似した電気泳動移動度を有した。ＢＲＳウィルス３９１−２に特異的な抗血清は、ウェスタンプロット分析で示されたように感染細胞において組換えワクシニアウィルスにより生成されたＢＲＳウィルスＧタンパク質を認識した。

組換えワクシニアウィルスから発現されたＢＲＳウィルスＧタンパク質は輸送され、表面免疫蛍光で示されたように感染細胞の表面で発現した。

（本頁以下余白）７、衷ｍｍ：ウシＲＳウィルス融合タンパク質のｍ　ＲＮ　Ａ及び組換えワクシニアウィルスのヌクレオチド配列分析ＢＲＳウィルス３９１−２、野生型（コペンハーゲン株）、及び、組換えワクシニアウィルス、ウシ鼻甲介（ＢＴ）細胞、ＨＥｐ−２細胞、及び、チミジンキナーゼ陰性（ｔｋ）の１４３Ｂ細胞の成育及び増殖は、Ｈｒｕｂｙ　ａｎｄ　Ｂａ１ｌ　（１９８ＬＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　４０：４５６−４６４；５ｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、６０＋　６０７−６１３；Ｌｅｒｃｈ　ｅｔａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）において記載されているウシ鼻甲介（Ｂ　Ｔ）細胞の細胞単層を、擬似に、ＢＲＳウィルス、もしくは、ＨＲウィルスで感染させた。ツニカマイシン（１，５μｇ／ｍｌ、ベーリンガー　マンハイム社）を、必要な場合には、感染後２５時間目に細胞を覆う培地に添加した。１時間後に、その培地を全ての単層から除去して、メチオニンを含まないＤＭＥＭ　（ギブコ社）に入れ替えた。ツニカマイシンを、必要な場合には再添加した。３０分のインキュベーション後、［”Ｓ］メチオニン（Ｉ００μＣｉ／ｍｌ、ニューイングランド　ヌクレアー社）を培地に添加した。細胞を２時間インキュベートし、タンパク質を、Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｒｒｏｌ、　６３：８３３−８４０において記載しであるように収集した。ウィルス特異的なタンパク質を、ＷｅｒｔＺら（１９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）において記載しであるように、ウェルカム社の抗−Ｒ３血清（ウェルカム　リエーンエンッ社）を使用して免疫沈殿させた。タンパク質を５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡ　Ｇ　Ｅ　）　（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ、１９７０、Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２２７：６８０−６８５）により分析し、蛍光光度法（Ｄａｖｉｓ　ａｎｄ　Ｗｅｒｔｚ、１９８２、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４１：８２１−８３２）により検出した。

Ｇｕｌｂｅｒ　ａｎｄ　Ｈｏｆｆｔｎａｎ　（１９８３、ｇｅｎｅ　２５：２６３−２６０）のストランド置換法を使用して、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ　ｅｔ　ａｌ　（＋９８７、Ｆｏｃｕｓ　９：１−４）において記載されているようにｃＤＮＡを合成した。Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を使用して、ｃＤＮＡの末端部を平滑にした（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２．１ｎ″ＭｏＩｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｊｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔ。

ｒｙ　ｍａｎｕａｌ、”Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ、Ｙ、）　。ｃＤＮＡを、Ｓｍａｌで消化させてありかつウシ腸管アルカリホスファターゼ（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、上記）で処理しであるＭ１３ｍｐ１９複製型（ＲＦ）ＤＮＡに結合し、コンピテントのＥ、Ｃｏ１１ＤＨ５αＦ°細胞（ベセスダ　リザーチラボラトリーズ社）内にトランスフェクトさせた（Ｈａｎａｈａｎ、　１９８３、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６：５５７−５８０）　。ＢＲＳウィルスのＦ特異的挿入断片を含むＭ　１３　ｍ　ｐ　１９フアージを、ニックトランスレーション（Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９７７、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１３：２３７−２５１）により標識した、予め同定しであるＢＲＳウィルスＦ遺伝子特異的クローン（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）をプローブとしてファージＤＮＡのドツトプロットハイブリッド形成（Ｄａｖｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６、”Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、、Ｎｅｙ　Ｙｏｒｋ、Ｎ、Ｙ、）により同定した。Ｍ１３ｍｐ１９及び組換えファージの増殖及び操作は、Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８３、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１：２０−７８）により記載されている大腸菌のＤＮＡポリメラーゼ ■　（ファルマシア社）のフレノウ断片もしくは修飾したＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ（シークエナーゼ、Ｕ、Ｓ、バイオチミカルズ社）を用いるジデオキシヌクレオチド配列決定は、Ｔａｂｏｒ　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ　（１９８７、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８４：４７４６−４７７１）　、及び、Ｌｉｍ　ａｎｄ　Ｐｅｎｅ　（１９８８、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、　Ｔｅｃｈ、　５：３２−３９）において記載されているようにして、Ｍ１３配列決定用プライマーにニューイングランド　バイオラボズ社）を使用して行った。ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの塩基２６４から２８４までに対して相補的である合成りＮＡプライマーの伸長は、ＢＲＳウィルスのｍＲＮＡに対して、トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素（モレキュラー　ジェネティック　リゾーシス社）を用いて行った（Ａｉｒ、１９７９、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ９７　：４６８−４７２）。ＲＮＡ上のプライマー伸長で鋳型として使用されるＢＲＳウィルスｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成のために用いられるｍ　ＲＮ　Ａのために記載されているように採取した（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：　８３３−８４０　）　。ヌクレオチド配列決定及びプライマー伸長は、［α−”Ｓ］　ｄＡＴＰ　（アマージャム社）及びポリアクリルアミド−尿素濃度勾配ゲル電気泳動を使用して、Ｂｉｇｇｉｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８０：３９６３−３９６５）により記載されているように行った。

ヌクレオチド配列は、ライスコンシン大学のジェネティックコンピューターグループのソフトウェア−製品を使用して分析した（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２：３８７−３９５）。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの完全な主要読み取り枠を含むｃＤＮＡを、第２鎖合成についての特異的合成オリゴヌクレオチドを使用して合成した。このオリゴヌクレオチドについてのヌクレオチド配列は、ＢＲＳウィルスのｍＲＮＡの配列分析から決定した。第１鎖合成は、Ｄ’Ａｌｅｓｓｉｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７、Ｆｏｃｕｓ　９：１−４）において記載されているとおりになった。合成に引き続き、ＲＮＡ鋳型をＲＮアーゼＡ（１μｇ／μｍ）で３７°Ｃで３０分間消化させた。結果として生じる１本鎖のｃＤＮＡを、フェノール抽出及びエタノール沈殿により単離した。第２鎖合成に用いられるオリゴヌクレオチドは、配列、５’　ＣＡＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＣＣ３’　を有し、このオリゴヌクレオチドの５“側の最初の９塩基はＢａｍＨＩ制限部位を含んでいる。１本鎖のｃＤＮＡをこのオリゴヌクレオチド（５０μｇ　／　ｍ　＋　）と混合し、１００°Ｃに１分間加熱し、氷上に置いた。ＡＭＶの逆転写酵素を利用して、反応物［５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８゜０）、５０ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭのＭ　ｇ　Ｃ１２，１０ｍＭのジチオスレイトール、１．６ｍＭのｄＮＴＰ類、１００ＵのＡＭＶＩニア）逆転写酵素］中で第２鎖のｃＤＮＡを合成するために用い、その反応物は５０°Ｃて１時間インキュベートした。ｃＤＮＡを、フェノール抽出によりタンパク質から分離し、エタノール沈殿により回収し、更に、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑にした。

平滑末端のｃＤＮＡをその後、制限酵素ＢａｍＨＩ（ベセスダリサーチ　ラボラトリーズ社）で消化し、更に、フェノール抽出によりタンパク質から分離した。

Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦのＤＮＡを、ＢａｍＨＩ及びＳｍａｌで消化し更にウソ腸管のフォスファターゼで処理し、これを、先のｃＤＮＡに添加し、更に、エタノール沈殿により回収した。このｃＤＮＡとベクターとを結合させ、更に、Ｈａｎａｈａｎ　（１９８３、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６：５５７−５８０）において記載されているように、感応性のＤＨ５αＦ′細胞（ベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ社）内にトランスフェクトさせた。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡに対応する完全なｃＤＮＡクローンであるＦ２０を、ＢａｍＨＩ及びＫｐｎｌでの消化、ｃＤＮＡの平滑末端を作成するためのＴ４ＤＮＡポリメラーゼでの処理、及び、ｐｌＢＩ７６−１９２の非反復のＳｍａ　Ｉ部内への連結により、組換え用プラスミドｐＩＢＩ７６−１９２内へサブクローン化させた。このプラスミドｐＩＢＩ７６−１９２は、Ｂａ１ｌら（１９８６、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：２４６−２５０）において記載されているような紹換え用プラスミド類に類似している。

ｐｌＢｒ７６−１９２の場合においては、ワクシニアウィルスのＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ断片の塩基対（ｂｐ）１から１７１０を、ｐＩＢＩ７６　（インターナショナル　バテクノロシー社）のＨｉｎｄｌｌｌとＳｍａ１部位との間に挿入した。

２８０ｂｐ、つまり、ツクシアウィルスの７．５にプロモーターを含むＤＮＡの断片を、ワクシニアウィルスのチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子（ＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ断片のｂｐ　５０２から１０７０、Ｗｅｉｒ　ａｎｄ　Ｍａｓｓ、　１９８３、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　４６：５３０−５３７）のＥｃｏＲ１部位（Ｈｉｎ　ｄＩＩＩ　Ｊ断片のｂｐ　６７０）内に挿入した。このプロモーターの方向は、ワクシニアウィルスのｔｋ遺伝子の転写方向とは逆の、通常のワクシニアウィルス地図上の右から左への転写を指示するようなものであった。Ｉ）ＩＢＩ７６ −１９２内の非反復のＳｍａｒ部位は、７．５にプロモーターの主要な転写開始部位の下流にある。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡ配列を含む組換えワクシニアウィルス類の単離は、組換えウィルス類をＬａｖｉ　ａｎｄ　Ｅｋｔｉｎ　（１９８１、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　２：４１７−４２３）のプロット法を使用して同定したこと以外は、５ｔＯｔｔら（１９８６、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０：６０７−６１３）において記載されているように行った。

７、　１．　７．　組換えワクシニアウィルスベクターの性質決定野生型及び組換えウィルス類から単離したワクシニアウィルスのコアＤＮＡを、Ｅｓｐｏｓ　ｉ　ｔｏら（１９８１，Ｊ、　Ｖ：ｒｏｌ、　Ｍｅｔｈ、　２：ｌ７５−１７９）により記載されているようにサザンプロット分析用に調製した。制限酵素消化、サザンブロソト分析、及び、ニックトランスレーションによるＤＮＡの放射活性ラベル化は、上述の区分６において記載したように行った。野生型及び組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞からのタンパク質の代謝ラベル化は、感染後３時間から開始する３時間の間、感染させた細胞類をラベル化物に露出したことを除いては、先と同様に行った。タンパク質は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により標準的な方法を使用して分析した。ウィルス特異的タンパク質類の免疫沈降法は、ｗｅｒｔｚら（１９８５、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８２：４０７５−４０７９）において記載されているように、ウェルカム社の抗−Ｒ５血清（ウェルカム　リージエンツ社）を使用して行った。免疫蛍光法については、ＨＥｐ　−２細胞をカバーガラス片上で増殖させた。細胞は、野生型もしくは組換えワクシニアウィルス類（ｍｏｉ＝１０）で感染させ、更に、感染後２４時間目に、その細胞を間接的蛍光法により、第１抗体として抗−ＢＲＳウィルス３９　・１−２血清（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、ｌ９８９、Ｊ、　Ｖｊｒｏｌ、　６３：８３３−８４０　）を使用し、次に蛍光複合体形成させた抗−ウシＩ　ｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）を使用して染色した。蛍光発光は、ニコン社の蛍光顕微鏡を使用して観察した。

７．２．　結果７、　２．　１．　核酸配列とその比較ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの完全なヌクレオチド配列を決定する目的で、Ｍ１３ファージベクター内のｃＤＮＡクローンを単離し、更に、それらのヌクレオチド配列を分析した。このＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡ配列は、４つの別々なｃＤＮＡ合成反応に独立的に由来する８つのクローン類から決定した。異なるクローンから決定したＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの領域を図８に示している。この配列の大部分は、３つのクローン、ＦＢ３、ＦＢ５、及び、Ｆ２０から決定した。クローンＦ２０はＢＨ３つイルスのＦ　ｃＤＮＡの全要分にあたり、これは、ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの５ ′端に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して合成した。クローンＦＢ３、ＦＢ５、及び、Ｆ２０からの挿入断片類を、挿入断片内は切断しない制限酵素Ｐｓｔｌ及びＫｐｎＩを使用して切除し、Ｍ１３ｍｐ１８　ＲＦ　ＤＮＡ内にサブクローン化してそのｃＤＮＡの反対側の末端から配列を決定した。

更に、その挿入断片類の制限断片類を、Ｍ１３ｍｐ１８及びｍｐ１９というＲＦ　ＤＮＡ内へサブクローン化して、そのｃ　ＤＮＡの中間部分の配列の決定を可能にした。クローンＦ２０を制限酵素、ＡＩｗＮＩ、Ｐｆ　ＩＭＬ　ＥｃｏＲＶ、もしくは、ＨｐａＩで消化し、クローンＦＢ３及びＦＢ５を制限酵素ＥｃｏＲＩて消化した。ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡ配列の５°端は、ＢＲＳウィルスで感染させた細胞類からのｍ　ＲＮ　Ａ上におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドの伸長により決定した。ＢＲＳウィルスのＦｍ　ＲＮ　Ａの塩基２６７から２８４に対して相補的なオリゴヌクレオチドについての配列は、ｃＤＮＡクローン類により提供される配列から決定した。クローンＦ２９、ＦＢ２、Ｆ１３８、及び、ＦＢＩは、全て７５０ヌクレオチドもしくはこれらを下回るものであり、これらは広範囲には配列決定を行わなかった。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡは、ポリアデニル尾部を除く１８９９ヌクレオチドを含んでいた（図９）。そのｍ　ＲＮ　Ａの厳密な５“端にある７つの塩基は、ｍＲＮＡについてのプライマー伸長中の各塩基についての４つのヌクレオチド反応全てにおける強力な停止シグナルのために、決定することができなかった。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの３゛端の配列は、全てのＨＲＳウィルス遺伝子（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：４５９４−４５９８）の末端及びＢＲＳウィルスのＧｍＲＡＮの３″末端において見いだされる２つのコンセンサス遺伝子末端配列の内の一つである、Ａ５′　・・・・・ＡＧＵ−ＡＵ−ＵポリＡ３’Ｕであることを突き止めた。ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＡＮは単一の主要読み取り枠を有し、それは、ヌクレオチド１４で始まる開始コドンから始まりかつヌクレオチド１７３６の停止コドンにまで広がっている。３′ポリアデニル化領域の手前には、３′端における１６１ヌクレオチドの非コーディング領域が存在していた（図９）。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡのヌクレオチド配列を、ＨＲＳウィルスＡ　２　（Ｃｏｆｆｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：４５９４−４５９８）のＦ　ｍＲＮＡ、　Ｌｏｎｇ　（Ｌｏｐｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、　１０：２４９−２６２）　、Ｒ８Ｓ　−２（Ｂａｙｂｕｔｔ　ａｎｄ　ＰｒｉｎｇｌｅＳ１９８７ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒ、　６８：２７８９−２７９６）　、及び、１８５３７　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ、１９８８、Ｊ、Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９：２６２３−２６２８）について公表されている配列と比較して、様々なＦ　ｍＲＮＡ配列間における核酸の相同性の程度を決定した（表１）。

（本頁以下余白）ＨＲＳウィルスＡ２、Ｌｏｎｇ、及び、ＰＳＳ−２はサブグループＡのウィルス類であり、更に、１８５３７はサブグループＢのウィルスである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５１：６２６−６３３；Ｍｕｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６６：２１１１−２１２４）。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルス類のＦ　ｍＲＮＡ間の核酸相同性のレベル（７１，５％）は、２つのＨＲＳウィルスサブグループのＦ　ｍＲＮＡを比較する場合に観察される相同性レベル（７９％）に類似していた。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡ間、及び、２つのＨＲＳウィルスサブグループのＦｍ　ＲＮ　Ａの間の、両方の相同性のレベルは、同一のサブグループ内のＨＲＳウィルス類のＦ　ｍＲＮＡの間の相同性のレベル（９７−９８％）よりも低いものであった。Ｆ配列の３′非コーデイング領域におけるＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルス類との間のヌクレオチド配列相同性のレベルは、Ｆ配列のコーディング領域における７４．５％と比較すると３７．５％であった。これは、サブグループＡのＨＲＳウィルス類のＦ配列をサブグループＢのＨＲＳウィルスのＦ配列と比較した場合、それぞれ４７％と８２％である、３′非コーデイング領域及びコーディング領域における相同性のレベルに類似していた。Ｆ　ｍＲＮＡ配列における２つの部位上のヌクレオチドには変異種が存在していた。あるクローン、すなわちクローンＦ２０においては、ヌクレオチド４５５と４７３は、他のクローンにおいて観察されかつ配列図（図９）において示されるＡとＧではなく、それぞれ、ＧとＣであった。

７．２．２．　ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の予想アミノ酸配列及びＨＲＳウィルスのＦタンパク質配列との比較ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの読み取り枠では５７４アミノ酸のポリペプチドが予測された。このポリペプチドのアミノ酸配列を、図９におけるｍＲＮＡ配列の下に示した。予想されたＢＲＳウィルスのＦポリペプチドの推定分子量は６３．８ｋＤａであった。予想されたポリペプチドのヒトロバシー（Ｈｕｄｒｏｐａｔｈｙ）は、残基１から２６に相当する、アミノ末端、及び、残基５２２から５４９に相当するカルボキシ末端付近における強い疎水性領域を示した（図１０）。ヒトロバシー曲線及びアミノ酸配列は、ＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中の領域（ドメイン）はＨＲＳウィルスのＦタンパク質について記載されているものに類似しており、アミノ末端のシグナルペプチド領域（残基１−２６）、カルボキシ末端のアンカー領域（残基５２２−５４９）、及び、Ｆｌ及びＦ２ポリペプチドを産生ずる推定上の開裂配列（残基１３１−１３６）を含むことを示唆していた（図１０及び１１を参照せよ）。Ｎ−結合性炭化水素側鎖類の付加については３つの可能な部位が存在し、そのうち２つは提案されたＦ２ポリペプチド内に、そして１つは提案されたＦ１ポリペプチド内に存在した（図９）。

予想されるＢＲＳウィルスのＦアミノ酸配列を、ＨＲＳウィルス類、Ａ　２　（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｔ、、ｌ９８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、Ｌｌ、Ｓ、Ａ、　８］ニア１６８３−７ｉ６８７）　、Ｌ　ｏ　ｎ　ｇ　（Ｌｏｐｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、　１０：２４９−２６２）　、ＲＳ　Ｓ　−２（Ｂａｙｂｕｔｔ　ａｎｄ　Ｐｒｉｎｇｌｅ、１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：２７８９−２７９６）　、及び、１８５３７　（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ、１９８８、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９：２６２３−２６２８）のＦポリペプチド類の予想されるアミノ酸配列類と比較した（図１１）。

ＢＲＳウィルスのＦポリペプチドは、４種類全てのＨＲＳウィルスのＦポリペプチド類と同様、５７４アミノ酸である。ＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中に存在する、提案されたカルボキシ末端の疎水性アンカー（残基５２２−５４９）及びアミノ末端のシグナル領域（残基１−２６）は、ＨＲＳウィルスのＦタンパク質類中に存在するものに類似していた。更に、ＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中の残基１３１から１３６におけるＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇの配列は、提案された開裂シグナルを示した。この配列は、全てのＨＲＳウィルスＦタンパク質類中における、提案された開裂シグナル類と相同であった。ＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中の開裂配列は−続きの疎水性残基（残基１３７− １５８　’）の次にあるが、この疎水性残基は開裂後のＦ１ポリペプチドのアミノ末端を意味するものと思われる。クローンＦ２０中におけるヌクレオチドの違いは、結果的には、提案されたＦ１アミノ末端の一部分であるアミノ酸残基１４８及び１５４において生じ、これらはそれぞれ、ＶａｌからＩｌｅへ、かつ、ＬｅＵからＶａｌへと変化する。これらの違いは、結果的には、ＨＲＳウィルスのＦタンパク質類中の相関するアミノ酸部位と相同である、ＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中におけるこれらの２つの部位におけるアミノ酸中に生じるであろう。

提案されたアミノ末端のシグナルペプチドにおける一つのシスティン残基（残基２５）の例外はあるものの、全てのシスティン残基はＢＲＳウィルス及びＨＲＳウィルスのＦタンパク質内の部位において保存されていた。これには位置５５０におけるシスティン残基が含まれるが、これは、ヒトのＲＳウィルスのＦタンパク質に対するパルミチン酸の共有結合の部位であることが示されている（Ａｒｕｍｕｇｈａｍ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：１０３３９−１０３４２）。ＢＲＳウィルスのＦタンパク質のＦ１ポリペプチド中においては、Ｎ−結合グリコリル化についての単一の可能な部位（残基５００）が存在し、その部位は、全てのＨＲＳウィルスのＦタンパク質において保存されていた（図１１）。ＢＲＳウィルスのＦ２ポリペプチドにおいては、Ｎ− 結合グリコシル化（残基２７及び１２０）についての２つの可能な部位が存在していた（図９及び１１）。残基２７におけるこの可能な部位は、ＢＲＳウィルス及びＨＲＳウィルスのＦタンパク質類中で保存されていた（図１１）。しかしながら、ＨＲＳウィルスのＦ２ポリペプチド類は、総計で４つか５つの可能な部位を含むが、その数はその単離物に依存しており、更に、ＢＲＳウィルスのＦ２ポリペプチド中におけるＮ−結合グリコシル化についての残存する可能な部位の位置は、全てのＨＲＳウィルスのＦ２ポリペプチド類において保存されていなかった（図１１）。ＢＲＳウィルスのＦ２ポリペプチド上の、唯２つの可能なＮ−結合グリコシル化部位の存在は、ＢＲＳウィルス及びＨＲＳウィルスのＦ２ポリペプチド類の電気泳動上での移動度における違いが存在したという初期の観察事項に矛盾しないものであった（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）。

様々なウィルス類のＦタンパク質類間のアミノ酸同一性を、Ｆタンパク質の様々な領域について示した（表２）。

ＨＲＳウィルス類である、Ａ２、Ｌｏｎｇ、及び、Ｒ３５−２はサブグループＡのウィルス類であり、更に、１８５３７はサブグループＢのウィルスである（Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、Ｊ、１ｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ、　１５１：６２６−６３３）　；　Ｍｕｆｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｒｒａｌ、　６６：２１１１−２１２４）。変異が生じている最も大きい領域が提案されたシグナルペプチド領域（残基１−２６）内に存在するものの、この領域の総体的な疎水性特性はＢＲＳウィルスのＦタンパク雪中においては保存されていた（図１０）。ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の提案されたＦ２ポリペプチドは、ＨＲＳウィルスＡとＢとのサブグループのＦ２ポリペプチド類の間に存在する相同性と比較して、Ｆ２ポリペプチド類に対してより低いレベルの相同性を示した（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃａ１１ｉｎｓ、１９８８、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　２６２３−２６２８）。それとは対照的に、様々なＦ１ポリペプチド類の間の相同性のレベルは、ＢＲＳウィルスをＨＲＳウィルスに比較しても、２つのＨＲＳウィルスサブグループ同志を比較してみても、いずれの場合にも類似していた。

７．２．３．　ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の電気泳動上の移動度についてのツニカマイシンの効果以前に観察されたＢＲＳウィルスのＦタンパク質（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔａｔ、、　１９８９．　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）のグリコジル化が果たしてＮ−結合グリコシル化のためであるか否かを決定するために、Ｎ−結合グリコジル化の阻害物であるツニカマイシンの存在下及び非存在下において放射活性でラベル化したＢＲＳウィルスＦタンパク質の電気泳動上の移動度を調査した。ＢＲＳウィルス、ＨＲＳウィルス、及び、ｍｏｃｋ感染させた細胞類中のタンパク質を、ツニカマイシンの存在及び非存在下において、［”Ｓ］メチオニンに対して露出させることにより放射活性ラベル化し、免疫沈降化させ、更に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ツニカマイシンの存在下においてラベル化したＢＲＳウィルスのＦタンパク質は、ツニカマイシンの非存在下においてラベル化したＢＲＳウィルスのＦタンパク質と比較した電気泳動上の移動度の変化を証明するものであった（図１２、レーンＢア及びＢ）。更に、ツニカマイシンの存在下において合成したＢＲＳウィルスのＦｏ、Ｆｌ、及び、Ｆ２ポリペプチドは、ツニカマイシンの存在下において合成したＨＲＳウィルスのＦｏ、Ｆｌ、及ヒ、Ｆ２ポリペプチド類の各々に類似する電気泳動上の移動度を有していた（図１２、レーンＨ工及びＢ、）。これらの結果は、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質はＮ−結合した炭化水素添加を介してグリコジル化され、かつ、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスとのＦ２ポリペプチドの電気泳動上の移動度において観察された違いは、波峰されたアミノ酸配列により予想されたように、グリコジル化の程度の違いによるものであることを示すものであった（図宿主における防御免疫反応の誘導化におけるＢＲＳウィルスの特有なタンパク質の役割の研究を促進させるために、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質を、ワクシニアウィルスの発現ベクター内に配置させた。ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの完全な主要読み取り枠を含むｃＤＮＡ（Ｆ２０）を、ワクシニアウィルスの組換え体類の作製のために設計されたプラスミドであるＩ）ＩＢｉ７６ −１９２の中へ挿入した。このプラスミドｐＩＢＩ７６−１９２は、Ｂａ１ｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８３：２４６−２５０）により記載されている組換えプラスミドに類似しており、これは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子内に挿入された７、５にのプロモーターを有するワクシニアウィルスのＨｉｎｄＩＩＩＪ断片の一部分を含む。しかしながら、ｐＩＢＩ７６−１９２の場合においては、この７．５にのプロモーターは、ｔｋｋ伝子の転写の反対方向における転写を指示する。ＢＲＳウィルスのＦｍＲＮＡのｃＤＮＡを、この７．５にのプロモーターの主要転写開始部位の下流に挿入した。挿入したＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ　Ｊ断片を、相同的組換え（Ｓｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ。

、１９８６、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０：６０７−６１３）により、ツクシアウィルス（コペンハーゲン株）のゲノム内に挿入した。チミジンキナーゼ陰性の組換えワクシニアウィルス（ｒＶＶ）を、組換えウィルスのハイブリッド形成により、ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子に特異的でありかつ３回のプラーク精製により選択されたプローブを使用して同定した。組換えワクシニアウィルスＦ４６４及びＦ１５９７は、それぞれ、７．５にのプロモーターに関して正方向及び逆方向におけるＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を含んでいた。組換えワクシニアウィルスのゲノム構造は、ワクシニアウィルスのコアＤＮＡの制限酵素消化物のサザンプロット分析により調へた。これらの実験は、ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子が組換えウィルス類のｔｋ遺遺伝円内挿入されたことを立証するものであった。

７．２．５．　ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞類からのタンパク質の分析ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルスがＢＲＳウィルスのＦタンパク質を発現する能力を組織培養細胞類中で調べた。ＢＲＳウィルス、野生型のワクシニアウィルス、あるいは、プロモーターに関して正方向もしくは負の方向でＢＲＳウィルスのＦ遺伝子を含む組換えワクシニアウィルス類のいずれかで、ＢＴ細胞を感染させた。細胞中のタンパク質を［”Ｓ］メチオニンの取り込みによりラベル化し、収集し、その後、ウェルカム社の抗−Ｒ８血清で免疫沈降化させ、更に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドケル電気泳動により分離した。組換えワクシニアウィルスＦ４６４（正方向）は感染させた細胞中において少なくとも２つのタンパク質を産生じ、これらのタンパク質を、ウェルカム社の抗−Ｒ８血清により沈降化させたところ（図Ｉ３、レーンＦ４６４＋）、これらのタンパク質は、野生型のワクシニアウィルスで感染させた細胞（図１３、レーンＶＶ）、もしくは、ｒＶＶ　Ｆ１５９７　（逆方向）で感染させた細胞（図１３、レーンＦ１５９７−）内には存在していなかった。ｒＶＶＦ４６４で感染させた細胞類に特異的な２つのタンパク質は、ＢＲＳウィルスのＦｏ及びＦ１ポリペプチドに相同な電気泳動上の移動度を有していた。血清により沈降化された細胞質タンパク質（図１２、レーンＭ）は、ＢＲＳウィルスのＦ２ポリペプチドに類似する電気泳動上の移動度を有しており、かつ、ｒＶＶ　Ｆ４６４て感染させた細胞内におけるＦ２ポリペプチドの検出を阻害した。Ｆ、タンパク質が産生され、切断されてＦ１ポリペプチドを作製する場合には、可視化できないにしても、Ｆ２ポリペプチドもやはり存在していることが推定された。

ＢＲＳウィルスで感染させた細胞内に以前は観察され（Ｌｅｒｃｈｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）　、かっ、ＢＲＳウイルスノ２２にタンパク質よりもやや大きい、付加的なタンパク質が、ｒＶＶ　Ｆ２Ｏ３て感染させた細胞中において観察された（図１３、レーンＦ４６４＋）。この付加的なタンパク質はＢＲＳウィルスで感染させた細胞類もしくはｒＶＶ　Ｆ２Ｏ３て感染させた細胞中にのみ産生され、かつ、ウェルカム社の抗血清により免疫沈降化された。この結果は、この付加的タンパク質が、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の特異的開裂断片であるか、あるいは、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質との相互作用のいずれかであることができることを示すものであった。

組換えウィルスで感染させた細胞類中において合成されるＦポリペプチド類が、本当のＢＲＳウィルスのＦポリペプチドに類似した様式にグリコジル化されているか否かを決定する目的て、ｒＶＶ　Ｆ２Ｏ３で感染させたＢＴ細胞内のタンパク質を、ツニカマイシンの存在下及び非存在下において［”Ｓ］メチオニンでラベル化した。これらのタンパク質を、ＢＲＳウィルスで感染させたＢＴ細胞からの同様にラベル化したタンパク質類と、免疫沈降化及び５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により比較した（図１４）。ツニカマイシンの存在下においては、ｒＶＶ　Ｆ４６４ウィルスで感染させた細胞中に産生されるＦｏ及びＦ、ポリペプチドは、ツニカマイシンの非存在下において合成されたそれらの対照物と比較して、より速い電気泳動上の移動度を有しており（図１４、レーンＦＴをレーンＦと比較せよ）、かつ、ＢＲＳウィルスで感染させた細胞類からの、グリコジル化されていないＦ。及びＦ、ポリペプチドに相同な電気泳動上の移動度を有していた（図１３、レーンＢＴと比較したレーンＦ□）。ツニカマイシンの存在下においては、組換えウィルスで感染させた細胞類からのタンパク質のバンドは、消失した細胞質タンパク質の他に恐らくＢＲＳウィルスのＦ２ポリペプチドを含み、かつ、グリコジル化されていないＢＲＳウィルスのＦ２が泳動するゲルの底（図１４、レーンＦ工）ではバンドの強度が増大していた（図１２を参照せよ）。

ＨＲＳウィルスのＦ糖タンパク質は感染させた細胞の表面上に発現され、かつ、ピリオン類の膜内に取り込まれる（Ｈｕａｎｇ、１９８３、Ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ　ｖｉｒｕｓ″Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ　ａｔ　Ｃｈａｐｅｌ　Ｈｉｌｌ；Ｈｕａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５．２：１５７−１７３）　、組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞中において発現されるＢＲＳウィルスのＦタンパク質が、感染させた細胞の表面上に輸送されかつそこで発現されているかどうかを決定する目的で、組換えワクシニアウィルスで感染させた細胞類を、間接的な免疫蛍光染色により調べた。ＢＴ細胞はワクシニアウィルス感染に対して極めて高い感受性を示し、かつ、高いバックグラウンドの蛍光光度を除去した状態では免疫蛍光測定に使用することができなかった。この理由のため、免疫蛍光法は、組換えウィルスで感染させたＨＥｐ−２細胞について行った。

この免疫蛍光法において使用した抗血清はＢＲＳウイスル３９１−２特異的抗血清であり、これは、ＢＲＳウィルスで感染させた細胞からのタンパク質のウェスタンブロンド分析において、ＢＲＳウィルスのＦタンパク質を認識することが以前に示されているものである（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）　。この抗血清はＢＲＳウィルスで感染させた細胞についての免疫蛍光アンセイに特異的であるが、未感染の細胞類に対しては特異性を示さない。組換えＦ−４６４で感染させたＨＥｐ−２細胞（図１５、ｒＶＶＦ欄）は特異的表面蛍光を示したが、これは、未感染の細胞（図１５、Ｍ欄）もしくは野生型のワクシニアウィルスで感染させた細胞（図１５、Ｖｖ欄）のいずれにおいても存在しな我々は、ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。ヌクレオチド配列及び波峰されたアミノ酸配列を、相関するＨＲＳウィルス配列のものと比較した。Ｆ　ｍＲＮＡは、１８９９ヌクレオチドの長さにおいては、ＨＲＳウィルスのＡ２、Ｌｏｎｇ、及び、Ｒ３５−２のＦｍＲＮＡと相同であった（Ｃｏｌｌｉｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、８１ニア６８３−７６８７；Ｂａｙｂｕｔｔ　ａｎｄ　Ｐｒｉｎｇｌｅ、１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：２７８９−２７９６；Ｌｏｐｅｚ　ｅｔ　ａｌ、１９８８、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ。

］］０：２４９−２６２　。ＨＲＳウィルス１８５３７のＦ　ｒｒ＋／ＲＮＡは、３°非コーデイング領域において３ヌクレオチド分短い（Ｊｏｈｎｓ。

ｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ、１９８８、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６９：２６２３−２６２８）　、Ｂ　ＲＳウィルスとＨＲＳウィルスとのＦ　ｍＲＮＡの間の核酸相同性のレベルは、ＨＲＳウィルスのサブグループＡのウィルスとサブグループＢのウィルスとのＦ　ｍＲＮＡ間のレベルに等しかった（Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ、１９８８、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９：２６２３−２６２８）。

ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡの主要読み取り枠は予想されたタンパク質である５７４アミノ酸のタンパク質をコードしており、これはＨＲＳウィルスのＦタンパク質類のサイズに相同であった（Ｃｏｌｌｔｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　８１ニア６８３−７６８７；Ｂａｙｂｕｔｔ　ａｎｄ　Ｐｒｉｎｇｌｅ、１９８７ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：２７８９−２７９６；Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎｓ、１９８８、Ｊ、　Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、６９：２６２３−２６２８；Ｌｏｐｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、］９８８、Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓ、　ＩＯ：２４９−２６２）　ｏ　Ｂ　ＲＳウィルスのＦタンパク質の予想される主要構造の特徴は、Ｎ−末端シグナル、Ｃ−末端のアンカー配列、及び、Ｆ、及びＦ２ポリペプチド類を産生ずるための開裂配列のようなものであるが、これらは、ＨＲＳウィルスのＦタンパク雪中におけるこれらの特徴とともに保存されていた。ＢＲＳウィルスのＦタンパク質の波峰されたアミノ酸配列は、ＨＲＳウィルスのＦタンパク質に対して８０％の総体的アミノ酸相同性を有していた。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＦ１ポリペプチドは、６８％のアミノ酸相同性を有するＦ２ポリペプチドよりもより多く保存されており、８８％のアミノ酸相同性を有していた。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスとが単一の共通な祖先から分岐してきたとすると、Ｆ、と比較してＦ２のアミノ酸相同性の低いレベルは、特異的なアミノ酸配列を維持するために、Ｆ、ペプチド上の束縛とは異なるか、もしくはより少ない束縛がＦ２ポリペプチド上に存在しているかも知れないことを示唆している。又、Ｆ１ポリペプチドと比較した時の、ヒトとウシとのＦ２ポリペプチドの間の相同性のレベルにおける違いは、Ｆ２ポリペプチドの正確なアミノ酸配列の保存機構は、Ｆタンパク質の構造及び機能を保持するという点においてはＦ１ポリペプチドのアミノ酸配列の保存機構はどは重要でないことを示唆している。提案されたアンカー領域及びＢＲＳウィルスのＦ１ポリペプチドのアミン末端のアミノ酸配列は、ＨＲＳウィルスのＦタンパク胃中のこれらの配列と比較した場合に、かなり保存されていた。ＢＲＳウィルスと）（ＲＳウィルスとのＦタンパク質の、提案されたアミノ末端のシグナルペプチドはアミノ酸配列においては保存されていないが、予想される疎水性特性については保存されていた。

Ｎ−結合性グリコシル化の阻害剤であるツイ力マイシンの存在下におけるＢＲＳウィルスのＦポリペプチドの合成により、ＢＲＳウィルスのＦポリペプチドはＮ −結合性炭水化物部分の添加によりグリコジル化されることが証明された。叉、ツイ力マイシンの存在下において合成されるＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＦ２ポリペプチドは５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で同じ電気泳動上の移動度を有した。このことは、ＢＲＳウィルス及びＨＲＳウィルスのＦ２ポリペプチドはグリコジル化の程度が異なることを示していた。ＢＲＳウィルスのＦ　ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分析により、可能なグリコジル化部位の数の違いが立証された。波峰されたＢＲＳウィルスのＦ２アミノ酸配列は可能なＮ−結合性オリゴ糖添加のための２つのの部位のみを含んでいる一方、ＨＲＳウィルスＡ２のＦ２ポリペプチド中には４つの可能な部位が存在する。

Ｎ−結合性グリコシル化を阻害するためのツニカマイシンの利用により、ＨＲＳウィルス及びＢＲＳウィルスのＦ１ポリペプチドの電気泳動上の移動度の違いはグリコジル化の違いによるものではないということが示されたが、それは、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのグリコジル化されていないＦ１ポリペプチドの電気泳動上の移動度はほんの僅かしか違わないためである。ヌクレオチド配列分析で、予想されるＢＲＳウィルスのＦ１アミノ酸配列とＨＲＳウィルスのＦ１ポリペプチドとはサイズが同じであり、かつ、両者ともＮ−結合性のオリゴ糖添加についての一つの可能な部位を含んでいることが明らかにされた。目下、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＦ、ポリペプチドのアミノ酸組成内に存在する僅かな違いが電気泳動上の移動度の違いの原因となっていると結論付けている。タンパク質のグリコジル化を変化させずに小水泡性口内炎ウィルスのＧタンパク質内の単一のアミノ酸を変化させると、電気泳動上の移動度が変化するということを証明する最近の研究がこの結論を裏付けている（Ｐｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３二３８０１　−　３８０９）　。

ＢＲＳウィルスのＦタンパク質及びＨＲＳウィルスのＦタンパク質は保存されたエピトープを有する。回復期のウシ血清及びモノクローナル抗体の両方ともは、いずれのウィルスのＦタンパク質をも認識するものと思われる（Ｏｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５；５ｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８４、Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、　５ｔａｎｄ。

５７：２３７−２４４：Ｋｅｎｎｅｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９：３０２３−３０３２；Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、６３：８３３−８４０）　。０ｒｖｅｌｌ　ｅｔａｌ、　（１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）は、ＨＲＳウィルスのＦタンパク質に対して作製された３５のモノクローナル抗体のうち僅か３つのみが、３つのＢＲＳウィルス株のＦタンパク質を認識しなかったことを発見した。更に、Ｆタンパク質に対する１１のモノクローナル抗体の全てはＨＲＳウィルスについて中和効果を有するが、これらは叉、ＢＲＳウィルス株の感染性をも中和した（Ｏｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）。

合成ペプチド類及びモノクローナル抗体類を使用する研究では、ＨＲＳウィルスのＦタンパク賃上の少なくとも２つのエピトープかウィルスの中和化に関係していることが示唆された。このエピトープはアミノ酸２１２から２３２　（Ｔｒｕｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７ａ、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８＋２２７３−２２８０；Ｔｒｕｄｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７ｂＳＣａｎａｄ、　Ｊ、　Ｍｉｒｏｂｉｏｌ、　３３：９３３−９３８）　、及び、アミノ酸２８３から２９９に位置している。これらのエピトープの最初のものは、ＢＲＳウィルスのＦタンパク胃中に厳密に保存されている。第２エピトープにおいては、ＢＲＳウィルスのＦタンパク胃中に３つの変化が存在するが、これらの変化の全てのものは保存的変化である。これらのエピトープの両方ともかＦ、ポリペプチド上に存在するものの、中和化に影響を与えるアミノ酸は、ニューキャッスル病ウィルスの融合タンパク賃上のＦ２ポリペプチドに集中して存在していた（Ｔｏｔｏｄａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６２：４４２７−４４３０；Ｎｅｙｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：９５２− ９５４）。

ＨＲＳウィルスとＢＲＳウィルスのＦタンパク質の類似性とは対照的に、これらのウィルスのＧタンパク質は抗原的には性質が異なっている。いずれのＨＲＳウィルスのサブグループのＧタンパク質に対して作製した全てのモノクローナル抗体は、ＢＲＳウィルスのＧタンパク質を認識しなかった（Ｏｒｖｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８７、Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６８：３１２５−３１３５）　。ＢＲＳウィルスで感染したウシからのポリクローナルな回復期血清はＢＲＳウィルスのＧタンパク質を認識するものの、ＨＲＳウィルスのＧタンパク質は認識しなかったことが示されいる（Ｌｅｒｃｈ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：８３３−８４０）。ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスとのＦタンパク質の間の抗原類似性、及び、ＢＲＳウィルスとＨＲＳウィルスのＧタンパク質の間の抗原交差反応性における違いも叉、ＨＲＳウィルスとＢＲＳウィルスとの相同タンパク質の間のアミノ酸相同性のレベルに反映されていた。ＨＲＳウィルスとＢＲＳウィルスとのＧタンパク質は僅か３０％のアミノ酸相同性を共有しているものの、この２つのウィルスのＦタンパク質は８０％のアミノ酸相同性を共有している。Ｆ及びＧ糖タンパク質における違いは又、それらのエピトープ提示においても顕著である。Ｇａｒｃｉａ　−Ｂａｒｒｅｎｏ　ｅｔ　ａｌ、（１９８９、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６３：９２５−９３２）は、一連のモノクローナル抗体を使用してこのＦタンパク質のエピトープを５つの非重複群に分割できるが、Ｇタンパク質上のエピトープの多くの競合反応曲線はかなり重複したものであることを発見した。

ＢＲＳウィルスのＦ遺伝子へのｃＤＮＡ挿入断片を含む組換えワクシニアウィルスはＢＲＳウィルスのＦタンパク質を発現した。

このＢＲＳウィルスのＦタンパク質をＦｌ及びＦ２ポリペプチドへと開始裂したところ、これらは、ＢＲＳウィルスで感染させた細胞からのＦタンパク質に類似した５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動上の移動度を有していた。Ｎ−結合グリコシル化の阻害物であるツニカマイシンでの実験では、組換え体で感染させた細胞から発現されるＢＲＳウィルスのＦタンパク質は、ＢＲＳウィルスで感染させた細胞からのＦタンパク質に類似するレベルにまでグリコジル化されていた。組換えワクシニアウィルスから発現されるＢＲＳウィルスのＦタンパク質は、表面免疫蛍光法により示されるように、感染させた細胞類の表面に輸送されかつそこで発現される。

８、　実施例：　ＢＲＳウィルスのＧタンパク質に対する非特異的なポリクローナル抗体の産生及び抗原特異性の証明組換えＶＶベクターから発現されるウシＲＳウィルスの付着タンパク質の生物学的活性をテストし、かつ、ポリクローナル抗血清を使用してＢＨ３及びＨＲＳウィルスのＧタンパク質の間の抗原交差反応性を評定するために、ＢＲＳウィルスもしくはＨＲＳウィルスのいずれかのＧタンパク質を発現する組換えＶＶを使用して、５ｔｏｔｔ　ｅｔ　ａｔ、、　１９８６、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　６０：６０７−６１３において記載されているように動物を免疫した。ＢＲＳウィルスのＧタンパク質で免疫した動物からの血清は、ＢＲＳウィルスの付着タンパク質を特異的に免疫沈降化させたが、ヒトのＲ５Ｇタンパク質は認識しなかった（図１６）。同様に、ＨＲＳウィルスのＧタンパク質に対して生した抗血清はＨＲＳウィルスのＧタンパク質に特異的であり、かつ、ウシのＲＳＳライスルＧタンパク質の認識は示さず、これらのことは、２つの付着タンパク質が抗原的に異なっていることを立証している。

ＦＩＧ、　５Ａ３Ｉ　＋ｔ（、ＦＩＧ、５Ｂアミノ酸位置ＦＩＧ、５Ｃ２９−−−Ｍ・−― １４ＣＭ　ＭＴＢ　８７　Ｆ　ＦＴＶ　Ｖ７ＶＶＦＡ　Ｂ　Ｃｔ　′ 要約本発明は、Ｂ　ＲＳ　（ｂｏｖｉｎｅ　ｒｅｓｐｊｒａｔｏｒｙ　５ｙｎｃｙｔｉａｌ）ウィルスのタンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子、ＢＲＳウィルスのタンパク質およびペプチド、並びにそれらから製造された組換えＢＲＳウィルスワクチンに関する。それは、部分的に、ＢＲＳウィルスの完全なＧ、ＦおよびＮタンパク質をコードする実質的に全長のｃＤＮＡのクローニングに基づいている。本発明の特定の態様によれば、ＢＲＳウィルスのタンパク質またはペプチドをコードするＤＮＡはＢＲＳウィルス感染の診断に使用され、また、ワクシニアウィルスや、細菌、酵母、昆虫または他のを推動物のベクターのような発現ベクターに挿入される。これらの発現ベクターはＢＲＳウィルスのタンパク質またはペプチドの大量生産に利用され、得られた実質的に純粋なウィルスペプチドまたはタンパク質はサブユニットワクチン処方物に配合されるか、あるいはＢＲＳウィルス感染の診断または受動免疫感作に利用し得るモノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造に使用される。別の態様では、本発明により得られたＢＲＳウィルスタンパク質の配列が、サブユニットワクチンやポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に利用し得る合成ペプチドまたはタンパク質を製造する際に使用される。また、遺伝子、遺伝子の一部、遺伝子の任意の組み合わせ、またはそれらの一部を含む非病原性の発現ベクターもそれ自体を組換えウィルスワクチンとして利用することができる。

国際調査報告１°１′”°１６″″ａ−＝１−＝”　”　ＰＣＴ／じ５９１／ｎ５１Ｑ４；二 τυＳＱ１／１）５１９４賢ｆ）　？”、、’ｊ　：’ＪｂＣ１ａＳ’３２７”ｙｒｏＩ３ｐ　＋’／、　ＣｌａｌｍＳ　２７−３２．３５．３６．６３−６δ、７１，７２，７５，７６、１２１．ａｎｄ　＋２３．ｄ窒≠翌獅狽■ ＝＊ｃ＜Ｉｎ＝　ｃｌａｓｓ＋ｆｌｅｄ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４２４　ａｎｄ　５ｕｔｘｌａｓｓδ８゛、：ｒへｌｊｐ　’Ｉ、　４！ａ１ｍｓ　３３．３４．６９．７０．　ａｎｄ　＋２０．　ｄｒａ’Ａｍ　ｕ　Ｖｉｒｕｓ、　ｃｌａｓｓ{ｆｌｅｄ　Ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ −１３５ａｎｄ　加ｂｃｌａｓｉ　２３５．１すｒｏｔ−１ｐ　’−’１．　Ｃ！ａ１ｍｓ　’ｉ・１−４６．４７．　＋　１６　ａｎｄ　！＋７．ｄｒａ細し＞　ｒｅｃｏｍｂｌｎａｎ煤@ｂａｃｔａｒｉｕｍ：１ａｓｓ出ｅ＋ｊ　ｉｎ　Ｃ１ａｓｓ　４３５　ａｎｄ　５ｕｌｘｌａ錦２→ ３Ｔｈ豐＋ｎｙ１１ｒ＋ｔ＋ｏｎｓ　ｏ（Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ　ａｒｅ　ｄｌｓｕｎｃｔ　ｆｒｏｍ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ　ａ刀@ｔＪｘｅｕ＞ｖｏｎｔｌＣｎ　ｏｆ　Ｇｒｏｕｐ　ｌ　ｍａｙｂｅ　ｕｃｄ　ｓｓ　ａ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄ　ａ刀@ｕｓｄ　ｉｎ二二、ｉｕＴ、ｅｆｆ＋ｊ！・・’ｕ’＋−”ｈ、ｌＩシー７ｈそｌｎｖ＋ｎｒＫ・ｎ＋：ＩＣ；ｒ＾ｕ７．１ｉｉｓｄｌｒ６’：に：！ＷH、！二１蟲？Ｌｒｍ？Ｉ？、Ｖｉｎｑ　’ｊ、’ｕｉｌＪ”　？、’５３１７＞５Ｓｆｆ、ｌ’？　４’＞ｕｒｃｅ　ｆ’Ｘ　ａ　ｐｒｏｊ６１ｎτ≧−ｉ　！！ＩＶ：ｎｊＱ：ｎ　’＞１　’フｒぐＺｕｐ　ＩＩＩ　ｉｓ　４１３ｔＪｒ、Ｃｔ　ｆｒｃｍ　ａｌｌ　０ｔｈｅｒ　ＧｒＯ浮垂r　＆５Ｉｔ　ｉＳ　ｄｉｒ、＋、ｔｓｄｔ・： ’　Ｉ　５ｐｋｌｒｉＣ−二ｔｌｅｆｆｌｉ’、ａｌ　（ＯｆｆｉｐＯ５ｌｔｌＯｎ　Ｗｈｌ（ｎ　ｈａｓ　ｕｔｉｌｌｔ’／　ａＳ@ａ　ｍｏｌｅ（ｕｌａｒ　ＷｅｌＱ＋＋しｇｒｏｕｐ　１ｊｒａ′４ｎｗ　ａ　マａｃｃ＋ｎｅ、１．！１ｅｒｅｂｙ　ｈａｖｉｎｇ　ａ　ｕｒｕｑｕｅ　ａｎｄ　ｄｅ（Ｌｎｅ−ｄ@ ｕｔｌ＋ｔｙ　ａｎｄｒｙｕｉｒ＋ｒｕｚ　ａ　Ｌ１１Ｈ＊ｒ今ｎｔ、５ｅａｒｃｈＴｈｅ！　ＩｎＶｉ？ｎｊｊＯｎ　Ｏ（Ｇｒｏｕｐｓ　Ｉ　Ｉ、　Ｖ、　’Ｔ’ｌ、　ａｎｄ　Ｘ　Ｍｅ　ｄｌｓｍ（ｔ　ｆｒｏｍ　ｅａｃ■@ｏｔｊｚｅｒ　ａｓ　ｗｅｌｌＩｓ　ｆｒｏｍ　ａｉｉ　０ｔｈｅｒ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｓ　ｓａｉｄｇｒｏｕｐｓ　ａｒｅ　ａｌｌ　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅ獅煤@１ｉｆｅ　ｆｏｒｍｓ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ウシＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルスのＧタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子。
２．ウシＲＳウイルスのＧタンパク質をコードする核酸配列または部分配列が実質的に図２に示したとおりであり、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
３．ウシＲＳウイルスのＧタンパク質をコードする核酸配列または部分配列が実質的に図２に示したとおりの約ヌクレオチド１６から約ヌクレオチド９１２までであり、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む、請求項１記載の組換えＤＮＡ分子。
４．ＡＴＣＣに受託番号４０８４１として寄託されたプラスミドｐＲＬＧ４１４ −７６−１９１中に含まれる、請求項２記載の組換えＤＮＡ分子。
５．図３に示したアミノ酸配列に実質的に相同なタンパク質をコードする配列、または少なくとも約１０のヌクレオチドを含むその一部を含む組換えＤＮＡ分子。
６．ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現が第二の核酸配列により調節され、その結果として組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主においてウシＲＳウイルスのＧタンパク質が発現される、請求項１、２または５記載の組換えＤＮＡ分子。
７．　ＡＴＣＣに受託番号ＶＲ２２７６として寄託されたｒＶＧ６４２中に含まれる、請求項６記載の組換えＤＮＡ分子。
８．請求項１、２または５記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物。
９．細菌である、請求項８記載の組換え微生物。
１０．酵母である、請求項８記載の組換え微生物。
１１．請求項６記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物。
１２．請求項１、２または５記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
１３．請求項６記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
１４．請求項７記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
１５．請求項１、３または５記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が該微生物により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
１６．請求項６記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が該微生物により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
１７．請求項１、３または５記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
１８．請求項６記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
１９．請求項７記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＧタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
２０．微生物が細菌である、請求項１５記載の方法。
２１．微生物が細菌である、請求項１６記載の方法。
２２．請求項１５記載の生産物。
２３．請求項１６記載の生産物。
２４．請求項１７記載の生産物。
２５．請求項１８記載の生産物。
２６．請求項１９記載の生産物。
２７．請求項１５記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
２８．請求項１６記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
２９．請求項１７記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
３０．請求項１８記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
３１．請求項１９記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
３２．請求項２０記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
３３．感染するが非病原性であり、請求項１、２または５記載のＤＮＡ分子を含む組換えウイルス。
３４．感染するが非病原性であり、請求項６記載のＤＮＡ分子を含む組換えウイルス。
３５．請求項３３記載の組換えウイルスを含むワクチン。
３６．請求項３４記載の組換えウイルスを含むワクチン。
３７．ウシＲＳウイルスのＦタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子。
３８．ウシＲＳウイルスのＦタンパク質をコードする核酸配列または部分配列が実質的に図９に示したとおりであり、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む、請求項３７記載の組換えＤＮＡ分子。
３９．ウシＲＳウイルスのＦタンパク質をコードする核酸配列または部分配列が実質的に図９に示したとおりの約ヌクレオチド１４から約ヌクレオチド１７３５までであり、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む、請求項３７記載の組換えＤＮＡ分子。
４０．ＡＴＣＣに受託番号４０８４２として寄託されたプラスミドｐＲＬＦ２０１２−７６−１９０２中に含まれる、請求項３８記載の組換えＤＮＡ分子。
４１．図１１に示したアミノ酸配列に実質的に相同なタンパク質をコードする配列、または少なくとも約１０のヌクレオチドを含むその一部を含む組換えＤＮＡ分子。
４２．ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現が第二の核酸配列により調節され、その結果として組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主においてウシＲＳウイルスのＦタンパク質が発現される、請求項３７、３８または４１記載の組換えＤＮＡ分子。
４３．ＡＴＣＣに受託番号ＶＲ２２７７として寄託されたｒＶＦ−４６４中に含まれる、請求項４２記載の組換えＤＮＡ分子。
４４．請求項３７、３８または４１記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物。
４５．細菌である、請求項４４記載の組換え微生物。
４６．酵母である、請求項４４記載の組換え微生物。
４７．請求項４２記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物。
４８．請求項３７、３８または４１記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
４９．請求項４２記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
５０．請求項４３記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
５１．請求項３７、３８または４１記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が該微生物により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
５２．請求項４２記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が該微生物により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
５３．請求項３７、３８または４１記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
５４．請求項４２記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
５５．請求項４３記載のＤＮＡ分子を含む組換え微生物を、該ＤＮＡ分子が真核細胞により発現されるように生育させ、発現されたウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはフラグメントを単離することから成る、ウシＲＳウイルスのＦタンパク質またはそのフラグメントの生産方法。
５６．微生物が細菌である、請求項５１記載の方法。
５７．微生物が細菌である、請求項５２記載の方法。
５８．請求項５１記載の生産物。
５９．請求項５２記載の生産物。
６０．請求項５３記載の生産物。
６１．請求項５４記載の生産物。
６２．請求項５５記載の生産物。
６３．請求項５１記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６４．請求項５２記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６５．請求項５３記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６６．請求項５４記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６７．請求項５５記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６８．請求項５６記載の生産物を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
６９．感染するが非病原性であり、請求項３７、３８または４１記載のＤＮＡ分子を含む組換えウイルス。
７０．感染するが非病原性であり、請求項４２記載のＤＮＡ分子を含む組換えウイルス。
７１．請求項６９記載の組換えウイルスを含むワクチン。
７２．請求項７０記載の組換えウイルスを含むワクチン。
７３．実質的に図３に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質。
７４．実質的に図１１に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質。
７５．請求項７３記載の組換えまたは合成タンパク質を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
７６．請求項７４記載の組換えまたは合成タンパク質を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
７７．請求項７３記載の組換えまたは合成タンパク質を動物に接種することから成る方法により製造された抗体。
７８．モノクローナル抗体である、請求項７７記載の抗体。
７９．請求項７７記載の抗体から製造された抗体フラグメントまたは抗体誘導体。
８０．請求項７８記載の抗体から製造された抗体フラグメントまたは抗体誘導体。
８１．請求項７４記載の組換えまたは合成タンパク質を動物に接種することから成る方法により製造された抗体。
８２．モノクローナル抗体である、請求項８１記載の抗体。
８３．請求項８１記載の抗体から製造された抗体フラグメントまたは抗体誘導体。
８４．請求項８２記載の抗体から製造された抗体フラグメントまたは抗体誘導体。
８５．ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた試料中のウシＲＳウイルス核酸の存在を検出することから成る、ウシＲＳウイルス感染の診断方法。
８６．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた試料より調製した核酸を、実質的に図２に示したとおりの配列または部分配列を有しかつ少なくとも約１０のヌクレオチドを含む核酸分子に、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが起こったかどうか検出する；ことから成り、その際ハイブリダイゼーションの検出がウシＲＳウイルス感染の指標となる、請求項８５記載の方法。
８７．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた試料より調製した核酸を、実質的に図９に示したとおりの配列または部分配列を有しかつ少なくとも約１０のヌクレオチドを含む核酸分子に、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが起こったかどうか検出する；ことから成り、その際ハイブリダイゼーションの検出がウシＲＳウイルス感染の指標となる、請求項８５記載の方法。
８８．ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物からＲＮＡを調製し、工程（ｉ）でノーザンブロット分析にかける、請求項８６記載の方法。
８９．ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物からＲＮＡを調製し、工程（ｉ）でノーザンブロット分析にかける、請求項８７記載の方法。
９０．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた血清試料を、実質的に図３に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質に、抗体のタンパク質への結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）抗体の該タンパク質への結合が起こったかどうか検出する；ことから成り、その際抗体のタンパク質への結合がウシＲＳウイルスにさらされたことまたは感染したことの指標となる、ウシＲＳウイルス感染の診断方法。
９１．酵素結合免疫吸着検定である、請求項９０記載の方法。
９２．抗体の存在をウェスタンブロット法により検出することを含む、請求項９０記載の方法。
９３．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた血清試料を、実質的に図１１に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質に、抗体のタンパク質への結合を可能にする条件下で接触させ：そして（ｉｉ）抗体の該タンパク質への結合が起こったかどうか検出する；ことから成り、その際抗体のタンパク質への結合がウシＲＳウイルスにさらされたことまたは感染したことの指標となる、ウシＲＳウイルス感染の診断方法。
９４．酵素結合免疫吸着検定である、請求項９３記載の方法。
９５．抗体の存在をウェスタンブロット法により検出することを含む、請求項９３記載の方法。
９６．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項２７記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
９７．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項２８記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
９８．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項２９記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
９９．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項３０記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１００．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項３１記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０１．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項３２記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０２．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項３５記載のワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０３．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項３６記載のワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０４．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６３記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０５．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６４記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０６．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６５記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０７．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６６記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０８．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６７記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１０９．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項６８記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１１０．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項７１記載のワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１１１．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項７２記載のワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。
１１２．ウシＲＳウイルスのＮタンパク質をコードする核酸配列を含む組換えＤＮＡ分子。
１１３．ウシＲＳウイルスのＮタンパク質をコードする核酸配列または部分配列が実質的に図１７に示したとおりであり、少なくとも約１０のヌクレオチドを含む、請求項１１２記載の組換えＤＮＡ分子。
１１４．ＡＴＣＣに受託番号４０８４３として寄託されたプラスミドｐＲＬＮＢ３−７６に含まれる、請求項１１３記載の組換えＤＮＡ分子。
１１５．図１８に示したアミノ酸配列に実質的に相同なタンパク質をコードする配列、または少なくとも約１０のヌクレオチドを含むその一部を含む組換えＤＮＡ分子。
１１６．請求項１１３記載の組換えＤＮＡ分子を含む組換え微生物。
１１７．細菌である、請求項１１６記載の組換え微生物。
１１８．酵母である、請求項１１６記載の組換え微生物。
１１９．請求項１１３記載の組換えＤＮＡ分子を含む真核細胞。
１２０．感染するが非病原性であり、請求項１１３記載のＤＮＡ分子を含む組換えウイルス。
１２１．請求項１２０記載の組換えウイルスを含むワクチン。
１２２．実質的に図１８に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質。
１２３．請求項１２２記載の組換えまたは合成タンパク質を適当な製剤学的担体中に含有してなるサブユニットワクチン。
１２４．請求項１２２記載の組換えまたは合成タンパク質を動物に接種することから成る方法により製造された抗体。
１２５．モノクローナル抗体である、請求項１２４記載の抗体。
１２６．請求項１２５記載の抗体から製造された抗体フラグメントまたは抗体誘導体。
１２７．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた試料より調製した核酸を、実質的に図１７に示したとおりの配列または部分配列を有しかつ少なくとも約１０のヌクレオチドを含む核酸分子に、ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）ハイブリダイゼーションが起こったかどうか検出する；ことから成り、その際ハイブリダイゼーションの検出がウシＲＳウイルス感染の指標となる、請求項８５記載の方法。
１２８．（ｉ）ウシＲＳウイルスに感染したらしい動物から得られた血清試料を、実質的に図１８に示したとおりのアミノ酸配列または抗原決定基を含むその部分配列を有する組換えまたは合成タンパク質に、抗体のタンパク質への結合を可能にする条件下で接触させ；そして（ｉｉ）抗体の該タンパク質への結合が起こったかどうか検出する；ことから成り、その際抗体のタンパク質への結合がウシＲＳウイルスにさらされたことまたは感染したことの指標となる、ウシＲＳウイルス感染の診断方法。
１２９．下記処置を必要とする動物に、有効量の請求項１２３記載のサブユニットワクチンを投与することから成る、ウシＲＳウイルスに対して免疫応答を誘発する方法。