JPH0556779A

JPH0556779A - 遺伝子組換えによる耐熱性β−チロシナーゼの製造方法

Info

Publication number: JPH0556779A
Application number: JP19216791A
Authority: JP
Inventors: Teruhiko Beppu; 輝彦別府; Toshikatsu Hirahara; 利克平原; Kiyobumi Suzuki; 清文鈴木; Makoto Nishiyama; 真西山; Sueji Horinouchi; 末治堀之内
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-07-31
Filing date: 1991-07-31
Publication date: 1993-03-09
Anticipated expiration: 2015-11-20
Also published as: JP3110087B2

Abstract

(57)【要約】【構成】シンビオバクテリウム（Symbiobacterium ）
属に属し耐熱性β−チロシナーゼを生産することができ
る微生物から得た耐熱性Ｌ−チロシナーゼ遺伝子を挿入
した発現ベクターにより形質転換された宿主微生物を培
養し、その培養物から耐熱性β−チロシナーゼを採取す
ることを特徴とする耐熱性β−チロシナーゼの製造方
法、並びにこの方法に用いることができる遺伝子系。【効果】シンビオバクテリウムに属する耐熱性β−チ
ロシナーゼ生産株はバチルス属微生物との共生によって
のみ生産可能であり、しかも酵素生産性も低い（全蛋白
質の１％以下）が、本発明の形質転換宿主は単独で生育
し、しかも全蛋白に対して約30％という多量の酵素を生
産することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は耐熱性β−チロシナーゼ
の遺伝子組換え技術による製造方法、並びに該製造方法
のために有用な遺伝子、発現ベクター及び宿主微生物に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、β−チロシナーゼはビタミンＢ₆
の一種であるピリドキサール−５′−リン酸(PLP) の関
与のもとに、Ｌ−チロシンをピルビン酸、フェノール、
アンモニアに分解するα，β脱離反応を触媒する酵素と
して発見され、その後フェノールまたはピロカテコール
とＬ−セリンからＬ−チロシンまたは L−DOPAを合成す
るβ置換反応、またピルビン酸、アンモニア、フェノー
ルまたはピロカテコールからＬ−チロシンまたはＬ−ド
ーパを合成するα，β脱離反応の逆反応を触媒する酵素
として知られており、たとえばエシェリキア・インター
メディア（Escherichia intermedia）、プロテウス・
レトゲリ（Proteus rettgeri) 、エルビニア・ヘルビ
コーラ（Erwinia herbicola ) などの如き常温菌であ
る腸内細菌群を中心とする微生物から見いだされる。

【０００３】しかし、このような常温菌が生産するβ−
チロシナーゼは、耐熱性が低く、利用に際して反応温
度、熱安定性などの点で著しく制約を受けるという技術
的難点があった。そこで、本発明者らはこのような技術
的難点を克服した耐熱性に優れたβ−チロシナーゼを創
製すべく鋭意研究を行なった結果、天然培地及びＬ−チ
ロシン含有合成培地のいずれにおいても単独では生育し
ないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp stra
in S；微工研条寄第 809号）との共生により生育する従
来完全に未知で且ついかなる公知文献にも未記載の特異
な生育特性を有する耐熱性β−チロシナーゼ生産桿菌シ
ンビオバクテリウム・サーモフィラム（Symbiobacteriu
m thermophilum；微工研条寄第 810号）はバチルス・
エスピー・Ｓ株との混合形態）を土壌試料により分離採
取することに成功し、且つ該新規桿菌が約80℃（pH8.
０）に作用至適温度を有し、且つ約80℃（pH8.０、保持
時間20分) までは殆ど熱失活しない熱安定性を示す点
で、前記常温菌が生産するβ−チロシナーゼとは全く別
異の新規酵素である耐熱性β−チロシナーゼを産生する
ことを見いだした（特開昭62−285785号公報）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】しかし、この耐熱性β
−チロシナーゼ生産菌シンビオバクテリウム・サーモフ
ィラムは単独では生育せず、バチルス・エスピー・Ｓ株
との共生においてしか生育できず、その培養のために
は、バチルス・エスピー・Ｓ株との共生関係を保持しつ
つ混合培養しなければならないために、培養系が複雑で
大量培養も困難である、また菌体蛋白当りの耐熱性β−
チロシナーゼ蛋白量も少ない、更に酵素の精製も困難で
ある等の問題がある。

【０００５】従って本発明は、上記の種々の問題点を遺
伝子工学的手法により解決しようとするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
培養系の単純化、菌体当りの生産性の向上、酵素精製の
簡素化を目的として遺伝子工学の技術を利用し、上記シ
ンビオバクテリウム・サーモフィラムから耐熱性β−チ
ロシナーゼ構造遺伝子を単離し、その構造遺伝子を適当
な発現ベクターに挿入して、それを用いて宿主微生物を
形質転換して、耐熱性β−チロシナーゼを大量に生産す
ることを目的に研究を重ねた結果、今回好熱性共生細菌
シンビオバクテリウム・サーモフィラムの染色体ＤＮＡ
より耐熱性β−チロシナーゼ構造遺伝子を含有するＤＮ
Ａ断片をクローニングすることができ、このＤＮＡ断片
を適当な発現ベクターに組み込み、それを用いて大腸菌
を形質転換することにより、耐熱性β−チロシナーゼを
大量に発現させることに成功し、この耐熱性β−チロシ
ナーゼが、遺伝子入手の出発材料として用いたシンビオ
バクテリウム・サーモフィラムにより生産された酵素と
同様の性質を有することを確認し、本発明を完成するに
至った。

【０００７】従って本発明は、次の性質：（１）作用：ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ
−チロシンからピルビン酸、フェノール及びアンモニア
を生成する；（２）基質特異性：Ｌ−チロシンを分解する；（３）作用至適pH及び安定pHの範囲：反応温度70℃にお
ける至適pHは約７〜7.５であり、25℃にて２日間置いた
場合の安定pHは６〜11である；（４）作用至適温度及び耐熱性：pH8.０での作用至適温
度は約80℃であり、pH8.０にて20分間保持した場合、80
℃までは熱失活しない；及び（５）ＳＤＳゲル電気泳動により測定した分子量は約4
8,000である；また遺伝配列より推定されるアミノ酸配
列から予想される分子量は約52,300である；を有する耐熱性β−チロシナーゼの製造方法であって、
シンビオバクテリウム（Symbiobacterium ）属に属し前
記酵素をコードする遺伝子を有する微生物から得た該酵
素をコードする遺伝子が挿入されている発現ベクターに
より形質転換された宿主を培養し、その培養物から該酵
素を採取することを特徴とする、耐熱性β−チロシナー
ゼの製造方法を提供する。

【０００８】本発明はさらに、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列を有する耐熱性β−チロシナーゼ蛋白質をコー
ドしているＤＮＡを提供する。本発明はさらに、前記Ｄ
ＮＡを含む発現ベクターを提供する。本発明はさらに、
前記発現ベクターにより形質転換された宿主をも提供す
る。

【０００９】

【具体的な説明】本発明の耐熱性β−チロシナーゼ構造
遺伝子を含有するＤＮＡ断片は、前述したシンビオバク
テリウム・サーモフィラムの染色体ＤＮＡから遺伝子ラ
イブラリーを作成し、適当なプローブ、たとえば前記特
開昭62−285785号公報に記載の方法で精製・単離した耐
熱性β−チロシナーゼのアミノ酸一次配列の決定によ
り、アミノ酸レベルで高い相同性が有る事が明らかとな
った本菌の耐熱性トリプトファナーゼの遺伝子をプロー
ブとして用いて、上記染色体ＤＮＡライブラリーをスク
リーニングし、本発明の耐熱性β−チロシナーゼを含有
するＤＮＡ断片をクローニングすることにより得ること
ができる。

【００１０】このようにクローニングしたＤＮＡ断片の
構造遺伝子部分の塩基配列は、それ自体既知の方法、た
とえばＭ13ファージを用いたザンガー法によって決定す
ることができ、その結果、本発明に従う耐熱性β−チロ
シナーゼの構造遺伝子は1377塩基からなり、それによっ
てコードされるアミノ酸残基の解析により、 458個のア
ミノ酸残基よりなる分子量52,269である耐熱性β−チロ
シナーゼ蛋白の一次構造を解明することができた（配列
番号：１）。

【００１１】しかしながら、よく知られているように多
くのアミノ酸についてはそれをコードする遺伝子ＤＮＡ
塩基配列は複数存在する。その塩基配列は一義的には決
まらず多数の可能性が在り得る。本発明者らにより明ら
かにされたシンビオバクテリウム・サーモフィラムの耐
熱性β−チロシナーゼ蛋白のアミノ酸配列をコードする
遺伝子の場合も、そのＤＮＡ塩基配列は、天然の遺伝子
のＤＮＡ塩基配列以外にも多数の可能性があるが、本発
明の遺伝子ＤＮＡは、天然のＤＮＡ塩基配列のみに限定
されるものではなく、本発明により明らかにされた耐熱
性β−チロシナーゼ蛋白のアミノ酸配列をコードする他
のＤＮＡ塩基配列も含むものである。

【００１２】また、遺伝子組換え技術によれば基本とな
るＤＮＡの特定の部位に、該ＤＮＡがコードする耐熱性
β−チロシナーゼの酵素活性の基本的な特性を変化させ
ることなく、あるいはその特性を改善するように、人為
的に変異を起こすことができる。本発明により提供され
る、天然の塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡあるいは天然
のものとは異なる塩基配列を有する遺伝子ＤＮＡに関し
ても、同様に人為的に挿入、欠失、置換を行なうことに
より天然の遺伝子と同等あるいは改善された特性とする
ことが可能であり、本発明はそのような変異遺伝子をも
含むものである。

【００１３】本発明の耐熱性β−チロシナーゼを含有す
るＤＮＡ断片は、該耐熱性β−チロシナーゼを微生物菌
体内で発現させる宿主に応じた適当な発現ベクター、例
えば大腸菌の lacプロモーターを保持する pUC18（宝酒
造）等に接続することにより、宿主微生物菌体内、例え
ば大腸菌に於て耐熱性β−チロシナーゼを生産させる発
現プラスミドを構築することができる。

【００１４】本発明の耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子を
保持する発現プラスミドは、適当な宿主微生物、たとえ
ば、大腸菌等に導入することにより、菌体内で耐熱性β
−チロシナーゼ蛋白を生産する形質転換微生物を創製す
ることができる。このように創製された形質転換微生物
は適当な培地、条件で培養することにより、耐熱性β−
チロシナーゼを大量に生産することが可能である。培養
後の培養物からの耐熱性β−チロシナーゼ蛋白の単離
は、たとえば、菌体を超音波で破砕後、熱処理・遠心分
離を行なうことにより大腸菌由来のタンパク質を熱変性
・除去出来、耐熱性β−チロシナーゼ蛋白を高純度で含
む菌体抽出液を高効率で得ることができる。

【００１５】また、本発明においては、大腸菌の宿主−
ベクター系のみならず、枯草菌、酵母、シュードモナス
菌、放線菌等の宿主−ベクター系も利用可能であり、そ
れぞれの宿主−ベクター系の特徴を生かして耐熱性β−
チロシナーゼの大量生産を行なうことができる。次に、
実施例により本発明をさらに具体的に説明する。実施例１．耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子のクローニン
グ（１）耐熱性β−チロシナーゼ生産菌の染色体ＤＮＡ
の取得該耐熱性β−チロシナーゼ生産菌シンビオバクテリウム
・サーモフィラムは、単独では生育せずバチルス・エス
ピー・Ｓ株（微工研条寄第 809号) との共生においての
み生育可能となるため、特開昭61−282076号公報に記載
する方法で該菌体を単離した。

【００１６】すなわち、 Trp−PEP 液体培地（0.２％Ｌ
−トリプトファン(115℃、15分間)、0.５％ポリペプト
ン、0.１％酵母エキス、0.３％K₂HPO₄、0.１％KH₂PO₄、
0.05％MgSO₄・７H₂O 、0.05％ピリドキサール−５′−
リン酸(121℃、20分間))で、60℃、20時間静置培養した
該生産菌とバチルス・エスピー・Ｓ株の混合培養菌体を
ＣＰＥ液(100mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.０）、３
％クエン酸ナトリウム、0.02％エチレンジアミン４酢酸
２ナトリウム、各々を 121℃、20分間別滅菌)で洗浄、
懸濁し、0.３mg／mlとなるよう卵白リゾチーム（生化学
工業、６回結晶化）を加え、35℃、15分間作用させて、
バチルス・エスピー・Ｓ株を選択的に溶菌させてシンビ
オバクテリウム・サーモフィラムの菌体を取得した。

【００１７】調製した該生産菌菌体からの耐熱性β−チ
ロシナーゼの遺伝子を含む染色体ＤＮＡの単離精製は常
法にしたがい、Biochim.Biophys.Acta, 72. 619-629(19
63)に記載のフェノール法により行った。（２）該耐熱性β−チロシナーゼのアミノ酸一次配列
の決定該耐熱性β−チロシナーゼを、該生産菌シンビオバクテ
リウム・サーモフィラムとバチルス・エスピー・Ｓ株の
混合培養菌体の超音波破砕抽出液より常法により分離精
製した。すなわち、 Tyr−PEP 液体培地（0.２％Ｌ−チ
ロシン、0.５％ポリペプトン、0.１％酵母エキス、0.３
％K₂HPO₄、0.１％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄・７H₂O 、0.05
％ピリドキサール−５′−リン酸(121℃、20分間滅
菌）、0.05％Ｌ−トリプトファン(115℃、15分間別滅
菌))で60℃、30時間静置培養した。得られた菌体を超音
波破砕した後、特開昭62−285785号公報に記載の方法に
よって、各種カラムクロマトグラフィーを行い、精製し
た耐熱性β−チロシナーゼのアミノ末端アミノ酸配列
を、エドマン分解法を用いたアプライド・バイオシステ
ムズ社のプロテイン・シークエンサー 470Ａにより分析
したが、アミノ末端はブロックされていたために決定で
きなかった。

【００１８】そこで精製した耐熱性β−チロシナーゼを
常法に従いCNBrにより化学分解し、その分解物を高速液
体カラムクロマトグラフィー (HPLC法) により精製して
得た二つのペプチドについて下記の通りそのアミノ酸の
一次配列を決定した。ペプチド No.１(Met)-X-Glu-Glu-Trp-Ile-Leu-Gln-Lys-
Ala-Z ペプチド No.２(Met)-Val-Tyr-Glu-Pro-Pro-Thr-Leu-Ar
g-Phe-Phe （X, Z；未決定）（３）耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子のクローニングステップ１：ＤＮＡプローブの作成上記（２）で決定した耐熱性β−チロシナーゼ蛋白のア
ミノ酸一次構造により、アミノ酸の一次構造レベルで高
い相同性の存在する事の分かった本菌の耐熱性トリプト
ファナーゼの構造遺伝子ＤＮＡを制限酵素Sma I で処理
した後、それを電気泳動で分離しそのゲルより耐熱性ト
リプトファナーゼの構造遺伝子の後半部分を含むSma I
0.55kbＤＮＡ断片を回収した。

【００１９】次に回収したＤＮＡ断片の³²Ｐ標識化を以
下のように行った。上記のＤＮＡ断片20ngを、50μCiの
α−³²Ｐ dCTP(Amersham International Co Ltd, PB1
0205) 及びマルチプライムＤＮＡ標識キット(Amersham
International Co Ltd) を用いてリン酸標識した後、セ
ファデックスＧ−50（ファルマシア社）のゲル濾過によ
り標識されたＤＮＡを分取し、それを³²Ｐ標識ＤＮＡプ
ローブとして用いた。

【００２０】なお、耐熱性トリプトファナーゼの構造遺
伝子は次のようにして得た。先ず始めに特開61−282076
号公報に記載の方法により精製したシンビオバクテリウ
ム・サーモフィラムの生産する耐熱性トリプトファナー
ゼ蛋白のアミノ末端アミノ酸配列を、エドマン分解法を
用いたアプライド・バイオシステムズ社のプロテイン・
シークエンサー 470Ａを用いて決定した。そのアミノ酸
配列より予想される遺伝子配列を持つ合成混合オリゴヌ
クレオチドを作成し、その５′−末端をＴ４ポリヌクレ
オチド・キナーゼと〔γ−³²Ｐ〕ＡＴＰを用いて標識し
た。

【００２１】これをプローブとして用いて、シンビオバ
クテリウム・サーモフィラムの染色体ＤＮＡの制限酵素
Bam HI分解物に対して、常法に従いサザン・ハイブリダ
イゼーション続いてコロニー・ハイブリダイゼーション
を行い、それぞれ5.５kbと1.８kbの挿入Bam HI DNA断片
を持つプラスミドを取得した。これらのプラスミドの挿
入遺伝子断片中の上記作成のプローブとハイブリダイズ
する部分付近の塩基配列をザンガーらの方法に従って決
定し、シンビオバクテリウム・サーモフィラムの生産す
る耐熱性トリプトファナーゼの全遺伝子構造を決定し
た。決定された塩基配列中より上記決定のアミノ末端ア
ミノ酸配列をコードしている部分の存在が確認され、耐
熱性トリプトファナーゼ遺伝子が取得された事を確認し
た。またそれは、遺伝子全長を挿入したプラスミドによ
り形質転換された大腸菌が、同様の酵素活性を有する耐
熱性トリプトファナーゼを生産することによっても確認
された。ステップ２：サザン・ハイブリダイゼーションによる耐
熱性β−チロシナーゼ遺伝子ＤＮＡ断片の取得前項（１）で取得した耐熱性β−チロシナーゼ生産菌の
染色体ＤＮＡを制限酵素Sac I （宝酒造）を用いて切断
した後、１％アガロースゲル電気泳動を行ない分画した
後、アルカリ・ブロッティング法によりナイロン・メン
ブレンHybond N＋(Amersham International Co Ltd) に
転移・固定した。

【００２２】上記ステップ１で作成した³²Ｐ標識ＤＮＡ
プローブを用いたサザン・ハイブリダイゼーション法
(J.Mol.Biol. 98, 503-517(1975))により、染色体ＤＮ
ＡのSac I 断片中の耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子を含
むＤＮＡ断片の大きさを3.８kbと特定し、その3.８kb
Sac I DNA断片を１％アガロースゲル中より(Anal.Bioch
em.101,339(1980)) に記載の方法を用いて回収した。ステップ３：耐熱性β−チロシナーゼ生産菌の染色体Ｄ
ＮＡライブラリーの作製耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子
のスクリーニングのために常法により、プラスミド pUC
18をベクターとする耐熱性β−チロシナーゼ生産菌の染
色体ＤＮＡライブラリーを作成した。

【００２３】すなわち、１μｇのプラスミド pUC18（宝
酒造）を、制限酵素Sac I で切断し、大腸菌アルカリフ
ォスファターゼ（宝酒造）を用いてベクターＤＮＡの
５′末端リン酸を除去した後、等量のフェノール：クロ
ロホルム（１：１、ＴＥ緩衝液飽和）を加え混合し、上
澄を１％アガロースゲル電気泳動し、ベクターＤＮＡを
ゲル中より回収した。

【００２４】上記ステップ２で取得した染色体DNA Sac
I 断片と上記のベクターＤＮＡ断片を、T4 DNAリガーゼ
（宝酒造）を用いてライゲーションした後、これを用い
て大腸菌JM 105株（アマシャム社）を常法 J.Bacterio
l., 119 , 1072(1974) に従って形質転換した。該大腸
菌を、最終濃度50μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢ寒
天平板培地にスプレッドし37℃一夜培養した。ステップ４：コロニーハイブリダイゼーションによる耐
熱性β−チロシナーゼ遺伝子のクローニングプレート上のコロニーをニトロセルロース・フィルター
にレプリカし、そのフィルターをアンピシリン（50μｇ
／ml) を含むＬＢ平板培地に移して、37℃、約10時間培
養した。該フィルターを、Ａ液（0.５N NaOH) 、Ｂ液
1.０M Tris（pH8.０）、Ｃ液（0.５M Tris (pH7.５）
＋1.５M NaCl) に各５分間浸し、Ｄ液（２xSSC；30mMク
エン酸ナトリウム＋0.３M NaCl(pH7. ０))で５分間洗浄
・風乾後、80℃で２時間、減圧下で焼付けを行った。

【００２５】該フィルターを、上記ステップ１で作成し
た³²Ｐ標識合成ＤＮＡプローブを用いてコロニー・ハイ
ブリダイゼーションを行い、ポジティブ・シグナルを与
えるコロニーをマスタープレートより拾い、再度、同様
のコロニー・ハイブリダイゼーションを行い、ポジティ
ブ・クローン大腸菌JM 105／pTYAl をクローン化した。実施例２．耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子の構造解析単離したポジティブクローン大腸菌JM 105／pTYAl から
常法に従い、プラスミドpTYAl を取得した。該プラスミ
ドpTYAl を、制限酵素Bam HI, Pst I,Eco RV,Xho I,Kpn
I,Bgl II, Sal I を用いて切断し、１％アガロース電
気泳動で解析することにより、挿入ＤＮＡ断片Sac I 3.
８kbの制限酵素地図を作製した（図１参照）。さらに、
前記ステップ１の³²Ｐ標識合成ＤＮＡプローブを用いた
上記制限酵素切断ＤＮＡ断片のサザン・ハイブリダイゼ
ーション法による解析により、耐熱性トリプトファナー
ゼ遺伝子とハイブリダイズするＤＮＡ配列の、挿入Sac
IDNA断片中における位置を決定した（Bam HI−Bam HI
1.０kb部位間) 。次に、このpTYAl を用いて形質転換し
た大腸菌JM 105は耐熱性β−チロシナーゼ蛋白を生産し
ており、しかも耐熱性β−チロシナーゼ活性が検出され
た。従って、耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子は、この3.
８kbSac I DNA断片中に存在することがわかった。

【００２６】上記（２）のステップ２で調製したプロー
ブとハイブリダイズしたBam HI−Bam HI 1.０kb DNA断
片を中心とする領域を各種制限酵素により消化した後、
それぞれ得たＤＮＡ断片を M13mp18または M13mp19ファ
ージ・ベクタープラスミドのマルチ・クローニング部位
に挿入した。得られたこれらのファージ・プラスミドに
より、それぞれ大腸菌JM 105を形質転換し、37℃で培養
を行い培養上清中より常法によりファージの１本鎖ＤＮ
Ａを取得した。

【００２７】この１本鎖ＤＮＡを鋳型にSequenase Vers
ion2.０ Kits (United States Biochemical Corporatio
n) を用いてザンガーらの方法 Proc. Natl. Acad. Sc
i. U.S.A.,74,5463-5467(1977), により、β−チロシナ
ーゼ遺伝子の全塩基配列の決定を行なった。解明した塩
基配列と、耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子の塩基配列に
対応するアミノ酸配列を配列番号：１に示す。

【００２８】ここで明らかとなった耐熱性β−チロシナ
ーゼ遺伝子は、開始コドンＡＴＧで始まり、終了コドン
ＴＡＧで終わる 1,377塩基のＯＲＦ領域を持ち、 458ア
ミノ酸残基よりなる分子量 52, 269の蛋白をコードして
いた。実施例３．耐熱性β−チロシナーゼ遺伝子の大腸菌菌体
内大量発現形質転換体JM 105／pTYAl をアンピシリンを含むＬＢ液
体培地に植え付け、37℃一夜振とう培養後、新鮮なアン
ピシリン入りのＬＢ液体培地に１％接種し、最終濃度１
mMのIPTG存在下で遺伝子の誘導をかけながら37℃、24時
間振とう培養した。集菌した菌体を緩衝液 50mMリン酸
カリウム＋１mM ２−メルカプトエタノール＋ 250μM
PMSF＋ 100μM ピリドキサール−５′−リン酸（pH8.
０) に懸濁し超音波破砕した後、山田ら（京大）の方法
Agric. Biol. Chem.,38(11),2065-2072,(197 4) に準
じて酵素反応を行わせた。

【００２９】すなわち、Ｌ−チロシン2.５mM、ピリドキ
サール−５′−リン酸0.１mM、K₂HPO₄-KH₂PO₄(pH8.０)2
00 50mM 及び酵素を含む反応液4.０mlを用い、70℃で10
分間反応後、30％トリクロロ酢酸水溶液1.０mlを加えて
反応を停止した。そして反応液中に生成したピルビン酸
をフリードマン・ハウゲン〔Friedemann-Haugen, J.Bio
l.Chem., 147, 415(1943)〕法より定量し、酵素活性を
決定した。

【００３０】培地当りの酵素活性は、耐熱性β−チロシ
ナーゼ生産菌シンビオバクテリウム・サーモフィラムよ
りも形質転換体JM 105／pTYAlの方が向上していたが、
さらに生産性を向上するために、発現ベクターpUC18 の
大腸菌の lacプロモーターと耐熱性β−チロシナーゼ遺
伝子の開始コドンＡＴＧの配置を適切にする実験、つま
りβ−チロシナーゼ遺伝子の５′−末端非翻訳領域を除
去する実験を行なった。

【００３１】まず、pTYAl を制限酵素Eco RIで切断し、
BAL 31ヌクレアーゼで直鎖状ＤＮＡの両端を約 300塩基
ずつ消化させた後、これを１％アガロース電気泳動しゲ
ルよりＤＮＡ断片を回収した。なお、BAL 31ヌクレアー
ゼによる反応は次の条件で行った。２μｇのプラスミド
pTYAl 40μｌに制限酵素Ｈ緩衝液（宝酒造）５μｌ，４
Ｖの制限酵素Eco RIを加えて、37℃、１時間反応させ
た。次にBAL 31ヌクレアーゼ用５倍濃縮緩衝液(100mM T
ris ・HCl(pH8.０), 3,000mM NaCl, 60mM CaCl₂, 60mM
MgCl₂,５mM EDTA)を10μｌ、BAL 31ヌクレアーゼ（宝酒
造）を0.６Ｖ加えて、37℃１分間または２分間反応させ
た後、 200mM EDTA(pH8.０）を50μｌ加えて反応を停止
させた。この反応液を１％アガロースゲル電気泳動し、
ゲル中より切り縮められた直鎖状ＤＮＡを回収した。

【００３２】このＤＮＡ断片を制限酵素Xho I で切断
し、１％アガロース電気泳動した後、耐熱性β−チロシ
ナーゼ遺伝子の上流域を切り縮めたＤＮＡ断片をゲルよ
り回収した。得られたＤＮＡ断片を発現ベクターpUC 18
のマルチ・クローニング部位のSmaI−Sal I 間に挿入し
た後、これを用いて大腸菌JM 105株を形質転換した。こ
の形質転換体の中で、耐熱性β−チロシナーゼ活性の高
い大腸菌クローンJM 105／pTYA2 をクローニングした。

【００３３】なお、この大腸菌JM 105／pTYA2 は工業技
術院微生物工学技術研究所に微工研条寄第３４９５号
（FERM BP-３４９５として1991年７月29日に寄託され
た。形質転換体JM 105／pTYA2 を上記と同様にして培養
し、得られた菌体を超音波破砕した後、ラエムリ(Laemm
li) らの方法 Nature,227,680-685,(1970) に従って、
全菌体蛋白をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
した。泳動後、クマシー・ブリリアントブルーＲ−250
で染色を行いデンシトメーターで分析を行うと、耐熱性
β−チロシナーゼ蛋白の形質転換体全蛋白に対する割合
は約30％であることが判明した。

【００３４】なお、シンビオバクテリウム・サーモフィ
ラム（微工研条寄第 810号）により生産された耐熱性β
−チロシナーゼの量は全蛋白に対して１％以下である。実施例４．大腸菌で生産された耐熱性β−チロシナーゼ
の精製法形質転換体JM 105／pTYA2 について、実施例３と同様に
して培養後、集菌し緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。
得られた耐熱性β−チロシナーゼは常温菌由来のβ−チ
ロシナーゼ蛋白と比べて耐熱性が高いため、70℃の熱処
理を行うと該耐熱性β−チロシナーゼ以外の大腸菌菌体
蛋白は熱変性を起こして凝集・沈澱を起こすために、こ
れを遠心分離で除去することにより効率よく耐熱性β−
チロシナーゼ蛋白の精製が行い得る。

【００３５】すなわち、上記形質転換体JM 105／pTYA2
の超音波菌体破砕抽出液を70℃、１時間保持した後、氷
冷し、冷却遠心分離（15,000ｇ、10分、４℃）して沈澱
物を除去した。得られた上清をＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行い、デンシトメーターで分析する
と、全蛋白中の耐熱性β−チロシナーゼの占める割合が
処理前の約30％から実質的に純粋にまで濃縮できた。

【００３６】従って、上記調製法を用いることにより、
容易に形質転換体大腸菌菌体蛋白から高度に効率よく耐
熱性β−チロシナーゼ蛋白を精製できることが明らかと
なった。以上、大腸菌JM 105／pTYA2 により生産された
耐熱性β−チロシナーゼについて各種クロマトグラフィ
ーにより精製を行い、特開昭62−285785号公報に記載の
方法により、作用至適pH、pH安定性、作用至適温度、温
度安定性について検討を行った。

【００３７】次に、得られた酵素の性質を記載する。（１）作用ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−チロシンか
らピルビン酸、フェノール及びアンモニアを生成する。（２）基質特異性チロシンを分解する。（３）至適pH及び安定pH 50mMのリン酸カリウム緩衝液（pH5.９〜7.９）及び50mM
のグリシン−NaOH緩衝液（pH6.４〜9.０）の各々を用
い、各pH（70℃におけるpH）条件下に、本発明酵素のβ
−チロシナーゼ活性を測定した。至適pHは70℃において
７付近と決定される。

【００３８】10mMのKCl 及び10μM のピリドキサール
５′−リン酸を含有する50mMの各種緩衝液〔クエン酸−
Na₂HPO₄緩衝液（pH4.５〜6.５）；K₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝
液（pH6.０〜8.０）；Tris-HCl緩衝液（pH8.５〜 10.
５）；グリシン−NaOH緩衝液（pH11.０〜 11.５)〕の
それぞれを用い、各pH（25℃におけるpH) 条件下に、25
℃で２日間、本発明酵素を処理した後の残存β−チロシ
ナーゼ活性を測定した結果から安定pH範囲６〜11（25
℃、２日間）と決定される。（４）作用至適温度の範囲各測定温度におけるpHを8.０となるように調製した50mM
のK₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液（pH8.０）中で、10分間酵素反
応を行わせることにより、β−チロシナーゼ活性を求め
た。この結果から作用至適温度約80℃（pH＝8.０）と決
定される。（５）pH、温度などによる失活の条件約80℃（pH＝8.０、保持時間20分）までは熱失活しな
い。

【００３９】約85℃（pH＝8.０、保持時間20分）で約75
％の残存活性を示す。（６）ＳＤＳゲル電気泳動による分子量は約48,000であ
り、塩基配列から推定されるアミノ酸配列から計算され
た分子量は約52,300である。なお、本発明の耐熱性β−チロシナーゼの力価は次の様
にして測定される。Ｌ−チロシン2.５mM、ピリドキサー
ル・リン酸(PLP) 0.１mM、K₂HPO₄−KH₂PO₄（pH8.０）50
mM及び酵素を含む反応液4.０mlを用い、70℃で10分間反
応後、30％トリクロロ酢酸(TCA）水溶液1.０mlを加えて
反応を停止する。反応系中に生成したピルビン酸を、フ
リードマン−ハウゲン〔Friedemann-Haugen, J.Biol.Ch
em.,147, 415(1943)〕法により定量決定する。活性は
１分間に生成するピルビン酸のμmole数を１Ｕ（μ mol
es／min)として表わす。

【００４０】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：２４７１配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：シンビオバクテリウム・サーモフィラム (Symbiobacterium thermophilum) 直接の起源：プラスミド pTYA1 配列 GGATCCGGCC TCGGCGGAGG GGTTGCGCCA GGCGGGCGCA GAGGACGCCC 50 GCGCGCTGGT GGCGCTGACC AGCGACGAAC GCTCCAACCT CGCCGCGGCT 100 CGCCTGGGCC GCGGGGAGTT CGGCATCCCG CGCGCCATCC TCTTCGCAAC 150 CAGCCCGGAC GGGCTGGCGG AAGCCCGGCA GGAAGGACTG GAGGCGGTGA 200 ATCCGGACCT GGCGCCGGCC CTGCTGGTGG AGAGCCTGCT CTCCAGCCCG 250 GCCGCGACCG AGCTCACGGG CGGGACCAGG ACGTGCGATC CAGGACTTCC 300 TGCTGGCCGG CGGACCCCTG GCGGGCACCG CCCTGCGGGA TGCGCCGCTG 350 CCCGCCGGGG TGCTGGTGGT GTCGGTGAAG CGGGGCGCCG AGAAGATCGT 400 ACCCCACGGT CACACCGTGC TGCAGCCTTT CCTTTCCCCT GTTCAGCCGC 450 GCTGTTTTAT TCAGGTAAAG ACAGCTTGTT CTGGCAGTTC GTGCCCTCCT 500 ATACTGGTCG TGGTCGTGGA GCGAACAGCA CCGAGCCGGA CAGGAGGAAT 550 GATCCC ATG CAG CGA CCC TGG GCG GAA CCG TAC AAG ATC AAG GCG 595 Met Gln Arg Pro Trp Ala Glu Pro Tyr Lys Ile Lys Ala 5 10 GTG GAA CCC ATC CGC ATG ACG ACC CGG GAG TAC CGG GAA CAG GCG 640 Val Glu Pro Ile Arg Met Thr Thr Arg Glu Tyr Arg Glu Gln Ala 15 20 25 ATC CGG GAG GCC GGC TAC AAC ACC TTC CTG CTG CGC AGC GAG GAC 685 Ile Arg Glu Ala Gly Tyr Asn Thr Phe Leu Leu Arg Ser Glu Asp 30 35 40 GTG TAC ATC GAC CTG CTG ACG GAC TCG GGA ACC AAC GCG ATG TCG 730 Val Tyr Ile Asp Leu Leu Thr Asp Ser Gly Thr Asn Ala Met Ser 45 50 55 GAC CGG CAG TGG GGC GCC CTG ATG ATG GGC GAT GAG GCC TAC GCC 775 Asp Arg Gln Trp Gly Ala Leu Met Met Gly Asp Glu Ala Tyr Ala 60 65 70 GGC GCA CGC TCC TTC TTC CGC CTG GAG GAG GCG GTG CGC GAG ATC 820 Gly Ala Arg Ser Phe Phe Arg Leu Glu Glu Ala Val Arg Glu Ile 75 80 85 TAC GGC TTC AAG TAC GTG GTG CCG ACC CAT CAG GGG CGC GGT GCC 865 Tyr Gly Phe Lys Tyr Val Val Pro Thr His Gln Gly Arg Gly Ala 90 95 100 GAG CAC CTG ATC TCC CGC ATC CTC ATC AAG CCC GGC GAC TAC ATC 910 Glu His Leu Ile Ser Arg Ile Leu Ile Lys Pro Gly Asp Tyr Ile 105 110 115 CCC GGC AAC ATG TAC TTC ACG ACG ACG CGC ACC CAC CAG GAG CTG 955 Pro Gly Asn Met Tyr Phe Thr Thr Thr Arg Thr His Gln Glu Leu 120 125 130 CAG GGG GGC ACG TTC GTC GAC GTG ATC ATC GAC GAG GCC CAC GAT 1000 Gln Gly Gly Thr Phe Val Asp Val Ile Ile Asp Glu Ala His Asp 135 140 145 CCC CAG GCC AGT CAC CCG TTC AAG GGG AAC GTG GAC ATC GCC AAG 1045 Pro Gln Ala Ser His Pro Phe Lys Gly Asn Val Asp Ile Ala Lys 150 155 160 TTC GAG GCG CTC ATC GAC CGG GTC GGC CGC GAC AAG ATC CCG TAC 1090 Phe Glu Ala Leu Ile Asp Arg Val Gly Arg Asp Lys Ile Pro Tyr 165 170 175 ATC AAC GTG GCG CTT ACG GTC AAC ATG GCC GGT GGT CAG CCC GTC 1135 Ile Asn Val Ala Leu Thr Val Asn Met Ala Gly Gly Gln Pro Val 180 185 190 TCC ATG GCC AAC CTG CGT GAG GTG CGG AAG GTT TGC GAC CGG CAC 1180 Ser Met Ala Asn Leu Arg Glu Val Arg Lys Val Cys Asp Arg His 195 200 205 GGC ATC CGG ATG TGG AGC GAC GCG ACC CGC GCC GTG GAG AAC GCC 1225 Gly Ile Arg Met Trp Ser Asp Ala Thr Arg Ala Val Glu Asn Ala 210 215 220 TAC TTC ATC AAG GAG CGG GAG GAG GGC TAC CAG GAC AAG CCG GTC 1270 Tyr Phe Ile Lys Glu Arg Glu Glu Gly Tyr Gln Asp Lys Pro Val 225 230 235 CGG GAG ATC CTG AAG GAG ATG ATG TCC TAC TTC GAC GGC TGC ACC 1315 Arg Glu Ile Leu Lys Glu Met Met Ser Tyr Phe Asp Gly Cys Thr 240 245 250 ATG TCG GGA AAG AAG GAC TGC CTG GTC AAC ATC GGC GGC TTC CTG 1360 Met Ser Gly Lys Lys Asp Cys Leu Val Asn Ile Gly Gly Phe Leu 255 260 265 GCC ATG AAC GAG GAG TGG ATC CTC CAG AAG GCC CGG GAG CAG GTG 1405 Ala Met Asn Glu Glu Trp Ile Leu Gln Lys Ala Arg Glu Gln Val 270 275 280 GTC ATC TTC GAG GGC ATG CCC ACG TAC GGC GGC CTG GCC GGG CGC 1450 Val Ile Phe Glu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Gly Leu Ala Gly Arg 285 290 295 GAC ATG GAG GCG ATC GCT CAG GGC ATC TAC GAG ATG GTG GAC GAC 1495 Asp Met Glu Ala Ile Ala Gln Gly Ile Tyr Glu Met Val Asp Asp 300 305 310 GAC TAC ATC GCC CAC CGG ATC CAT CAG GTG CGC TAC CTG GGC GAG 1540 Asp Tyr Ile Ala His Arg Ile His Gln Val Arg Tyr Leu Gly Glu 315 320 325 CAG CTG CTG GAG GCG GGC ATC CCC ATC GTG CAG CCC ATC GGC GGC 1585 Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ile Pro Ile Val Gln Pro Ile Gly Gly 330 335 340 CAC GCC GTC TTC CTG GAC GCC CGG GCC TTC CTG CCT CAC ATC CCG 1630 His Ala Val Phe Leu Asp Ala Arg Ala Phe Leu Pro His Ile Pro 345 350 355 CAG GAC CAG TTC CCT GCC CAG GCG CTG GCG GCG GCG CTC TAC GTC 1675 Gln Asp Gln Phe Pro Ala Gln Ala Leu Ala Ala Ala Leu Tyr Val 360 365 370 CAC TCC GGG GTG CGC GCG ATG GAG CGG GGC ATC GTC TCC GCC GGC 1720 His Ser Gly Val Arg Ala Met Glu Arg Gly Ile Val Ser Ala Gly 375 380 385 CGC AAC CCC CAG ACC GGT GAG CAC AAC TAT CCC AAG CTG GAG CTG 1765 Arg Asn Pro Gln Thr Gly Glu His Asn Tyr Pro Lys Leu Glu Leu 390 395 400 GTG CGC CTC ACG ATC CCG CGG CGG GTC TAC ACC GAC CGG CAC ATG 1810 Val Arg Leu Thr Ile Pro Arg Arg Val Tyr Thr Asp Arg His Met 405 410 415 GAC GTG GTG GCG TAC TCG GTG AAG CAC CTG TGG AAG GAG CGC GAC 1855 Asp Val Val Ala Tyr Ser Val Lys His Leu Trp Lys Glu Arg Asp 420 425 430 ACC ATC CGC GGG CTG CGC ATG GTC TAC GAG CCG CCC ACC CTG CGG 1900 Thr Ile Arg Gly Leu Arg Met Val Tyr Glu Pro Pro Thr Leu Arg 435 440 445 TTC TTC ACG GCC CGC TTC GAG CCG ATC AGC TAG CAGATCCGCA 1943 Phe Phe Thr Ala Arg Phe Glu Pro Ile Ser ^*** 450 455 ACCCCGCCCG GAGCCGGCGT GAGCACCGGG GCCCGGCAGT CGACCCTCCG 1993 GGCCCCGGCG CGTCGAACGA TGCCCGGCCA TCGGCGGCGT CGCCCCGGGC 2043 CCCGTCACCA AACCGGCGGC GTGCACATAC GCTGGACCTG AACTCGTATG 2093 CGCGAAAGGA GAGGAGAAGG ATGCAGCAGC CCGGCATGGT GACCTACAGC 2143 CCGCAGGCGC CGGTTCAGAC CCAGCCGCAG GCAGCCCTGG CTGCGCCGGT 2193 CCCCTTCGCC GCCGGACCAT TCGGCAGCGC GCCGCCCTTC GCCCAGACCG 2243 GCCTGCCCGT GCAGGGGCAG CAGCCCAACC CCGCCCAGGT GCTGACCCAG 2293 CAGCTGGTGC AGACGGCCCG GTCCCTGGAG CAGCTCTTCC CCGGTTACCA 2343 GGCTCTGCTC TCGCTCCTGC TGGAGGCCAG CAGTAACGCC CCCTCGCCCG 2393 CCCTGAACGA GGCGGTGCGC AGCGTCGAGG AGGGGCTCTA CTACCACGGG 2443 GCCGCGCTGG GAGCGATCCG GAGGATCC 2471

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成３年８月３０日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００３】しかし、このような常温菌が生産するβ−
チロシナーゼは、耐熱性が低く、利用に際して反応温
度、熱安定性などの点で著しく制約を受けるという技術
的難点があった。そこで、本発明者らはこのような技術
的難点を克服した耐熱性に優れたβ−チロシナーゼを創
製すべく鋭意研究を行なった結果、天然培地及びＬ−チ
ロシン含有合成培地のいずれにおいても単独では生育し
ないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp stra
in S；微工研条寄第８０９号）との共生により生育する
従来完全に未知で且ついかなる公知文献にも未記載の特
異な生育特性を有する耐熱性β−チロシナーゼ生産桿菌
シンビオバクテリウム・サーモフィラム（Symbiobacter
ium thermophilum；微工研条寄第８１０号）（バチル
ス・エスピー・Ｓ株との混合形態）を土壌試料により分
離採取することに成功し、且つ該新規桿菌が約８０℃
（pH８．０）に作用至適温度を有し、且つ約８０℃（pH
８．０、保持時間２０分）までは殆ど熱失活しない熱安
定性を示す点で、前記常温菌が生産するβ−チロシナー
ゼとは全く別異の新規酵素である耐熱性β−チロシナー
ゼを産生することを見いだした（特開昭６２−２８５７
８５号公報）。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３１

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３１】まず、pTYA１を制限酵素Eco RIで切断し、
BAL 31ヌクレアーゼで直鎖状ＤＮＡの両端を約３００塩
基ずつ消化させた後、これを１％アガロース電気泳動し
ゲルよりＤＮＡ断片を回収した。なお、BAL 31ヌクレア
ーゼによる反応は次の条件で行った。２μｇのプラスミ
ドpTYA１ 40μｌに制限酵素Ｈ緩衝液（宝酒造）５μ
ｌ，４Ｕの制限酵素Eco RIを加えて、３７℃、１時間反
応させた。次にBAL 31ヌクレアーゼ用５倍濃縮緩衝液
（１００mM Tris ・HCl （pH８．０），3,000mM NaCl，
60mM CaCl₂，60mM MgCl₂，5mM EDTA）を10μｌ、BAL 31
ヌクレアーゼ（宝酒造）を０．６Ｕ加えて、３７℃１分
間または２分間反応させた後、200mM EDTA（pH８．０）
を５０μｌ加えて反応を停止させた。この反応液を１％
アガロースゲル電気泳動し、ゲル中より切り縮められた
直鎖状ＤＮＡを回収した。

【手続補正３】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００３３

【補正方法】変更

【補正内容】

【００３３】なお、この大腸菌JM 105／pTYA2 は工業技
術院微生物工学技術研究所に微工研条寄第３４９５号
（FERM BP-３４９５）として１９９１年７月２９日に寄
託された。形質転換体JM 105／pTYA2 を上記と同様にし
て培養し、得られた菌体を超音波破砕した後、ラエムリ
(Laemmli)らの方法Nature，２２７，６８０−６８５，
（１９７０）に従って、全菌体蛋白をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動した。泳動後、クマシー・ブリ
リアントブルーＲ−２５０で染色を行いデンシトメータ
ーで分析を行うと、耐熱性β−チロシナーゼ蛋白の形質
転換体全蛋白に対する割合は約３０％であることが判明
した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/60 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者西山真東京都新宿区西落合２丁目16番11号メープルハウス１階 (72)発明者堀之内末治東京都江東区越中島１丁目３番16棟403号

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】次の性質：（１）作用：ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ
−チロシンからピルビン酸、フェノール及びアンモニア
を生成する；（２）基質特異性：Ｌ−チロシンを分解する；（３）作用至適pH及び安定pHの範囲：反応温度70℃にお
ける至適pHは約７〜7.５であり、25℃にて２日間置いた
場合の安定pHは６〜11である；（４）作用至適温度及び耐熱性：pH8.０での作用至適温
度は約80℃であり、pH8.０にて20分間保持した場合、80
℃までは熱失活しない；及び（５）ＳＤＳゲル電気泳動により測定した分子量は約4
8,000である；また遺伝子配列より推定されるアミノ酸
配列から予想される分子量は約52,300である；を有する耐熱性β−チロシナーゼの製造方法であって、
シンビオバクテリウム（Symbiobacterium ）属に属し前
記酵素をコードする遺伝子を有する微生物から得た該酵
素をコードする遺伝子が挿入されている発現ベクターに
より形質転換された宿主を培養し、その培養物から該酵
素を採取することを特徴とする、耐熱性β−チロシナー
ゼの製造方法。
【請求項２】前記宿主が大腸菌である、請求項１に記
載の方法。
【請求項３】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
る耐熱性β−チロシナーゼ蛋白質をコードしているＤＮ
Ａ。
【請求項４】請求項３に記載のＤＮＡを含有する発現
ベクター。
【請求項５】請求項４に記載の発現ベクターにより形
質転換された宿主。
【請求項６】請求項５に記載の大腸菌宿主。