JPH0556781A - 発現用プロモーターおよびその用途 - Google Patents
発現用プロモーターおよびその用途Info
- Publication number
- JPH0556781A JPH0556781A JP2405849A JP40584990A JPH0556781A JP H0556781 A JPH0556781 A JP H0556781A JP 2405849 A JP2405849 A JP 2405849A JP 40584990 A JP40584990 A JP 40584990A JP H0556781 A JPH0556781 A JP H0556781A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- promoter
- cells
- dna
- gene
- rat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】組織特異的な発現用プロモーターを開発する。
【構成】蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプロモーターのク
ローニング、およびその塩基配列の決定を行なった。 【効果】蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプロモーターを用
いて脳神経系の細胞で特異的に種々の遺伝子を発現させ
ることが可能となり、脳内でのこれら遺伝子の機能の検
討、脳内の病気の研究、治療を可能とする。
ローニング、およびその塩基配列の決定を行なった。 【効果】蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプロモーターを用
いて脳神経系の細胞で特異的に種々の遺伝子を発現させ
ることが可能となり、脳内でのこれら遺伝子の機能の検
討、脳内の病気の研究、治療を可能とする。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組織特異的な発現用プロ
モーターおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本
発明は蛋白リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）遺伝子のプロモー
ター領域を含有する組換えＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡおよび形質転換体に関する。
モーターおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本
発明は蛋白リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）遺伝子のプロモー
ター領域を含有する組換えＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡおよび形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】動物、特に高等動物では、その発生の時
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなるる。器官特異的に発
現し、作用している蛋白質の遺伝子にはその器官でのみ
作動する転写誘導系（プロモーター、エンハンサー）が
あって、このプロモーター部分が蛋白質合成を指令する
ｍＲＮＡの転写を制御している。さらにプロモーターに
はホルモン依存性や、増殖因子依存性を示すものも知ら
れており、これらを利用したトランスジェニックマウス
が既に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能
の解析に利用されている。
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなるる。器官特異的に発
現し、作用している蛋白質の遺伝子にはその器官でのみ
作動する転写誘導系（プロモーター、エンハンサー）が
あって、このプロモーター部分が蛋白質合成を指令する
ｍＲＮＡの転写を制御している。さらにプロモーターに
はホルモン依存性や、増殖因子依存性を示すものも知ら
れており、これらを利用したトランスジェニックマウス
が既に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能
の解析に利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】従って、特定の器官
でのみ作動するプロモーター部分を使って、その下流に
種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを卵に
注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入
動物）を作成すれば、特定の目標とした器官でのみその
蛋白を合成させ、その生体での作用を検討することも可
能となる。しかし大部分の遺伝子の転写を指令するプロ
モーターには明確な組織特異性は検出されず、特異性を
示すプロモーターが渇望されている。
でのみ作動するプロモーター部分を使って、その下流に
種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを卵に
注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入
動物）を作成すれば、特定の目標とした器官でのみその
蛋白を合成させ、その生体での作用を検討することも可
能となる。しかし大部分の遺伝子の転写を指令するプロ
モーターには明確な組織特異性は検出されず、特異性を
示すプロモーターが渇望されている。
【０００４】一方、PKCは細胞の情報伝達機構において
重要な役割を担っている酵素である。PKCはカルシウム
の存在下にジアシルグリセロールによって活性化され、
この活性化されたPKCによる細胞内蛋白質のリン酸化反
応が種々の細胞機能の活性化や細胞増殖をもたらすと考
えられている。PKCには少くとも７種のサブタイプ(α、
β-1、β-2、γ、δ、ε、ξ)が知られている〔Nishizu
ka,Y. ネイチャー(Nature)334,661-665(1988)〕。ラッ
トでは、このうち、α、βサブタイプは広い範囲の組織
に見出されるが、γサブタイプは脳にのみ局在している
ことがわかった。特に脳内の海馬領域に多く見出されて
いる。脳には脳血液関門があり、高分子物質は容易には
脳内に入りこむことは少い。従ってCキナーゼγは脳で
のみ合成、蓄積されていると考えられ、PKC-γ遺伝子の
プロモーターは脳内の細胞系でのみ作動するものと考え
られる。
重要な役割を担っている酵素である。PKCはカルシウム
の存在下にジアシルグリセロールによって活性化され、
この活性化されたPKCによる細胞内蛋白質のリン酸化反
応が種々の細胞機能の活性化や細胞増殖をもたらすと考
えられている。PKCには少くとも７種のサブタイプ(α、
β-1、β-2、γ、δ、ε、ξ)が知られている〔Nishizu
ka,Y. ネイチャー(Nature)334,661-665(1988)〕。ラッ
トでは、このうち、α、βサブタイプは広い範囲の組織
に見出されるが、γサブタイプは脳にのみ局在している
ことがわかった。特に脳内の海馬領域に多く見出されて
いる。脳には脳血液関門があり、高分子物質は容易には
脳内に入りこむことは少い。従ってCキナーゼγは脳で
のみ合成、蓄積されていると考えられ、PKC-γ遺伝子の
プロモーターは脳内の細胞系でのみ作動するものと考え
られる。
【０００５】また、PKC-α遺伝子のプロモーターはユニ
バーサルに働くものとして活用され得る。中枢神経系は
神経管から分化した神経細胞（ニューロン）および神経
膠細胞より構成され、複雑な機能を営む細胞社会と言え
る。この神経系で特異的に機能しかつ、他の細胞系で機
能しないプロモーターは機能分化のための神経特異蛋白
質の発現調節機構を解析するための手段として有用であ
る。また、種々の遺伝子を下流に連結させて細胞あるい
は動物に移入することにより、それらを神経系細胞ある
いは脳で特異的に発現させることが出来る。
バーサルに働くものとして活用され得る。中枢神経系は
神経管から分化した神経細胞（ニューロン）および神経
膠細胞より構成され、複雑な機能を営む細胞社会と言え
る。この神経系で特異的に機能しかつ、他の細胞系で機
能しないプロモーターは機能分化のための神経特異蛋白
質の発現調節機構を解析するための手段として有用であ
る。また、種々の遺伝子を下流に連結させて細胞あるい
は動物に移入することにより、それらを神経系細胞ある
いは脳で特異的に発現させることが出来る。
【０００６】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、特定の
器官でのみ作動するプロモーターとして、脳内でのみ作
動するPKC-γ遺伝子のプロモーターを見出し、取り出す
ことを目標とし、ラットPKC-γcDNA断片をプローブとし
て、ラットPKC-γ遺伝子をクローニングした。この遺伝
子を制限酵素消化してPKC-γをコードしている構造遺伝
子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これを再び
プラスミドDNA上にクローニングした。この３kb DNAの
下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェニコー
ルアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプラスミ
ドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細胞ある
いは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を測定す
ることにより、PKC-γ上流部分３kb DNAに、中枢神経細
胞で特異的に作動するプロモーターを見出すことが出来
た。同様に、ラットPKC-α遺伝子をクローニングし、こ
の遺伝子を制限酵素消化してPKC-αをコードしている構
造遺伝子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これ
を再びプラスミドDNA上にクローニングした。この３kb
DNAの下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェ
ニコールアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプ
ラスミドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細
胞あるいは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を
測定することにより、PKC-α上流部分３kb DNAに、中枢
神経細胞のみならず、多くの細胞種で普遍的に作動する
プロモーターを見出すことが出来た。本発明者らは、こ
れらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完
成した。
器官でのみ作動するプロモーターとして、脳内でのみ作
動するPKC-γ遺伝子のプロモーターを見出し、取り出す
ことを目標とし、ラットPKC-γcDNA断片をプローブとし
て、ラットPKC-γ遺伝子をクローニングした。この遺伝
子を制限酵素消化してPKC-γをコードしている構造遺伝
子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これを再び
プラスミドDNA上にクローニングした。この３kb DNAの
下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェニコー
ルアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプラスミ
ドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細胞ある
いは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を測定す
ることにより、PKC-γ上流部分３kb DNAに、中枢神経細
胞で特異的に作動するプロモーターを見出すことが出来
た。同様に、ラットPKC-α遺伝子をクローニングし、こ
の遺伝子を制限酵素消化してPKC-αをコードしている構
造遺伝子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これ
を再びプラスミドDNA上にクローニングした。この３kb
DNAの下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェ
ニコールアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプ
ラスミドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細
胞あるいは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を
測定することにより、PKC-α上流部分３kb DNAに、中枢
神経細胞のみならず、多くの細胞種で普遍的に作動する
プロモーターを見出すことが出来た。本発明者らは、こ
れらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完
成した。
【０００７】すなわち本発明は（１）蛋白リン酸化酵素
Ｃ遺伝子のプロモーター領域を含有する組換えＤＮＡ、
（２）蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ γで
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（３）蛋白リン酸化酵
素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃαである上記１記載の組換え
ＤＮＡ、（４）プロモーター領域がラット由来のもので
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（５）プロモーター領
域が次の塩基配列： ＧＧＴＧＴ ＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧ ＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴ ＧＧＡＡＴ
ＧＴＡＴＴ ＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡ ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＧ ＧＡＣＧＴＣＣＣＣＴ ＣＣＴ
ＴＧＣＡＴＡＧ ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡ ＡＴＧＧＧＡＧＴＧＴ ＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧ ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧ ＧＧＣ
ＡＡＣＴＧＴＣ ＣＧＧＧＡＴＴＣＴＴ ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＧＧＡＣＧＣＣＴＴＴ ＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣ ＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＴＴ ＧＧＴＣＧＴＣＡＴＧ ＧＣＡＡＣＧＣＣＴＡ ＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣ ＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣ ＡＴＴ
ＴＣＡＧＣＡＧ ＧＴＧＣＧＧＡＴＡＧ ＣＧＧＡＧＣＴＣＣＣ ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＴＧＣＣＴＧＣＧＧ ＣＴ を含有あるいはその一部で表わされる、上記２記載の組
換えＤＮＡ、（６）プロモーター領域が次の塩基配列： ＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ ＣＧＡＣＧＧＡＡＧＡ ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡ ＡＡＡ
ＡＡＡＡＧＡＧ ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡ ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ ＡＧＧ
ＡＧＡＡＧＧＡ ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣ ＴＣＧＧＣＴＴＣＴＴ ＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧ ＧＧＣ
ＣＴＣＴＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣ ＣＣＴＣＣＧＧＴＧＧ ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣ ＴＣＡＣＡＡＧＧＧＣ ＣＣＣ
ＣＣＡＣＣＣＡ ＧＴＡＣＧＣＧＴＧＴ ＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴ ＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣ ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ ＧＧＣ
ＣＣＴＡＧＧＣ ＴＣＧＣＣＣＣＧＣＧ ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧ ＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡ ＧＴＣ
ＣＧＣＧＣＧＣ ＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣ ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣ ＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧ ＣＡＧ
ＴＧＧＧＣＧＧ ＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧ ＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴ ＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧ ＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣ ＧＣＧ
ＡＧＣＧＣＣＡ ＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣ ＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧ ＣＧＴＧ を含有あるいはその一部で表わされる、上記３記載のＤ
ＮＡ、（７）上記１記載の組換えＤＮＡを含有する組換
えベクター、（８）下流に構造遺伝子を連結している上
記７記載の組換えベクター、（９）請求項７または８記
載のベクターを保持する形質転換体に関するものであ
る。
Ｃ遺伝子のプロモーター領域を含有する組換えＤＮＡ、
（２）蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ γで
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（３）蛋白リン酸化酵
素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃαである上記１記載の組換え
ＤＮＡ、（４）プロモーター領域がラット由来のもので
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（５）プロモーター領
域が次の塩基配列： ＧＧＴＧＴ ＧＧＧＡＧＣＣＡＡＧ ＡＴＡＡＣＡＧＡＣＴ ＧＧＡＡＴ
ＧＴＡＴＴ ＴＧＧＧＡＧＡＡＡＧ ＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡ ＡＧＧＣＴＴＧＧＡＧ ＧＡＣＧＴＣＣＣＣＴ ＣＣＴ
ＴＧＣＡＴＡＧ ＡＧＣＣＴＧＣＧＧＡ ＡＴＧＧＧＡＧＴＧＴ ＧＣＡＣＧＴＧＧＡＧ ＡＧＧＡＧＧＧＡＧＧ ＧＧＣ
ＡＡＣＴＧＴＣ ＣＧＧＧＡＴＴＣＴＴ ＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧ ＧＧＡＣＧＣＣＴＴＴ ＡＡＡＣＴＧＡＡＡＣ ＣＣＣ
ＧＣＣＣＣＴＴ ＧＧＴＣＧＴＣＡＴＧ ＧＣＡＡＣＧＣＣＴＡ ＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣ ＣＧＡＣＴＴＣＴＡＣ ＡＴＴ
ＴＣＡＧＣＡＧ ＧＴＧＣＧＧＡＴＡＧ ＣＧＧＡＧＣＴＣＣＣ ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣ ＧＴＧＣＣＴＧＣＧＧ ＣＴ を含有あるいはその一部で表わされる、上記２記載の組
換えＤＮＡ、（６）プロモーター領域が次の塩基配列： ＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ ＣＧＡＣＧＧＡＡＧＡ ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡ ＡＡＡ
ＡＡＡＡＧＡＧ ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡ ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ ＡＧＧ
ＡＧＡＡＧＧＡ ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣ ＴＣＧＧＣＴＴＣＴＴ ＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧ ＧＧＣ
ＣＴＣＴＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣ ＣＣＴＣＣＧＧＴＧＧ ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣ ＴＣＡＣＡＡＧＧＧＣ ＣＣＣ
ＣＣＡＣＣＣＡ ＧＴＡＣＧＣＧＴＧＴ ＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴ ＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣ ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ ＧＧＣ
ＣＣＴＡＧＧＣ ＴＣＧＣＣＣＣＧＣＧ ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧ ＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡ ＧＴＣ
ＣＧＣＧＣＧＣ ＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣ ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣ ＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧ ＣＡＧ
ＴＧＧＧＣＧＧ ＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧ ＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴ ＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧ ＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣ ＧＣＧ
ＡＧＣＧＣＣＡ ＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣ ＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧ ＣＧＴＧ を含有あるいはその一部で表わされる、上記３記載のＤ
ＮＡ、（７）上記１記載の組換えＤＮＡを含有する組換
えベクター、（８）下流に構造遺伝子を連結している上
記７記載の組換えベクター、（９）請求項７または８記
載のベクターを保持する形質転換体に関するものであ
る。
【０００８】本発明のＰＫＣ遺伝子プロモーターを種々
の組み換え用ベクターに組み込み、その下流に任意の構
造遺伝子を挿入し、さらにこのDNAを用いて形質転換体
を作成することにより、該構造遺伝子を神経細胞でのみ
発現させることができる。プロモーターを組み込む組み
換え用ベクターとしては、たとえばpCDベクター、cDM8
ベクター〔Aruffo, AとSeed,B.,プロシージングス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sci, USA), 84,8573-8577(1987)）,レトロウ
ィルスベクター(Cone,R.D.とMulligan,R.C.,プロシージ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci, USA),81, 6349-6353(198
4)〕など動物細胞用のものを含め、pBR、pUCなどいかな
るプラスミドであっても用いられ得る。形質転換体の宿
主としては、動物細胞、特に脳神経系の細胞が用いられ
得る。PKC α遺伝子プロモーターについては公知の多く
の動物細胞株も用いられる。また動物個体へのDNA移入
への一過程としての卵細胞、あるいはES細胞〔Evans,
M.J.とKaufman, K.H., ネイチャー(Nature),292, 154(1
981)〕も使用される。これらの細胞の形質転換の方法と
しては、リン酸カルシウム法〔Grahamら、ヴィロロジー
(Virology) 52, 456(1973)〕、エレクトロポレーション
法〔石崎ら、細胞工学, 5, 557(1986)〕、マイクロイン
ジェクション法などが用いられる。
の組み換え用ベクターに組み込み、その下流に任意の構
造遺伝子を挿入し、さらにこのDNAを用いて形質転換体
を作成することにより、該構造遺伝子を神経細胞でのみ
発現させることができる。プロモーターを組み込む組み
換え用ベクターとしては、たとえばpCDベクター、cDM8
ベクター〔Aruffo, AとSeed,B.,プロシージングス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sci, USA), 84,8573-8577(1987)）,レトロウ
ィルスベクター(Cone,R.D.とMulligan,R.C.,プロシージ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci, USA),81, 6349-6353(198
4)〕など動物細胞用のものを含め、pBR、pUCなどいかな
るプラスミドであっても用いられ得る。形質転換体の宿
主としては、動物細胞、特に脳神経系の細胞が用いられ
得る。PKC α遺伝子プロモーターについては公知の多く
の動物細胞株も用いられる。また動物個体へのDNA移入
への一過程としての卵細胞、あるいはES細胞〔Evans,
M.J.とKaufman, K.H., ネイチャー(Nature),292, 154(1
981)〕も使用される。これらの細胞の形質転換の方法と
しては、リン酸カルシウム法〔Grahamら、ヴィロロジー
(Virology) 52, 456(1973)〕、エレクトロポレーション
法〔石崎ら、細胞工学, 5, 557(1986)〕、マイクロイン
ジェクション法などが用いられる。
【０００９】これらの方法で得られた形質転換体はそれ
自体公知の方法で培養する。培地としては、たとえば約
５〜20％の牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)
122, 501(1952)〕, DMEM培地〔ヴィロロジー(Virolog
y) 8, 396(1959)〕、RPMI 1640培地〔ザ ジャーナル オ
ブ ジ アメリカン メディカル アソシエーション(TheJo
urnal of Medical Association) 199, 519(1967)〕、19
9培地〔プロシージング オブ ザ ソサイエティ フォー
ザ バイオロジカル メディスン(Proceeding of the Soc
iety for the Biological Medicine) 73, 1(1950)〕な
どが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は強常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応
じて通気や攪拌を加える。これらの方法により、任意の
構造遺伝子を本発明のPKCγ遺伝子プロモーターを用い
た場合には脳神経細胞で特異的に発現させることが可能
となり、本発明のPKC α遺伝子プロモーターを用いた場
合には多くの細胞種で普遍的に発現させることが可能と
なる。
自体公知の方法で培養する。培地としては、たとえば約
５〜20％の牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)
122, 501(1952)〕, DMEM培地〔ヴィロロジー(Virolog
y) 8, 396(1959)〕、RPMI 1640培地〔ザ ジャーナル オ
ブ ジ アメリカン メディカル アソシエーション(TheJo
urnal of Medical Association) 199, 519(1967)〕、19
9培地〔プロシージング オブ ザ ソサイエティ フォー
ザ バイオロジカル メディスン(Proceeding of the Soc
iety for the Biological Medicine) 73, 1(1950)〕な
どが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は強常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応
じて通気や攪拌を加える。これらの方法により、任意の
構造遺伝子を本発明のPKCγ遺伝子プロモーターを用い
た場合には脳神経細胞で特異的に発現させることが可能
となり、本発明のPKC α遺伝子プロモーターを用いた場
合には多くの細胞種で普遍的に発現させることが可能と
なる。
【００１０】本発明のPKCプロモーターを用いた発現用
プラスミドは、たとえば以下の様に作製される。ラット
PKC-γcDNAおよびラットPKC-αcDNAはたとえば吉川らの
方法〔フェブスレターズ（FEBS Letters), 217, 227-23
1（1987)〕によりそれぞれ得ることができる。すなわち
蛋白リン酸化酵素C-γあるいは蛋白リン酸化酵素C-αの
アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いて、λgt10ベクターに組み込まれたラッ
ト脳のcDNAライブラリーをスクリーニングする。こうし
て得られたcDNAの最上流域をプローブとして例えばラッ
ト遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このプロ
ーブと反応するλファージのクローンを得る。このファ
ージクローンよりDNAを抽出し、組みこまれているラッ
ト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、cDNAの最上流域
プローブと反応する、例えば制限酵素EcoRＩ消化による
3.3kb DNA断片を、例えばプラスミドPUC118に再クロー
ニングすることが出来る。クローニングしたDNAの塩基
配列を決定し、例えばcDNAの塩基配列と比較検討するこ
とにより遺伝子上の翻訳開始コドンの位置を知ることが
できる。また、ラットmRNAを用いて、例えばSＩマッピ
ング法〔Berk, A. J,とSharp,P. A., セル(Cell), 12,
721,1977〕を行えば、該遺伝子の転写開始点を知ること
もできる。このようにして得た3.3kb DNA断片あるい
は、さらにその５'側上流域を一部欠失させたDNA断片の
下流に、レポーター遺伝子である、たとえばクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）遺伝子を
組みこんだプラスミドを構築して、該DNA断片のプロモ
ーター活性を測定するためのプラスミドとなす〔Gorwan
ら、モレキュラー セルラー バイオロジー(MolecularCe
llular Biology),2, 1044 1982〕。レポーター遺伝子と
してはCAT遺伝子の他に、βガラクトシダーゼ遺伝子が
汎用されているが、他のいかなる構造遺伝子であって
も、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。
プラスミドは、たとえば以下の様に作製される。ラット
PKC-γcDNAおよびラットPKC-αcDNAはたとえば吉川らの
方法〔フェブスレターズ（FEBS Letters), 217, 227-23
1（1987)〕によりそれぞれ得ることができる。すなわち
蛋白リン酸化酵素C-γあるいは蛋白リン酸化酵素C-αの
アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いて、λgt10ベクターに組み込まれたラッ
ト脳のcDNAライブラリーをスクリーニングする。こうし
て得られたcDNAの最上流域をプローブとして例えばラッ
ト遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このプロ
ーブと反応するλファージのクローンを得る。このファ
ージクローンよりDNAを抽出し、組みこまれているラッ
ト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、cDNAの最上流域
プローブと反応する、例えば制限酵素EcoRＩ消化による
3.3kb DNA断片を、例えばプラスミドPUC118に再クロー
ニングすることが出来る。クローニングしたDNAの塩基
配列を決定し、例えばcDNAの塩基配列と比較検討するこ
とにより遺伝子上の翻訳開始コドンの位置を知ることが
できる。また、ラットmRNAを用いて、例えばSＩマッピ
ング法〔Berk, A. J,とSharp,P. A., セル(Cell), 12,
721,1977〕を行えば、該遺伝子の転写開始点を知ること
もできる。このようにして得た3.3kb DNA断片あるい
は、さらにその５'側上流域を一部欠失させたDNA断片の
下流に、レポーター遺伝子である、たとえばクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）遺伝子を
組みこんだプラスミドを構築して、該DNA断片のプロモ
ーター活性を測定するためのプラスミドとなす〔Gorwan
ら、モレキュラー セルラー バイオロジー(MolecularCe
llular Biology),2, 1044 1982〕。レポーター遺伝子と
してはCAT遺伝子の他に、βガラクトシダーゼ遺伝子が
汎用されているが、他のいかなる構造遺伝子であって
も、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。
【００１１】このプラスミドを種々の動物細胞、例えば
初代培養神経細胞、グリア細胞、上皮由来細胞あるいは
例えば、3T3、NRK細胞等の株化細胞に、種々の方法、例
えばカルシウムフォスフェート法〔Wigler, Mら、セル
（Cell), 16, 777 1979〕DEAEデキストラン法〔Lopata,
M, Aら、ヌクレイック アシッド リサーチ（NucleicAc
id Res.), 12, 5707 1984), エレクトロポレーション法
（石崎ら、細胞工学５,557 1986）等の方法を用いて導
入する。導入した細胞をその細胞に適合した培地、例え
ば、10％血清を含むMEM培地、あるいは血清を含まないD
ME／F12培地（DMEMとF12培地の等量混合物）等で37℃で
例えば５〜10％のCO2共存下、24〜72時間、望ましくは4
8時間、プラスチックディッシュ上で培養する。培養
後、この細胞をラバーポリスマン等ではがして集め、例
えば凍結融解法、あるいは超音波処理法等で調製した細
胞の抽出液についてCAT活性を測定する。CAT活性は、例
えば14C・クロラムフェニコールへのアセチル基の付加
を、薄層クロマトグラフィー法により測定することによ
り測定される。細胞抽出液中に検出されたCAT活性は細
胞に導入したプラスミドのCAT遺伝子の上流に組みこま
れているプロモーターにより転写が指令されたCAT遺伝
子産物によるものである。従って、導入されたプラスミ
ドに組み込まれているプロモーターの細胞中での活性は
検出されたCAT活性に比例するものと考えられる。この
レポーター遺伝子の発現活性によりプロモーター組織特
異性やその発現に必要な領域を決めることができる。
初代培養神経細胞、グリア細胞、上皮由来細胞あるいは
例えば、3T3、NRK細胞等の株化細胞に、種々の方法、例
えばカルシウムフォスフェート法〔Wigler, Mら、セル
（Cell), 16, 777 1979〕DEAEデキストラン法〔Lopata,
M, Aら、ヌクレイック アシッド リサーチ（NucleicAc
id Res.), 12, 5707 1984), エレクトロポレーション法
（石崎ら、細胞工学５,557 1986）等の方法を用いて導
入する。導入した細胞をその細胞に適合した培地、例え
ば、10％血清を含むMEM培地、あるいは血清を含まないD
ME／F12培地（DMEMとF12培地の等量混合物）等で37℃で
例えば５〜10％のCO2共存下、24〜72時間、望ましくは4
8時間、プラスチックディッシュ上で培養する。培養
後、この細胞をラバーポリスマン等ではがして集め、例
えば凍結融解法、あるいは超音波処理法等で調製した細
胞の抽出液についてCAT活性を測定する。CAT活性は、例
えば14C・クロラムフェニコールへのアセチル基の付加
を、薄層クロマトグラフィー法により測定することによ
り測定される。細胞抽出液中に検出されたCAT活性は細
胞に導入したプラスミドのCAT遺伝子の上流に組みこま
れているプロモーターにより転写が指令されたCAT遺伝
子産物によるものである。従って、導入されたプラスミ
ドに組み込まれているプロモーターの細胞中での活性は
検出されたCAT活性に比例するものと考えられる。この
レポーター遺伝子の発現活性によりプロモーター組織特
異性やその発現に必要な領域を決めることができる。
【００１２】これらの方法を用いて、本発明者らは、PK
C-γ構造遺伝子上流3.3ｋb DNA中に脳神経系細胞、即
ち、大脳由来初代培養神経細胞中で作動し、他の非神経
系の細胞、例えば、腎臓由来細胞、グリア細胞等で作動
しないプロモーター活性を見出した。さらに本発明者ら
は、3.3kbDNAを上流側から削っていく事により、プロモ
ーター活性を保持した、より短いDNA断片を得ることが
出来た。
C-γ構造遺伝子上流3.3ｋb DNA中に脳神経系細胞、即
ち、大脳由来初代培養神経細胞中で作動し、他の非神経
系の細胞、例えば、腎臓由来細胞、グリア細胞等で作動
しないプロモーター活性を見出した。さらに本発明者ら
は、3.3kbDNAを上流側から削っていく事により、プロモ
ーター活性を保持した、より短いDNA断片を得ることが
出来た。
【００１３】
【作用】このプロモーターを用いることにより、脳神経
系の細胞に特異的に、種々の蛋白質を作らせることが可
能となった。この手法により、種々の遺伝子産物の中枢
神経系での機能を知ることができる。例えば、神経細胞
成長因子（NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子（basic FG
F)、酸性線維芽細胞成長因子（acidic FGF）などの神経
栄養因子を始めとする他の成長因子、リンホカインなど
の脳内での機能の検討には極めて有用である。
系の細胞に特異的に、種々の蛋白質を作らせることが可
能となった。この手法により、種々の遺伝子産物の中枢
神経系での機能を知ることができる。例えば、神経細胞
成長因子（NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子（basic FG
F)、酸性線維芽細胞成長因子（acidic FGF）などの神経
栄養因子を始めとする他の成長因子、リンホカインなど
の脳内での機能の検討には極めて有用である。
【００１４】また発現させる遺伝子としてmyc，rasをは
じめとした癌遺伝子を選べば、脳神経系に癌をはじめと
する特定の病変をひき起こす事も可能であり、こうして
作られた動物は疾患モデル動物として医薬品開発の有力
な手段となるであろう。さらには、DNA移入による脳の
遺伝的疾患の治療に、また癌抑制遺伝子を移入すること
による脳腫瘍の治療にも道をひらくものである。
じめとした癌遺伝子を選べば、脳神経系に癌をはじめと
する特定の病変をひき起こす事も可能であり、こうして
作られた動物は疾患モデル動物として医薬品開発の有力
な手段となるであろう。さらには、DNA移入による脳の
遺伝的疾患の治療に、また癌抑制遺伝子を移入すること
による脳腫瘍の治療にも道をひらくものである。
【００１５】本発明は脳、神経系の細胞で特異的に作動
する、ラットPKC-γ遺伝子のプロモーターをクローニン
グし、該プロモーターを用いて脳神経系の細胞のみで種
々の遺伝子、例えば成長因子遺伝子をはじめとして癌遺
伝子まで幅広い遺伝子の発現を可能とするものである。
該プロモーターを用いた発現プラスミドを動物に導入
し、DNA導入動物を作製すれば、脳神経系細胞に限定し
て導入DNAによりコードされる産物が発現される動物が
作られ得ることとなる。
する、ラットPKC-γ遺伝子のプロモーターをクローニン
グし、該プロモーターを用いて脳神経系の細胞のみで種
々の遺伝子、例えば成長因子遺伝子をはじめとして癌遺
伝子まで幅広い遺伝子の発現を可能とするものである。
該プロモーターを用いた発現プラスミドを動物に導入
し、DNA導入動物を作製すれば、脳神経系細胞に限定し
て導入DNAによりコードされる産物が発現される動物が
作られ得ることとなる。
【００１６】また神経系をはじめとした多くの細胞種で
作動するラットPKC-α遺伝子のプロモーターをクローニ
ングし、該プロモーターを用いて種々の遺伝子の発現を
可能とした。該プロモーターは多くの細胞種で作動する
が、細胞内では、その転写活性は、PKC-αと同じ制御を
受けることとなる。この性質を利用すれば種々の遺伝子
の産物について、細胞内での産生の制御を行うことも可
能となる。
作動するラットPKC-α遺伝子のプロモーターをクローニ
ングし、該プロモーターを用いて種々の遺伝子の発現を
可能とした。該プロモーターは多くの細胞種で作動する
が、細胞内では、その転写活性は、PKC-αと同じ制御を
受けることとなる。この性質を利用すれば種々の遺伝子
の産物について、細胞内での産生の制御を行うことも可
能となる。
【００１７】後述の実施例３で得られた形質転換体 Esc
herichiacoli ＤＨ１／pTB1105および Escherichia col
i ＤＨ１／pTB1107は財団法人発酵研究所(IFO)および通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にそれ
ぞれ寄託されている。受託日および受託番号を次の表１
に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ Escherichia coli DH1/pTB1105 IFO 14981 FERM BP-2709 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日) Escherichia coli DH1/pTB1107 IFO 14982 FERM BP-2708 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日)
herichiacoli ＤＨ１／pTB1105および Escherichia col
i ＤＨ１／pTB1107は財団法人発酵研究所(IFO)および通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にそれ
ぞれ寄託されている。受託日および受託番号を次の表１
に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ Escherichia coli DH1/pTB1105 IFO 14981 FERM BP-2709 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日) Escherichia coli DH1/pTB1107 IFO 14982 FERM BP-2708 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日)
【００１８】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、これにより本発明は何ら限定されるもの
ではない。 参考例１ ラットPKC-γ型のcDNAの単離 吉川らが既に示した方法〔フェブス レターズ (FEBS LE
TTERS), 217, 227-231,(1987)〕すなわち蛋白リン酸化
酵素C-γのアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いて、λgt10ベクターに組み込
まれたラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングす
る。得られたcDNAの塩基配列をジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法〔Messingら、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research)，９，309,(1981)〕
によって決定した。〔Onoら、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research), 16, 5199-5200,
(1988)〕。この塩基配列を図１に示した。
に説明するが、これにより本発明は何ら限定されるもの
ではない。 参考例１ ラットPKC-γ型のcDNAの単離 吉川らが既に示した方法〔フェブス レターズ (FEBS LE
TTERS), 217, 227-231,(1987)〕すなわち蛋白リン酸化
酵素C-γのアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いて、λgt10ベクターに組み込
まれたラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングす
る。得られたcDNAの塩基配列をジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法〔Messingら、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research)，９，309,(1981)〕
によって決定した。〔Onoら、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research), 16, 5199-5200,
(1988)〕。この塩基配列を図１に示した。
【００１９】実施例１ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターのクローニングと
制限酵素地図の作成 (1) クローニング 参考例１に記した方法で決定し、図１に塩基配列を示し
たcDNAの最上流域（塩基番号１番からNcoＩ切断部位ま
での144塩基対）のDNA断片を、ニックトランスレーショ
ン法（Maniatisら、モレキュラー クローニング (Molec
ular Cloning),Cold Spring Harbor Laboratory, p109,
1982）により、32P標識し、プローブとした。ラットGe
nomic DNAのライブラリーは、クローンテック社（Clont
ech Laboratories, Inc.)から購入したものを用いた。
このライブラリーは、ラットの肝臓の染色体のDNAを制
限酵素、HaeIIIで部分分解したものをλファージCharon
４Aにクローニングしたものである。このライブラリー
（λファージ）を大腸菌LE392を宿主として、軟寒天プ
レート上に、約１×105クローンずつ、10枚まき、これ
をニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィ
ルター）上に移した後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変
性したファージDNAをフィルター上に乾燥固定した。(Ma
niatisら、同上P320）標識したプローブと、DNAを固定
したフィルターを、標識プローブを含む、５×SSPE(0.9
M NaCl 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4), ５mM ED
TA), 50％ホルミアミド、５×Denhardt's, 0.1％SDS,10
0μｇ/mｌ変性サケ精子DNA溶液10mｌ中で42℃、16時
間、会合反応を行い、反応後、フィルターを2×SSC(１
×SSC＝0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリウム),0.1％
SDS溶液中で室温で30分ずつ２回、１×SSC, 0.1％SDS溶
液中で、68℃で30分ずつ２回洗浄した。洗浄したフィル
ターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロ
ーブと反応するクローンを検索した。この方法により得
られたクローンλRG-γ1よりDavisらの方法（Davisら、
「アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス(Advanc
ed Bacterial Genetics）」，Cold Spring Harbor Labo
ratory 1980）によりファージDNAを抽出した。このDNA
を制限酵素EcoRＩで切断し、先のプローブと反応する約
3.3kbのDNA断片を、プラスミドPUC118〔Vieirら、メソ
ッズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）, 153, 3（1987）〕のEcoRＩ切断部位にクローニン
グし、プラスミドpTB1094を得た。
制限酵素地図の作成 (1) クローニング 参考例１に記した方法で決定し、図１に塩基配列を示し
たcDNAの最上流域（塩基番号１番からNcoＩ切断部位ま
での144塩基対）のDNA断片を、ニックトランスレーショ
ン法（Maniatisら、モレキュラー クローニング (Molec
ular Cloning),Cold Spring Harbor Laboratory, p109,
1982）により、32P標識し、プローブとした。ラットGe
nomic DNAのライブラリーは、クローンテック社（Clont
ech Laboratories, Inc.)から購入したものを用いた。
このライブラリーは、ラットの肝臓の染色体のDNAを制
限酵素、HaeIIIで部分分解したものをλファージCharon
４Aにクローニングしたものである。このライブラリー
（λファージ）を大腸菌LE392を宿主として、軟寒天プ
レート上に、約１×105クローンずつ、10枚まき、これ
をニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィ
ルター）上に移した後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変
性したファージDNAをフィルター上に乾燥固定した。(Ma
niatisら、同上P320）標識したプローブと、DNAを固定
したフィルターを、標識プローブを含む、５×SSPE(0.9
M NaCl 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4), ５mM ED
TA), 50％ホルミアミド、５×Denhardt's, 0.1％SDS,10
0μｇ/mｌ変性サケ精子DNA溶液10mｌ中で42℃、16時
間、会合反応を行い、反応後、フィルターを2×SSC(１
×SSC＝0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリウム),0.1％
SDS溶液中で室温で30分ずつ２回、１×SSC, 0.1％SDS溶
液中で、68℃で30分ずつ２回洗浄した。洗浄したフィル
ターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロ
ーブと反応するクローンを検索した。この方法により得
られたクローンλRG-γ1よりDavisらの方法（Davisら、
「アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス(Advanc
ed Bacterial Genetics）」，Cold Spring Harbor Labo
ratory 1980）によりファージDNAを抽出した。このDNA
を制限酵素EcoRＩで切断し、先のプローブと反応する約
3.3kbのDNA断片を、プラスミドPUC118〔Vieirら、メソ
ッズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）, 153, 3（1987）〕のEcoRＩ切断部位にクローニン
グし、プラスミドpTB1094を得た。
【００２０】(2) 制限酵素地図の作成 クローニングしたDNA断片を、各種の６塩基認識の制限
酵素で切断し、そのDNAのアガロースゲルでの電気泳動
のパターンから図２に示す、制限酵素地図を作成した。
酵素で切断し、そのDNAのアガロースゲルでの電気泳動
のパターンから図２に示す、制限酵素地図を作成した。
【００２１】実施例２ ラットPKC-α型の遺伝子のプロモーターのクローニング
と制限酵素地図の作成 (1) クローニング ラットPKCα型のcDNA〔Onoら、ヌクレイックアシッズリ
サーチ（Nucleic Acids Research),16, 5199-5200, (19
88)〕の塩基配列を図３に示す。このcDNAの最上流域
（塩基番号１番から、PstＩ切断部位までの370塩基対）
のDNA断片を、実施例１と同じ方法で32P標識し、プロー
ブとした。さらに、実施例１と同じ方法でラットのGeno
mic DNAのライブラリーをスクリーニングした。得られ
たクローンλRGα１より、実施例１と同様にしてファー
ジDNAを抽出した。このDNAを制限酵素HindIIIで切断
し、先のプローブと反応する約３KbのDNA断片を、プラ
スミドPUC119〔Vieirら、メソッズ インエンザイモロジ
ー (Methochs in Enzymology),153, ３(1987)〕HindIII
切断部位にクローニングし、プラスミドpTB1092を得
た。
と制限酵素地図の作成 (1) クローニング ラットPKCα型のcDNA〔Onoら、ヌクレイックアシッズリ
サーチ（Nucleic Acids Research),16, 5199-5200, (19
88)〕の塩基配列を図３に示す。このcDNAの最上流域
（塩基番号１番から、PstＩ切断部位までの370塩基対）
のDNA断片を、実施例１と同じ方法で32P標識し、プロー
ブとした。さらに、実施例１と同じ方法でラットのGeno
mic DNAのライブラリーをスクリーニングした。得られ
たクローンλRGα１より、実施例１と同様にしてファー
ジDNAを抽出した。このDNAを制限酵素HindIIIで切断
し、先のプローブと反応する約３KbのDNA断片を、プラ
スミドPUC119〔Vieirら、メソッズ インエンザイモロジ
ー (Methochs in Enzymology),153, ３(1987)〕HindIII
切断部位にクローニングし、プラスミドpTB1092を得
た。
【００２２】(2) 制限酵素地図の作成 (1)でクローニングしたDNA断片の制限酵素地図を、実施
例１−(2)と同じ方法で作成し、図４に示した。
例１−(2)と同じ方法で作成し、図４に示した。
【００２３】実施例３ 実施例１及び２でクローニングしたDNA断片中に、目的
のプロモーターが存在することを確認するために、CAT
アッセイ法〔Gormanら、モレキュラー アンドセルラー
バイオロジー (Molecular and Cellular Biology), ２,
1044(1982)〕を用いることにし、まず、そのためのプ
ラスミドDNAを構築した。
のプロモーターが存在することを確認するために、CAT
アッセイ法〔Gormanら、モレキュラー アンドセルラー
バイオロジー (Molecular and Cellular Biology), ２,
1044(1982)〕を用いることにし、まず、そのためのプ
ラスミドDNAを構築した。
【００２４】(1) ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図４に示した制限酵素地図のNcoＩ切断部位付近の塩基
配列を決定したところ、この位置が、翻訳開始コドンの
位置であることが明らかとなった。そこでクローニング
した約３kbのDNA断片のうち、これよりも上流の部分
を、CATアッセイ用のプラスミドDNAであるpSVOCAT〔Gor
manら、同上〕のHindIII切断部位に挿入した。構築の方
法を図５に示す。DNA断片を含むプラスミドDNA（pTB109
2）を制限酵素NcoＩで切断し、ヌクレアーゼS１で末端
を平滑にする。この末端をDNAライゲースを用いて再び
結合させる時に、12塩基の長さの合成DNAであるHindIII
リンカー（5'-CCCAAGCTTGGG-3'）を共存させ、このリン
カーをはさみこむことによって、pＴＢ1092のNcoＩ切断
部位をHindIII切断部位に変換したプラスミドpTB1102を
得た。pTB1102を制限酵素HindIIIで切断して得られるDN
A断片のうち、プロモーター領域を含む側の断片を、pSV
OCATのHindIII切断部位に、プロモーターとCAT遺伝子が
同方向になるようにクローニングした。このプラスミド
が目的のものであり、pTB1105と呼ぶ。プラスミドpTB11
05を用いて、E. coli DH1をプロシージングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 69,2110(1972);ジーン(Gene),17, 107(1
982)などに記載の方法に従って形質転換し、形質転換体
E. coli DH1／pTB1105(IFO 14981，FERM BP-2709)を得
た。
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図４に示した制限酵素地図のNcoＩ切断部位付近の塩基
配列を決定したところ、この位置が、翻訳開始コドンの
位置であることが明らかとなった。そこでクローニング
した約３kbのDNA断片のうち、これよりも上流の部分
を、CATアッセイ用のプラスミドDNAであるpSVOCAT〔Gor
manら、同上〕のHindIII切断部位に挿入した。構築の方
法を図５に示す。DNA断片を含むプラスミドDNA（pTB109
2）を制限酵素NcoＩで切断し、ヌクレアーゼS１で末端
を平滑にする。この末端をDNAライゲースを用いて再び
結合させる時に、12塩基の長さの合成DNAであるHindIII
リンカー（5'-CCCAAGCTTGGG-3'）を共存させ、このリン
カーをはさみこむことによって、pＴＢ1092のNcoＩ切断
部位をHindIII切断部位に変換したプラスミドpTB1102を
得た。pTB1102を制限酵素HindIIIで切断して得られるDN
A断片のうち、プロモーター領域を含む側の断片を、pSV
OCATのHindIII切断部位に、プロモーターとCAT遺伝子が
同方向になるようにクローニングした。このプラスミド
が目的のものであり、pTB1105と呼ぶ。プラスミドpTB11
05を用いて、E. coli DH1をプロシージングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 69,2110(1972);ジーン(Gene),17, 107(1
982)などに記載の方法に従って形質転換し、形質転換体
E. coli DH1／pTB1105(IFO 14981，FERM BP-2709)を得
た。
【００２５】(2) ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図２に示した制限酵素地図の、２ヶ所のNcoＩ切断部位
の塩基配列を決定したところ、図のNcoＩ-(1）の位置
が、翻訳開始コドンの位置であることが明らかとなっ
た。そこで、クローニングした約３kbのDNA断片のう
ち、これよりも上流の部分を、CATアッセイ用のプラス
ミドDNAであるpSVOCAT〔Gormanら、同上〕にクローニン
グした。構築の方法を図５に示す。DNA断片を含むプラ
スミドDNA（pTB1094）を制限酵素NcoＩで切断し、実施
例３-(1）と同じ方法で、pTB1094のNcoＩ切断部位をHin
dIII切断部位に変換したプラスミドpTB1103を得た。た
だし、２ヶ所のNcoＩ切断部位の間の約850塩基対のDNA
断片は失われる。プラスミドpTB1103とpSVOCATから、実
施例３-(1）と同様にして、目的のプラスミドpTB1107を
得た。 プラスミドpTB1107を用いて、E. coli DH1をプ
ロシージングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,2110(197
2); ジーン(Gene),17, 107(1982)などに記載の方法に従
って形質転換し、形質転換体E. coli DH1／pTB1107(IFO
14982，FERM BP-2708)を得た。
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図２に示した制限酵素地図の、２ヶ所のNcoＩ切断部位
の塩基配列を決定したところ、図のNcoＩ-(1）の位置
が、翻訳開始コドンの位置であることが明らかとなっ
た。そこで、クローニングした約３kbのDNA断片のう
ち、これよりも上流の部分を、CATアッセイ用のプラス
ミドDNAであるpSVOCAT〔Gormanら、同上〕にクローニン
グした。構築の方法を図５に示す。DNA断片を含むプラ
スミドDNA（pTB1094）を制限酵素NcoＩで切断し、実施
例３-(1）と同じ方法で、pTB1094のNcoＩ切断部位をHin
dIII切断部位に変換したプラスミドpTB1103を得た。た
だし、２ヶ所のNcoＩ切断部位の間の約850塩基対のDNA
断片は失われる。プラスミドpTB1103とpSVOCATから、実
施例３-(1）と同様にして、目的のプラスミドpTB1107を
得た。 プラスミドpTB1107を用いて、E. coli DH1をプ
ロシージングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,2110(197
2); ジーン(Gene),17, 107(1982)などに記載の方法に従
って形質転換し、形質転換体E. coli DH1／pTB1107(IFO
14982，FERM BP-2708)を得た。
【００２６】実施例４ 培養細胞NRK49F細胞を用いたCATアッセイ NRK49F細胞を、５％炭酸ガスの存在下、37℃で、DMEM培
地（10％牛準胎児血清を含む）を用いて、細胞が培養皿
の約80％の面積を占めるまで培養した。細胞をトリプシ
ンではがして、遠心操作で集めた。この細胞を、PBS
(＋）バッファー（フロウ社製のPBSバッファーに0.1mM
CaCl2と0.1mM MgCl2を加えたもの）に懸濁し、0.8ml
当りに100万個の細胞を含むようにした。この細胞浮遊
液0.8mlと、CATアッセイ用に構築したプラスミドDNA（1
0μｇ）を、電気穿孔法を行なうためのキュベット（バ
イオ・ラッド社製）に加えて、よく混合し、室温で５分
間放置した。バイオラッド社の電気パルス発生器であ
る、ジーン・パルサーを用いて、細胞浮遊液に電気パル
スを与えた。条件は、1200V、25μFに設定した。５分
間、室温で放置した後、全量を直径６ｃｍの培養皿にま
き、元の培地を４ml加えて、５％炭酸ガス存在下、37℃
で48時間培養した。細胞をラバーポリスマンで集めて、
1.5mlの反応チューブに移し、細胞を遠心操作で集め
た。この細胞を50μlの0.25Mのトリス緩衝液（pH7.5）
に懸濁し、ドライアイスを加えたエタノールのバスを用
いて凍結させ、その後、37℃の恒温槽を用いて融解させ
た。この操作を計３回行ない、細胞を破壊した。17,000
ｇで15分間、４℃で遠心し、上清を分取し別のチューブ
に移した。各チューブ内の蛋白濃度を、バイオラッド社
のプロテインアッセイキットを用いて測定し、全てのチ
ューブで、蛋白濃度が同じになるように0.25Mトリス緩
衝液（pH7.5）を加えて調整した。
地（10％牛準胎児血清を含む）を用いて、細胞が培養皿
の約80％の面積を占めるまで培養した。細胞をトリプシ
ンではがして、遠心操作で集めた。この細胞を、PBS
(＋）バッファー（フロウ社製のPBSバッファーに0.1mM
CaCl2と0.1mM MgCl2を加えたもの）に懸濁し、0.8ml
当りに100万個の細胞を含むようにした。この細胞浮遊
液0.8mlと、CATアッセイ用に構築したプラスミドDNA（1
0μｇ）を、電気穿孔法を行なうためのキュベット（バ
イオ・ラッド社製）に加えて、よく混合し、室温で５分
間放置した。バイオラッド社の電気パルス発生器であ
る、ジーン・パルサーを用いて、細胞浮遊液に電気パル
スを与えた。条件は、1200V、25μFに設定した。５分
間、室温で放置した後、全量を直径６ｃｍの培養皿にま
き、元の培地を４ml加えて、５％炭酸ガス存在下、37℃
で48時間培養した。細胞をラバーポリスマンで集めて、
1.5mlの反応チューブに移し、細胞を遠心操作で集め
た。この細胞を50μlの0.25Mのトリス緩衝液（pH7.5）
に懸濁し、ドライアイスを加えたエタノールのバスを用
いて凍結させ、その後、37℃の恒温槽を用いて融解させ
た。この操作を計３回行ない、細胞を破壊した。17,000
ｇで15分間、４℃で遠心し、上清を分取し別のチューブ
に移した。各チューブ内の蛋白濃度を、バイオラッド社
のプロテインアッセイキットを用いて測定し、全てのチ
ューブで、蛋白濃度が同じになるように0.25Mトリス緩
衝液（pH7.5）を加えて調整した。
【００２７】このサンプルを、65℃で５分間保温した
後、35μlをとり、５μlの10mMアセチル・コエンザイム
A（シグマ社製）と、0.5μCiの14C-クロラムフェニコー
ルを加えて混合し、37℃で16時間反応させた。反応後、
４℃の酢酸エチル500μlを加えて、よく混合し、クロラ
ムフェニコールを抽出した。17,000ｇで５分間遠心し、
上層（酢酸エチル層）を別のチューブに移した。酢酸エ
チルを蒸発させた後、再び15μｌの酢酸エチルを加え
て、クロラムフェニコールを溶かした。このうちの、10
μｌを用いて、シリカゲルの薄層クロマトを行なった。
薄層ゲルは、メルク社製（No.5735）を用いた。展開液
は95％クロロホルム；５％メタノールを用いた。展開終
了後、ゲルを乾燥させ、コダック社のフィルム（XAR
５）を用いてオートラジオグラフィーを行なった。現像
後、フィルムの感光している部分に相当する薄層ゲルを
切り取り、シンチレーション液を加えて、液体シンチレ
ーションカウンターで、14Cの量を測定した。この値か
ら、全体の14Cのうち、アセチル化されたクロラムフェ
ニコールのもつ14Cの割合を求めて、CATの酵素の活性と
した。この活性と、CAT遺伝子の上流にクローニングさ
れたプロモーターの活性が、比例すると考える。
後、35μlをとり、５μlの10mMアセチル・コエンザイム
A（シグマ社製）と、0.5μCiの14C-クロラムフェニコー
ルを加えて混合し、37℃で16時間反応させた。反応後、
４℃の酢酸エチル500μlを加えて、よく混合し、クロラ
ムフェニコールを抽出した。17,000ｇで５分間遠心し、
上層（酢酸エチル層）を別のチューブに移した。酢酸エ
チルを蒸発させた後、再び15μｌの酢酸エチルを加え
て、クロラムフェニコールを溶かした。このうちの、10
μｌを用いて、シリカゲルの薄層クロマトを行なった。
薄層ゲルは、メルク社製（No.5735）を用いた。展開液
は95％クロロホルム；５％メタノールを用いた。展開終
了後、ゲルを乾燥させ、コダック社のフィルム（XAR
５）を用いてオートラジオグラフィーを行なった。現像
後、フィルムの感光している部分に相当する薄層ゲルを
切り取り、シンチレーション液を加えて、液体シンチレ
ーションカウンターで、14Cの量を測定した。この値か
ら、全体の14Cのうち、アセチル化されたクロラムフェ
ニコールのもつ14Cの割合を求めて、CATの酵素の活性と
した。この活性と、CAT遺伝子の上流にクローニングさ
れたプロモーターの活性が、比例すると考える。
【００２８】図６に結果を棒グラフにして示した。SV40
ウィルスの初期プロモーターを用いた場合の値を100％
として、その比活性を示した。この図から、ラットPKC-
α型遺伝子のプロモーターが、NRK49F細胞中で、SV40ウ
イルスの初期プロモーターの約２倍の強さで働くことが
わかる。一方、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
は、対照として用いた、プロモーターをもたないプラス
ミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、弱い活性しか示さな
かった。NRK49F細胞は、ラットの腎臓由来の細胞である
ので、先の結果は、α型PKCは全ての組織で観察される
が、γ型PKCは脳でのみ観察されるという事実と、矛盾
しない。
ウィルスの初期プロモーターを用いた場合の値を100％
として、その比活性を示した。この図から、ラットPKC-
α型遺伝子のプロモーターが、NRK49F細胞中で、SV40ウ
イルスの初期プロモーターの約２倍の強さで働くことが
わかる。一方、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
は、対照として用いた、プロモーターをもたないプラス
ミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、弱い活性しか示さな
かった。NRK49F細胞は、ラットの腎臓由来の細胞である
ので、先の結果は、α型PKCは全ての組織で観察される
が、γ型PKCは脳でのみ観察されるという事実と、矛盾
しない。
【００２９】実施例５ ラットの初代培養中枢神経細胞を用いたCATアッセイ 神経細胞の採取は、畠中と津久井の方法〔ディベロプメ
ント オブ ブレインリサーチ （Develop. Brain Res.）30, 47-56（1986)〕を若干修
正し、以下のように行った。妊娠20日目のラット（SD系
ラット）を断頭、脱血後、70％エタノールで清毒した。
ラットをクリーンベンチ内に移し、70％エタノールで滅
菌した器具を用いて開腹し、胎児を取りした。胎児の頭
部を切り取り、氷冷したHanks'BSS中におき、胎児の頭
部の表皮と骨を取り除き、脳を取り出した。この脳から
大脳だけを選んで集めた。バネバサミで細断後、0.25％
トリプシン（Gibco)、および0.01％DNaseＩ（シグマ）
を含むHanks'BSS ８mｌ中で、37℃、10分間反応させ
た。牛準胎児血清0.8mｌを加えて反応を止め、150ｇで
１分間遠心した。沈澱に、４mｌの培地（DMEM＋F12＋15
mM HEPESバッファーpH7.4）を加えて、パスツールピペ
ットで緩やかにピペッティングして、細胞を分散させた
後、二重のレンズペーパー（富士フィルム）を用いてロ
過した。約30mｌの細胞浮遊液とした後、150ｇで５分間
遠心して細胞を集め、再び30mｌの培地に懸濁した。同
じ遠心操作を計３回行ない、細胞を洗い、PBS(＋）(実
施例５に既に示した）10mｌに懸濁した。細胞の数を計
測し、再び遠心して、最終的に0.8mｌ中に１×106個の
細胞が含まれるように、PBS(＋）に懸濁した。この細胞
浮遊液を0.8mｌずつとり、実施例４と同じ方法で、電気
穿孔法を用いて、細胞に実施例４と同じDNAを導入し
た。あらかじめシート状に生育させたアストログリア細
胞の上に、DNAを導入した神経細胞を生育させた。培地
は、先の培地（DMEM＋F12＋HEPES）に、N2supplement
（５μｇ/mｌ insulin, 100μｇ/mｌ transferrin,100
μM putrescine, 20μM progesterone, 30μM sodinm s
elenite）と、10％牛胎児血清を加えたものを用いた。
５％炭酸ガス存在下、37℃で72時間培養後、細胞をラバ
ーポリスマンで集め、実施例４と同じ方法でCATアッセ
イを行ない、プロモーターの強さを調べた。図６に結果
を棒グラフにして示した。値は、SV40ウイルスの初期プ
ロモーターに対する比活性である。ラット PKC-α型遺
伝子のプロモーターと、γ型遺伝子のプロモーターは、
共に、SV40ウイルスの初期プロモーターと、ほぼ同じ強
さで働いている。この結果は、実施例４と次に示す実施
例６の結果と合わせて、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモ
ーターが、中枢神経細胞で特異的に働くことを示してい
る。また、α型PKCが、全ての細胞で検出されるという
事実と矛盾しない。
ント オブ ブレインリサーチ （Develop. Brain Res.）30, 47-56（1986)〕を若干修
正し、以下のように行った。妊娠20日目のラット（SD系
ラット）を断頭、脱血後、70％エタノールで清毒した。
ラットをクリーンベンチ内に移し、70％エタノールで滅
菌した器具を用いて開腹し、胎児を取りした。胎児の頭
部を切り取り、氷冷したHanks'BSS中におき、胎児の頭
部の表皮と骨を取り除き、脳を取り出した。この脳から
大脳だけを選んで集めた。バネバサミで細断後、0.25％
トリプシン（Gibco)、および0.01％DNaseＩ（シグマ）
を含むHanks'BSS ８mｌ中で、37℃、10分間反応させ
た。牛準胎児血清0.8mｌを加えて反応を止め、150ｇで
１分間遠心した。沈澱に、４mｌの培地（DMEM＋F12＋15
mM HEPESバッファーpH7.4）を加えて、パスツールピペ
ットで緩やかにピペッティングして、細胞を分散させた
後、二重のレンズペーパー（富士フィルム）を用いてロ
過した。約30mｌの細胞浮遊液とした後、150ｇで５分間
遠心して細胞を集め、再び30mｌの培地に懸濁した。同
じ遠心操作を計３回行ない、細胞を洗い、PBS(＋）(実
施例５に既に示した）10mｌに懸濁した。細胞の数を計
測し、再び遠心して、最終的に0.8mｌ中に１×106個の
細胞が含まれるように、PBS(＋）に懸濁した。この細胞
浮遊液を0.8mｌずつとり、実施例４と同じ方法で、電気
穿孔法を用いて、細胞に実施例４と同じDNAを導入し
た。あらかじめシート状に生育させたアストログリア細
胞の上に、DNAを導入した神経細胞を生育させた。培地
は、先の培地（DMEM＋F12＋HEPES）に、N2supplement
（５μｇ/mｌ insulin, 100μｇ/mｌ transferrin,100
μM putrescine, 20μM progesterone, 30μM sodinm s
elenite）と、10％牛胎児血清を加えたものを用いた。
５％炭酸ガス存在下、37℃で72時間培養後、細胞をラバ
ーポリスマンで集め、実施例４と同じ方法でCATアッセ
イを行ない、プロモーターの強さを調べた。図６に結果
を棒グラフにして示した。値は、SV40ウイルスの初期プ
ロモーターに対する比活性である。ラット PKC-α型遺
伝子のプロモーターと、γ型遺伝子のプロモーターは、
共に、SV40ウイルスの初期プロモーターと、ほぼ同じ強
さで働いている。この結果は、実施例４と次に示す実施
例６の結果と合わせて、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモ
ーターが、中枢神経細胞で特異的に働くことを示してい
る。また、α型PKCが、全ての細胞で検出されるという
事実と矛盾しない。
【００３０】実施例６ アストログリア細胞を用いたCATアッセイ アストログリア細胞は、実施例５と同じ方法で、ラット
胎児の大脳から採取した。レンズペーパーを用いてロ過
した後、DMEMに10％の牛胎児血清を加えたものを培地と
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で培養した。混在する
神経細胞は、この条件では浮遊したままなので、３時間
後に培地で３回洗うことにより、全細胞の95％以上がア
ストログリア細胞となる。この細胞を数回分裂するまで
培養した後、トリプシンを用いて培養皿からはがし、実
施例４に示したのと同じ方法でプラスミドDNAを導入
し、CATアッセイを行なった。図６に結果を棒グラフに
して示した。値はSV40ウイルスの初期プロモーターに対
する比活性である。ラットPKC-α型遺伝子のプロモータ
ーは、対照として用いた、プロモーターをもたないプラ
スミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、有意に高い活性を
示している。一方、γ型遺伝子のプロモーターは、pSVO
CATの場合よりも低い活性しか示さない。この結果は、
γ型遺伝子のプロモーターの、中枢神経細胞で特異的に
働くという性質を、より確かに示している。また、α型
キナーゼが、全ての組織で検出されるという事実とも、
矛盾しない。
胎児の大脳から採取した。レンズペーパーを用いてロ過
した後、DMEMに10％の牛胎児血清を加えたものを培地と
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で培養した。混在する
神経細胞は、この条件では浮遊したままなので、３時間
後に培地で３回洗うことにより、全細胞の95％以上がア
ストログリア細胞となる。この細胞を数回分裂するまで
培養した後、トリプシンを用いて培養皿からはがし、実
施例４に示したのと同じ方法でプラスミドDNAを導入
し、CATアッセイを行なった。図６に結果を棒グラフに
して示した。値はSV40ウイルスの初期プロモーターに対
する比活性である。ラットPKC-α型遺伝子のプロモータ
ーは、対照として用いた、プロモーターをもたないプラ
スミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、有意に高い活性を
示している。一方、γ型遺伝子のプロモーターは、pSVO
CATの場合よりも低い活性しか示さない。この結果は、
γ型遺伝子のプロモーターの、中枢神経細胞で特異的に
働くという性質を、より確かに示している。また、α型
キナーゼが、全ての組織で検出されるという事実とも、
矛盾しない。
【００３１】実施例７ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の
決定 実施例１でプラスミドPUC118のEcoRＩ切断部位にクロー
ンニングした約3.3kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配
列〔Onoら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic
Acids Research）16, 5199-5200,(1988), Knoptら、セ
ル（Cell),46,491-502（1986)〕よりも上流側の塩基配
列を決定した。方法は、まずPUC118にクローニングした
DNA断片を、キロシークエンス用ディリーションキット
（宝酒造）を用いて片方の端からけずり、約300bpおき
の欠失変異プラスミドを作成した。PUC118のEcoRＩ切断
部位に、DNA断片を逆の向きにクローニングしたプラス
ミドDNAについても、同様に欠失変異プラスミドを作成
することによって、DNAの両側の鎖の配列を読むことが
できる。
決定 実施例１でプラスミドPUC118のEcoRＩ切断部位にクロー
ンニングした約3.3kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配
列〔Onoら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic
Acids Research）16, 5199-5200,(1988), Knoptら、セ
ル（Cell),46,491-502（1986)〕よりも上流側の塩基配
列を決定した。方法は、まずPUC118にクローニングした
DNA断片を、キロシークエンス用ディリーションキット
（宝酒造）を用いて片方の端からけずり、約300bpおき
の欠失変異プラスミドを作成した。PUC118のEcoRＩ切断
部位に、DNA断片を逆の向きにクローニングしたプラス
ミドDNAについても、同様に欠失変異プラスミドを作成
することによって、DNAの両側の鎖の配列を読むことが
できる。
【００３２】それぞれの欠失変異プラスミドを持つ大腸
菌MV1184に対して、ヘルパーファージKO7を感染させる
ことにより、プラスミドと同じ配列の環状単鎖DNAをも
つM13ファージを得た〔Vieiraら、メソッズ イン エン
ザイモロジー(Metholsin Enzymology) 153, 3 (198
7)〕。これらのファージの単鎖DNAを用いて、塩基配列
をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messing
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ (Nucleic Acids
Research) ９, 309（1981)〕によって決定した。全ての
領域について、両方の鎖の塩基配列を調べた。図７に、
決定した塩基配列を示す。最も下流の271塩基対は、既
に報告されているラットγ型PKCのcDNAの最上流域の配
列（Onoら、ヌカレイック アシッズ リサーチ (Nucleic
Acids Research) 16, 5199-5200, (1988),Knopfら、セ
ル (Cell) 46, 491-502 (1986)〕と完全に一致した。
菌MV1184に対して、ヘルパーファージKO7を感染させる
ことにより、プラスミドと同じ配列の環状単鎖DNAをも
つM13ファージを得た〔Vieiraら、メソッズ イン エン
ザイモロジー(Metholsin Enzymology) 153, 3 (198
7)〕。これらのファージの単鎖DNAを用いて、塩基配列
をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messing
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ (Nucleic Acids
Research) ９, 309（1981)〕によって決定した。全ての
領域について、両方の鎖の塩基配列を調べた。図７に、
決定した塩基配列を示す。最も下流の271塩基対は、既
に報告されているラットγ型PKCのcDNAの最上流域の配
列（Onoら、ヌカレイック アシッズ リサーチ (Nucleic
Acids Research) 16, 5199-5200, (1988),Knopfら、セ
ル (Cell) 46, 491-502 (1986)〕と完全に一致した。
【００３３】実施例８ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターが、中枢神経細胞
に特異的に働くために必要な領域を調べるために、実施
例３-(2)で構築法を示したプラスミドpTB1107をもとに
して、各種欠失変異プラスミドを構築し、各種細胞でCA
Tアッセイを行なった。 (1) 欠失変異プラスミドの構築 図８の上側に、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターを
含む1.8kbの長さのDNA断片の制限酵素地図を示した。こ
の断片を、CATアッセイ用のプラスミドpSVOCATにクロー
ニングしたものが、プラスミドpTB1107である。DNA断片
の最も上流側に、制限酵素SphＩとSalＩによる切断部位
が存在する。また、この２種類の制限酵素は、pTB1107
を他の部位で切断しない。pTB1107を制限酵素SphＩとSa
lＩで同時に切断し、そのDNAを用いて、実施例７と同じ
方法で、欠失変異プラスミドを作成した。得られた多く
の変異プラスミドの中から、約300塩基対おきの長さの
ものを選び、以後の実験に用いた。各欠失変異プラスミ
ドがもつプロモーター領域を図８の下側に示す。また、
塩基配列との対応を図９に示す。
に特異的に働くために必要な領域を調べるために、実施
例３-(2)で構築法を示したプラスミドpTB1107をもとに
して、各種欠失変異プラスミドを構築し、各種細胞でCA
Tアッセイを行なった。 (1) 欠失変異プラスミドの構築 図８の上側に、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターを
含む1.8kbの長さのDNA断片の制限酵素地図を示した。こ
の断片を、CATアッセイ用のプラスミドpSVOCATにクロー
ニングしたものが、プラスミドpTB1107である。DNA断片
の最も上流側に、制限酵素SphＩとSalＩによる切断部位
が存在する。また、この２種類の制限酵素は、pTB1107
を他の部位で切断しない。pTB1107を制限酵素SphＩとSa
lＩで同時に切断し、そのDNAを用いて、実施例７と同じ
方法で、欠失変異プラスミドを作成した。得られた多く
の変異プラスミドの中から、約300塩基対おきの長さの
ものを選び、以後の実験に用いた。各欠失変異プラスミ
ドがもつプロモーター領域を図８の下側に示す。また、
塩基配列との対応を図９に示す。
【００３４】(2) 各種欠失変異プラスミドを用いた、ラ
ットの初代培養中枢神経細胞中のCATアッセイ 得られた変異プラスミドと、対照として用いる各プラス
ミドを、ラットの初代培養中枢神経細胞に導入し、CAT
アッセイを行なった。方法は、実施例５と同じである。
図１０に結果を棒グラフにして示す。値は、SV40ウイル
スの初期プロモーターに対する比活性である。この結果
から、上流側からの欠失が大きくなるに従って、プロモ
ーター活性が上昇していることがわかる。このことは、
上流側にプロモーターの働きを抑制する領域があること
を示唆している。また、最も短い領域をもつもの（得ら
れている最長のcDNAの５'端よりも上流の277塩基対をも
つ）でも、プロモーターとして充分働くことがわかる。
ットの初代培養中枢神経細胞中のCATアッセイ 得られた変異プラスミドと、対照として用いる各プラス
ミドを、ラットの初代培養中枢神経細胞に導入し、CAT
アッセイを行なった。方法は、実施例５と同じである。
図１０に結果を棒グラフにして示す。値は、SV40ウイル
スの初期プロモーターに対する比活性である。この結果
から、上流側からの欠失が大きくなるに従って、プロモ
ーター活性が上昇していることがわかる。このことは、
上流側にプロモーターの働きを抑制する領域があること
を示唆している。また、最も短い領域をもつもの（得ら
れている最長のcDNAの５'端よりも上流の277塩基対をも
つ）でも、プロモーターとして充分働くことがわかる。
【００３５】(3) 各種欠失変異プラスミドを用いた、NR
K細胞及び、アストログリア細胞でのCATアッセイ 実施例８-(2)で示したように、各欠失変異プラスミド
は、プロモーター活性を有するが、各変異プラスミドの
活性が、中枢神経細胞に特異的であるかどうかを調べる
ために、NRK細胞とアストログリア細胞でのプロモータ
ー活性を調べた。各プラスミドを細胞へ導入し、CATア
ッセイを行なった。方法は、NRK細胞に関しては実施例
４、アストログリア細胞に関しては実施例６に示したの
と同じ方法で行なった。図１１に結果を棒グラフにして
示す。値は、SV40ウイルスの初期プロモーターに対する
比活性である。この結果から、各欠失変異プラスミド
は、NRK細胞及びアストログリア細胞中で、プロモータ
ー活性をもたないことがわかる。以上の結果から、cDNA
よりも上流の277塩基対のみでも、中枢神経特異的なプ
ロモーターとしての活性を有することがわかる。
K細胞及び、アストログリア細胞でのCATアッセイ 実施例８-(2)で示したように、各欠失変異プラスミド
は、プロモーター活性を有するが、各変異プラスミドの
活性が、中枢神経細胞に特異的であるかどうかを調べる
ために、NRK細胞とアストログリア細胞でのプロモータ
ー活性を調べた。各プラスミドを細胞へ導入し、CATア
ッセイを行なった。方法は、NRK細胞に関しては実施例
４、アストログリア細胞に関しては実施例６に示したの
と同じ方法で行なった。図１１に結果を棒グラフにして
示す。値は、SV40ウイルスの初期プロモーターに対する
比活性である。この結果から、各欠失変異プラスミド
は、NRK細胞及びアストログリア細胞中で、プロモータ
ー活性をもたないことがわかる。以上の結果から、cDNA
よりも上流の277塩基対のみでも、中枢神経特異的なプ
ロモーターとしての活性を有することがわかる。
【００３６】実施例９ ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の
決定 実施例２において、プラスミドpUC119にクローニングし
た約３kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配列〔Onoら、
ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Resea
rch 16, 5199-5200(1988)〕よりも上流側の塩基配列
を、414塩基対決定した。方法は、図４に示した制限酵
素地図のNcoＩ切断部位から両側に向って、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messingら、ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research ９, 30
9(1981)〕で塩基配列を決定した。図１２に決定した塩
基配列を示す。
決定 実施例２において、プラスミドpUC119にクローニングし
た約３kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配列〔Onoら、
ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Resea
rch 16, 5199-5200(1988)〕よりも上流側の塩基配列
を、414塩基対決定した。方法は、図４に示した制限酵
素地図のNcoＩ切断部位から両側に向って、ジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messingら、ヌクレイッ
ク アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research ９, 30
9(1981)〕で塩基配列を決定した。図１２に決定した塩
基配列を示す。
【００３７】
【発明の効果】本発明の蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプ
ロモーター領域を含有するＤＮＡは、これを用いること
により、脳神経系の細胞に特異的に種々の蛋白質を作ら
せることが可能となり、これにより種々の遺伝子産物の
中枢神経系での機能を検討することができ、また発現さ
せる遺伝子を選ぶことにより、脳神経系に特定の病変を
引き起こして疾患モデル動物を作ったり、脳内の病気の
治療を行なうことも可能とするものである。
ロモーター領域を含有するＤＮＡは、これを用いること
により、脳神経系の細胞に特異的に種々の蛋白質を作ら
せることが可能となり、これにより種々の遺伝子産物の
中枢神経系での機能を検討することができ、また発現さ
せる遺伝子を選ぶことにより、脳神経系に特定の病変を
引き起こして疾患モデル動物を作ったり、脳内の病気の
治療を行なうことも可能とするものである。
図１は、ラットPKC-γ型のcDNAの塩基配列を示す。ま
た、プローブの作成に利用した制限酵素NcoＩによる切
断部位も示した。図２は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロ
モーターとしてクローニングした、約3.3kbのDNA断片の
制限酵素地図を示す。図３は、ラットPKC-α型のcDNAの
塩基配列を示す。また、プローブの作成に利用した制限
酵素PstＩによる切断部位も示した。図４は、ラットPKC
-α型遺伝子のプロモーターとしてクローニングした、
約3.1kbのDNA断片の制限酵素地図を示す。図５は、プロ
モーター活性をCATアッセイ法で測定するためのプラス
ミドDNAの構築方法を示す。図６は、各種細胞中での各
プロモーターの活性を、SV40ウイルスの初期プロモータ
ーでの値を100％として、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター alpha：ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター gamma：ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター 図７は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩
基配列を示す。図８は、その上側に、ラットPKC-γ型遺
伝子のプロモーター領域の制限酵素地図を示し、その下
方に、作成した各種欠失変異プロモーターの長さを示し
た。図９は、図８で示した各種欠失変異と、塩基配列と
の関係を示した。図１０は、各種欠失変異プロモーター
の、ラットの初代培養中枢神経細胞中での転写活性を、
SV40ウイルスの初期プロモーターでの値を100％とし
て、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター complete及びAからFは、図８に示した各プロモーターで
ある。図１１は、各種欠失変異プロモーターの、アスト
ログリア細胞、及び、NRK細胞中での転写活性を、SV40
ウイルスの初期プロモーターでの値を100％として、棒
グラフで示した。各プロモーターの表記は、図１０と同
じである。図１２は、ラットPKC-α型遺伝子のプロモー
ター領域の塩基配列を示す。
た、プローブの作成に利用した制限酵素NcoＩによる切
断部位も示した。図２は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロ
モーターとしてクローニングした、約3.3kbのDNA断片の
制限酵素地図を示す。図３は、ラットPKC-α型のcDNAの
塩基配列を示す。また、プローブの作成に利用した制限
酵素PstＩによる切断部位も示した。図４は、ラットPKC
-α型遺伝子のプロモーターとしてクローニングした、
約3.1kbのDNA断片の制限酵素地図を示す。図５は、プロ
モーター活性をCATアッセイ法で測定するためのプラス
ミドDNAの構築方法を示す。図６は、各種細胞中での各
プロモーターの活性を、SV40ウイルスの初期プロモータ
ーでの値を100％として、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター alpha：ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター gamma：ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター 図７は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩
基配列を示す。図８は、その上側に、ラットPKC-γ型遺
伝子のプロモーター領域の制限酵素地図を示し、その下
方に、作成した各種欠失変異プロモーターの長さを示し
た。図９は、図８で示した各種欠失変異と、塩基配列と
の関係を示した。図１０は、各種欠失変異プロモーター
の、ラットの初代培養中枢神経細胞中での転写活性を、
SV40ウイルスの初期プロモーターでの値を100％とし
て、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター complete及びAからFは、図８に示した各プロモーターで
ある。図１１は、各種欠失変異プロモーターの、アスト
ログリア細胞、及び、NRK細胞中での転写活性を、SV40
ウイルスの初期プロモーターでの値を100％として、棒
グラフで示した。各プロモーターの表記は、図１０と同
じである。図１２は、ラットPKC-α型遺伝子のプロモー
ター領域の塩基配列を示す。
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２７７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラット 配列 GGTGTGGGAG CCAAGATAAC AGACTGGAAT GTATTTGGGA GAAAGGGGGT GGACAAGGCT 60 TGGAGGACGT CCCCTCCTTG CATAGAGCCT GCGGAATGGG AGTGTGCACG TGGAGAGGAG 120 GGAGGGGCAA CTGTCCGGGA TTCTTGGGGG TGGGGGGACG CCTTTAAACT GAAACCCCGC 180 CCCTTGGTCG TCATGGCAAC GCCTACCCCC ACCCCCGACT TCTACATTTC AGCAGGTGCG 240 GATAGCGGAG CTCCCGCCGC CGCCCGTGCC TGCGGCT 277 配列番号：２ 配列の長さ：４１４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラット 配列 GAGCGCCAGA CGACGGAAGA GAGGAGGAGA AAAAAAAGAG GGAGGAGCAG AGGAAAAGGG 60 AGGAAAAGAA CGGGCGGTGG AGGAGAAGGA CCGCCCCCTC TCGGCTTCTT CCTGGGCTGG 120 GCATCTCCAG GGCCTCTCCC TGACCGCCGC CCTCCGGTGG TTGGCCCGGC TCACAAGGGC 180 CCCCCACCCA GTACGCGTGT CCAGCTCGGT GCAGAGCAGC GCAGCTCAGA GGCCCTAGGC 240 TCGCCCCGCG CGCGTCCCCG CCCCGCGCGC TCCTACTCCA GTCCGCGCGC GCGCGTGCAC 300 ACATACATAC GCTAGCTCTC CGGGCATGCG CAGTGGGCGG CGCCGCTCCG GGCCGCCTCT 360 TGCTGCCGCG AGTAGGAAGC GCGAGCGCCA GGCGCCGGGC TGTCAGTGAG CGTG 414 配列番号：３ 配列の長さ：３０２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：cDNA 起源：ラットＰＫＣ−γ 配列 TGCTTTCTGC CCTGCGCTGC GCACCGTTAG TGCCCTGCCC CTGTCCTTCC GATCTCAGAG 60 TCTGCGGAGT GCCCCTATCG CCGTCCACCT GTTTCCTCAG AAAAAAGGCC AGCTCGTGAT 120 CCCTGCTGCG TTCCTGGGGC CATGGCGGGT CTGGGTCCTG GCGGGGGCGA CTCAGAAGGG 180 ＮｃｏＩ GGACCCCGAC CCCTGTTTTG CAGAAAGGGG GCGCTGAGGC AGAAGGTGGT CCACGAGGTG 240 AAGAGCCACA AGTTCACCGC TCGTTTCTTC AAGCAGCCAA CCTTCTGCAG TCACTGTACC 300 GACTTCATCT GGGGCATTGG AAAGCAGGGC CTGCAATGTC AAGTCTGCAG CTTTGTGGTT 360 CACCGCCGAT GCCACGAATT TGTGACCTTC GAGTGTCCAG GCGCTGGAAA GGGCCCCCAG 420 ACGGACGACC CTCGCAACAA GCACAAGTTC CGTCTGCACA GCTACAGCAG TCCCACCTTC 480 TGCGACCACT GTGGTTCCCT CCTCTACGGG CTGGTGCACC AGGGCATGAA ATGTTCCTGT 540 TGCGAAATGA ATGTGCACCG ACGCTGTGTG CGCAGCGTGC CCTCCCTTTG CGGCGTGGAC 600 CATACAGAGC GCCGTGGACG TCTGCAACTG GAAATCCGGG CTCCCACATC AGATGAGATC 660 CATATTACTG TGGGTGAGGC CCGGAACCTC ATTCCTATGG ACCCCAATGG CCTGTCTGAT 720 CCCTATGTGA AACTGAAGCT CATCCCGGAC CCTCGGAACC TGACAAAACA GAAGACAAAG 780 ACCGTGAAAG CCACACTGAA TCCCGTGTGG AACGAGACCT TCGTGTTCAA CCTGAAGCCG 840 GGGGATGTGG AGCGCCGGCT CAGTGTGGAG GTGTGGGATT GGGATAGGAC ATCCCGAAAT 900 GACTTCATGG GTGCCATGTC CTTTGGTGTC TCAGAGCTAC TCAAGGCTCC TGTGGATGGA 960 TGGTACAAGT TACTGAACCA GGAGGAGGGC GAGTATTACA ATGTACCGGT GGCCGATGCT 1020 GACAACTGCA GCCTCCTCCA GAAGTTTGAG GCCTGTAATT ACCCCTTGGA ATTGTATGAG 1080 AGAGTGCGGA TGGGCCCCTC TTCCTCTCCC ATTCCTTCTC CATCCCCCAG TCCCACGGAC 1140 TCCAAGAGAT GCTTCTTCGG TGCCAGCCCA GGACGCCTGC ATATCTCTGA CTTCAGCTTC 1200 CTCATGGTTC TAGGGAAAGG CAGTTTTGGG AAGGTGATGC TGGCAGAGCG CAGAGGATCC 1260 GATGAACTCT ATGCCATCAA GATACTGAAA AAAGACGTCA TTGTCCAGGA TGATGATGTA 1320 GACTGCACCC TTGTGGAGAA GCGTGTGCTG GCATTGGGAG GCCGAGGTCC TGGAGGCCGG 1380 CCACACTTTC TCACACAACT TCATTCCACC TTTCAGACTC CGGACCGCCT GTATTTTGTG 1420 ATGGAGTACG TCACTGGGGG CGATTTAATG TACCACATTC AGCAACTGGG CAAGTTTAAG 1500 GAGCCCCACG CAGCATTCTA TGCCGCGGAA ATCGCCATAG GCCTCTTCTT CCTTCACAAC 1560 CAGGGCATCA TCTACAGGGA CCTCAAGTTG GATAATGTGA TGCTGGATGC TGAAGGACAC 1620 ATCAAGATCA CAGACTTCGG CATGTGTAAA GAGAATGTCT TCCCTGGGTC CACAACCCGC 1680 ACCTTCTGTG GGACCCCAGA CTACATAGCA CCTGAGATCA TTGCCTATCA GCCCTATGGG 1740 AAGTCTGTCG ACTGGTGGTC CTTTGGAGTC CTGCTGTATG AGATGTTGGC AGGACAGCCA 1800 CCCTTTGATG GGGAAGATGA GGAGGAGCTG TTTCAAGCCA TCATGGAACA AACTGTCACC 1860 TATCCCAAGT CACTTTCCCG GGAAGCTGTG GCCATCTGCA AGGGGTTCCT GACCAAGCAC 1920 CCAGGAAAGC GCCTGGGCTC AGGGCCAGAT GGGGAACCCA CCATCCGGGC TCATGGCTTT 1980 TTCCGTTGGA TCGATTGGGA GAGGTTGGAG AGACTGGAAA TTGCGCCTCC TTTTAGACCA 2040 CGTCCGTGTG GCCGCAGCGG CGAAAACTTT GACAAGTTCT TCACGCGGGC AGCGCCAGCC 2100 TTGACCCCGC CAGACCGCTT GGTCCTAGCC AGCATCGACC AAGCTGATTT CCAGGGCTTT 2160 ACTTATGTGA ACCCGGACTT CGTGCACCCA GATGCCCGCA GCCCCACAAG CCCTGTGCCT 2220 GTGCCCGTCA TGTAATCTCA TCTGCTGCCG CTAGGTGTTC CCAGTGCTCC CTCCGCCAAG 2280 TTGGCTGTAA CTCCCATCCA CCCCCATCCC CGCCTCTAGT CCGAATTTTA GGTCTCTTAA 2340 ACCACCCAAC CTTCTGGCCT CTTTCACGCG CCCCAAGTGG GTTCTAGACG CTGTTCCCCA 2400 GCATTGCTGG CATTTTAAAC TTCAAACAGT CTCTAGAGCC TTTCTGTGTT CTAGATTCGT 2460 TGTGCTGAGC CCTGGTTTTT CCCCACCCCC AACATCTGGA TGCTGTTCCA ACTCTTCCCA 2520 GAAACCCCAC TCCGTGTGGG GTTCTAGACT CTATCTTGGT AGTTTTATGC CTTCTCTCTC 2580 CCTAGACCAC GTTGGGAGAA ATAGTCTCAT GAGATTGCCT GCTCCAGACT AAGATTCCAG 2640 ATCAGCTCTC TGCATCCTTC AAGGCCCCTC CTACCTCCAC TTCAGTTGTA GAATTAAGTG 2700 GGAGGCTGGG CTCCGTGTTC CAGGCCACCT CCCTTCCATG TTCTGGGGAT TCCTGGCATG 2760 CACGGAGGAT TCTCTCCCCG ACTTTTCTCA GTCAGCTTTT GTTCTAGATT TGTTCCAGAA 2820 CCCTTCACTG CTCACCTGCC CCGTGCATGG CTCCAGCCTT GGTCGGAATC ACACACACAC 2860 ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCTTGTC CTCCGCAGTG 2940 CCTGCCACTT TCTGGGACTT TCTCATCCCC CACGCCCTTC CTTTATCCTC TCCCACCCAG 3000 ACACAGCTGC TGGAGAATAA ATTTG ３０
２５ 配列番号：４ 配列の長さ：３３０５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：ラットＰＫＣ−α 配列 GGGCCAGCCA GAGAGCGAGA GAGCCGGAGA GAGCCAGAGA GAGCCAGAGA GAGCGGCTCA 60 GCTCCCAGCT CCAAGCAGCG CAGCGCCCGC CCGGCTCTCC CCGGCCACCG CCGCCACCAC 120 CGCTACCTCA GCACCGCCAC CTCGGCCGCC GCCCCCGCCC ACCCCGGCCC TCCCCGGCTG 180 CTGCTCCCCG GCGGAGGCAA GAGGTGGTTG GGGGGGACCA TGGCTGACGT TTACCCGGCC 240 AACGACTCCA CGGCGTCTCA GGACGTGGCC AACCGCTTCG CCCGCAAAGG GGCGCTGAGG 300 CAGAAGAACG TGCATGAGGT GAAAGACCAC AAATTCATCG CCCGCTTCTT CAAGCAACCC 360 ACCTTCTGCA GCCACTGCAC CGACTTCATC TGGGGGTTTG GAAAACAAGG CTTCCAGTGC 420 PstI CAAGTTTGCT GTTTTGTGGT TCACAAGAGG TGCCATGAGT TTGTTACTTT CTCTTGTCCG 480 GGTGCGGATA AGGGACCTGA CACTGATGAC CCCAGAAGCA AGCACAAGTT CAAAATCCAC 540 ACCTATGGAA GCCCTACCTT CTGTGATCAC TGTGGGTCCC TGCTCTACGG ACTTATCCAC 600 CAAGGGATGA AATGCGACAC CTGCGACATG AATGTTCACA AGCAGTGCGT GATCAATGTC 660 CCCAGCCTCT GCGGAATGGA TCACACAGAG AAGAGGGGGC GGATTTACCT GAAGGCAGAG 720 GTCACAGATG AAAAGCTGCA CGTCACCGTA CGAGATGCAA AAAATCTAAT CCCTATGGAT 780 CCAAATGGGC TTTCGGATCC TTACGTGAAG CTGAAACTTA TTCCTGACCC CAAGAATGAG 840 AGCAAACAGA AAACCAAAAC CATCCGATCC ACACTGAACC CTCAGTGGAA TGAGTCCTTC 900 ACGTTCAAAT TAAAACCTTC AGACAAAGAC CGGCGACTGT CCGTAGAAAT CTGGGACTGG 960 GATCGGACGA CACGGAATGA CTTCATGGGC TCCCTTTCCT TCGGCGTCTC AGAGCTGATG 1020 AAGATGCCAG CCAGTGGATG GTACAAGTTG CTCAACCAAG AGGAGGGTGA ATACTACAAT 1080 GTGCCCATTC CAGAAGGAGA TGAAGAAGGC AACGTGGAAC TCAGGCAGAA GTTCGAGAAA 1140 GCCAAGCTGG GCCCCGCTGG AAACAAAGTC ATCAGCCCTT CAGAAGACAG GAAGCAGCCA 1200 TCTAACAACC TGGACAGGGT GAAACTCACA GACTTCAACT TCCTCATGGT GCTGGGGAAG 1260 GGGAGTTTTG GAAAGGTGAT GCTTGCTGAC AGGAAGGGAA CAGAGGAACT GTACGCCATC 1320 AAAATCCTGA AGAAGGACGT GGTGATCCAG GATGACGACG TGGAGTGCAC CATGGTGGAG 1380 AAGCGGGTTC TGGCCCTGCT CGACAAGCCC CCGTTCCTGA CACAGCTGCA CTCCTGCTTC 1440 CAGACAGTGG ACCGGCTGTA CTTCGTCATG GAATACGTCA ACGGTGGGGA CCTCATGTAC 1500 CACATTCAGC AAGTCGGAAA ATTTAAGGAG CCACAAGCAG TATTCTATGC AGCCGAGATC 1560 TCCATCGGAC TGTTCTTTCT TCACAAAAGA GGAATCATTT ACAGGGATCT GAAGCTGGAC 1620 AACGTCATGC TGGACTCAGA AGGGCATATC AAAATCGCCG ACTTCGGGAT GTGCAAGGAA 1680 CACATGATGG ACGGGGTCAC GACCAGGACC TTCTGTGGGA CTCCGGATTA CATTGCCCCA 1740 GAGATAATCG CTTACCAGCC ATATGGAAAG TCTGTGGACT GGTGGGCGTA CGGCGTGCTC 1800 CTGTATGAGA TGCTAGCTGG GCAGCCTCCG TTCGATGGCG AAGACGAAGA TGAACTGTTT 1860 CAGTCTATAA TGGAGCACAA TGTGTCCTAC CCCAAATCCT TGTCCAAGGA AGCTGTCTCC 1920 ATCTGCAAAG GGCTTATGAC CAAACACCCT GCCAAGCGGC TGGGCTGCGG GCCCGAGGGG 1980 GAAAGGGATG TCAGAGAGCA TGCCTTCTTT AGGAGGATCG ACTGGGAGAA GTTGGAGAAC 2040 AGGGAGATCC AACCGCCATT CAAGCCCAAA GTGTGCGGCA AAGGAGCAGA AAACTTTGAC 2100 AAGTTCTTCA CACGAGGGCA GCCTGTCTTA ACACCACCAG ATCAGCTGGT CATCGCTAAC 2160 ATAGACCAGT CTGATTTTGA AGGGTTCTCG TATGTCAACC CCCAGTTTGT GCACCCAATC 2220 TTGCAAAGTG CAGTATGAAA CTCAGAAACA AAAGATCTAA TGCCTCCCTA GCCCCCAATC 2280 TCCCCAGCAG TTGGGAAGTG ATTCTTAACC ATAAAATTTT AAGGCTATAG CCTTGTATTT 2340 TGTTCCACAC AGAGGCCTGA AAATTCTGGG GATATTAGTC CATAAGTGAT CAACTTTCTT 2400 CCCCCACCCA ATCCCAAACC AAAAAACATT ATCTTAGTGG ATGATGACAT AATATACAGA 2460 GTATAGTTTA ATTATGTAGA AGTCACATCT GGCTTCAAGT TAATTCTTTC TTAGGAAACA 2520 AAGAGACTTG GACCCTATTT TTTGGTACGA TTTAATATAT TCTCCATACC TTTCATATTT 2580 TGGATTTTCA CTATCCAAAT CACCAGAGAT AATAAAGTGA ACCCACCTGA ACTCAAGGGA 2640 TGGAAACATT TCTGCCCAAG ATATCTTTGG AATTAAAGAA CAGGAAGCCC AAACAGAAAA 2700 CAAAGAGAGG CAGAGTCTCA TATATTCAAG ACCTCGTTGC TTCTATTTTC TGCTTCAATG 2760 GAAACAGTCC CTAGAGTCTG AGAGGGCAGG ATGAACCTGA TCACTGTTCC CAATCATCAT 2820 AGCACAACCA TAGTGCATAG TTTGAAAATG AAAGAAAACT TCAGACAGAT GTTCGTTGAA 2880 TCTATCATAT GTACTCCCCT GCTCGGTTGA TAACTATCTC GATAACTCAT TCTTTTTAAG 2940 AGGCCAAAAT CATCTAAGGA CTTTGCTAAA CAAACATGTG AAATCATTTC AGATCAAGGA 3000 TAAACCATGT GTATGTTCAT TTTAATCTCT GGGAGATGAC TCTTCAATCC AGGGTGCCAT 3060 CAGTAATCAT GCCACTGTTC ACGAGTGTTG TTAGCCAACC CCCCGCCACA TAATAATATT 3120 TTGCTACCTT TGTGGGTACC CTTCCTAGGA AGCTAAAATG TATGCCCCAT CCCCTTTTGT 3180 ACTACTTATT TAATAAGCCG CAGTGTCGTT TATGAAAGTA CAATGTATAG TAACTTAATC 3240 AAAAGTACTG ACTAGCATCA GTCCCTATAG GTTGATTTTC CTCCTTTCTC TAGCCCCACA 3300 TCCAC 3305 配列番号：５ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γ プロモーター領域 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1702 配列番号：６ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γの各種欠失変異プロモーター 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 Ａ AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 Ｂ CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 Ｃ GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 Ｄ GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 Ｅ AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1632
２５ 配列番号：４ 配列の長さ：３３０５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源：ラットＰＫＣ−α 配列 GGGCCAGCCA GAGAGCGAGA GAGCCGGAGA GAGCCAGAGA GAGCCAGAGA GAGCGGCTCA 60 GCTCCCAGCT CCAAGCAGCG CAGCGCCCGC CCGGCTCTCC CCGGCCACCG CCGCCACCAC 120 CGCTACCTCA GCACCGCCAC CTCGGCCGCC GCCCCCGCCC ACCCCGGCCC TCCCCGGCTG 180 CTGCTCCCCG GCGGAGGCAA GAGGTGGTTG GGGGGGACCA TGGCTGACGT TTACCCGGCC 240 AACGACTCCA CGGCGTCTCA GGACGTGGCC AACCGCTTCG CCCGCAAAGG GGCGCTGAGG 300 CAGAAGAACG TGCATGAGGT GAAAGACCAC AAATTCATCG CCCGCTTCTT CAAGCAACCC 360 ACCTTCTGCA GCCACTGCAC CGACTTCATC TGGGGGTTTG GAAAACAAGG CTTCCAGTGC 420 PstI CAAGTTTGCT GTTTTGTGGT TCACAAGAGG TGCCATGAGT TTGTTACTTT CTCTTGTCCG 480 GGTGCGGATA AGGGACCTGA CACTGATGAC CCCAGAAGCA AGCACAAGTT CAAAATCCAC 540 ACCTATGGAA GCCCTACCTT CTGTGATCAC TGTGGGTCCC TGCTCTACGG ACTTATCCAC 600 CAAGGGATGA AATGCGACAC CTGCGACATG AATGTTCACA AGCAGTGCGT GATCAATGTC 660 CCCAGCCTCT GCGGAATGGA TCACACAGAG AAGAGGGGGC GGATTTACCT GAAGGCAGAG 720 GTCACAGATG AAAAGCTGCA CGTCACCGTA CGAGATGCAA AAAATCTAAT CCCTATGGAT 780 CCAAATGGGC TTTCGGATCC TTACGTGAAG CTGAAACTTA TTCCTGACCC CAAGAATGAG 840 AGCAAACAGA AAACCAAAAC CATCCGATCC ACACTGAACC CTCAGTGGAA TGAGTCCTTC 900 ACGTTCAAAT TAAAACCTTC AGACAAAGAC CGGCGACTGT CCGTAGAAAT CTGGGACTGG 960 GATCGGACGA CACGGAATGA CTTCATGGGC TCCCTTTCCT TCGGCGTCTC AGAGCTGATG 1020 AAGATGCCAG CCAGTGGATG GTACAAGTTG CTCAACCAAG AGGAGGGTGA ATACTACAAT 1080 GTGCCCATTC CAGAAGGAGA TGAAGAAGGC AACGTGGAAC TCAGGCAGAA GTTCGAGAAA 1140 GCCAAGCTGG GCCCCGCTGG AAACAAAGTC ATCAGCCCTT CAGAAGACAG GAAGCAGCCA 1200 TCTAACAACC TGGACAGGGT GAAACTCACA GACTTCAACT TCCTCATGGT GCTGGGGAAG 1260 GGGAGTTTTG GAAAGGTGAT GCTTGCTGAC AGGAAGGGAA CAGAGGAACT GTACGCCATC 1320 AAAATCCTGA AGAAGGACGT GGTGATCCAG GATGACGACG TGGAGTGCAC CATGGTGGAG 1380 AAGCGGGTTC TGGCCCTGCT CGACAAGCCC CCGTTCCTGA CACAGCTGCA CTCCTGCTTC 1440 CAGACAGTGG ACCGGCTGTA CTTCGTCATG GAATACGTCA ACGGTGGGGA CCTCATGTAC 1500 CACATTCAGC AAGTCGGAAA ATTTAAGGAG CCACAAGCAG TATTCTATGC AGCCGAGATC 1560 TCCATCGGAC TGTTCTTTCT TCACAAAAGA GGAATCATTT ACAGGGATCT GAAGCTGGAC 1620 AACGTCATGC TGGACTCAGA AGGGCATATC AAAATCGCCG ACTTCGGGAT GTGCAAGGAA 1680 CACATGATGG ACGGGGTCAC GACCAGGACC TTCTGTGGGA CTCCGGATTA CATTGCCCCA 1740 GAGATAATCG CTTACCAGCC ATATGGAAAG TCTGTGGACT GGTGGGCGTA CGGCGTGCTC 1800 CTGTATGAGA TGCTAGCTGG GCAGCCTCCG TTCGATGGCG AAGACGAAGA TGAACTGTTT 1860 CAGTCTATAA TGGAGCACAA TGTGTCCTAC CCCAAATCCT TGTCCAAGGA AGCTGTCTCC 1920 ATCTGCAAAG GGCTTATGAC CAAACACCCT GCCAAGCGGC TGGGCTGCGG GCCCGAGGGG 1980 GAAAGGGATG TCAGAGAGCA TGCCTTCTTT AGGAGGATCG ACTGGGAGAA GTTGGAGAAC 2040 AGGGAGATCC AACCGCCATT CAAGCCCAAA GTGTGCGGCA AAGGAGCAGA AAACTTTGAC 2100 AAGTTCTTCA CACGAGGGCA GCCTGTCTTA ACACCACCAG ATCAGCTGGT CATCGCTAAC 2160 ATAGACCAGT CTGATTTTGA AGGGTTCTCG TATGTCAACC CCCAGTTTGT GCACCCAATC 2220 TTGCAAAGTG CAGTATGAAA CTCAGAAACA AAAGATCTAA TGCCTCCCTA GCCCCCAATC 2280 TCCCCAGCAG TTGGGAAGTG ATTCTTAACC ATAAAATTTT AAGGCTATAG CCTTGTATTT 2340 TGTTCCACAC AGAGGCCTGA AAATTCTGGG GATATTAGTC CATAAGTGAT CAACTTTCTT 2400 CCCCCACCCA ATCCCAAACC AAAAAACATT ATCTTAGTGG ATGATGACAT AATATACAGA 2460 GTATAGTTTA ATTATGTAGA AGTCACATCT GGCTTCAAGT TAATTCTTTC TTAGGAAACA 2520 AAGAGACTTG GACCCTATTT TTTGGTACGA TTTAATATAT TCTCCATACC TTTCATATTT 2580 TGGATTTTCA CTATCCAAAT CACCAGAGAT AATAAAGTGA ACCCACCTGA ACTCAAGGGA 2640 TGGAAACATT TCTGCCCAAG ATATCTTTGG AATTAAAGAA CAGGAAGCCC AAACAGAAAA 2700 CAAAGAGAGG CAGAGTCTCA TATATTCAAG ACCTCGTTGC TTCTATTTTC TGCTTCAATG 2760 GAAACAGTCC CTAGAGTCTG AGAGGGCAGG ATGAACCTGA TCACTGTTCC CAATCATCAT 2820 AGCACAACCA TAGTGCATAG TTTGAAAATG AAAGAAAACT TCAGACAGAT GTTCGTTGAA 2880 TCTATCATAT GTACTCCCCT GCTCGGTTGA TAACTATCTC GATAACTCAT TCTTTTTAAG 2940 AGGCCAAAAT CATCTAAGGA CTTTGCTAAA CAAACATGTG AAATCATTTC AGATCAAGGA 3000 TAAACCATGT GTATGTTCAT TTTAATCTCT GGGAGATGAC TCTTCAATCC AGGGTGCCAT 3060 CAGTAATCAT GCCACTGTTC ACGAGTGTTG TTAGCCAACC CCCCGCCACA TAATAATATT 3120 TTGCTACCTT TGTGGGTACC CTTCCTAGGA AGCTAAAATG TATGCCCCAT CCCCTTTTGT 3180 ACTACTTATT TAATAAGCCG CAGTGTCGTT TATGAAAGTA CAATGTATAG TAACTTAATC 3240 AAAAGTACTG ACTAGCATCA GTCCCTATAG GTTGATTTTC CTCCTTTCTC TAGCCCCACA 3300 TCCAC 3305 配列番号：５ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γ プロモーター領域 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1702 配列番号：６ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γの各種欠失変異プロモーター 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 Ａ AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 Ｂ CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 Ｃ GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 Ｄ GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 Ｅ AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1632
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年８月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組織特異的な発現用プロ
モーターおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本
発明は蛋白リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）遺伝子のプロモー
ター領域を含有する組換えＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡおよび形質転換体に関する。
モーターおよびその用途に関する。さらに詳しくは、本
発明は蛋白リン酸化酵素Ｃ（ＰＫＣ）遺伝子のプロモー
ター領域を含有する組換えＤＮＡ、当該ＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡおよび形質転換体に関する。
【０００２】
【従来の技術】動物、特に高等動物では、その発生の時
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなるる。器官特異的に発
現し、作用している蛋白質の遺伝子にはその器官でのみ
作動する転写誘導系（プロモーター、エンハンサー）が
あって、このプロモーター部分が蛋白質合成を指令する
mRNAの転写を制御している。さらにプロモーターにはホ
ルモン依存性や、増殖因子依存性を示すものも知られて
おり、これらを利用したトランスジェニックマウスが既
に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能の解
析に利用されている。
期より各種器官の分化、成熟がおこり生体の各種機能を
発揮せしめるようになる。この過程で種々の器官特異的
な蛋白質の一過性の、あるいは恒常的な発現がおこり、
器官に特異性を付与することとなるる。器官特異的に発
現し、作用している蛋白質の遺伝子にはその器官でのみ
作動する転写誘導系（プロモーター、エンハンサー）が
あって、このプロモーター部分が蛋白質合成を指令する
mRNAの転写を制御している。さらにプロモーターにはホ
ルモン依存性や、増殖因子依存性を示すものも知られて
おり、これらを利用したトランスジェニックマウスが既
に作成されて、薬物のスクリーニングや、生体機能の解
析に利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする問題点】従って、特定の器官
でのみ作動するプロモーター部分を使って、その下流に
種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを卵に
注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入
動物）を作成すれば、特定の目標とした器官でのみその
蛋白を合成させ、その生体での作用を検討することも可
能となる。しかし大部分の遺伝子の転写を指令するプロ
モーターには明確な組織特異性は検出されず、特異性を
示すプロモーターが渇望されている。
でのみ作動するプロモーター部分を使って、その下流に
種々の蛋白質をコードする遺伝子を連結し、これを卵に
注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入
動物）を作成すれば、特定の目標とした器官でのみその
蛋白を合成させ、その生体での作用を検討することも可
能となる。しかし大部分の遺伝子の転写を指令するプロ
モーターには明確な組織特異性は検出されず、特異性を
示すプロモーターが渇望されている。
【０００４】一方、PKCは細胞の情報伝達機構において
重要な役割を担っている酵素である。PKCはカルシウム
の存在下にジアシルグリセロールによって活性化され、
この活性化されたPKCによる細胞内蛋白質のリン酸化反
応が種々の細胞機能の活性化や細胞増殖をもたらすと考
えられている。PKCには少くとも７種のサブタイプ(α、
β-1、β-2、γ、δ、ε、ξ)が知られている〔Nishizu
ka,Y. ネイチャー(Nature)334,661-665(1988)〕。ラッ
トでは、このうち、α、βサブタイプは広い範囲の組織
に見出されるが、γサブタイプは脳にのみ局在している
ことがわかった。特に脳内の海馬領域に多く見出されて
いる。脳には脳血液関門があり、高分子物質は容易には
脳内に入りこむことは少い。従ってCキナーゼγは脳で
のみ合成、蓄積されていると考えられ、PKC-γ遺伝子の
プロモーターは脳内の細胞系でのみ作動するものと考え
られる。
重要な役割を担っている酵素である。PKCはカルシウム
の存在下にジアシルグリセロールによって活性化され、
この活性化されたPKCによる細胞内蛋白質のリン酸化反
応が種々の細胞機能の活性化や細胞増殖をもたらすと考
えられている。PKCには少くとも７種のサブタイプ(α、
β-1、β-2、γ、δ、ε、ξ)が知られている〔Nishizu
ka,Y. ネイチャー(Nature)334,661-665(1988)〕。ラッ
トでは、このうち、α、βサブタイプは広い範囲の組織
に見出されるが、γサブタイプは脳にのみ局在している
ことがわかった。特に脳内の海馬領域に多く見出されて
いる。脳には脳血液関門があり、高分子物質は容易には
脳内に入りこむことは少い。従ってCキナーゼγは脳で
のみ合成、蓄積されていると考えられ、PKC-γ遺伝子の
プロモーターは脳内の細胞系でのみ作動するものと考え
られる。
【０００５】また、PKC-α遺伝子のプロモーターはユニ
バーサルに働くものとして活用され得る。中枢神経系は
神経管から分化した神経細胞（ニューロン）および神経
膠細胞より構成され、複雑な機能を営む細胞社会と言え
る。この神経系で特異的に機能しかつ、他の細胞系で機
能しないプロモーターは機能分化のための神経特異蛋白
質の発現調節機構を解析するための手段として有用であ
る。また、種々の遺伝子を下流に連結させて細胞あるい
は動物に移入することにより、それらを神経系細胞ある
いは脳で特異的に発現させることが出来る。
バーサルに働くものとして活用され得る。中枢神経系は
神経管から分化した神経細胞（ニューロン）および神経
膠細胞より構成され、複雑な機能を営む細胞社会と言え
る。この神経系で特異的に機能しかつ、他の細胞系で機
能しないプロモーターは機能分化のための神経特異蛋白
質の発現調節機構を解析するための手段として有用であ
る。また、種々の遺伝子を下流に連結させて細胞あるい
は動物に移入することにより、それらを神経系細胞ある
いは脳で特異的に発現させることが出来る。
【０００６】
【問題点を解決するための手段】本発明者らは、特定の
器官でのみ作動するプロモーターとして、脳内でのみ作
動するPKC-γ遺伝子のプロモーターを見出し、取り出す
ことを目標とし、ラットPKC-γcDNA断片をプローブとし
て、ラットPKC-γ遺伝子をクローニングした。この遺伝
子を制限酵素消化してPKC-γをコードしている構造遺伝
子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これを再び
プラスミドDNA上にクローニングした。この３kb DNAの
下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェニコー
ルアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプラスミ
ドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細胞ある
いは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を測定す
ることにより、PKC-γ上流部分３kb DNAに、中枢神経細
胞で特異的に作動するプロモーターを見出すことが出来
た。同様に、ラットPKC-α遺伝子をクローニングし、こ
の遺伝子を制限酵素消化してPKC-αをコードしている構
造遺伝子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これ
を再びプラスミドDNA上にクローニングした。この３kb
DNAの下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェ
ニコールアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプ
ラスミドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細
胞あるいは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を
測定することにより、PKC-α上流部分３kb DNAに、中枢
神経細胞のみならず、多くの細胞種で普遍的に作動する
プロモーターを見出すことが出来た。本発明者らは、こ
れらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完
成した。
器官でのみ作動するプロモーターとして、脳内でのみ作
動するPKC-γ遺伝子のプロモーターを見出し、取り出す
ことを目標とし、ラットPKC-γcDNA断片をプローブとし
て、ラットPKC-γ遺伝子をクローニングした。この遺伝
子を制限酵素消化してPKC-γをコードしている構造遺伝
子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これを再び
プラスミドDNA上にクローニングした。この３kb DNAの
下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェニコー
ルアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプラスミ
ドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細胞ある
いは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を測定す
ることにより、PKC-γ上流部分３kb DNAに、中枢神経細
胞で特異的に作動するプロモーターを見出すことが出来
た。同様に、ラットPKC-α遺伝子をクローニングし、こ
の遺伝子を制限酵素消化してPKC-αをコードしている構
造遺伝子の一部を含むその上流部分３kb DNAを得、これ
を再びプラスミドDNA上にクローニングした。この３kb
DNAの下流に、リポーター遺伝子としてのクロラムフェ
ニコールアセチル転移酵素（CAT）遺伝子を連結したプ
ラスミドDNAを構築し、該DNAで形質転換された脳神経細
胞あるいは他の動物細胞等の形質転換体でのCAT活性を
測定することにより、PKC-α上流部分３kb DNAに、中枢
神経細胞のみならず、多くの細胞種で普遍的に作動する
プロモーターを見出すことが出来た。本発明者らは、こ
れらの知見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完
成した。
【０００７】すなわち本発明は（１）蛋白リン酸化酵素
Ｃ遺伝子のプロモーター領域を含有する組換えＤＮＡ、
（２）蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ γで
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（３）蛋白リン酸化酵
素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃαである上記１記載の組換え
ＤＮＡ、（４）プロモーター領域がラット由来のもので
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（５）プロモーター領
域が次の塩基配列： GGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC GTGCCTGCGG CT を含有あるいはその一部で表わされる、上記２記載の組
換えＤＮＡ、（６）プロモーター領域が次の塩基配列： GAGCGCCAGA CGACGGAAGA GAGGAGGAGA AAAAAAAGAG GGAGGAGCAG AGGAAAAGGG AGGAAAAGAA CGGGCGGTGG AGGAGAAGGA CCGCCCCCTC TCGGCTTCTT CCTGGGCTGG GCATCTCCAG GGCCTCTCCC TGACCGCCGC CCTCCGGTGG TTGGCCCGGC TCACAAGGGC CCCCCACCCA GTACGCGTGT CCAGCTCGGT GCAGAGCAGC GCAGCTCAGA GGCCCTAGGC TCGCCCCGCG CGCGTCCCCG CCCCGCGCGC TCCTACTCCA GTCCGCGCGC GCGCGTGCAC ACATACATAC GCTAGCTCTC CGGGCATGCG CAGTGGGCGG CGCCGCTCCG GGCCGCCTCT TGCTGCCGCG AGTAGGAAGC GCGAGCGCCA GGCGCCGGGC TGTCAGTGAG CGTG を含有あるいはその一部で表わされる、上記３記載のＤ
ＮＡ、（７）上記１記載の組換えＤＮＡを含有する組換
えベクター、（８）下流に構造遺伝子を連結している上
記７記載の組換えベクター、（９）請求項７または８記
載のベクターを保持する形質転換体に関するものであ
る。
Ｃ遺伝子のプロモーター領域を含有する組換えＤＮＡ、
（２）蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ γで
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（３）蛋白リン酸化酵
素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃαである上記１記載の組換え
ＤＮＡ、（４）プロモーター領域がラット由来のもので
ある上記１記載の組換えＤＮＡ、（５）プロモーター領
域が次の塩基配列： GGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC GTGCCTGCGG CT を含有あるいはその一部で表わされる、上記２記載の組
換えＤＮＡ、（６）プロモーター領域が次の塩基配列： GAGCGCCAGA CGACGGAAGA GAGGAGGAGA AAAAAAAGAG GGAGGAGCAG AGGAAAAGGG AGGAAAAGAA CGGGCGGTGG AGGAGAAGGA CCGCCCCCTC TCGGCTTCTT CCTGGGCTGG GCATCTCCAG GGCCTCTCCC TGACCGCCGC CCTCCGGTGG TTGGCCCGGC TCACAAGGGC CCCCCACCCA GTACGCGTGT CCAGCTCGGT GCAGAGCAGC GCAGCTCAGA GGCCCTAGGC TCGCCCCGCG CGCGTCCCCG CCCCGCGCGC TCCTACTCCA GTCCGCGCGC GCGCGTGCAC ACATACATAC GCTAGCTCTC CGGGCATGCG CAGTGGGCGG CGCCGCTCCG GGCCGCCTCT TGCTGCCGCG AGTAGGAAGC GCGAGCGCCA GGCGCCGGGC TGTCAGTGAG CGTG を含有あるいはその一部で表わされる、上記３記載のＤ
ＮＡ、（７）上記１記載の組換えＤＮＡを含有する組換
えベクター、（８）下流に構造遺伝子を連結している上
記７記載の組換えベクター、（９）請求項７または８記
載のベクターを保持する形質転換体に関するものであ
る。
【０００８】本発明のＰＫＣ遺伝子プロモーターを種々
の組み換え用ベクターに組み込み、その下流に任意の構
造遺伝子を挿入し、さらにこのDNAを用いて形質転換体
を作成することにより、該構造遺伝子を神経細胞でのみ
発現させることができる。プロモーターを組み込む組み
換え用ベクターとしては、たとえばpCDベクター、cDM8
ベクター〔Aruffo, AとSeed,B.,プロシージングス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sci, USA), 84,8573-8577(1987)）,レトロウ
ィルスベクター(Cone,R.D.とMulligan,R.C.,プロシージ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci, USA),81, 6349-6353(198
4)〕など動物細胞用のものを含め、pBR、pUCなどいかな
るプラスミドであっても用いられ得る。形質転換体の宿
主としては、動物細胞、特に脳神経系の細胞が用いられ
得る。PKC α遺伝子プロモーターについては公知の多く
の動物細胞株も用いられる。また動物個体へのDNA移入
への一過程としての卵細胞、あるいはES細胞〔Evans,
M.J.とKaufman, K.H., ネイチャー(Nature),292, 154(1
981)〕も使用される。これらの細胞の形質転換の方法と
しては、リン酸カルシウム法〔Grahamら、ヴィロロジー
(Virology) 52, 456(1973)〕、エレクトロポレーション
法〔石崎ら、細胞工学, 5, 557(1986)〕、マイクロイン
ジェクション法などが用いられる。
の組み換え用ベクターに組み込み、その下流に任意の構
造遺伝子を挿入し、さらにこのDNAを用いて形質転換体
を作成することにより、該構造遺伝子を神経細胞でのみ
発現させることができる。プロモーターを組み込む組み
換え用ベクターとしては、たとえばpCDベクター、cDM8
ベクター〔Aruffo, AとSeed,B.,プロシージングス オブ
ザ ナショナルアカデミー オブ サイエンス(Proc. Nat
l. Acad. Sci, USA), 84,8573-8577(1987)）,レトロウ
ィルスベクター(Cone,R.D.とMulligan,R.C.,プロシージ
ングス オブ ザ ナショナル アカデミー オブ サイエン
ス(Proc. Natl. Acad. Sci, USA),81, 6349-6353(198
4)〕など動物細胞用のものを含め、pBR、pUCなどいかな
るプラスミドであっても用いられ得る。形質転換体の宿
主としては、動物細胞、特に脳神経系の細胞が用いられ
得る。PKC α遺伝子プロモーターについては公知の多く
の動物細胞株も用いられる。また動物個体へのDNA移入
への一過程としての卵細胞、あるいはES細胞〔Evans,
M.J.とKaufman, K.H., ネイチャー(Nature),292, 154(1
981)〕も使用される。これらの細胞の形質転換の方法と
しては、リン酸カルシウム法〔Grahamら、ヴィロロジー
(Virology) 52, 456(1973)〕、エレクトロポレーション
法〔石崎ら、細胞工学, 5, 557(1986)〕、マイクロイン
ジェクション法などが用いられる。
【０００９】これらの方法で得られた形質転換体はそれ
自体公知の方法で培養する。培地としては、たとえば約
５〜20％の牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)
122, 501(1952)〕, DMEM培地〔ヴィロロジー(Virolog
y) 8, 396(1959)〕、RPMI 1640培地〔ザ ジャーナル オ
ブ ジ アメリカン メディカル アソシエーション(TheJo
urnal of Medical Association) 199, 519(1967)〕、19
9培地〔プロシージング オブ ザ ソサイエティ フォー
ザ バイオロジカル メディスン(Proceeding of the Soc
iety for the Biological Medicine) 73, 1(1950)〕な
どが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は強常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応
じて通気や攪拌を加える。これらの方法により、任意の
構造遺伝子を本発明のPKC γ遺伝子プロモーターを用い
た場合には脳神経細胞で特異的に発現させることが可能
となり、本発明のPKC α遺伝子プロモーターを用いた場
合には多くの細胞種で普遍的に発現させることが可能と
なる。
自体公知の方法で培養する。培地としては、たとえば約
５〜20％の牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science)
122, 501(1952)〕, DMEM培地〔ヴィロロジー(Virolog
y) 8, 396(1959)〕、RPMI 1640培地〔ザ ジャーナル オ
ブ ジ アメリカン メディカル アソシエーション(TheJo
urnal of Medical Association) 199, 519(1967)〕、19
9培地〔プロシージング オブ ザ ソサイエティ フォー
ザ バイオロジカル メディスン(Proceeding of the Soc
iety for the Biological Medicine) 73, 1(1950)〕な
どが挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。
培養は強常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応
じて通気や攪拌を加える。これらの方法により、任意の
構造遺伝子を本発明のPKC γ遺伝子プロモーターを用い
た場合には脳神経細胞で特異的に発現させることが可能
となり、本発明のPKC α遺伝子プロモーターを用いた場
合には多くの細胞種で普遍的に発現させることが可能と
なる。
【００１０】本発明のPKCプロモーターを用いた発現用
プラスミドは、たとえば以下の様に作製される。ラット
PKC-γcDNAおよびラットPKC-αcDNAはたとえば吉川らの
方法〔フェブスレターズ（FEBS Letters), 217, 227-23
1（1987)〕によりそれぞれ得ることができる。すなわち
蛋白リン酸化酵素C-γあるいは蛋白リン酸化酵素C-αの
アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いて、λgt10ベクターに組み込まれたラッ
ト脳のcDNAライブラリーをスクリーニングする。こうし
て得られたcDNAの最上流域をプローブとして例えばラッ
ト遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このプロ
ーブと反応するλファージのクローンを得る。このファ
ージクローンよりDNAを抽出し、組みこまれているラッ
ト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、cDNAの最上流域
プローブと反応する、例えば制限酵素EcoRＩ消化による
3.3kb DNA断片を、例えばプラスミドPUC118に再クロー
ニングすることが出来る。クローニングしたDNAの塩基
配列を決定し、例えばcDNAの塩基配列と比較検討するこ
とにより遺伝子上の翻訳開始コドンの位置を知ることが
できる。また、ラットmRNAを用いて、例えばSＩマッピ
ング法〔Berk, A. J, とSharp,P. A., セル(Cell), 12,
721, 1977〕を行えば、該遺伝子の転写開始点を知るこ
ともできる。このようにして得た3.3kb DNA断片あるい
は、さらにその５'側上流域を一部欠失させたDNA断片の
下流に、レポーター遺伝子である、たとえばクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）遺伝子を
組みこんだプラスミドを構築して、該DNA断片のプロモ
ーター活性を測定するためのプラスミドとなす〔Gorwan
ら、モレキュラー セルラー バイオロジー(MolecularCe
llular Biology),2, 1044 1982〕。レポーター遺伝子と
してはCAT遺伝子の他に、βガラクトシダーゼ遺伝子が
汎用されているが、他のいかなる構造遺伝子であって
も、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。
プラスミドは、たとえば以下の様に作製される。ラット
PKC-γcDNAおよびラットPKC-αcDNAはたとえば吉川らの
方法〔フェブスレターズ（FEBS Letters), 217, 227-23
1（1987)〕によりそれぞれ得ることができる。すなわち
蛋白リン酸化酵素C-γあるいは蛋白リン酸化酵素C-αの
アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドをプロ
ーブとして用いて、λgt10ベクターに組み込まれたラッ
ト脳のcDNAライブラリーをスクリーニングする。こうし
て得られたcDNAの最上流域をプローブとして例えばラッ
ト遺伝子ライブラリーをスクリーニングして、このプロ
ーブと反応するλファージのクローンを得る。このファ
ージクローンよりDNAを抽出し、組みこまれているラッ
ト遺伝子部分の制限酵素地図を作成し、cDNAの最上流域
プローブと反応する、例えば制限酵素EcoRＩ消化による
3.3kb DNA断片を、例えばプラスミドPUC118に再クロー
ニングすることが出来る。クローニングしたDNAの塩基
配列を決定し、例えばcDNAの塩基配列と比較検討するこ
とにより遺伝子上の翻訳開始コドンの位置を知ることが
できる。また、ラットmRNAを用いて、例えばSＩマッピ
ング法〔Berk, A. J, とSharp,P. A., セル(Cell), 12,
721, 1977〕を行えば、該遺伝子の転写開始点を知るこ
ともできる。このようにして得た3.3kb DNA断片あるい
は、さらにその５'側上流域を一部欠失させたDNA断片の
下流に、レポーター遺伝子である、たとえばクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT）遺伝子を
組みこんだプラスミドを構築して、該DNA断片のプロモ
ーター活性を測定するためのプラスミドとなす〔Gorwan
ら、モレキュラー セルラー バイオロジー(MolecularCe
llular Biology),2, 1044 1982〕。レポーター遺伝子と
してはCAT遺伝子の他に、βガラクトシダーゼ遺伝子が
汎用されているが、他のいかなる構造遺伝子であって
も、その遺伝子産物の検出法があれば使用され得る。
【００１１】このプラスミドを種々の動物細胞、例えば
初代培養神経細胞、グリア細胞、上皮由来細胞あるいは
例えば、3T3、NRK細胞等の株化細胞に、種々の方法、例
えばカルシウムフォスフェート法〔Wigler, Mら、セル
（Cell), 16, 777 1979〕DEAEデキストラン法〔Lopata,
M, Aら、ヌクレイック アシッド リサーチ（NucleicAc
id Res.), 12, 5707 1984), エレクトロポレーション法
（石崎ら、細胞工学５,557 1986）等の方法を用いて導
入する。導入した細胞をその細胞に適合した培地、例え
ば、10％血清を含むMEM培地、あるいは血清を含まないD
ME／F12培地（DMEMとF12培地の等量混合物）等で37℃で
例えば５〜10％のCO2共存下、24〜72時間、望ましくは4
8時間、プラスチックディッシュ上で培養する。培養
後、この細胞をラバーポリスマン等ではがして集め、例
えば凍結融解法、あるいは超音波処理法等で調製した細
胞の抽出液についてCAT活性を測定する。CAT活性は、例
えば14C・クロラムフェニコールへのアセチル基の付加
を、薄層クロマトグラフィー法により測定することによ
り測定される。細胞抽出液中に検出されたCAT活性は細
胞に導入したプラスミドのCAT遺伝子の上流に組みこま
れているプロモーターにより転写が指令されたCAT遺伝
子産物によるものである。従って、導入されたプラスミ
ドに組み込まれているプロモーターの細胞中での活性は
検出されたＣＡＴ活性に比例するものと考えられる。こ
のレポーター遺伝子の発現活性によりプロモーター組織
特異性やその発現に必要な領域を決めることができる。
初代培養神経細胞、グリア細胞、上皮由来細胞あるいは
例えば、3T3、NRK細胞等の株化細胞に、種々の方法、例
えばカルシウムフォスフェート法〔Wigler, Mら、セル
（Cell), 16, 777 1979〕DEAEデキストラン法〔Lopata,
M, Aら、ヌクレイック アシッド リサーチ（NucleicAc
id Res.), 12, 5707 1984), エレクトロポレーション法
（石崎ら、細胞工学５,557 1986）等の方法を用いて導
入する。導入した細胞をその細胞に適合した培地、例え
ば、10％血清を含むMEM培地、あるいは血清を含まないD
ME／F12培地（DMEMとF12培地の等量混合物）等で37℃で
例えば５〜10％のCO2共存下、24〜72時間、望ましくは4
8時間、プラスチックディッシュ上で培養する。培養
後、この細胞をラバーポリスマン等ではがして集め、例
えば凍結融解法、あるいは超音波処理法等で調製した細
胞の抽出液についてCAT活性を測定する。CAT活性は、例
えば14C・クロラムフェニコールへのアセチル基の付加
を、薄層クロマトグラフィー法により測定することによ
り測定される。細胞抽出液中に検出されたCAT活性は細
胞に導入したプラスミドのCAT遺伝子の上流に組みこま
れているプロモーターにより転写が指令されたCAT遺伝
子産物によるものである。従って、導入されたプラスミ
ドに組み込まれているプロモーターの細胞中での活性は
検出されたＣＡＴ活性に比例するものと考えられる。こ
のレポーター遺伝子の発現活性によりプロモーター組織
特異性やその発現に必要な領域を決めることができる。
【００１２】これらの方法を用いて、本発明者らは、Ｐ
ＫＣ−γ構造遺伝子上流3.3ｋb DNA中に脳神経系細胞、
即ち、大脳由来初代培養神経細胞中で作動し、他の非神
経系の細胞、例えば、腎臓由来細胞、グリア細胞等で作
動しないプロモーター活性を見出した。さらに本発明者
らは、3.3kb DNAを上流側から削っていく事により、プ
ロモーター活性を保持した、より短いDNA断片を得るこ
とが出来た。
ＫＣ−γ構造遺伝子上流3.3ｋb DNA中に脳神経系細胞、
即ち、大脳由来初代培養神経細胞中で作動し、他の非神
経系の細胞、例えば、腎臓由来細胞、グリア細胞等で作
動しないプロモーター活性を見出した。さらに本発明者
らは、3.3kb DNAを上流側から削っていく事により、プ
ロモーター活性を保持した、より短いDNA断片を得るこ
とが出来た。
【００１３】
【作用】このプロモーターを用いることにより、脳神経
系の細胞に特異的に、種々の蛋白質を作らせることが可
能となった。この手法により、種々の遺伝子産物の中枢
神経系での機能を知ることができる。例えば、神経細胞
成長因子（NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子（basic FG
F)、酸性線維芽細胞成長因子（acidic FGF）などの神経
栄養因子を始めとする他の成長因子、リンホカインなど
の脳内での機能の検討には極めて有用である。
系の細胞に特異的に、種々の蛋白質を作らせることが可
能となった。この手法により、種々の遺伝子産物の中枢
神経系での機能を知ることができる。例えば、神経細胞
成長因子（NGF)、塩基性線維芽細胞成長因子（basic FG
F)、酸性線維芽細胞成長因子（acidic FGF）などの神経
栄養因子を始めとする他の成長因子、リンホカインなど
の脳内での機能の検討には極めて有用である。
【００１４】また発現させる遺伝子としてmyc，rasをは
じめとした癌遺伝子を選べば、脳神経系に癌をはじめと
する特定の病変をひき起こす事も可能であり、こうして
作られた動物は疾患モデル動物として医薬品開発の有力
な手段となるであろう。さらには、DNA移入による脳の
遺伝的疾患の治療に、また癌抑制遺伝子を移入すること
による脳腫瘍の治療にも道をひらくものである。
じめとした癌遺伝子を選べば、脳神経系に癌をはじめと
する特定の病変をひき起こす事も可能であり、こうして
作られた動物は疾患モデル動物として医薬品開発の有力
な手段となるであろう。さらには、DNA移入による脳の
遺伝的疾患の治療に、また癌抑制遺伝子を移入すること
による脳腫瘍の治療にも道をひらくものである。
【００１５】本発明は脳、神経系の細胞で特異的に作動
する、ラットPKC-γ遺伝子のプロモーターをクローニン
グし、該プロモーターを用いて脳神経系の細胞のみで種
々の遺伝子、例えば成長因子遺伝子をはじめとして癌遺
伝子まで幅広い遺伝子の発現を可能とするものである。
該プロモーターを用いた発現プラスミドを動物に導入
し、DNA導入動物を作製すれば、脳神経系細胞に限定し
て導入DNAによりコードされる産物が発現される動物が
作られ得ることとなる。
する、ラットPKC-γ遺伝子のプロモーターをクローニン
グし、該プロモーターを用いて脳神経系の細胞のみで種
々の遺伝子、例えば成長因子遺伝子をはじめとして癌遺
伝子まで幅広い遺伝子の発現を可能とするものである。
該プロモーターを用いた発現プラスミドを動物に導入
し、DNA導入動物を作製すれば、脳神経系細胞に限定し
て導入DNAによりコードされる産物が発現される動物が
作られ得ることとなる。
【００１６】また神経系をはじめとした多くの細胞種で
作動するラットPKC-α遺伝子のプロモーターをクローニ
ングし、該プロモーターを用いて種々の遺伝子の発現を
可能とした。該プロモーターは多くの細胞種で作動する
が、細胞内では、その転写活性は、PKC-αと同じ制御を
受けることとなる。この性質を利用すれば種々の遺伝子
の産物について、細胞内での産生の制御を行うことも可
能となる。
作動するラットPKC-α遺伝子のプロモーターをクローニ
ングし、該プロモーターを用いて種々の遺伝子の発現を
可能とした。該プロモーターは多くの細胞種で作動する
が、細胞内では、その転写活性は、PKC-αと同じ制御を
受けることとなる。この性質を利用すれば種々の遺伝子
の産物について、細胞内での産生の制御を行うことも可
能となる。
【００１７】後述の実施例３で得られた形質転換体 Esc
herichiacoli ＤＨ１／pTB1105および Escherichia col
i ＤＨ１／pTB1107は財団法人発酵研究所(IFO)および通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にそれ
ぞれ寄託されている。受託日および受託番号を次の表１
に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ Escherichia coli DH1/pTB1105 IFO 14981 FERM BP-2709 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日) Escherichia coli DH1/pTB1107 IFO 14982 FERM BP-2708 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日)
herichiacoli ＤＨ１／pTB1105および Escherichia col
i ＤＨ１／pTB1107は財団法人発酵研究所(IFO)および通
商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FRI)にそれ
ぞれ寄託されている。受託日および受託番号を次の表１
に示す。 表 １ 形質転換体 ＩＦＯ ＦＲＩ Escherichia coli DH1/pTB1105 IFO 14981 FERM BP-2709 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日) Escherichia coli DH1/pTB1107 IFO 14982 FERM BP-2708 (実施例 3) (1989年12月25日)(1989年12月26日)
【００１８】
【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明するが、これにより本発明は何ら限定されるもの
ではない。 参考例１ ラットPKC-γ型のcDNAの単離 吉川らが既に示した方法〔フェブス レターズ (FEBS LE
TTERS), 217, 227-231,(1987)〕すなわち蛋白リン酸化
酵素C-γのアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いて、λgt10ベクターに組み込
まれたラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングす
る。得られたcDNAの塩基配列をジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法〔Messingら、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research)，９，309,(1981)〕
によって決定した。〔Onoら、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research), 16, 5199-5200,
(1988)〕。この塩基配列を図１に示した。
に説明するが、これにより本発明は何ら限定されるもの
ではない。 参考例１ ラットPKC-γ型のcDNAの単離 吉川らが既に示した方法〔フェブス レターズ (FEBS LE
TTERS), 217, 227-231,(1987)〕すなわち蛋白リン酸化
酵素C-γのアミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオ
チドをプローブとして用いて、λgt10ベクターに組み込
まれたラット脳のcDNAライブラリーをスクリーニングす
る。得られたcDNAの塩基配列をジデオキシヌクレオチド
合成鎖停止法〔Messingら、ヌクレイック アシッズ リ
サーチ（Nucleic Acids Research)，９，309,(1981)〕
によって決定した。〔Onoら、ヌクレイック アシッズ
リサーチ（Nucleic Acids Research), 16, 5199-5200,
(1988)〕。この塩基配列を図１に示した。
【００１９】実施例１ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターのクローニングと
制限酵素地図の作成 (1) クローニング 参考例１に記した方法で決定し、図１に塩基配列を示し
たcDNAの最上流域（塩基番号１番からNcoＩ切断部位ま
での144塩基対）のDNA断片を、ニックトランスレーショ
ン法（Maniatisら、モレキュラー クローニング (Molec
ular Cloning),Cold Spring Harbor Laboratory, p109,
1982）により、32P標識し、プローブとした。ラットGe
nomic DNAのライブラリーは、クローンテック社（Clont
ech Laboratories, Inc.)から購入したものを用いた。
このライブラリーは、ラットの肝臓の染色体のDNAを制
限酵素、HaeIIIで部分分解したものをλファージCharon
４Aにクローニングしたものである。このライブラリー
（λファージ）を大腸菌LE392を宿主として、軟寒天プ
レート上に、約１×105クローンずつ、10枚まき、これ
をニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィ
ルター）上に移した後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変
性したファージDNAをフィルター上に乾燥固定した。(Ma
niatisら、同上P320）標識したプローブと、DNAを固定
したフィルターを、標識プローブを含む、５×SSPE(0.9
M NaCl 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4), ５mM ED
TA), 50％ホルミアミド、５×Denhardt's, 0.1％SDS,10
0μｇ/mｌ変性サケ精子DNA溶液10mｌ中で42℃、16時
間、会合反応を行い、反応後、フィルターを2×SSC(１
×SSC＝0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリウム),0.1％
SDS溶液中で室温で30分ずつ２回、１×SSC, 0.1％SDS溶
液中で、68℃で30分ずつ２回洗浄した。洗浄したフィル
ターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロ
ーブと反応するクローンを検索した。この方法により得
られたクローンλRG-γ1よりDavisらの方法（Davisら、
「アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス(Advanc
ed Bacterial Genetics）」，Cold Spring Harbor Labo
ratory 1980）によりファージDNAを抽出した。このDNA
を制限酵素EcoRＩで切断し、先のプローブと反応する約
3.3kbのDNA断片を、プラスミドPUC118〔Vieirら、メソ
ッズ インエンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）, 153, 3（1987）〕のEcoRＩ切断部位にクローニン
グし、プラスミドpTB1094を得た。
制限酵素地図の作成 (1) クローニング 参考例１に記した方法で決定し、図１に塩基配列を示し
たcDNAの最上流域（塩基番号１番からNcoＩ切断部位ま
での144塩基対）のDNA断片を、ニックトランスレーショ
ン法（Maniatisら、モレキュラー クローニング (Molec
ular Cloning),Cold Spring Harbor Laboratory, p109,
1982）により、32P標識し、プローブとした。ラットGe
nomic DNAのライブラリーは、クローンテック社（Clont
ech Laboratories, Inc.)から購入したものを用いた。
このライブラリーは、ラットの肝臓の染色体のDNAを制
限酵素、HaeIIIで部分分解したものをλファージCharon
４Aにクローニングしたものである。このライブラリー
（λファージ）を大腸菌LE392を宿主として、軟寒天プ
レート上に、約１×105クローンずつ、10枚まき、これ
をニトロセルロースフィルター（ミリポア社、HATFフィ
ルター）上に移した後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変
性したファージDNAをフィルター上に乾燥固定した。(Ma
niatisら、同上P320）標識したプローブと、DNAを固定
したフィルターを、標識プローブを含む、５×SSPE(0.9
M NaCl 50mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7.4), ５mM ED
TA), 50％ホルミアミド、５×Denhardt's, 0.1％SDS,10
0μｇ/mｌ変性サケ精子DNA溶液10mｌ中で42℃、16時
間、会合反応を行い、反応後、フィルターを2×SSC(１
×SSC＝0.15M NaCl, 0.015Mクエン酸ナトリウム),0.1％
SDS溶液中で室温で30分ずつ２回、１×SSC, 0.1％SDS溶
液中で、68℃で30分ずつ２回洗浄した。洗浄したフィル
ターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり、プロ
ーブと反応するクローンを検索した。この方法により得
られたクローンλRG-γ1よりDavisらの方法（Davisら、
「アドバンスト・バクテリアル・ジェネティクス(Advanc
ed Bacterial Genetics）」，Cold Spring Harbor Labo
ratory 1980）によりファージDNAを抽出した。このDNA
を制限酵素EcoRＩで切断し、先のプローブと反応する約
3.3kbのDNA断片を、プラスミドPUC118〔Vieirら、メソ
ッズ インエンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y）, 153, 3（1987）〕のEcoRＩ切断部位にクローニン
グし、プラスミドpTB1094を得た。
【００２０】(2) 制限酵素地図の作成 クローニングしたDNA断片を、各種の６塩基認識の制限
酵素で切断し、そのDNAのアガロースゲルでの電気泳動
のパターンから図２に示す、制限酵素地図を作成した。
酵素で切断し、そのDNAのアガロースゲルでの電気泳動
のパターンから図２に示す、制限酵素地図を作成した。
【００２１】実施例２ ラットPKC-α型の遺伝子のプロモーターのクローニング
と制限酵素地図の作成 (1) クローニング ラットPKCα型のcDNA〔Onoら、ヌクレイックアシッズリ
サーチ（Nucleic Acids Research),16, 5199-5200, (19
88)〕の塩基配列を図３に示す。このcDNAの最上流域
（塩基番号１番から、PstＩ切断部位までの370塩基対）
のDNA断片を、実施例１と同じ方法で32P標識し、プロー
ブとした。さらに、実施例１と同じ方法でラットのGeno
mic DNAのライブラリーをスクリーニングした。得られ
たクローンλRGα１より、実施例１と同様にしてファー
ジDNAを抽出した。このDNAを制限酵素HindIIIで切断
し、先のプローブと反応する約３KbのDNA断片を、プラ
スミドPUC119〔Vieirら、メソッズ インエンザイモロジ
ー (Methochs in Enzymology),153, ３(1987)〕HindIII
切断部位にクローニングし、プラスミドpTB1092を得
た。
と制限酵素地図の作成 (1) クローニング ラットPKCα型のcDNA〔Onoら、ヌクレイックアシッズリ
サーチ（Nucleic Acids Research),16, 5199-5200, (19
88)〕の塩基配列を図３に示す。このcDNAの最上流域
（塩基番号１番から、PstＩ切断部位までの370塩基対）
のDNA断片を、実施例１と同じ方法で32P標識し、プロー
ブとした。さらに、実施例１と同じ方法でラットのGeno
mic DNAのライブラリーをスクリーニングした。得られ
たクローンλRGα１より、実施例１と同様にしてファー
ジDNAを抽出した。このDNAを制限酵素HindIIIで切断
し、先のプローブと反応する約３KbのDNA断片を、プラ
スミドPUC119〔Vieirら、メソッズ インエンザイモロジ
ー (Methochs in Enzymology),153, ３(1987)〕HindIII
切断部位にクローニングし、プラスミドpTB1092を得
た。
【００２２】(2) 制限酵素地図の作成 (1)でクローニングしたDNA断片の制限酵素地図を、実施
例１−(2)と同じ方法で作成し、図４に示した。
例１−(2)と同じ方法で作成し、図４に示した。
【００２３】実施例３ 実施例１及び２でクローニングしたDNA断片中に、目的
のプロモーターが存在することを確認するために、CAT
アッセイ法〔Gormanら、モレキュラー アンドセルラー
バイオロジー (Molecular and Cellular Biology), ２,
1044(1982)〕を用いることにし、まず、そのためのプ
ラスミドDNAを構築した。
のプロモーターが存在することを確認するために、CAT
アッセイ法〔Gormanら、モレキュラー アンドセルラー
バイオロジー (Molecular and Cellular Biology), ２,
1044(1982)〕を用いることにし、まず、そのためのプ
ラスミドDNAを構築した。
【００２４】(1) ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図４に示した制限酵素地図のNcoＩ切断部位付近の塩基
配列を決定したところ、この位置が、翻訳開始コドンの
位置であることが明らかとなった。そこでクローニング
した約３kbのDNA断片のうち、これよりも上流の部分
を、CATアッセイ用のプラスミドDNAであるpSVOCAT〔Gor
manら、同上〕のHindIII切断部位に挿入した。構築の方
法を図５に示す。DNA断片を含むプラスミドDNA（pTB109
2）を制限酵素NcoＩで切断し、ヌクレアーゼS１で末端
を平滑にする。この末端をDNAライゲースを用いて再び
結合させる時に、12塩基の長さの合成DNAであるHindIII
リンカー（5'-CCCAAGCTTGGG-3'）を共存させ、このリン
カーをはさみこむことによって、pＴＢ1092のNcoＩ切断
部位をHindIII切断部位に変換したプラスミドpTB1102を
得た。pTB1102を制限酵素HindIIIで切断して得られるDN
A断片のうち、プロモーター領域を含む側の断片を、pSV
OCATのHindIII切断部位に、プロモーターとCAT遺伝子が
同方向になるようにクローニングした。このプラスミド
が目的のものであり、pTB1105と呼ぶ。プラスミドpTB11
05を用いて、E. coli DH1をプロシージングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 69,2110(1972);ジーン(Gene),17, 107(1
982)などに記載の方法に従って形質転換し、形質転換体
E. coli DH1／pTB1105(IFO 14981，FERM BP-2709)を得
た。
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図４に示した制限酵素地図のNcoＩ切断部位付近の塩基
配列を決定したところ、この位置が、翻訳開始コドンの
位置であることが明らかとなった。そこでクローニング
した約３kbのDNA断片のうち、これよりも上流の部分
を、CATアッセイ用のプラスミドDNAであるpSVOCAT〔Gor
manら、同上〕のHindIII切断部位に挿入した。構築の方
法を図５に示す。DNA断片を含むプラスミドDNA（pTB109
2）を制限酵素NcoＩで切断し、ヌクレアーゼS１で末端
を平滑にする。この末端をDNAライゲースを用いて再び
結合させる時に、12塩基の長さの合成DNAであるHindIII
リンカー（5'-CCCAAGCTTGGG-3'）を共存させ、このリン
カーをはさみこむことによって、pＴＢ1092のNcoＩ切断
部位をHindIII切断部位に変換したプラスミドpTB1102を
得た。pTB1102を制限酵素HindIIIで切断して得られるDN
A断片のうち、プロモーター領域を含む側の断片を、pSV
OCATのHindIII切断部位に、プロモーターとCAT遺伝子が
同方向になるようにクローニングした。このプラスミド
が目的のものであり、pTB1105と呼ぶ。プラスミドpTB11
05を用いて、E. coli DH1をプロシージングス オブ ナ
ショナル アカデミー オブ サイエンス(Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 69,2110(1972);ジーン(Gene),17, 107(1
982)などに記載の方法に従って形質転換し、形質転換体
E. coli DH1／pTB1105(IFO 14981，FERM BP-2709)を得
た。
【００２５】(2) ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図２に示した制限酵素地図の、２ヶ所のNcoＩ切断部位
の塩基配列を決定したところ、図のNcoＩ-(1）の位置
が、翻訳開始コドンの位置であることが明らかとなっ
た。そこで、クローニングした約３kbのDNA断片のう
ち、これよりも上流の部分を、CATアッセイ用のプラス
ミドDNAであるpSVOCAT〔Gormanら、同上〕にクローニン
グした。構築の方法を図５に示す。DNA断片を含むプラ
スミドDNA（pTB1094）を制限酵素NcoＩで切断し、実施
例３-(1）と同じ方法で、pTB1094のNcoＩ切断部位をHin
dIII切断部位に変換したプラスミドpTB1103を得た。た
だし、２ヶ所のNcoＩ切断部位の間の約850塩基対のDNA
断片は失われる。プラスミドpTB1103とpSVOCATから、実
施例３-(1）と同様にして、目的のプラスミドpTB1107を
得た。 プラスミドpTB1107を用いて、E. coli DH1をプ
ロシージングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,2110(197
2); ジーン(Gene),17, 107(1982)などに記載の方法に従
って形質転換し、形質転換体E. coli DH1／pTB1107(IFO
14982，FERM BP-2708)を得た。
の活性を測定するためのプラスミドDNAの構築 図２に示した制限酵素地図の、２ヶ所のNcoＩ切断部位
の塩基配列を決定したところ、図のNcoＩ-(1）の位置
が、翻訳開始コドンの位置であることが明らかとなっ
た。そこで、クローニングした約３kbのDNA断片のう
ち、これよりも上流の部分を、CATアッセイ用のプラス
ミドDNAであるpSVOCAT〔Gormanら、同上〕にクローニン
グした。構築の方法を図５に示す。DNA断片を含むプラ
スミドDNA（pTB1094）を制限酵素NcoＩで切断し、実施
例３-(1）と同じ方法で、pTB1094のNcoＩ切断部位をHin
dIII切断部位に変換したプラスミドpTB1103を得た。た
だし、２ヶ所のNcoＩ切断部位の間の約850塩基対のDNA
断片は失われる。プラスミドpTB1103とpSVOCATから、実
施例３-(1）と同様にして、目的のプラスミドpTB1107を
得た。 プラスミドpTB1107を用いて、E. coli DH1をプ
ロシージングス オブ ナショナル アカデミー オブ サ
イエンス(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69,2110(197
2); ジーン(Gene),17, 107(1982)などに記載の方法に従
って形質転換し、形質転換体E. coli DH1／pTB1107(IFO
14982，FERM BP-2708)を得た。
【００２６】実施例４ 培養細胞NRK49F細胞を用いたCATアッセイ NRK49F細胞を、５％炭酸ガスの存在下、37℃で、DMEM培
地（10％牛準胎児血清を含む）を用いて、細胞が培養皿
の約80％の面積を占めるまで培養した。細胞をトリプシ
ンではがして、遠心操作で集めた。この細胞を、PBS
(＋）バッファー（フロウ社製のPBSバッファーに0.1mM
CaCl2と0.1mM MgCl2を加えたもの）に懸濁し、0.8ml
当りに100万個の細胞を含むようにした。この細胞浮遊
液0.8mlと、CATアッセイ用に構築したプラスミドDNA（1
0μｇ）を、電気穿孔法を行なうためのキュベット（バ
イオ・ラッド社製）に加えて、よく混合し、室温で５分
間放置した。バイオラッド社の電気パルス発生器であ
る、ジーン・パルサーを用いて、細胞浮遊液に電気パル
スを与えた。条件は、1200V、25μFに設定した。５分
間、室温で放置した後、全量を直径６ｃｍの培養皿にま
き、元の培地を４ml加えて、５％炭酸ガス存在下、37℃
で48時間培養した。細胞をラバーポリスマンで集めて、
1.5mlの反応チューブに移し、細胞を遠心操作で集め
た。この細胞を50μlの0.25Mのトリス緩衝液（pH7.5）
に懸濁し、ドライアイスを加えたエタノールのバスを用
いて凍結させ、その後、37℃の恒温槽を用いて融解させ
た。この操作を計３回行ない、細胞を破壊した。17,000
ｇで１５分間、４℃で遠心し、上清を分取し別のチュー
ブに移した。各チューブ内の蛋白濃度を、バイオラッド
社のプロテインアッセイキットを用いて測定し、全ての
チューブで、蛋白濃度が同じになるように０．２５Ｍト
リス緩衝液（pH7.5）を加えて調整した。
地（10％牛準胎児血清を含む）を用いて、細胞が培養皿
の約80％の面積を占めるまで培養した。細胞をトリプシ
ンではがして、遠心操作で集めた。この細胞を、PBS
(＋）バッファー（フロウ社製のPBSバッファーに0.1mM
CaCl2と0.1mM MgCl2を加えたもの）に懸濁し、0.8ml
当りに100万個の細胞を含むようにした。この細胞浮遊
液0.8mlと、CATアッセイ用に構築したプラスミドDNA（1
0μｇ）を、電気穿孔法を行なうためのキュベット（バ
イオ・ラッド社製）に加えて、よく混合し、室温で５分
間放置した。バイオラッド社の電気パルス発生器であ
る、ジーン・パルサーを用いて、細胞浮遊液に電気パル
スを与えた。条件は、1200V、25μFに設定した。５分
間、室温で放置した後、全量を直径６ｃｍの培養皿にま
き、元の培地を４ml加えて、５％炭酸ガス存在下、37℃
で48時間培養した。細胞をラバーポリスマンで集めて、
1.5mlの反応チューブに移し、細胞を遠心操作で集め
た。この細胞を50μlの0.25Mのトリス緩衝液（pH7.5）
に懸濁し、ドライアイスを加えたエタノールのバスを用
いて凍結させ、その後、37℃の恒温槽を用いて融解させ
た。この操作を計３回行ない、細胞を破壊した。17,000
ｇで１５分間、４℃で遠心し、上清を分取し別のチュー
ブに移した。各チューブ内の蛋白濃度を、バイオラッド
社のプロテインアッセイキットを用いて測定し、全ての
チューブで、蛋白濃度が同じになるように０．２５Ｍト
リス緩衝液（pH7.5）を加えて調整した。
【００２７】このサンプルを、65℃で５分間保温した
後、35μlをとり、５μlの10mMアセチル・コエンザイム
A（シグマ社製）と、0.5μCiの14C-クロラムフェニコー
ルを加えて混合し、37℃で16時間反応させた。反応後、
４℃の酢酸エチル500μlを加えて、よく混合し、クロラ
ムフェニコールを抽出した。17,000ｇで５分間遠心し、
上層（酢酸エチル層）を別のチューブに移した。酢酸エ
チルを蒸発させた後、再び15μｌの酢酸エチルを加え
て、クロラムフェニコールを溶かした。このうちの、10
μｌを用いて、シリカゲルの薄層クロマトを行なった。
薄層ゲルは、メルク社製（No.5735）を用いた。展開液
は95％クロロホルム；５％メタノールを用いた。展開終
了後、ゲルを乾燥させ、コダック社のフィルム（XAR
５）を用いてオートラジオグラフィーを行なった。現像
後、フィルムの感光している部分に相当する薄層ゲルを
切り取り、シンチレーション液を加えて、液体シンチレ
ーションカウンターで、14Cの量を測定した。この値か
ら、全体の14Cのうち、アセチル化されたクロラムフェ
ニコールのもつ14Cの割合を求めて、CATの酵素の活性と
した。この活性と、CAT遺伝子の上流にクローニングさ
れたプロモーターの活性が、比例すると考える。
後、35μlをとり、５μlの10mMアセチル・コエンザイム
A（シグマ社製）と、0.5μCiの14C-クロラムフェニコー
ルを加えて混合し、37℃で16時間反応させた。反応後、
４℃の酢酸エチル500μlを加えて、よく混合し、クロラ
ムフェニコールを抽出した。17,000ｇで５分間遠心し、
上層（酢酸エチル層）を別のチューブに移した。酢酸エ
チルを蒸発させた後、再び15μｌの酢酸エチルを加え
て、クロラムフェニコールを溶かした。このうちの、10
μｌを用いて、シリカゲルの薄層クロマトを行なった。
薄層ゲルは、メルク社製（No.5735）を用いた。展開液
は95％クロロホルム；５％メタノールを用いた。展開終
了後、ゲルを乾燥させ、コダック社のフィルム（XAR
５）を用いてオートラジオグラフィーを行なった。現像
後、フィルムの感光している部分に相当する薄層ゲルを
切り取り、シンチレーション液を加えて、液体シンチレ
ーションカウンターで、14Cの量を測定した。この値か
ら、全体の14Cのうち、アセチル化されたクロラムフェ
ニコールのもつ14Cの割合を求めて、CATの酵素の活性と
した。この活性と、CAT遺伝子の上流にクローニングさ
れたプロモーターの活性が、比例すると考える。
【００２８】図６に結果を棒グラフにして示した。SV40
ウィルスの初期プロモーターを用いた場合の値を100％
として、その比活性を示した。この図から、ラットPKC-
α型遺伝子のプロモーターが、NRK49F細胞中で、SV40ウ
イルスの初期プロモーターの約２倍の強さで働くことが
わかる。一方、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
は、対照として用いた、プロモーターをもたないプラス
ミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、弱い活性しか示さな
かった。NRK49F細胞は、ラットの腎臓由来の細胞である
ので、先の結果は、α型PKCは全ての組織で観察される
が、γ型PKCは脳でのみ観察されるという事実と、矛盾
しない。
ウィルスの初期プロモーターを用いた場合の値を100％
として、その比活性を示した。この図から、ラットPKC-
α型遺伝子のプロモーターが、NRK49F細胞中で、SV40ウ
イルスの初期プロモーターの約２倍の強さで働くことが
わかる。一方、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター
は、対照として用いた、プロモーターをもたないプラス
ミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、弱い活性しか示さな
かった。NRK49F細胞は、ラットの腎臓由来の細胞である
ので、先の結果は、α型PKCは全ての組織で観察される
が、γ型PKCは脳でのみ観察されるという事実と、矛盾
しない。
【００２９】実施例５ ラットの初代培養中枢神経細胞を用いたCATアッセイ 神経細胞の採取は、畠中と津久井の方法〔ディベロプメ
ント オブ ブレインリサーチ（Develop. Brain Res.）3
0,47-56（1986)〕を若干修正し、以下のように行った。
妊娠20日目のラット（SD系ラット）を断頭、脱血後、70
％エタノールで清毒した。ラットをクリーンベンチ内に
移し、70％エタノールで滅菌した器具を用いて開腹し、
胎児を取りした。胎児の頭部を切り取り、氷冷したHank
s'BSS中におき、胎児の頭部の表皮と骨を取り除き、脳
を取り出した。この脳から大脳だけを選んで集めた。バ
ネバサミで細断後、0.25％トリプシン（Gibco)、および
0.01％ DNaseＩ（シグマ）を含むHanks'BSS ８mｌ中
で、37℃、10分間反応させた。牛準胎児血清0.8mｌを加
えて反応を止め、150ｇで１分間遠心した。沈澱に、４m
ｌの培地（DMEM＋F12＋15mM HEPESバッファーpH7.4）を
加えて、パスツールピペットで緩やかにピペッティング
して、細胞を分散させた後、二重のレンズペーパー（富
士フィルム）を用いてロ過した。約30mｌの細胞浮遊液
とした後、150ｇで５分間遠心して細胞を集め、再び30m
ｌの培地に懸濁した。同じ遠心操作を計３回行ない、細
胞を洗い、PBS(＋）(実施例５に既に示した）10mｌに懸
濁した。細胞の数を計測し、再び遠心して、最終的に0.
8mｌ中に１×106個の細胞が含まれるように、PBS(＋）
に懸濁した。この細胞浮遊液を0.8mｌずつとり、実施例
４と同じ方法で、電気穿孔法を用いて、細胞に実施例４
と同じDNAを導入した。あらかじめシート状に生育させ
たアストログリア細胞の上に、DNAを導入した神経細胞
を生育させた。培地は、先の培地（DMEM＋F12＋HEPES）
に、N2supplement（５μｇ/mｌ insulin, 100μｇ/mｌ
transferrin,100μM putrescine, 20μM progesterone,
30μM sodinm selenite）と、10％牛胎児血清を加えた
ものを用いた。５％炭酸ガス存在下、37℃で72時間培養
後、細胞をラバーポリスマンで集め、実施例４と同じ方
法でCATアッセイを行ない、プロモーターの強さを調べ
た。図６に結果を棒グラフにして示した。値は、SV40ウ
イルスの初期プロモーターに対する比活性である。ラッ
ト PKC-α型遺伝子のプロモーターと、γ型遺伝子のプ
ロモーターは、共に、SV40ウイルスの初期プロモーター
と、ほぼ同じ強さで働いている。この結果は、実施例４
と次に示す実施例６の結果と合わせて、ラットPKC-γ型
遺伝子のプロモーターが、中枢神経細胞で特異的に働く
ことを示している。また、α型PKCが、全ての細胞で検
出されるという事実と矛盾しない。
ント オブ ブレインリサーチ（Develop. Brain Res.）3
0,47-56（1986)〕を若干修正し、以下のように行った。
妊娠20日目のラット（SD系ラット）を断頭、脱血後、70
％エタノールで清毒した。ラットをクリーンベンチ内に
移し、70％エタノールで滅菌した器具を用いて開腹し、
胎児を取りした。胎児の頭部を切り取り、氷冷したHank
s'BSS中におき、胎児の頭部の表皮と骨を取り除き、脳
を取り出した。この脳から大脳だけを選んで集めた。バ
ネバサミで細断後、0.25％トリプシン（Gibco)、および
0.01％ DNaseＩ（シグマ）を含むHanks'BSS ８mｌ中
で、37℃、10分間反応させた。牛準胎児血清0.8mｌを加
えて反応を止め、150ｇで１分間遠心した。沈澱に、４m
ｌの培地（DMEM＋F12＋15mM HEPESバッファーpH7.4）を
加えて、パスツールピペットで緩やかにピペッティング
して、細胞を分散させた後、二重のレンズペーパー（富
士フィルム）を用いてロ過した。約30mｌの細胞浮遊液
とした後、150ｇで５分間遠心して細胞を集め、再び30m
ｌの培地に懸濁した。同じ遠心操作を計３回行ない、細
胞を洗い、PBS(＋）(実施例５に既に示した）10mｌに懸
濁した。細胞の数を計測し、再び遠心して、最終的に0.
8mｌ中に１×106個の細胞が含まれるように、PBS(＋）
に懸濁した。この細胞浮遊液を0.8mｌずつとり、実施例
４と同じ方法で、電気穿孔法を用いて、細胞に実施例４
と同じDNAを導入した。あらかじめシート状に生育させ
たアストログリア細胞の上に、DNAを導入した神経細胞
を生育させた。培地は、先の培地（DMEM＋F12＋HEPES）
に、N2supplement（５μｇ/mｌ insulin, 100μｇ/mｌ
transferrin,100μM putrescine, 20μM progesterone,
30μM sodinm selenite）と、10％牛胎児血清を加えた
ものを用いた。５％炭酸ガス存在下、37℃で72時間培養
後、細胞をラバーポリスマンで集め、実施例４と同じ方
法でCATアッセイを行ない、プロモーターの強さを調べ
た。図６に結果を棒グラフにして示した。値は、SV40ウ
イルスの初期プロモーターに対する比活性である。ラッ
ト PKC-α型遺伝子のプロモーターと、γ型遺伝子のプ
ロモーターは、共に、SV40ウイルスの初期プロモーター
と、ほぼ同じ強さで働いている。この結果は、実施例４
と次に示す実施例６の結果と合わせて、ラットPKC-γ型
遺伝子のプロモーターが、中枢神経細胞で特異的に働く
ことを示している。また、α型PKCが、全ての細胞で検
出されるという事実と矛盾しない。
【００３０】実施例６ アストログリア細胞を用いたCATアッセイ アストログリア細胞は、実施例５と同じ方法で、ラット
胎児の大脳から採取した。レンズペーパーを用いてロ過
した後、DMEMに10％の牛胎児血清を加えたものを培地と
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で培養した。混在する
神経細胞は、この条件では浮遊したままなので、３時間
後に培地で３回洗うことにより、全細胞の95％以上がア
ストログリア細胞となる。この細胞を数回分裂するまで
培養した後、トリプシンを用いて培養皿からはがし、実
施例４に示したのと同じ方法でプラスミドDNAを導入
し、CATアッセイを行なった。図６に結果を棒グラフに
して示した。値はSV40ウイルスの初期プロモーターに対
する比活性である。ラットPKC-α型遺伝子のプロモータ
ーは、対照として用いた、プロモーターをもたないプラ
スミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、有意に高い活性を
示している。一方、γ型遺伝子のプロモーターは、pSVO
CATの場合よりも低い活性しか示さない。この結果は、
γ型遺伝子のプロモーターの、中枢神経細胞で特異的に
働くという性質を、より確かに示している。また、α型
キナーゼが、全ての組織で検出されるという事実とも、
矛盾しない。
胎児の大脳から採取した。レンズペーパーを用いてロ過
した後、DMEMに10％の牛胎児血清を加えたものを培地と
して、５％炭酸ガス存在下、37℃で培養した。混在する
神経細胞は、この条件では浮遊したままなので、３時間
後に培地で３回洗うことにより、全細胞の95％以上がア
ストログリア細胞となる。この細胞を数回分裂するまで
培養した後、トリプシンを用いて培養皿からはがし、実
施例４に示したのと同じ方法でプラスミドDNAを導入
し、CATアッセイを行なった。図６に結果を棒グラフに
して示した。値はSV40ウイルスの初期プロモーターに対
する比活性である。ラットPKC-α型遺伝子のプロモータ
ーは、対照として用いた、プロモーターをもたないプラ
スミドDNA（pSVOCAT）の場合よりも、有意に高い活性を
示している。一方、γ型遺伝子のプロモーターは、pSVO
CATの場合よりも低い活性しか示さない。この結果は、
γ型遺伝子のプロモーターの、中枢神経細胞で特異的に
働くという性質を、より確かに示している。また、α型
キナーゼが、全ての組織で検出されるという事実とも、
矛盾しない。
【００３１】実施例７ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の
決定 実施例１でプラスミドPUC118のEcoRＩ切断部位にクロー
ンニングした約3.3kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配
列〔Onoら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic
Acids Research）16, 5199-5200,(1988), Knoptら、セ
ル（Cell),46,491-502（1986)〕よりも上流側の塩基配
列を決定した。方法は、まずPUC118にクローニングした
DNA断片を、キロシークエンス用ディリーションキット
（宝酒造）を用いて片方の端からけずり、約300bpおき
の欠失変異プラスミドを作成した。PUC118のEcoRＩ切断
部位に、DNA断片を逆の向きにクローニングしたプラス
ミドDNAについても、同様に欠失変異プラスミドを作成
することによって、DNAの両側の鎖の配列を読むことが
できる。
決定 実施例１でプラスミドPUC118のEcoRＩ切断部位にクロー
ンニングした約3.3kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配
列〔Onoら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic
Acids Research）16, 5199-5200,(1988), Knoptら、セ
ル（Cell),46,491-502（1986)〕よりも上流側の塩基配
列を決定した。方法は、まずPUC118にクローニングした
DNA断片を、キロシークエンス用ディリーションキット
（宝酒造）を用いて片方の端からけずり、約300bpおき
の欠失変異プラスミドを作成した。PUC118のEcoRＩ切断
部位に、DNA断片を逆の向きにクローニングしたプラス
ミドDNAについても、同様に欠失変異プラスミドを作成
することによって、DNAの両側の鎖の配列を読むことが
できる。
【００３２】それぞれの欠失変異プラスミドを持つ大腸
菌MV1184に対して、ヘルパーファージKO7を感染させる
ことにより、プラスミドと同じ配列の環状単鎖DNAをも
つM13ファージを得た〔Vieiraら、メソッズ イン エン
ザイモロジー(Metholsin Enzymology) 153, 3 (198
7)〕。これらのファージの単鎖DNAを用いて、塩基配列
をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messing
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ (Nucleic Acids
Research) ９, 309（1981)〕によって決定した。全ての
領域について、両方の鎖の塩基配列を調べた。図７に、
決定した塩基配列を示す。最も下流の271塩基対は、既
に報告されているラットγ型PKCのcDNAの最上流域の配
列（Onoら、ヌカレイック アシッズ リサーチ (Nucleic
Acids Research) 16, 5199-5200, (1988),Knopfら、セ
ル (Cell) 46, 491-502 (1986)〕と完全に一致した。
菌MV1184に対して、ヘルパーファージKO7を感染させる
ことにより、プラスミドと同じ配列の環状単鎖DNAをも
つM13ファージを得た〔Vieiraら、メソッズ イン エン
ザイモロジー(Metholsin Enzymology) 153, 3 (198
7)〕。これらのファージの単鎖DNAを用いて、塩基配列
をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messing
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ (Nucleic Acids
Research) ９, 309（1981)〕によって決定した。全ての
領域について、両方の鎖の塩基配列を調べた。図７に、
決定した塩基配列を示す。最も下流の271塩基対は、既
に報告されているラットγ型PKCのcDNAの最上流域の配
列（Onoら、ヌカレイック アシッズ リサーチ (Nucleic
Acids Research) 16, 5199-5200, (1988),Knopfら、セ
ル (Cell) 46, 491-502 (1986)〕と完全に一致した。
【００３３】実施例８ ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターが、中枢神経細胞
に特異的に働くために必要な領域を調べるために、実施
例３-(2)で構築法を示したプラスミドpTB1107をもとに
して、各種欠失変異プラスミドを構築し、各種細胞でCA
Tアッセイを行なった。 (1) 欠失変異プラスミドの構築 図８の上側に、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターを
含む1.8kbの長さのDNA断片の制限酵素地図を示した。こ
の断片を、CATアッセイ用のプラスミドpSVOCATにクロー
ニングしたものが、プラスミドpTB1107である。DNA断片
の最も上流側に、制限酵素SphＩとSalＩによる切断部位
が存在する。また、この２種類の制限酵素は、pTB1107
を他の部位で切断しない。pTB1107を制限酵素SphＩとSa
lＩで同時に切断し、そのDNAを用いて、実施例７と同じ
方法で、欠失変異プラスミドを作成した。得られた多く
の変異プラスミドの中から、約300塩基対おきの長さの
ものを選び、以後の実験に用いた。各欠失変異プラスミ
ドがもつプロモーター領域を図８の下側に示す。また、
塩基配列との対応を図９に示す。
に特異的に働くために必要な領域を調べるために、実施
例３-(2)で構築法を示したプラスミドpTB1107をもとに
して、各種欠失変異プラスミドを構築し、各種細胞でCA
Tアッセイを行なった。 (1) 欠失変異プラスミドの構築 図８の上側に、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーターを
含む1.8kbの長さのDNA断片の制限酵素地図を示した。こ
の断片を、CATアッセイ用のプラスミドpSVOCATにクロー
ニングしたものが、プラスミドpTB1107である。DNA断片
の最も上流側に、制限酵素SphＩとSalＩによる切断部位
が存在する。また、この２種類の制限酵素は、pTB1107
を他の部位で切断しない。pTB1107を制限酵素SphＩとSa
lＩで同時に切断し、そのDNAを用いて、実施例７と同じ
方法で、欠失変異プラスミドを作成した。得られた多く
の変異プラスミドの中から、約300塩基対おきの長さの
ものを選び、以後の実験に用いた。各欠失変異プラスミ
ドがもつプロモーター領域を図８の下側に示す。また、
塩基配列との対応を図９に示す。
【００３４】(2) 各種欠失変異プラスミドを用いた、ラ
ットの初代培養中枢神経細胞中のCATアッセイ 得られた変異プラスミドと、対照として用いる各プラス
ミドを、ラットの初代培養中枢神経細胞に導入し、CAT
アッセイを行なった。方法は、実施例５と同じである。
図１０に結果を棒グラフにして示す。値は、SV40ウイル
スの初期プロモーターに対する比活性である。この結果
から、上流側からの欠失が大きくなるに従って、プロモ
ーター活性が上昇していることがわかる。このことは、
上流側にプロモーターの働きを抑制する領域があること
を示唆している。また、最も短い領域をもつもの（得ら
れている最長のcDNAの５'端よりも上流の277塩基対をも
つ）でも、プロモーターとして充分働くことがわかる。
ットの初代培養中枢神経細胞中のCATアッセイ 得られた変異プラスミドと、対照として用いる各プラス
ミドを、ラットの初代培養中枢神経細胞に導入し、CAT
アッセイを行なった。方法は、実施例５と同じである。
図１０に結果を棒グラフにして示す。値は、SV40ウイル
スの初期プロモーターに対する比活性である。この結果
から、上流側からの欠失が大きくなるに従って、プロモ
ーター活性が上昇していることがわかる。このことは、
上流側にプロモーターの働きを抑制する領域があること
を示唆している。また、最も短い領域をもつもの（得ら
れている最長のcDNAの５'端よりも上流の277塩基対をも
つ）でも、プロモーターとして充分働くことがわかる。
【００３５】(3) 各種欠失変異プラスミドを用いた、NR
K細胞及び、アストログリア細胞でのCATアッセイ 実施例８-(2)で示したように、各欠失変異プラスミド
は、プロモーター活性を有するが、各変異プラスミドの
活性が、中枢神経細胞に特異的であるかどうかを調べる
ために、NRK細胞とアストログリア細胞でのプロモータ
ー活性を調べた。各プラスミドを細胞へ導入し、CATア
ッセイを行なった。方法は、NRK細胞に関しては実施例
４、アストログリア細胞に関しては実施例６に示したの
と同じ方法で行なった。図１１に結果を棒グラフにして
示す。値は、SV40ウイルスの初期プロモーターに対する
比活性である。この結果から、各欠失変異プラスミド
は、NRK細胞及びアストログリア細胞中で、プロモータ
ー活性をもたないことがわかる。以上の結果から、cDNA
よりも上流の277塩基対のみでも、中枢神経特異的なプ
ロモーターとしての活性を有することがわかる。
K細胞及び、アストログリア細胞でのCATアッセイ 実施例８-(2)で示したように、各欠失変異プラスミド
は、プロモーター活性を有するが、各変異プラスミドの
活性が、中枢神経細胞に特異的であるかどうかを調べる
ために、NRK細胞とアストログリア細胞でのプロモータ
ー活性を調べた。各プラスミドを細胞へ導入し、CATア
ッセイを行なった。方法は、NRK細胞に関しては実施例
４、アストログリア細胞に関しては実施例６に示したの
と同じ方法で行なった。図１１に結果を棒グラフにして
示す。値は、SV40ウイルスの初期プロモーターに対する
比活性である。この結果から、各欠失変異プラスミド
は、NRK細胞及びアストログリア細胞中で、プロモータ
ー活性をもたないことがわかる。以上の結果から、cDNA
よりも上流の277塩基対のみでも、中枢神経特異的なプ
ロモーターとしての活性を有することがわかる。
【００３６】実施例９ ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター領域の塩基配列の
決定実施例２において、プラスミドpUC119にクローニン
グした約３kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配列〔Ono
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids R
esearch 16, 5199-5200(1988)〕よりも上流側の塩基配
列を、414塩基対決定した。方法は、図４に示した制限
酵素地図のNcoＩ切断部位から両側に向って、ジデオキ
シヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messingら、ヌクレイ
ック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research ９,
309(1981)〕で塩基配列を決定した。図１２に決定した
塩基配列を示す。
決定実施例２において、プラスミドpUC119にクローニン
グした約３kbのDNA断片の、公知のcDNAの塩基配列〔Ono
ら、ヌクレイック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids R
esearch 16, 5199-5200(1988)〕よりも上流側の塩基配
列を、414塩基対決定した。方法は、図４に示した制限
酵素地図のNcoＩ切断部位から両側に向って、ジデオキ
シヌクレオチド合成鎖停止法〔J. Messingら、ヌクレイ
ック アシッズ リサーチ(Nucleic Acids Research ９,
309(1981)〕で塩基配列を決定した。図１２に決定した
塩基配列を示す。
【００３７】
【発明の効果】本発明の蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプ
ロモーター領域を含有するＤＮＡは、これを用いること
により、脳神経系の細胞に特異的に種々の蛋白質を作ら
せることが可能となり、これにより種々の遺伝子産物の
中枢神経系での機能を検討することができ、また発現さ
せる遺伝子を選ぶことにより、脳神経系に特定の病変を
引き起こして疾患モデル動物を作ったり、脳内の病気の
治療を行なうことも可能とするものである。
ロモーター領域を含有するＤＮＡは、これを用いること
により、脳神経系の細胞に特異的に種々の蛋白質を作ら
せることが可能となり、これにより種々の遺伝子産物の
中枢神経系での機能を検討することができ、また発現さ
せる遺伝子を選ぶことにより、脳神経系に特定の病変を
引き起こして疾患モデル動物を作ったり、脳内の病気の
治療を行なうことも可能とするものである。
【００３８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２７７ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラット 配列 GGTGTGGGAG CCAAGATAAC AGACTGGAAT GTATTTGGGA GAAAGGGGGT GGACAAGGCT 60 TGGAGGACGT CCCCTCCTTG CATAGAGCCT GCGGAATGGG AGTGTGCACG TGGAGAGGAG 120 GGAGGGGCAA CTGTCCGGGA TTCTTGGGGG TGGGGGGACG CCTTTAAACT GAAACCCCGC 180 CCCTTGGTCG TCATGGCAAC GCCTACCCCC ACCCCCGACT TCTACATTTC AGCAGGTGCG 240 GATAGCGGAG CTCCCGCCGC CGCCCGTGCC TGCGGCT 277
【００３９】配列番号：２ 配列の長さ：４１４ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラット 配列 GAGCGCCAGA CGACGGAAGA GAGGAGGAGA AAAAAAAGAG GGAGGAGCAG AGGAAAAGGG 60 AGGAAAAGAA CGGGCGGTGG AGGAGAAGGA CCGCCCCCTC TCGGCTTCTT CCTGGGCTGG 120 GCATCTCCAG GGCCTCTCCC TGACCGCCGC CCTCCGGTGG TTGGCCCGGC TCACAAGGGC 180 CCCCCACCCA GTACGCGTGT CCAGCTCGGT GCAGAGCAGC GCAGCTCAGA GGCCCTAGGC 240 TCGCCCCGCG CGCGTCCCCG CCCCGCGCGC TCCTACTCCA GTCCGCGCGC GCGCGTGCAC 300 ACATACATAC GCTAGCTCTC CGGGCATGCG CAGTGGGCGG CGCCGCTCCG GGCCGCCTCT 360 TGCTGCCGCG AGTAGGAAGC GCGAGCGCCA GGCGCCGGGC TGTCAGTGAG CGTG 414
【００４０】配列番号：３ 配列の長さ：３０２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：cDNA 起源：ラットＰＫＣ−γ 配列 TGCTTTCTGC CCTGCGCTGC GCACCGTTAG TGCCCTGCCC CTGTCCTTCC GATCTCAGAG 60 TCTGCGGAGT GCCCCTATCG CCGTCCACCT GTTTCCTCAG AAAAAAGGCC AGCTCGTGAT 120 CCCTGCTGCG TTCCTGGGGC CATGGCGGGT CTGGGTCCTG GCGGGGGCGA CTCAGAAGGG 180 NcoI GGACCCCGAC CCCTGTTTTG CAGAAAGGGG GCGCTGAGGC AGAAGGTGGT CCACGAGGTG 240 AAGAGCCACA AGTTCACCGC TCGTTTCTTC AAGCAGCCAA CCTTCTGCAG TCACTGTACC 300 GACTTCATCT GGGGCATTGG AAAGCAGGGC CTGCAATGTC AAGTCTGCAG CTTTGTGGTT 360 CACCGCCGAT GCCACGAATT TGTGACCTTC GAGTGTCCAG GCGCTGGAAA GGGCCCCCAG 420 ACGGACGACC CTCGCAACAA GCACAAGTTC CGTCTGCACA GCTACAGCAG TCCCACCTTC 480 TGCGACCACT GTGGTTCCCT CCTCTACGGG CTGGTGCACC AGGGCATGAA ATGTTCCTGT 540 TGCGAAATGA ATGTGCACCG ACGCTGTGTG CGCAGCGTGC CCTCCCTTTG CGGCGTGGAC 600 CATACAGAGC GCCGTGGACG TCTGCAACTG GAAATCCGGG CTCCCACATC AGATGAGATC 660 CATATTACTG TGGGTGAGGC CCGGAACCTC ATTCCTATGG ACCCCAATGG CCTGTCTGAT 720 CCCTATGTGA AACTGAAGCT CATCCCGGAC CCTCGGAACC TGACAAAACA GAAGACAAAG 780 ACCGTGAAAG CCACACTGAA TCCCGTGTGG AACGAGACCT TCGTGTTCAA CCTGAAGCCG 840 GGGGATGTGG AGCGCCGGCT CAGTGTGGAG GTGTGGGATT GGGATAGGAC ATCCCGAAAT 900 GACTTCATGG GTGCCATGTC CTTTGGTGTC TCAGAGCTAC TCAAGGCTCC TGTGGATGGA 960 TGGTACAAGT TACTGAACCA GGAGGAGGGC GAGTATTACA ATGTACCGGT GGCCGATGCT 1020 GACAACTGCA GCCTCCTCCA GAAGTTTGAG GCCTGTAATT ACCCCTTGGA ATTGTATGAG 1080 AGAGTGCGGA TGGGCCCCTC TTCCTCTCCC ATTCCTTCTC CATCCCCCAG TCCCACGGAC 1140 TCCAAGAGAT GCTTCTTCGG TGCCAGCCCA GGACGCCTGC ATATCTCTGA CTTCAGCTTC 1200 CTCATGGTTC TAGGGAAAGG CAGTTTTGGG AAGGTGATGC TGGCAGAGCG CAGAGGATCC 1260 GATGAACTCT ATGCCATCAA GATACTGAAA AAAGACGTCA TTGTCCAGGA TGATGATGTA 1320 GACTGCACCC TTGTGGAGAA GCGTGTGCTG GCATTGGGAG GCCGAGGTCC TGGAGGCCGG 1380 CCACACTTTC TCACACAACT TCATTCCACC TTTCAGACTC CGGACCGCCT GTATTTTGTG 1420 ATGGAGTACG TCACTGGGGG CGATTTAATG TACCACATTC AGCAACTGGG CAAGTTTAAG 1500 GAGCCCCACG CAGCATTCTA TGCCGCGGAA ATCGCCATAG GCCTCTTCTT CCTTCACAAC 1560 CAGGGCATCA TCTACAGGGA CCTCAAGTTG GATAATGTGA TGCTGGATGC TGAAGGACAC 1620 ATCAAGATCA CAGACTTCGG CATGTGTAAA GAGAATGTCT TCCCTGGGTC CACAACCCGC 1680 ACCTTCTGTG GGACCCCAGA CTACATAGCA CCTGAGATCA TTGCCTATCA GCCCTATGGG 1740 AAGTCTGTCG ACTGGTGGTC CTTTGGAGTC CTGCTGTATG AGATGTTGGC AGGACAGCCA 1800 CCCTTTGATG GGGAAGATGA GGAGGAGCTG TTTCAAGCCA TCATGGAACA AACTGTCACC 1860 TATCCCAAGT CACTTTCCCG GGAAGCTGTG GCCATCTGCA AGGGGTTCCT GACCAAGCAC 1920 CCAGGAAAGC GCCTGGGCTC AGGGCCAGAT GGGGAACCCA CCATCCGGGC TCATGGCTTT 1980 TTCCGTTGGA TCGATTGGGA GAGGTTGGAG AGACTGGAAA TTGCGCCTCC TTTTAGACCA 2040 CGTCCGTGTG GCCGCAGCGG CGAAAACTTT GACAAGTTCT TCACGCGGGC AGCGCCAGCC 2100 TTGACCCCGC CAGACCGCTT GGTCCTAGCC AGCATCGACC AAGCTGATTT CCAGGGCTTT 2160 ACTTATGTGA ACCCGGACTT CGTGCACCCA GATGCCCGCA GCCCCACAAG CCCTGTGCCT 2220 GTGCCCGTCA TGTAATCTCA TCTGCTGCCG CTAGGTGTTC CCAGTGCTCC CTCCGCCAAG 2280 TTGGCTGTAA CTCCCATCCA CCCCCATCCC CGCCTCTAGT CCGAATTTTA GGTCTCTTAA 2340 ACCACCCAAC CTTCTGGCCT CTTTCACGCG CCCCAAGTGG GTTCTAGACG CTGTTCCCCA 2400 GCATTGCTGG CATTTTAAAC TTCAAACAGT CTCTAGAGCC TTTCTGTGTT CTAGATTCGT 2460 TGTGCTGAGC CCTGGTTTTT CCCCACCCCC AACATCTGGA TGCTGTTCCA ACTCTTCCCA 2520 GAAACCCCAC TCCGTGTGGG GTTCTAGACT CTATCTTGGT AGTTTTATGC CTTCTCTCTC 2580 CCTAGACCAC GTTGGGAGAA ATAGTCTCAT GAGATTGCCT GCTCCAGACT AAGATTCCAG 2640 ATCAGCTCTC TGCATCCTTC AAGGCCCCTC CTACCTCCAC TTCAGTTGTA GAATTAAGTG 2700 GGAGGCTGGG CTCCGTGTTC CAGGCCACCT CCCTTCCATG TTCTGGGGAT TCCTGGCATG 2760 CACGGAGGAT TCTCTCCCCG ACTTTTCTCA GTCAGCTTTT GTTCTAGATT TGTTCCAGAA 2820 CCCTTCACTG CTCACCTGCC CCGTGCATGG CTCCAGCCTT GGTCGGAATC ACACACACAC 2860 ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACACACACAC ACCCCTTGTC CTCCGCAGTG 2940 CCTGCCACTT TCTGGGACTT TCTCATCCCC CACGCCCTTC CTTTATCCTC TCCCACCCAG 3000 ACACAGCTGC TGGAGAATAA ATTTG 3025
【００４１】配列番号：４ 配列の長さ：３３０５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 鎖の数：一本鎖 配列の種類：cDNA 起源：ラットＰＫＣ−α 配列 GGGCCAGCCA GAGAGCGAGA GAGCCGGAGA GAGCCAGAGA GAGCCAGAGA GAGCGGCTCA 60 GCTCCCAGCT CCAAGCAGCG CAGCGCCCGC CCGGCTCTCC CCGGCCACCG CCGCCACCAC 120 CGCTACCTCA GCACCGCCAC CTCGGCCGCC GCCCCCGCCC ACCCCGGCCC TCCCCGGCTG 180 CTGCTCCCCG GCGGAGGCAA GAGGTGGTTG GGGGGGACCA TGGCTGACGT TTACCCGGCC 240 AACGACTCCA CGGCGTCTCA GGACGTGGCC AACCGCTTCG CCCGCAAAGG GGCGCTGAGG 300 CAGAAGAACG TGCATGAGGT GAAAGACCAC AAATTCATCG CCCGCTTCTT CAAGCAACCC 360 ACCTTCTGCA GCCACTGCAC CGACTTCATC TGGGGGTTTG GAAAACAAGG CTTCCAGTGC 420 PstI CAAGTTTGCT GTTTTGTGGT TCACAAGAGG TGCCATGAGT TTGTTACTTT CTCTTGTCCG 480 GGTGCGGATA AGGGACCTGA CACTGATGAC CCCAGAAGCA AGCACAAGTT CAAAATCCAC 540 ACCTATGGAA GCCCTACCTT CTGTGATCAC TGTGGGTCCC TGCTCTACGG ACTTATCCAC 600 CAAGGGATGA AATGCGACAC CTGCGACATG AATGTTCACA AGCAGTGCGT GATCAATGTC 660 CCCAGCCTCT GCGGAATGGA TCACACAGAG AAGAGGGGGC GGATTTACCT GAAGGCAGAG 720 GTCACAGATG AAAAGCTGCA CGTCACCGTA CGAGATGCAA AAAATCTAAT CCCTATGGAT 780 CCAAATGGGC TTTCGGATCC TTACGTGAAG CTGAAACTTA TTCCTGACCC CAAGAATGAG 840 AGCAAACAGA AAACCAAAAC CATCCGATCC ACACTGAACC CTCAGTGGAA TGAGTCCTTC 900 ACGTTCAAAT TAAAACCTTC AGACAAAGAC CGGCGACTGT CCGTAGAAAT CTGGGACTGG 960 GATCGGACGA CACGGAATGA CTTCATGGGC TCCCTTTCCT TCGGCGTCTC AGAGCTGATG 1020 AAGATGCCAG CCAGTGGATG GTACAAGTTG CTCAACCAAG AGGAGGGTGA ATACTACAAT 1080 GTGCCCATTC CAGAAGGAGA TGAAGAAGGC AACGTGGAAC TCAGGCAGAA GTTCGAGAAA 1140 GCCAAGCTGG GCCCCGCTGG AAACAAAGTC ATCAGCCCTT CAGAAGACAG GAAGCAGCCA 1200 TCTAACAACC TGGACAGGGT GAAACTCACA GACTTCAACT TCCTCATGGT GCTGGGGAAG 1260 GGGAGTTTTG GAAAGGTGAT GCTTGCTGAC AGGAAGGGAA CAGAGGAACT GTACGCCATC 1320 AAAATCCTGA AGAAGGACGT GGTGATCCAG GATGACGACG TGGAGTGCAC CATGGTGGAG 1380 AAGCGGGTTC TGGCCCTGCT CGACAAGCCC CCGTTCCTGA CACAGCTGCA CTCCTGCTTC 1440 CAGACAGTGG ACCGGCTGTA CTTCGTCATG GAATACGTCA ACGGTGGGGA CCTCATGTAC 1500 CACATTCAGC AAGTCGGAAA ATTTAAGGAG CCACAAGCAG TATTCTATGC AGCCGAGATC 1560 TCCATCGGAC TGTTCTTTCT TCACAAAAGA GGAATCATTT ACAGGGATCT GAAGCTGGAC 1620 AACGTCATGC TGGACTCAGA AGGGCATATC AAAATCGCCG ACTTCGGGAT GTGCAAGGAA 1680 CACATGATGG ACGGGGTCAC GACCAGGACC TTCTGTGGGA CTCCGGATTA CATTGCCCCA 1740 GAGATAATCG CTTACCAGCC ATATGGAAAG TCTGTGGACT GGTGGGCGTA CGGCGTGCTC 1800 CTGTATGAGA TGCTAGCTGG GCAGCCTCCG TTCGATGGCG AAGACGAAGA TGAACTGTTT 1860 CAGTCTATAA TGGAGCACAA TGTGTCCTAC CCCAAATCCT TGTCCAAGGA AGCTGTCTCC 1920 ATCTGCAAAG GGCTTATGAC CAAACACCCT GCCAAGCGGC TGGGCTGCGG GCCCGAGGGG 1980 GAAAGGGATG TCAGAGAGCA TGCCTTCTTT AGGAGGATCG ACTGGGAGAA GTTGGAGAAC 2040 AGGGAGATCC AACCGCCATT CAAGCCCAAA GTGTGCGGCA AAGGAGCAGA AAACTTTGAC 2100 AAGTTCTTCA CACGAGGGCA GCCTGTCTTA ACACCACCAG ATCAGCTGGT CATCGCTAAC 2160 ATAGACCAGT CTGATTTTGA AGGGTTCTCG TATGTCAACC CCCAGTTTGT GCACCCAATC 2220 TTGCAAAGTG CAGTATGAAA CTCAGAAACA AAAGATCTAA TGCCTCCCTA GCCCCCAATC 2280 TCCCCAGCAG TTGGGAAGTG ATTCTTAACC ATAAAATTTT AAGGCTATAG CCTTGTATTT 2340 TGTTCCACAC AGAGGCCTGA AAATTCTGGG GATATTAGTC CATAAGTGAT CAACTTTCTT 2400 CCCCCACCCA ATCCCAAACC AAAAAACATT ATCTTAGTGG ATGATGACAT AATATACAGA 2460 GTATAGTTTA ATTATGTAGA AGTCACATCT GGCTTCAAGT TAATTCTTTC TTAGGAAACA 2520 AAGAGACTTG GACCCTATTT TTTGGTACGA TTTAATATAT TCTCCATACC TTTCATATTT 2580 TGGATTTTCA CTATCCAAAT CACCAGAGAT AATAAAGTGA ACCCACCTGA ACTCAAGGGA 2640 TGGAAACATT TCTGCCCAAG ATATCTTTGG AATTAAAGAA CAGGAAGCCC AAACAGAAAA 2700 CAAAGAGAGG CAGAGTCTCA TATATTCAAG ACCTCGTTGC TTCTATTTTC TGCTTCAATG 2760 GAAACAGTCC CTAGAGTCTG AGAGGGCAGG ATGAACCTGA TCACTGTTCC CAATCATCAT 2820 AGCACAACCA TAGTGCATAG TTTGAAAATG AAAGAAAACT TCAGACAGAT GTTCGTTGAA 2880 TCTATCATAT GTACTCCCCT GCTCGGTTGA TAACTATCTC GATAACTCAT TCTTTTTAAG 2940 AGGCCAAAAT CATCTAAGGA CTTTGCTAAA CAAACATGTG AAATCATTTC AGATCAAGGA 3000 TAAACCATGT GTATGTTCAT TTTAATCTCT GGGAGATGAC TCTTCAATCC AGGGTGCCAT 3060 CAGTAATCAT GCCACTGTTC ACGAGTGTTG TTAGCCAACC CCCCGCCACA TAATAATATT 3120 TTGCTACCTT TGTGGGTACC CTTCCTAGGA AGCTAAAATG TATGCCCCAT CCCCTTTTGT 3180 ACTACTTATT TAATAAGCCG CAGTGTCGTT TATGAAAGTA CAATGTATAG TAACTTAATC 3240 AAAAGTACTG ACTAGCATCA GTCCCTATAG GTTGATTTTC CTCCTTTCTC TAGCCCCACA 3300 TCCAC 3305
【００４２】配列番号：５ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γ プロモーター領域 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1702
【００４３】配列番号：６ 配列の長さ：１６３２ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源：ラットＰＫＣ−γの各種欠失変異プロモーター 配列 CAGACGACCT CAGAAAACCG CAAAGACTGA ACAGACACCC GCATCACCGG AGCGGCCAGC 60 CTGATGCGCA TTGCACGTCG GGAGCAGTAG TTCTCCGTTG CGTTCCAAGA ATAGAGTACA 120 CGAGGGCCCC AACTATAAGT CCCAGAGTGC ACTGAGCTTG ACAGCCTCTG GCGGGCCACA 180 GCTCCCCAGA ACGGCTTCCT GCCAGAATGG ACCCATAGGA GGGCTGGAAC TGGGAGAAAG 240 GCGCATGGTG GGGCGTGACC TGGGGGAGGA ACTCAAGAGA GGAAACCTGG GCGTGTGCGT 300 Ａ AGGAAATCCC AGAGTGAGAC TGAGTTGGGA GAACGCTCCA GGTGGAGAGT CACAAGGAAA 360 Ｂ CACGAGAGAC GACACCCAAG ACAAAGTCAT AGGGAAATCC AGAGACAAGA AAGACTCAGG 420 TATAGTCAGT CATAGGGAGA TATGGAGGGA CGAGGCCCTC AGAGATGGAG AGTTACCGGG 480 AGACATGGAT AAAGGAGAGA CCGCCAGAGA TGGAGAGCCA TAGGGAGAGA CAGTAGAGAG 540 AACACCCGAG ACGGAGTCAC GGGGAGGCAA ATGAGAAAGA AAGAGAGAGA GAGAGAGACG 600 ACTAAGAGGG GACAATACAA GGAGTCACCT AGGAGGGTCG AGATTCCCCT GAAGACAGTT 660 CCAAGGAGAC ACCGACAAGG GTCGATATTC CTCCAGAGAC AGTCATTGGG AGACAAGGAA 720 Ｃ GGAGAAGAGA CCACTAGAGA CAGAGTCACA AGGAATGGAG ATGAACCCGC AGAAATAAAG 780 AGGGTCACAG GGCCAAAAGG ATAAACTCTG AATGGGTCAG AGAGAAAAGG ACAGAAAGGA 840 CAAGGTGATT ATTCAGAGAG AGCACCCCCT TGCGACAGAA AAGGGAGAAA TACAGAAGCA 900 Ｄ GGGAGTGACG GACGTCGGGA AACGCTGAAT TAATAGGCAA AGGTGAACGC AGATTAGGGA 960 AGACCGGGAA AGGCTGGAAG ATGAAAACGA AAACATTTCC AGTACACCAT GTGGGGCGTG 1020 AGGAGAGACG TGAGCAAGAA AAGGAAAGAA GCAGAGAGGG GGGAAATGGA GAGAGTAAAT 1080 Ｅ AGGAGAGAAG AGAGGAAAAG AGAGACAAGA GAAGGCAGAG AAAGAGACAC ACCCAGAGGG 1140 AGGCATGGCA CCAAGCCCAG AGGCTGTAAG AGCGATAAAG AGCCCGAAGC ATCACGGAGA 1200 ATGAGACATT AGCCTCCGCG GTCATCAGAA AGTCCTCAGC ACTGAAGACA AAGTTTCTTG 1260 ATTAAAAGAG TAATATGTCC AGAGACACAC AGGTCTACCC CAGATCCTAG ATTCTGGCAA 1320 GACCCACACA AGCGGCTGAG TCGAGGAGGA AGATGGGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT 1380 GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG 1440 AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT 1500 GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA 1560 CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC 1620 GTGCCTGCGG CT −−→ｃＤＮＡ 1632
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】 図１は、ラットＰＫＣ−γ型のcDNAの塩基配列を示す。
また、プローブの作成に利用した制限酵素NcoＩによる
切断部位も示した。図２は、ラットPKC-γ型遺伝子のプ
ロモーターとしてクローニングした、約3.3kbのDNA断片
の制限酵素地図を示す。図３は、ラットPKC-α型のcDNA
の塩基配列を示す。また、プローブの作成に利用した制
限酵素PstＩによる切断部位も示した。図４は、ラットP
KC-α型遺伝子のプロモーターとしてクローニングし
た、約3.1kbのDNA断片の制限酵素地図を示す。図５は、
プロモーター活性をCATアッセイ法で測定するためのプ
ラスミドDNAの構築方法を示す。図６は、各種細胞中で
の各プロモーターの活性を、SV40ウイルスの初期プロモ
ーターでの値を100％として、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター alpha：ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター gamma：ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター 図７は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩
基配列を示す。図８は、その上側に、ラットPKC-γ型遺
伝子のプロモーター領域の制限酵素地図を示し、その下
方に、作成した各種欠失変異プロモーターの長さを示し
た。図９は、図８で示した各種欠失変異と、塩基配列と
の関係を示した。図１０は、各種欠失変異プロモーター
の、ラットの初代培養中枢神経細胞中での転写活性を、
SV40ウイルスの初期プロモーターでの値を100％とし
て、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター complete及びAからFは、図８に示した各プロモーターで
ある。図１１は、各種欠失変異プロモーターの、アスト
ログリア細胞、及び、NRK細胞中での転写活性を、SV40
ウイルスの初期プロモーターでの値を100％として、棒
グラフで示した。各プロモーターの表記は、図１０と同
じである。図１２は、ラットPKC-α型遺伝子のプロモー
ター領域の塩基配列を示す。
また、プローブの作成に利用した制限酵素NcoＩによる
切断部位も示した。図２は、ラットPKC-γ型遺伝子のプ
ロモーターとしてクローニングした、約3.3kbのDNA断片
の制限酵素地図を示す。図３は、ラットPKC-α型のcDNA
の塩基配列を示す。また、プローブの作成に利用した制
限酵素PstＩによる切断部位も示した。図４は、ラットP
KC-α型遺伝子のプロモーターとしてクローニングし
た、約3.1kbのDNA断片の制限酵素地図を示す。図５は、
プロモーター活性をCATアッセイ法で測定するためのプ
ラスミドDNAの構築方法を示す。図６は、各種細胞中で
の各プロモーターの活性を、SV40ウイルスの初期プロモ
ーターでの値を100％として、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター alpha：ラットPKC-α型遺伝子のプロモーター gamma：ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター 図７は、ラットPKC-γ型遺伝子のプロモーター領域の塩
基配列を示す。図８は、その上側に、ラットPKC-γ型遺
伝子のプロモーター領域の制限酵素地図を示し、その下
方に、作成した各種欠失変異プロモーターの長さを示し
た。図９は、図８で示した各種欠失変異と、塩基配列と
の関係を示した。図１０は、各種欠失変異プロモーター
の、ラットの初代培養中枢神経細胞中での転写活性を、
SV40ウイルスの初期プロモーターでの値を100％とし
て、棒グラフで示した。 −DNA ：DNAを加えずに、CATアッセイを行なったもの SVO ：プロモーターを持たないもの SV2 ：SV40ウイルスの初期プロモーター complete及びAからFは、図８に示した各プロモーターで
ある。図１１は、各種欠失変異プロモーターの、アスト
ログリア細胞、及び、NRK細胞中での転写活性を、SV40
ウイルスの初期プロモーターでの値を100％として、棒
グラフで示した。各プロモーターの表記は、図１０と同
じである。図１２は、ラットPKC-α型遺伝子のプロモー
ター領域の塩基配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 48/00 8314−4Ｃ
Claims (9)
- 【請求項１】蛋白リン酸化酵素Ｃ遺伝子のプロモーター
領域を含有する組換えＤＮＡ。 - 【請求項２】蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ
γである請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項３】蛋白リン酸化酵素Ｃが蛋白リン酸化酵素Ｃ
αである請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】プロモーター領域がラット由来のものであ
る請求項１記載の組換えＤＮＡ。 - 【請求項５】プロモーター領域が次の塩基配列： GGTGT GGGAGCCAAG ATAACAGACT GGAATGTATT TGGGAGAAAG GGGGTGGACA AGGCTTGGAG GACGTCCCCT CCTTGCATAG AGCCTGCGGA ATGGGAGTGT GCACGTGGAG AGGAGGGAGG GGCAACTGTC CGGGATTCTT GGGGGTGGGG GGACGCCTTT AAACTGAAAC CCCGCCCCTT GGTCGTCATG GCAACGCCTA CCCCCACCCC CGACTTCTAC ATTTCAGCAG GTGCGGATAG CGGAGCTCCC GCCGCCGCCC GTGCCTGCGG CT を含有あるいはその一部で表わされる、請求項２記載の
組換えＤＮＡ。 - 【請求項６】プロモーター領域が次の塩基配列： ＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡ ＣＧＡＣＧＧＡＡＧＡ ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡ ＡＡＡ
ＡＡＡＡＧＡＧ ＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＧＧ ＡＧＧＡＡＡＡＧＡＡ ＣＧＧＧＣＧＧＴＧＧ ＡＧＧ
ＡＧＡＡＧＧＡ ＣＣＧＣＣＣＣＣＴＣ ＴＣＧＧＣＴＴＣＴＴ ＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧ ＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧ ＧＧＣ
ＣＴＣＴＣＣＣ ＴＧＡＣＣＧＣＣＧＣ ＣＣＴＣＣＧＧＴＧＧ ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＣ ＴＣＡＣＡＡＧＧＧＣ ＣＣＣ
ＣＣＡＣＣＣＡ ＧＴＡＣＧＣＧＴＧＴ ＣＣＡＧＣＴＣＧＧＴ ＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣ ＧＣＡＧＣＴＣＡＧＡ ＧＧＣ
ＣＣＴＡＧＧＣ ＴＣＧＣＣＣＣＧＣＧ ＣＧＣＧＴＣＣＣＣＧ ＣＣＣＣＧＣＧＣＧＣ ＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡ ＧＴＣ
ＣＧＣＧＣＧＣ ＧＣＧＣＧＴＧＣＡＣ ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣ ＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣ ＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧ ＣＡＧ
ＴＧＧＧＣＧＧ ＣＧＣＣＧＣＴＣＣＧ ＧＧＣＣＧＣＣＴＣＴ ＴＧＣＴＧＣＣＧＣＧ ＡＧＴＡＧＧＡＡＧＣ ＧＣＧ
ＡＧＣＧＣＣＡ ＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣ ＴＧＴＣＡＧＴＧＡＧ ＣＧＴＧ を含有あるいはその一部で表わされる、請求項３記載の
組換えＤＮＡ。 - 【請求項７】請求項１記載の組換えＤＮＡを含有する組
換えベクター。 - 【請求項８】下流に構造遺伝子を連結している請求項７
記載の組換えベクター。 - 【請求項９】請求項７または８記載の組換えベクターを
保持する形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2405849A JPH0556781A (ja) | 1989-12-26 | 1990-12-25 | 発現用プロモーターおよびその用途 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1-334751 | 1989-12-26 | ||
| JP33475189 | 1989-12-26 | ||
| JP2405849A JPH0556781A (ja) | 1989-12-26 | 1990-12-25 | 発現用プロモーターおよびその用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0556781A true JPH0556781A (ja) | 1993-03-09 |
Family
ID=26574926
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2405849A Withdrawn JPH0556781A (ja) | 1989-12-26 | 1990-12-25 | 発現用プロモーターおよびその用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0556781A (ja) |
-
1990
- 1990-12-25 JP JP2405849A patent/JPH0556781A/ja not_active Withdrawn
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Woloshin et al. | MSX1 inhibits MyoD expression in fibroblast× 10T½ cell hybrids | |
| AU723325B2 (en) | Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors | |
| Epstein et al. | Pax3 modulates expression of the c-Met receptor during limb muscle development. | |
| AU741856B2 (en) | Vascular endothelial growth factor-B | |
| Weinberger et al. | Domain structure of human glucocorticoid receptor and its relationship to the v-erb-A oncogene product | |
| Biggs et al. | A human Id-like helix-loop-helix protein expressed during early development. | |
| Cilley et al. | Fetal lung development: airway pressure enhances the expression of developmental genes | |
| JPH06503225A (ja) | アンギオジェネシス制御特性を有するヒト蛋白をコードするヌクレオチド配列 | |
| JP2010029207A (ja) | ＨＭＧ蛋白質（ｈｉｇｈｍｏｂｉｌｉｔｙｇｒｏｕｐｐｒｏｔｅｉｎ）遺伝子の核酸配列およびそれらの使用 | |
| Kitami et al. | Molecular structure and transcriptional regulation of the gene for the platelet-derived growth factor alpha receptor in cultured vascular smooth muscle cells. | |
| US5470736A (en) | Transdominant negative proto-oncogene | |
| Lafyatis et al. | Sequence specific protein binding to and activation of the TGF-β3 promoter through a repeated TCCC motif | |
| KR100227240B1 (ko) | 섬모형 신경성인자 수용체 | |
| WO1996039517A1 (en) | The erf genetic locus and its products | |
| US5972609A (en) | Utrophin gene promotor | |
| JPH06507062A (ja) | 毛様体神経栄養因子レセプター | |
| JP2002519059A (ja) | ミオスタチン遺伝子の新規なプロモーター配列 | |
| JP2003159089A (ja) | ヒト表皮遺伝子プロモーター | |
| Toutant et al. | Promoter elements and transcriptional control of the chicken β tropomycin gene | |
| JP2001505429A (ja) | シンデカンエンハンサーエレメントおよび遺伝子発現をターゲティングするためのその使用 | |
| JP3324782B2 (ja) | 発現用プロモーターおよびその用途 | |
| JP2003511069A (ja) | 甲状腺の過形成および腫瘍の核酸配列 | |
| JP4565702B2 (ja) | 予後良好及び不良なヒト神経芽細胞腫との比較において、予後良好なヒト神経芽細胞腫で発現が増強している核酸配列を検出するための検出キット | |
| GELFMAN et al. | Differentiation of Retinal Pigment Epithelial CellsIn VitroUncovers Silencer Activity in the FGF-5 Gene Promoter | |
| Strauss et al. | The mouse calretinin gene promoter region: structural and functional components |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980312 |