JPH0564301B2

JPH0564301B2 -

Info

Publication number: JPH0564301B2
Application number: JP59017647A
Authority: JP
Inventors: Tokio Kano; Akira Tamagawa; Makoto Nakamura; Katsunobu Doi
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1984-02-04
Filing date: 1984-02-04
Publication date: 1993-09-14
Also published as: JPS60162956A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、免疫学的自動分析方法、特に標識物
質として酵素を用いる免疫学的自動分析方法に関
するものである。

従来技術血液、体液等に含まれるグロブリン、酵素等の
タンパク質、またホルモン、細菌、ウイルス等
は、その分子構造が類似していたり、極く微量で
あるために通常の分析方法では固定、定量が困難
である。そこで、これらの物質の分析には、一般
に抗体（抗原）あるいはレクチン等を利用した免
疫学的な分析方法が用いられている。

このような抗原抗体反応を利用する免疫学的分
析方法には、従来種々の方法があるが、一般には
標識試薬の標識物質の違いによつてラジオイムノ
アツセイ、エンザイムイムノアツセイ、フルオロ
イムノアツセイに大別される。また、これらの免
疫学的分析方法は、抗原抗体反応系で競合法とサ
ンドイツチ法とに分類されると共に、測定法で標
識試薬もしくはサンプル中の抗原（抗体）が抗原
抗体反応を起した免疫複合体（Bound）と、抗原
抗体反応に関与しない標識試薬（Free）とを分
離する操作、いわゆるＢ−Ｆ分離を必要とするヘ
テロジニアスな方法と、必要としないホモジニア
スな方法とに分離され、そのヘテロジニアスな方
法の一つに、固相化した抗体（抗原）を有する反
応チヤンバを用い、原理的にはアフイニテイーク
ロマトグラフイーを利用したフローインジエクシ
ヨン式免疫学的分析方法がある。

かかるフローインジエクシヨン式免疫学的分析
方法においては、反応チヤンバ内での抗原抗体反
応を解離剤によつて解離させることにより、複数
のサンプルを順次分析することができ、この方法
を実施する装置として、米国特許第4009005号明
細書に標識物質として放射性同位元素を用いるフ
ローインジエクシヨン式免疫学的自動分析装置が
記載されている。

第１図は上記米国特許第4009005号明細書に記
載されたフローインジエクシヨン式免疫学的自動
査分析装置の構成を示すもので、緩衝液タンク１
内の反応緩衝液はポンプ２によりバルブ３、バル
ブ４およびフローライン５を経て、分析すべき抗
原に対して特異的に反応する抗体が固相化されて
いる反応チヤンバ６に輸送される。サンプルテー
ブル７には複数のサンプル容器がセツトされ、各
サンプル容器には分析すべきサンプルと、放射性
同位元素で標識された抗原を有する標識試薬との
混合液が収容されている。この混合液はポンプ８
によりフローライン９、バルフ１０、サンプルル
ープ１１、バルブ１２、フローライン１３および
バルブ１４を経て吸引されてサンプルループ１１
内に満たされ、その後このサンプルループ１１内
の混合液はバルブ４，１０および１２の切換えに
よりポンプ２によるフローライン１５を経ての反
応緩衝液の輸送によりフローライン１６および５
を経て反応チヤンバ６内に送出され、ここで抗原
抗体反応が行なわれる。

反応チヤンバ６から流出する未反応の標識抗原
を含む混合液はミキシングチヤンバ１７に送出さ
れ、ここでポンプ１８により前処理試薬タンク１
９からフローライン２０を経て送出される試薬と
混合されて測定容器２１に導かれ、シンチレーシ
ヨンカウンタ２２により未反応の標識抗原量が測
定される。

その後、バルブ３および４の切換えにより、解
離液タンク２３内の解離液がポンプ２によりフロ
ーライン５を経て反応チヤンバ６に輸送され、こ
れにより反応チヤンバ６内において抗原抗体反応
によつて捕捉された分析すべきサンプル中の抗原
および標識抗原が解離され、その標識抗原量が同
様に測定容器２１においてシンチレーシヨンカウ
ンタ２２により測定される。

このようにして、シンチレーシヨンカウンタ２
２により測定した未反応の標識抗原量と反応した
標識抗原量とに基づいてサンプル中の所定の抗原
が定量され、その後フローラインが反応緩衝液で
洗浄されて次のサンプル分析が開始される。な
お、上述したポンプおよびバルブの動作はCPU
等の制御装置２４によつて制御されるようになつ
ている。

上述したフローインジエクシヨン式免疫学的自
動分析装置によれば複数のサンプルを順次自動的
に分析することができるが、標識物質として放射
性同位元素を用いるために、その設置、廃液処
理、使用済反応チヤンバ等の処理等を一定の基準
に従つて行なわなければらず、このため普及性に
欠ける不具合がある。また、抗原抗体反応を行な
わせる反応チヤンバ６とシンチレーシヨンカウン
タ２２を具える測定部とが分離しているため、分
析時間が長くなり、したがつて処理能力が低いと
共に、装置も大形になる不具合がある。

発明の目的本発明の目的は上述した不具合を解決し、普及
性に富み、しかも処理能力を高くできると共に装
置全体も小形にできる免疫学的自動分析方法を提
供しようとするものである。

発明の概要本発明の免疫学的自動分析方法は、固相化した
所定の物質を有する反応チヤンバを通してサンプ
ルおよび酵素標識試薬を流して前記反応チヤンバ
内において免疫学的結合反応を行わせた後、前記
反応チヤンバを通して基質を流して酵素反応を行
わせ、前記反応チヤンバ内の酵素反応生成物を前
記基質の流れに沿う２以上の測定点について測定
し、前記測定点間の酵素反応生成物の量的変化率
に基づいて前記サンプル中の所定の抗原または抗
体を自動的に分析することを特徴とするものであ
る。

実施例第２図は本発明を実施する免疫学的自動分析装
置の一例の構成を示すものである。分析すべき複
数のサンプルはそれぞれサンプル容器３１に収容
してサンプラ３２にセツトし、所定のサンプル吸
引位置においてサンプルノズル３３により順次吸
引するようにする。サンプルノズル３３は計量バ
ルブ３４に連結すると共に、サンプラ３２の所定
のサンプル吸引位置と緩衝液タンク３５の設置位
置との間で移動可能でかつ各位置において昇降可
能に設ける。

計量バルブ３４は、例えばテフロン（商品名）
より成るほぼ円板状の固定部分と回転部分とのす
り合わせ構造とし、固定部分に形成した４個の貫
通孔３６ａ〜３６ｄと、これら貫通孔３６ａと３
６ｂおよび３６ｃと３６ｄにそれぞれ交互に連結
されるように回転部分に形成した一定容積の２個
の計量溝３７ａ，３７ｂとをもつて構成し、貫通
孔３６ａにサンプルノズル３３を連結する。ま
た、貫通孔３６ｂはポンプ３８を介して排液タン
ク３９に、貫通孔３６ｃはポンプ４０を介して緩
衝液タンク４１に、貫通孔３６ｄは流路切換えバ
ルブ４２にそれぞれ連結する。

流路切換えバルブ４２は、計量バルブ３４と同
様、例えばテフロン（商品名）より成るほぼ円板
状の固定部分と回転部分とのすり合わせ構造と
し、固定部分にはその中央部に１個の貫通孔４３
ａを形成すると共に周辺部に３個の貫通孔４３ｂ
〜４３ｄを形成し、回転部分には固定部分の中央
の貫通孔４３ａを周辺の３個の貫通孔４３ｂ〜４
３ｄに対して選択的に連結するための連結溝４４
を形成し、貫通孔４３ｃに計量バルブ３４の貫通
孔３６ｄを連結する。また、貫通孔４３ａは後述
する反応チヤンバユニツト４５を介して排液タン
ク４６に、貫通孔４３ｂは計量バルブ４７に、貫
通孔４３ｄはポンプ４８を介して解離液タンク４
９にそれぞれ連結し、反応チヤンバユニツト４５
の出力は記録ユニツト５０に供給する。

計量バルブ４７は、上述した計量バルブ３４と
同様に構成して、固定部分に形成した貫通孔５１
ａと５１ｂおよび５１ｃと５１ｄに、回転部分に
形成した一定容積の計量溝５２ａおよび５２ｂを
それぞれ交互に連結させるようにし、その貫通孔
５１ａに流路切換えバルブ４２の貫通孔４３ｂを
連結する。また、貫通孔５１ｂはポンプ５３を介
して緩衝液タンク５４に、貫通孔５１ｃは流路切
換えバルブ５５に、貫通孔５１ｄはポンプ５６を
介して排液タンク４６にそれぞれ連結する。

流路切換えバルブ５５は、上述した流路切換え
バルブ４２と同様に構成して、固定部分の中央部
に形成した貫通孔５７ａを回転部分に形成した連
結溝５８を介して固定部分の周辺部に形成した３
個の貫通孔５７ｂ〜５７ｄに選択的に連結させる
ようにし、その中央の貫通孔５７ａに計量バルブ
４７の貫通孔５１ｃを連結する。また、貫通孔５
７ｂは酵素標識試薬タンク５９に、貫通孔５７ｃ
は緩衝液タンク６０に、貫通孔５７ｄは基質タン
ク６１にそれぞれ連結する。

第３図は上述した反応チヤンバユニツトの構成
を示すものである。反応チヤンバ６５は例えば内
径２mm程度、長さ30mm程度のガラス管あるいは透
明なプラスチツク管より成り、内部にはサンプル
中の分析すべき例えば抗原に対し特異的に反応す
る抗体を直接固相化するか、あるいはこれを直径
数μm〜数百μmのガラス、プラスチツク、アガロ
ースゲル等の粒子の表面に固相化して充填する。
なお、粒子を用いる場合には管の両端に粒子より
も小さい開口を有するフイルタを設ける。この反
応チヤンバ６５にはキセノンランプ等の光源６６
から放射される光を集光レンズ６７により平行光
束にしてフイルタ６８を経て投射し、これにより
反応チヤンバ６５をその長さ方向に亘つて均一に
照明してその像を結像レンズ６９を経て受光器７
０上に結像させ、この受光器７０の出力に基いて
信号処理回路７１においてサンプル中の所定の抗
原を定量し、その結果を第１図に示す記録ユニツ
ト５０に供給するよう構成する。なお、フイルタ
６８は酵素標識試薬の触媒による基質の反応によ
つて生成される発色生成物が吸光する波長の光を
透過するものを用いる。また、受光器７０は反応
チヤンバ６５の長さ方向に少く共２個の受光素子
を配置して構成することができるが、本例では反
応チヤンバ６５の長さ方向における発色変化を細
かく測定するため、例えば直径が1100μmの円や
一辺が100μmの四角形の光感応部を有する受光素
子を多数配列して、この受光素子列上に反応チヤ
ンバ６５のほぼ全体の像を結像させるようにす
る。

以下、本実施例の動作を説明する。

先ず、第２図に示す状態において、ポンプ３８
によりサンプラ３２の所定のサンプル吸引位置に
あるサンプル容器３１内のサンプルを、サンプル
ノズル３３および計量バルブ３４を介して計量バ
ルブ３４の計量溝３７ａがサンプルで完全に満た
されるまで吸引する。次に、計量バルブ３４の回
転部分を回転させて、計量溝３７ａ，３７ｂを第
２図とは反応の状態、すなわち計量溝３７ａを貫
通孔３６ｃ，３６ｄに計量溝３７ｂを貫通孔３６
ａ，３６ｂにそれぞれ連結し、ポンプ４０により
緩衝液タンク４１から緩衝液を吸引して、計量溝
３７ａに一定量保持されたサンプルを流路切換え
バルブ４２を経て反応チヤンバ６５に輸送し、こ
こで反応チヤンバ６５内に固相化した抗体と抗原
抗体反応を行なわせて排液タンク４６に押し流
す。このサンプルの輸送速度は、サンプル中の所
定の抗原が反応チヤンバ６５内に固相化されてい
る抗体と十分反応する時間、例えば30秒程度、サ
ンプルが反応チヤンバ６５内に滞留する速度とす
る。

この間、サンプルノズル３３は緩衝液タンク３
５の位置に移動させ、ポンプ３８によりサンプル
ノズル３３および計量バルブ３４を経て緩衝液を
吸引して排液タンク３９に排出させることによ
り、サンプルノズル３３および計量バルブ３４の
計量溝３７ｂを洗浄して次のサンプルの吸引にそ
なえる。

サンプルが流路切換えバルブ４２を通過した
後、流路切換えバルブ４２の回転部分を回転させ
て連結溝４４を貫通孔４３ｂに連結し、酵素標識
試薬を反応チヤンバ６５に輸送する。その輸送に
あたつては、先ず第２図に示す状態においてポン
プ５６により酵素標識試薬タンク５９内の酵素標
識試薬を、流路切換えバルブ５５および計量バル
ブ４７を経て計量バルブ４７の量溝５２ｂが酵素
標識試薬で完全に満たされるまで吸引する。次
に、計量バルブ４７の回転部分を回転させて、計
量溝５２ａ，５２ｂを第２図とは反対の状態、す
なわち計量溝５２ｂを貫通孔５１ａ，５１ｂに、
計量溝５２ａを貫通孔５１ｃ，５１ｄにそれぞれ
連結し、ポンプ５３により緩衝液タンク５４から
緩衝液を吸引することにより、計量溝５２ｂに一
定量保持された酵素標識試薬を流路切換えバルブ
４２を経て反応チヤンバ６５に輸送し、これによ
り酵素標識試薬を反応チヤンバ６５内において固
相化された抗体に捕捉されたサンプル中の所定の
抗原と反応させて、反応チヤンバ６５内に固相化
抗体−サンプル中抗原−酵素標識抗体の複合物を
形成させ、この抗原抗体反応に関与しなかつた酵
素標識抗体をポンプ５３によつて輸送される緩衝
液により押し流して排液タンク４６に排出する。
なお、この酵素標識試薬の輸送速度はポンプ４０
によるサンプルの輸送速度とほぼ同じにする。

次に、反応チヤンバ６５に基質を輸送するが、
その輸送にあたつては、先ず、酵素標識試薬の吸
引後、流路切換えバルブ５５の回転部分を回転さ
せてその連結溝５８を貫通孔５７ｃに連結して、
ポンプ５６により流路切換えバルブ５５および計
量バルブ４７を経て緩衝液を吸引して排液タンク
４６に排出することにより連結溝５８および計量
溝５２ａを含む流路を洗浄した後、流路切換えバ
ルブ５５の連結溝５８を貫通孔５７ｄに連結して
ポンプ５６により基質タンク６１内の基質を、流
路切換えバルブ５５および計量バルブ４７を経て
計量溝５２ａが基質で完全に満たされるまで吸引
する。次に、計量バルブ４７の回転部分を回転さ
せて、計量溝５２ａ，５２ｂを第２図の状態、す
なわち計量溝５２ａを貫通孔５１ａ，５１ｂに、
計量溝５２ｂを貫通孔５１ｃ，５１ｄにそれぞれ
連結し、ポンプ５３により緩衝液タンク５４から
緩衝液を吸引することにより、計量溝５２ａに一
定量保持された基質を流路切換えバルブ４２を経
てサンプルおよび酵素標識試薬の輸送速度とほぼ
同じ輸送速度で反応チヤンバ６５に輸送する。な
お、この計量バルブ４７の切換えに同期して流路
切換えバルブ５５も切換えてその連結溝５８を貫
通孔５１ｃに連結し、ポンプ５６により流路切換
えバルブ５５および計量バルブ４７を経て緩衝液
を吸引して排液タンク４６に排出することによ
り、連結溝５８および計量溝５２ｂを含む流路を
洗浄する。

反応チヤンバ６５に基質が輸送されると、反応
チヤンバ６５内に捕捉されている標識酵素の触媒
作用により発色生成物が進出し、その量すなわち
発色の程度は基質の量が十分であれば反応チヤン
バ６５内を進行するにつれ大きくなる。したがつ
て、反応チヤンバ６５の入口、中央および出口に
それぞれ対応する受光器７０の各受光素子の出力
は、それぞれ第４図Ａ，ＢおよびＣに示すように
変化する。すなわち、第４図Ａに示す反応チヤン
バ６５の入口においては、標識酵素が殆んど捕捉
されていないために、緩衝液のみのの吸光度出力
V₀に対して基質の分散による基質そのものの吸
光度の変化に応じたものとなり、第４図Ｂに示す
中央においては基質が入口から中央までの間に捕
捉された標識酵素の触媒作用を受けて発色性に変
化し、吸光度が大きくなるために、その変化は第
４図Ａの場合よりも大きくなり、第４図Ｃに示す
出口においてはその変化が更に大きくなる。この
基質の発色性による吸光度、すなわち発色生成物
の産出量は、村反応チヤンバ６５内に捕捉された
標識酵素量にほぼ比例する。

一方、標識酵素は反応チヤンバ６５内に捕捉さ
れたサンプル中の所定の抗原と結合するから、そ
の量は捕捉されている抗原量に比例する。また、
サンプル中の所定の抗原はサンプルが一定速度、
一定時間で反応チヤンバ６５を通過する際に固相
化した抗体に捕捉されるから、その捕捉される抗
原量はサンプル中の抗原濃度に比例する。したが
つて、反応チヤンバ６５内に捕捉された標識酵素
の量を、発色生成物の産出量、すなわち基質の発
色性による吸光度から求めれば、これにより分析
すべきサンプル中の抗原濃度を求めることができ
る。

そこで、本実施例では、信号処理回路７１にお
いて、各受光素子の出力をモニタし、反応チヤン
バ６５の入口に対応する受光素子の出力の最小値
を基準として、各受光素子の出力の小値との差
ΔV（絶対値）を求める。このようにすれば、そ
の差ΔVは第５図に実線で示すように、反応チヤ
ンバ６５の入口から出口に向けてほぼ直線的に変
化し、その傾きは捕捉された標識酵素の量、すな
わち分析すべきサンプル中の抗原量が多い程仮想
線で示すように大きくなるから、予じめ抗原濃度
が既知の種々のサンプルを用いて検量線を作成し
て信号処理回路７１に記憶しておき、この検量線
に基いて測定した未知濃度のサンプルの抗原量を
求めて記録ユニツト５０において記録する。

上述した測光が終了した後は、流路切換えバル
ブ４２の連結溝４４を貫通孔４３ｄに連結し、ポ
ンプ４８により解離液タンク４９内の解離液を反
応チヤンバ６５を経て排液タンク４６に排出する
ことにより、反応チヤンバ６５内の抗原抗体反応
を解離させる。次に、流路切換えバルブ４２の連
結溝４４を貫通孔４３ｃに連結して、ポンプ４０
により緩衝液タンク４１内の緩衝液を計量バルブ
３４、流路切換えバルブ４２および反応チヤンバ
６５を経て排液タンク４６に排出することにより
解離液を流し去り、次のサンプルの分析にそなえ
る。

以上の動作を繰返し行なうことにより、サンプ
ラ３２にセツトされた複数のサンプルを順次自動
的に分析する。

なお、本発明は上述した例にのみ限定されるも
のではなく、幾多の変更または変形が可能であ
る。例えば受光器７０を反応チヤンバ６５の長さ
方向に離間した２箇所、例えば入口および出口に
対応する２個の受光素子をもつて構成し、それら
の出力の変化分の差あるいは比からサンプル中の
所定の抗原を定量するようにすることもできる。
また本発明は上述したサンドイツチ法による分析
に限らず、競合法による分析にも有効に適用する
ことができる。更に、第２図において計量バルブ
３４，４７はその計量溝を１つにすることもでき
る。

発明の効果以上述べたように、本発明はエンザイムノアツ
セイによるもので、放射性同位元素を用いないか
ら容易に実施でき、しかも普及性も高い。また、
基質による発色生成物を、基質の流れに沿う反応
チヤンバ内の２以上の測定点において、該反応チ
ヤンバを通して直接測光して酵素反応量の変化率
を得るようにしたいるので、反応チヤンバと測光
部とを同一部分に設けることができるから、基質
そのものの吸光度に左右されない発色生成物のみ
の吸光度を検出することができると共に、分析時
間も短くできる。したがつて、高精度の分析がで
きると共に、処理能力も向上させることができ、
しかも装置全体を小形にできる。

【図面の簡単な説明】

第１図は従来の免疫学的自動分析装置の構成を
示す図、第２図は本発明を実施する免疫学的自動
分析装置の一例の構成を示す図、第３図は第２図
に示す反応チヤンバユニツトの一例の構成を示す
図、第４図Ａ〜Ｃおよび第５図は第２図に示す免
疫学的自動分析装置の動作を説明するための図で
ある。３１………サンプル容器、３２……サンプラ、
３３……サンプルノズル、３４，４７……計量バ
ルブ、３５，４１，５４，６０……緩衝液タン
ク、３６ａ〜３６ｄ、４３ａ〜43d、５１ａ〜５
１ｄ、７ａ〜５７ｄ……貫通孔、３７ａ，３７
ｂ，５２ａ，５２ｂ……計量溝、３８，４０，４
８，５３，５６……ポンプ、３９，４６……排液
タンク、４２，５５……流路切換えバルブ、４
４，５８……連結溝、４５……反応チヤンバユニ
ツト、４９……解離液タンク、５０……記録ユニ
ツト、５９……酵素標識試薬タンク、６１……基
質タンク、６５……反応チヤンバ、６６……光
源、６７……集光レンズ、６８……フイルタ、６
９……結像レンズ、７０……受光器、７１………
信号処理回路。

Claims

【特許請求の範囲】

１固相化した所定の物質を有する反応チヤンバ
を通してサンプルおよび酵素標識試薬を流して前
記反応チヤンバ内において免疫学的結合反応を行
わせた後、前記反応チヤンバを通して基質を流し
て酵素反応を行わせ、前記反応チヤンバ内の酵素
反応生成物を前記基質の流れに沿う２以上の測定
点について測定し、前記測定点間の酵素反応生成
物の量的変化率に基づいて前記サンプル中の所定
の抗原または抗体を自動的に分析することを特徴
とする免疫学的自動分析方法。