JPH0564588A - 短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃ - Google Patents
短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃInfo
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- JPH0564588A JPH0564588A JP3228687A JP22868791A JPH0564588A JP H0564588 A JPH0564588 A JP H0564588A JP 3228687 A JP3228687 A JP 3228687A JP 22868791 A JP22868791 A JP 22868791A JP H0564588 A JPH0564588 A JP H0564588A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】安定性の向上したヒトプロテインＣ又は活性ヒ
トプロテインＣを提供する。 【構成】活性化ヒトプロテインＣの重鎖Ｃ末が天然型の
ものより数個削除された構造の蛋白。
トプロテインＣを提供する。 【構成】活性化ヒトプロテインＣの重鎖Ｃ末が天然型の
ものより数個削除された構造の蛋白。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、短い重鎖を有するヒト
プロテインＣまたは活性化ヒトプロテインＣに関するも
のである。さらに詳しくは抗凝固剤または線溶促進剤と
して使用し得る短鎖のヒトプロテインＣまたは活性化ヒ
トプロテインＣに関するものである。
プロテインＣまたは活性化ヒトプロテインＣに関するも
のである。さらに詳しくは抗凝固剤または線溶促進剤と
して使用し得る短鎖のヒトプロテインＣまたは活性化ヒ
トプロテインＣに関するものである。
【０００２】ここで、本明細書において、アミノ酸配列
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。
はＩＵＰＡＣ―ＩＵＢ生化学委員会（ＣＢＮ）で採用さ
れた方法により略記するものとし、たとえば下記の略号
を用いる。
【０００３】Ala Ｌ―アラニン Arg Ｌ―アルギニン Asn Ｌ―アスパラギン Asp Ｌ―アスパラギン酸 Cys Ｌ―システイン Gln Ｌ―グルタミン Glu Ｌ―グルタミン酸 Gly グリシン His Ｌ―ヒスチジン Ile Ｌ―イソロイシン Leu Ｌ―ロイシン Lys Ｌ―リジン Met Ｌ―メチオニン Phe Ｌ―フェニルアラニン Pro Ｌ―ブロリン Ser Ｌ―セリン Thr Ｌ―スレオニン Trp Ｌ―トリプトファン Tyr Ｌ―チロシン Val Ｌ―バリン
【０００４】また、ＤＮＡの配列はれそを構成する各デ
オキシリボヌクレオチドに含まれる塩基の種類で略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。
オキシリボヌクレオチドに含まれる塩基の種類で略記す
るものとし、たとえば下記の略号を用いる。
【０００５】 Ａ アデニン（デオキシアデニル酸を示す。） Ｃ シトシン（デオキシシチジル酸を示す。） Ｇ グアニン（デオキシグアニル酸を示す。） Ｔ チミン （デオキシチミジル酸を示す。）
【０００６】
【従来の技術】プロテインＣは血漿セリンプロテアーゼ
前駆体の一種であって、血小板や血管内皮細胞の表面
で、トロンビンとそのレセプターであるトロンボモジュ
リンとの複合体による限定分解を受けて活性化され、セ
リンプロテアーゼである活性化プロテインＣ（以下ＡＰ
Ｃという）に変換される。ＡＰＣは血液凝固系の活性化
第５因子および活性化第８因子を選択的に分解すること
によって抗凝固活性を発揮する。この活性はプロテイン
Ｓによって増強されることが知られている。また、ＡＰ
Ｃは組織プラスミノーゲンアクチベータの阻害剤である
PAI-1 を切断することにより、線溶促進活性をもつと考
えられている。
前駆体の一種であって、血小板や血管内皮細胞の表面
で、トロンビンとそのレセプターであるトロンボモジュ
リンとの複合体による限定分解を受けて活性化され、セ
リンプロテアーゼである活性化プロテインＣ（以下ＡＰ
Ｃという）に変換される。ＡＰＣは血液凝固系の活性化
第５因子および活性化第８因子を選択的に分解すること
によって抗凝固活性を発揮する。この活性はプロテイン
Ｓによって増強されることが知られている。また、ＡＰ
Ｃは組織プラスミノーゲンアクチベータの阻害剤である
PAI-1 を切断することにより、線溶促進活性をもつと考
えられている。
【０００７】ヒトプロテインＣのアミノ酸配列について
は既に、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA ，82，4673-467
7 （1985）等で明らかなように、Gla ドメインおよびエ
ピダーマルグロースファクター（ＥＧＦ）様ドメインを
アミノ末端側に有する軽鎖（分子量約21,000）と活性化
ぺプチドおよび触媒ドメインからなる重鎖（分子量約4
1,000）とがジスルフィド結合したもの（２本鎖型）で
ある。
は既に、Proc．Natl．Acad．Sci ．USA ，82，4673-467
7 （1985）等で明らかなように、Gla ドメインおよびエ
ピダーマルグロースファクター（ＥＧＦ）様ドメインを
アミノ末端側に有する軽鎖（分子量約21,000）と活性化
ぺプチドおよび触媒ドメインからなる重鎖（分子量約4
1,000）とがジスルフィド結合したもの（２本鎖型）で
ある。
【０００８】具体的には天然型ヒトプロテインＣは図１
に示すように、軽鎖はアミノ末端Ala からカルボキシル
末端のLeu まで１５５個のアミノ酸からなり、重鎖はア
ミノ末端のAsp からカルボキシル末端のPro まで262 個
のアミノ酸からなっており、軽鎖と重鎖は細胞中で（Ｈ
2 Ｎ―）軽鎖-Lys-Arg- 重鎖（―ＣＯＯＨ）の形で生合
成され、細胞から分泌される過程でLys-Arg が切断さ
れ、２本鎖化される。軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末
端から１４１番目のCys と重鎖のアミノ末端から１２０
番目のCys との間でＳ―Ｓ結合で結合している。
に示すように、軽鎖はアミノ末端Ala からカルボキシル
末端のLeu まで１５５個のアミノ酸からなり、重鎖はア
ミノ末端のAsp からカルボキシル末端のPro まで262 個
のアミノ酸からなっており、軽鎖と重鎖は細胞中で（Ｈ
2 Ｎ―）軽鎖-Lys-Arg- 重鎖（―ＣＯＯＨ）の形で生合
成され、細胞から分泌される過程でLys-Arg が切断さ
れ、２本鎖化される。軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末
端から１４１番目のCys と重鎖のアミノ末端から１２０
番目のCys との間でＳ―Ｓ結合で結合している。
【０００９】ヒトプロテインＣから活性化ヒトプロテイ
ンＣへの変換は、ヒトプロテインＣの重鎖のアミノ末端
（以下、Ｎ末という）から１２番目のアミノ酸から重鎖
のＮ末のアミノ酸までの活性化ポリペプチドが除去され
ることによって行われる。従って、活性化ヒトプロティ
ンＣのアミノ酸配列はヒトプロテインＣのアミノ酸配列
において、ヒトプロテインＣのアミノ酸配列から、重鎖
のＮ末から１２番目のアミノ酸から重鎖のＮ末のアミノ
酸までのすべてを除いたものであるがＣ末端側のアミノ
酸の活性に及ぼす影響や構造の安定性等に関しては明ら
かでない。
ンＣへの変換は、ヒトプロテインＣの重鎖のアミノ末端
（以下、Ｎ末という）から１２番目のアミノ酸から重鎖
のＮ末のアミノ酸までの活性化ポリペプチドが除去され
ることによって行われる。従って、活性化ヒトプロティ
ンＣのアミノ酸配列はヒトプロテインＣのアミノ酸配列
において、ヒトプロテインＣのアミノ酸配列から、重鎖
のＮ末から１２番目のアミノ酸から重鎖のＮ末のアミノ
酸までのすべてを除いたものであるがＣ末端側のアミノ
酸の活性に及ぼす影響や構造の安定性等に関しては明ら
かでない。
【００１０】
【発明の目的】ヒトプロテインＣ（以下ＰＣと略す）か
ら活性化ヒトプロテインＣ（以下ＡＰＣと略す）を製造
するためには適当な活性化剤、例えばトロンビン、トロ
ンビン―トロンボモジュリン複合体等をＰＣに作用させ
活性化ペプチドをＰＣより除去する必要がある。
ら活性化ヒトプロテインＣ（以下ＡＰＣと略す）を製造
するためには適当な活性化剤、例えばトロンビン、トロ
ンビン―トロンボモジュリン複合体等をＰＣに作用させ
活性化ペプチドをＰＣより除去する必要がある。
【００１１】我々は活性化操作の際に、活性化のペプチ
ドと共に、ＰＣに由来する他のペプチド特に重鎖のＣ末
端側ペプチドがＰＣより除去されるものが存在し、それ
は短い重鎖を有するにもかかわらず生理活性が尚も存在
することを見い出した。
ドと共に、ＰＣに由来する他のペプチド特に重鎖のＣ末
端側ペプチドがＰＣより除去されるものが存在し、それ
は短い重鎖を有するにもかかわらず生理活性が尚も存在
することを見い出した。
【００１２】このようなＰＣの重視のＣ末端アミノ酸を
含むペプチドが除去されたＰＣ又はＡＰＣは、既に酵素
の作用を受けたものであるため、最も安定性の高いＰＣ
又はＡＰＣとなっている。
含むペプチドが除去されたＰＣ又はＡＰＣは、既に酵素
の作用を受けたものであるため、最も安定性の高いＰＣ
又はＡＰＣとなっている。
【００１３】
【発明の構成】すなわち本発明は、基本的に天然型のヒ
トプロテインＣまたは活性化ヒトプロテインＣの構造を
有し、天然型の活性化ヒトプロテインＣで計算して重鎖
におけるアミノ末端が２３９番目〜２４６番目のいずれ
かのアミノ酸末端であることを特徴とする重鎖を持った
ＰＣ又はＡＰＣに関するものである。
トプロテインＣまたは活性化ヒトプロテインＣの構造を
有し、天然型の活性化ヒトプロテインＣで計算して重鎖
におけるアミノ末端が２３９番目〜２４６番目のいずれ
かのアミノ酸末端であることを特徴とする重鎖を持った
ＰＣ又はＡＰＣに関するものである。
【００１４】上述のＰＣ又はＡＰＣの一次構造はＰＣ又
はＡＰＣにおける最も安定な構造であると共に当該ＡＰ
Ｃは十分な生理活性を有している。
はＡＰＣにおける最も安定な構造であると共に当該ＡＰ
Ｃは十分な生理活性を有している。
【００１５】ＰＣの性質としては、例えば、本発明の蛋
白をプロテインＣ活性化酵素で処理することにより、抗
凝固活性、線溶促進活性、アミダーゼ活性等を有するよ
うになること等が挙げられる。
白をプロテインＣ活性化酵素で処理することにより、抗
凝固活性、線溶促進活性、アミダーゼ活性等を有するよ
うになること等が挙げられる。
【００１６】すなわち、本発明のＰＣは、天然型のヒト
プロテインＣと同じくプロテインＣ活性化酵素で処理す
ることにより本発明のＡＰＣに変換される。ここでプロ
テインＣ活性化酵素としては、トロビン、トロンビン―
トロンボモジュリン複合体、蛇毒等が挙げられる。
プロテインＣと同じくプロテインＣ活性化酵素で処理す
ることにより本発明のＡＰＣに変換される。ここでプロ
テインＣ活性化酵素としては、トロビン、トロンビン―
トロンボモジュリン複合体、蛇毒等が挙げられる。
【００１７】また、これらの本発明のＡＰＣを得るため
には遺伝子工学的手法も用いる事が出来る。すなわち、
重鎖Ｃ末端に存在するペプチドをあらかじめ欠失させて
おくことにより、安定な構造を活性化前に得ることが出
来る。
には遺伝子工学的手法も用いる事が出来る。すなわち、
重鎖Ｃ末端に存在するペプチドをあらかじめ欠失させて
おくことにより、安定な構造を活性化前に得ることが出
来る。
【００１８】また、さらに重鎖Ｎ末端に存在する活性化
ペプチドも同時に欠失させておくことにより直接本発明
のＡＰＣとして発現させることも可能である。
ペプチドも同時に欠失させておくことにより直接本発明
のＡＰＣとして発現させることも可能である。
【００１９】また、ＡＰＣ活性としては、前述したとお
り、凝固系の活性化第５因子および活性化第８因子を選
択的に分解する抗凝固活性、並びに組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターの阻害剤であるPAI-1 と反応してPAI-
1 を失活させることに起因する線溶活性等があげられ
る。
り、凝固系の活性化第５因子および活性化第８因子を選
択的に分解する抗凝固活性、並びに組織プラスミノーゲ
ンアクチベーターの阻害剤であるPAI-1 と反応してPAI-
1 を失活させることに起因する線溶活性等があげられ
る。
【００２０】本発明において、本発明の蛋白をコードす
るＤＮＡ配列とは、それを含有するプラスミドを宿主に
導入し、培養せしめたときに、本発明の性質を有する蛋
白が結果的に発現されるＤＮＡ配列であればよく、その
中間に構造遺伝子以外の他の遺伝子（例えばイントロ
ン）が介在していてもよい。
るＤＮＡ配列とは、それを含有するプラスミドを宿主に
導入し、培養せしめたときに、本発明の性質を有する蛋
白が結果的に発現されるＤＮＡ配列であればよく、その
中間に構造遺伝子以外の他の遺伝子（例えばイントロ
ン）が介在していてもよい。
【００２１】本発明の蛋白をコードするＤＮＡ断片は、
宿主ベクター系に応じて適当に選ばれた発現用ベクター
に組み込まれる。そのような発現ベクターの具体例とし
ては、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０
初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス
メタロチオネイン１・プロモーター、ＭＭＴＶ（マウス
乳頭腫ウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウ
イルス）プロモーター等を有するプラスミドベクターあ
るいはBovineパピローマウイルス等のウイルス由来のベ
クター等が用いられる。
宿主ベクター系に応じて適当に選ばれた発現用ベクター
に組み込まれる。そのような発現ベクターの具体例とし
ては、アデノウイルス主要後期プロモーター、ＳＶ４０
初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、マウス
メタロチオネイン１・プロモーター、ＭＭＴＶ（マウス
乳頭腫ウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウ
イルス）プロモーター等を有するプラスミドベクターあ
るいはBovineパピローマウイルス等のウイルス由来のベ
クター等が用いられる。
【００２２】前記ＤＮＡ断片のかかるベクターへの組み
込みはそれ自体既知の方法で行うことができ、例えばMi
ura O. et al., J. Clin. Invest. 83，1598-1604 （19
89）等の文献に記載の方法によって行うことができる。
込みはそれ自体既知の方法で行うことができ、例えばMi
ura O. et al., J. Clin. Invest. 83，1598-1604 （19
89）等の文献に記載の方法によって行うことができる。
【００２３】一方、宿主用の動物細胞とししてはヒトま
たはヒト以外の動物細胞のいずれであってもよく、例え
ばCHO, C127, BHK，Cos1，Cos7，LM，NIH3T3，293 ，He
la等があげられ、中でも CHO， BHK，293 が好ましい。
たはヒト以外の動物細胞のいずれであってもよく、例え
ばCHO, C127, BHK，Cos1，Cos7，LM，NIH3T3，293 ，He
la等があげられ、中でも CHO， BHK，293 が好ましい。
【００２４】上記発現型ベクターのこれらの細胞へのト
ランスフェクションも、また当該分野でよく知られたそ
れ自体公知の方法によって行うことができ、例えばSpan
didos D.A. and Wilkie N.M.,Expression of Exogenous
DNA in Mammalian Cells, Ed. Hames B.D.an Higgins
S.J. Transcription and Translation，IRL Press ，Ox
ford，ppl-48等の文献記載の方法によって行うことがで
きる。
ランスフェクションも、また当該分野でよく知られたそ
れ自体公知の方法によって行うことができ、例えばSpan
didos D.A. and Wilkie N.M.,Expression of Exogenous
DNA in Mammalian Cells, Ed. Hames B.D.an Higgins
S.J. Transcription and Translation，IRL Press ，Ox
ford，ppl-48等の文献記載の方法によって行うことがで
きる。
【００２５】かくして得られた形質転換細胞は、それぞ
れの細胞に適合した条件下に常法で培養し、それ培養液
から目的とする本発明の蛋白を回収することができる。
れの細胞に適合した条件下に常法で培養し、それ培養液
から目的とする本発明の蛋白を回収することができる。
【００２６】本発明のＰＣ又はＡＰＣの定量法は特開昭
61-283868 号公報によって示された方法を用いることが
できる。この方法によれば、Gla をもつヒトプロテイン
Ｃおよび／または活性化ヒトプロテインＣの活性を有す
る蛋白のみを測定することもできる。
61-283868 号公報によって示された方法を用いることが
できる。この方法によれば、Gla をもつヒトプロテイン
Ｃおよび／または活性化ヒトプロテインＣの活性を有す
る蛋白のみを測定することもできる。
【００２７】本発明のＰＣ又はＡＰＣの精製には、バリ
ウム吸着法、イオン交換クロマトグラフィー法を含む天
然型ヒトプロテインＣの精製法を応用することができる
が、カルシウムイオンによるGla ドメインのコンホメー
ション変化を認識する抗ヒトプロテインＣモノクローナ
ル抗体を使用したアフィニティカラムクロマトグラフィ
ーを用いるのが特に好ましい（特開昭64-85091号公報参
照）。この方法は、Gla を有するＰＣ又はＡＰＣのみを
精製できる点と、ＥＤＴＡという温和な溶離剤が使える
点で優れた方法である。
ウム吸着法、イオン交換クロマトグラフィー法を含む天
然型ヒトプロテインＣの精製法を応用することができる
が、カルシウムイオンによるGla ドメインのコンホメー
ション変化を認識する抗ヒトプロテインＣモノクローナ
ル抗体を使用したアフィニティカラムクロマトグラフィ
ーを用いるのが特に好ましい（特開昭64-85091号公報参
照）。この方法は、Gla を有するＰＣ又はＡＰＣのみを
精製できる点と、ＥＤＴＡという温和な溶離剤が使える
点で優れた方法である。
【００２８】本発明のＰＣの活性は、あらかじめ蛇毒
（プロタック、アメリカンダイアグノスチカ社製）で活
性化して合成基質（PCa 、アメリカンダイアグノスチカ
社製）の切断活性で調べた。本発明のＰＣ及びＡＰＣは
触媒ドメインについては天然型と同一であるので、合成
基質切断活性をもって、本来の活性である抗凝固活性、
線溶促進活性を表わすことができる。
（プロタック、アメリカンダイアグノスチカ社製）で活
性化して合成基質（PCa 、アメリカンダイアグノスチカ
社製）の切断活性で調べた。本発明のＰＣ及びＡＰＣは
触媒ドメインについては天然型と同一であるので、合成
基質切断活性をもって、本来の活性である抗凝固活性、
線溶促進活性を表わすことができる。
【００２９】
【実施例】本発明の実施例では、次の方法を用いた。組換ＰＣ（以下ｒＰＣと略す）の作製 ｒＰＣは既知の遺伝子組換技術、すなわち特開昭６４−
８５０８４号公報に記載されている方法により作製し
た。
８５０８４号公報に記載されている方法により作製し
た。
【００３０】ＰＣの活性化 （１）活性化反応 ｒＰＣ溶液を限外濾過膜ＹＭ１０を装着したアミコン濃
縮器（アミコン、グレースジャパン）で２mg／mlに濃縮
し、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５ ０．１
５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で透析した。上述の２mg／mlのｒ
ＰＣ溶液１８６０μｌに、２．７mg／mlウシトロンビン
溶液（持田製薬）６９μｌと５００ｍＭ Ｎａ2 ＥＤＴ
Ａを含むＴＢＳ溶液１０６５μｌとを加え約３mlとし
た。溶液を十分に混合後、ｒＰＣを活性化するために混
合溶液を恒温槽で３７℃にて３ｈｒインキュベートし
た。
縮器（アミコン、グレースジャパン）で２mg／mlに濃縮
し、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌｐＨ７．５ ０．１
５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液で透析した。上述の２mg／mlのｒ
ＰＣ溶液１８６０μｌに、２．７mg／mlウシトロンビン
溶液（持田製薬）６９μｌと５００ｍＭ Ｎａ2 ＥＤＴ
Ａを含むＴＢＳ溶液１０６５μｌとを加え約３mlとし
た。溶液を十分に混合後、ｒＰＣを活性化するために混
合溶液を恒温槽で３７℃にて３ｈｒインキュベートし
た。
【００３１】（２）ＡＰＣの精製 上記インキュベートした混合溶液中からトロンビンを除
去し、ＡＰＣを精製するために、陽イオン交換カラムを
用いた。
去し、ＡＰＣを精製するために、陽イオン交換カラムを
用いた。
【００３２】ＡＰＣを含む上述の混合溶液を３mlの０．
０２Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−morpholino）ethan Sulfur
ic acid ）／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液を加えることにより２倍に希釈した。希釈し
た溶液を同じ緩衝液で平衡化した１．５cmφ×４cmのＳ
―Sepharose Fast Flow カラム（ファルマシア）に通し
た。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、カラムに吸着し
たＡＰＣを０．０５〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直線グラジ
エントで溶出し、素通り画分と、０．３〜０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ画分とに含まれていた。トロンビンは約０．６Ｍ
ＮａＣｌにて溶出されていた。ＡＰＣとトロンビンと
はこの操作でほぼ完全に分離することができる。ＡＰＣ
を含む画分を合わせ、約３０mlの０．０２Ｍ ＭＥＳ／
ＴｒｉｓｐＨ６．０緩衝液をＮａＣｌ濃度を減少させる
ために加えた。
０２Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−morpholino）ethan Sulfur
ic acid ）／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液を加えることにより２倍に希釈した。希釈し
た溶液を同じ緩衝液で平衡化した１．５cmφ×４cmのＳ
―Sepharose Fast Flow カラム（ファルマシア）に通し
た。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、カラムに吸着し
たＡＰＣを０．０５〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直線グラジ
エントで溶出し、素通り画分と、０．３〜０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ画分とに含まれていた。トロンビンは約０．６Ｍ
ＮａＣｌにて溶出されていた。ＡＰＣとトロンビンと
はこの操作でほぼ完全に分離することができる。ＡＰＣ
を含む画分を合わせ、約３０mlの０．０２Ｍ ＭＥＳ／
ＴｒｉｓｐＨ６．０緩衝液をＮａＣｌ濃度を減少させる
ために加えた。
【００３３】ＰＣの活性化において遊離されたペプチド
のアミノ酸配列解析 トロンビンによるＰＣの活性化反応において、ＰＣとト
ロンビンを上述の条件で反応させた混合溶液１００μｌ
を遠心型限外濾過装置セントリコン１０（アミコン）を
用いて限外濾過した。次いで得られた濾液約８０μｌに
含まれる遊離ペプチドを下記の条件で単離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
のアミノ酸配列解析 トロンビンによるＰＣの活性化反応において、ＰＣとト
ロンビンを上述の条件で反応させた混合溶液１００μｌ
を遠心型限外濾過装置セントリコン１０（アミコン）を
用いて限外濾過した。次いで得られた濾液約８０μｌに
含まれる遊離ペプチドを下記の条件で単離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
【００３４】検出されたすべてのピークを分取し、凍結
乾燥後アセトニトリル／水＝１／１（vol ／vol ）100
μｌで再溶解し、４７７Ａプロテインシーケンサー（Ａ
ＢＩ）でアミノ酸配列を解析したところ、次の表に示す
配列のペプチドが確認された。
乾燥後アセトニトリル／水＝１／１（vol ／vol ）100
μｌで再溶解し、４７７Ａプロテインシーケンサー（Ａ
ＢＩ）でアミノ酸配列を解析したところ、次の表に示す
配列のペプチドが確認された。
【００３５】 NH2 ―Ser ―His ―Leu ―COOH NH2 ―Arg ―Ser ―His ―Leu ―COOH（配列番号
１） NH2 ―Lys ―Arg ―Ser ―His―Leu ―COOH（配列
番号２） NH2 ―Asp ―Thr ―Glu ―Asp ―Gln ―Glu ―Asp
―Gln ―Val ―Asp―Pro ―Arg ―HOOH（配列番号３） NH2 ―Ser ―Trp ―Ala ―Pro―COOH（配列番号
４）
１） NH2 ―Lys ―Arg ―Ser ―His―Leu ―COOH（配列
番号２） NH2 ―Asp ―Thr ―Glu ―Asp ―Gln ―Glu ―Asp
―Gln ―Val ―Asp―Pro ―Arg ―HOOH（配列番号３） NH2 ―Ser ―Trp ―Ala ―Pro―COOH（配列番号
４）
【００３６】ＰＣのアミノ酸配列データより、これらペ
プチドは，，が軽鎖Ｃ末端配列に由来し、が重
鎖Ｎ末端配列（アクティベーションペプチド）に由来
し、が重鎖Ｃ末端配列に由来することが確認された。
さらに、ウシトロンビンに上記の〜の配列は存在し
ないことから、これらのペプチドはウシトロンビンの自
己分解物ではない。
プチドは，，が軽鎖Ｃ末端配列に由来し、が重
鎖Ｎ末端配列（アクティベーションペプチド）に由来
し、が重鎖Ｃ末端配列に由来することが確認された。
さらに、ウシトロンビンに上記の〜の配列は存在し
ないことから、これらのペプチドはウシトロンビンの自
己分解物ではない。
【００３７】従って、活性化されたＰＣの重鎖Ｃ末端ア
ミノ酸は図１のアミノ酸：２４６番のLys を含めてそれ
よりもＮ末側に存在する。
ミノ酸は図１のアミノ酸：２４６番のLys を含めてそれ
よりもＮ末側に存在する。
【００３８】活性化プロテインＣのＨ鎖Ｃ末端配列の解
析 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）の緩衝液１mlに溶解してい
る、精製されたｒＰＣ１mg及び活性化ｒＰＣ１mg（重量
は２８０ｎｍにおける吸光度により次式を用いて測定）
の溶液に５mgのジチオスレイトール、４mlの６Ｍグアニ
ジン塩酸−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ バッファー（ｐＨ８．
３）を加え窒素雰囲気下で６５℃にて４ｈｒ加温するこ
とにより重鎖と軽鎖とを結合しているジスルフィド結合
を還元し、重鎖、軽鎖を分離した。次いでこの溶液に２
００μｌの４３mg／mlのモノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４
〜６）を加え、３７℃で３０min 加温し、ＳＨ基をカル
ボキシル化することにより、ＳＨ基の再酸化を防いだ。
この様にして得られた溶液を、１０倍の８Ｍ ウレア溶
液を徐々に加えつつ、限外濾過膜ＹＭ１０（アミコン）
を装着した限外濾過装置（アミコン）（型番８ＭＣ）に
て限外濾過し、溶液中より低分子化合物を除去した。こ
の重鎖と軽鎖とを含む溶液より重鎖を単離するためにポ
リＦカラム（デュポン社製）を用いて逆相液体クロマト
グラフィーを下記の条件で行った。
析 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）の緩衝液１mlに溶解してい
る、精製されたｒＰＣ１mg及び活性化ｒＰＣ１mg（重量
は２８０ｎｍにおける吸光度により次式を用いて測定）
の溶液に５mgのジチオスレイトール、４mlの６Ｍグアニ
ジン塩酸−０．５Ｍ Ｔｒｉｓ バッファー（ｐＨ８．
３）を加え窒素雰囲気下で６５℃にて４ｈｒ加温するこ
とにより重鎖と軽鎖とを結合しているジスルフィド結合
を還元し、重鎖、軽鎖を分離した。次いでこの溶液に２
００μｌの４３mg／mlのモノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４
〜６）を加え、３７℃で３０min 加温し、ＳＨ基をカル
ボキシル化することにより、ＳＨ基の再酸化を防いだ。
この様にして得られた溶液を、１０倍の８Ｍ ウレア溶
液を徐々に加えつつ、限外濾過膜ＹＭ１０（アミコン）
を装着した限外濾過装置（アミコン）（型番８ＭＣ）に
て限外濾過し、溶液中より低分子化合物を除去した。こ
の重鎖と軽鎖とを含む溶液より重鎖を単離するためにポ
リＦカラム（デュポン社製）を用いて逆相液体クロマト
グラフィーを下記の条件で行った。
【００３９】 カラム：ポリＦカラム(6.2mmφ×80mm、デュポン） 溶離液Ａ：０．１Ｍ ＮＨ4 ＨＣＯ3 （ｐＨ8.0 ） 溶離液Ｂ：アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
【００４０】重鎖を含むピーク（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分子量４万〜４万５千のバンド
が確認されたもの）を凍結乾燥し、５０ｍＭ Phosphate
−１Ｍ ウレア バッファー（ｐＨ８．０）２００μｌ
を加えて再溶解し、０．２μｇのエンドプロティナーゼ
Ａｓｐ−Ｎ（ベーリンガーマンハイム）を加え、３７℃
で６ｈｒ加温して、Ｈ鎖中のアスパラギン酸のＮ末端側
ペプチド結合を切断した。
アミドゲル電気泳動にて分子量４万〜４万５千のバンド
が確認されたもの）を凍結乾燥し、５０ｍＭ Phosphate
−１Ｍ ウレア バッファー（ｐＨ８．０）２００μｌ
を加えて再溶解し、０．２μｇのエンドプロティナーゼ
Ａｓｐ−Ｎ（ベーリンガーマンハイム）を加え、３７℃
で６ｈｒ加温して、Ｈ鎖中のアスパラギン酸のＮ末端側
ペプチド結合を切断した。
【００４１】この反応液に含まれるペプチドを下記の条
件で逆相クロマトグラフィーにて分離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
件で逆相クロマトグラフィーにて分離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
【００４２】検出されたすべてのピークを分取し、各ピ
ーク中に含まれるペプチドの配列解析を行ったところ、
重鎖Ｃ末端近傍の配列としては次に示す配列が、確認さ
れた。
ーク中に含まれるペプチドの配列解析を行ったところ、
重鎖Ｃ末端近傍の配列としては次に示す配列が、確認さ
れた。
【００４３】 NH2 ―Asp ―Lys ―Glu ―Ala ―Pro
―Gln ―Lys ―Ser ―Trp ―Ala―Pro ―COOH（配列番
号５） NH2 ―Asp ―Trp ―Ile ―His ―Gly ―His ―Ile
―Arg ―COOH（配列番号６）
―Gln ―Lys ―Ser ―Trp ―Ala―Pro ―COOH（配列番
号５） NH2 ―Asp ―Trp ―Ile ―His ―Gly ―His ―Ile
―Arg ―COOH（配列番号６）
【００４４】は重鎖Ｃ末端側ペプチドに由来し（アミ
ノ酸 No.240 〜250 ）、はとそのＮ末端とで結合し
ていたペプチドに由来する（アミノ酸 No.232 〜239
）。これらのペプチド断片はｒＰＣ，活性化ｒＰＣ両
者において検出されたが、ｒＰＣにおけるペプチドと
ペプチドとのモル比（アミノ酸組成分析により測定）
を１００とすると、活性化ｒＰＣにおいては２１であっ
た。
ノ酸 No.240 〜250 ）、はとそのＮ末端とで結合し
ていたペプチドに由来する（アミノ酸 No.232 〜239
）。これらのペプチド断片はｒＰＣ，活性化ｒＰＣ両
者において検出されたが、ｒＰＣにおけるペプチドと
ペプチドとのモル比（アミノ酸組成分析により測定）
を１００とすると、活性化ｒＰＣにおいては２１であっ
た。
【００４５】また、ｒＰＣ，活性化ｒＰＣ両者におい
て、ペプチドの量はほぼ同量であった。従って、活性
化ｒＰＣにおいてはＣ末端アミノ酸としてアミノ酸 No.
239 のArg から No.246 のLys のいづれかを有するＨ鎖
が存在する。
て、ペプチドの量はほぼ同量であった。従って、活性
化ｒＰＣにおいてはＣ末端アミノ酸としてアミノ酸 No.
239 のArg から No.246 のLys のいづれかを有するＨ鎖
が存在する。
【００４６】配列番号：１ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Arg Ser His Leu １
【００４７】配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Lys Ars Ser His Leu １ ５
【００４８】配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｎ末端フラグメント 配列 Asp Thr Glu Asp Gln Glu Asp Gln Val Asp Pro Arg １ ５ 10
【００４９】配列番号：４ 配列の長さ：４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Ser Trp Ala Pro １
【００５０】配列番号：５ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：Ｃ末端フラグメント 配列 Asp Lys Glu Ala Pro Gln Lys Ser Trp Ala Pro １ ５ 10
【００５１】配列番号：６ 配列の長さ：８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント型：中間部フラグメント 配列 Asp Trp Ile His Gly His IleArg １ ５
【図１】天然型活性化ヒトプロテインＣの構造を、軽鎖
Ｎ末のプレープロリーダーシークエンス及びアクティベ
ーションペプチドを付加した形で示すものである。
Ｎ末のプレープロリーダーシークエンス及びアクティベ
ーションペプチドを付加した形で示すものである。
【手続補正書】
【提出日】平成４年１１月１０日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】具体的には天然型ヒトプロテインＣは図１
に示すように、軽鎖はアミノ末端Ala からカルボキシル
末端のLeu まで１５５個のアミノ酸からなり、重鎖はア
ミノ末端のAsp からカルボキシル末端のPro まで262 個
のアミノ酸からなっており、軽鎖と重鎖は細胞中で（Ｈ
2 Ｎ―）軽鎖-Lys-Arg- 重鎖（―ＣＯＯＨ）の形で生合
成され、細胞から分泌される過程でLys-Arg が切断さ
れ、２本鎖化される。軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末
端から１４１番目のCys と重鎖のアミノ末端から１２０
番目のCys との間でＳ―Ｓ結合で結合している。また、
Glaドメインは９個のカルシウム結合性アミノ酸、すな
わちγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）残基を含むこ
とが知られている。
に示すように、軽鎖はアミノ末端Ala からカルボキシル
末端のLeu まで１５５個のアミノ酸からなり、重鎖はア
ミノ末端のAsp からカルボキシル末端のPro まで262 個
のアミノ酸からなっており、軽鎖と重鎖は細胞中で（Ｈ
2 Ｎ―）軽鎖-Lys-Arg- 重鎖（―ＣＯＯＨ）の形で生合
成され、細胞から分泌される過程でLys-Arg が切断さ
れ、２本鎖化される。軽鎖と重鎖とは、軽鎖のアミノ末
端から１４１番目のCys と重鎖のアミノ末端から１２０
番目のCys との間でＳ―Ｓ結合で結合している。また、
Glaドメインは９個のカルシウム結合性アミノ酸、すな
わちγ−カルボキシグルタミン酸（Gla）残基を含むこ
とが知られている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】このようなＰＣの重鎖のＣ末端アミノ酸を
含むペプチドが除去されたＰＣ又はＡＰＣは、既に酵素
の作用を受けたものであるため、最も安定性の高いＰＣ
又はＡＰＣとなっている。
含むペプチドが除去されたＰＣ又はＡＰＣは、既に酵素
の作用を受けたものであるため、最も安定性の高いＰＣ
又はＡＰＣとなっている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】ＡＰＣを含む上述の混合溶液を３mlの０．
０２Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−morpholino）ethan Sulfur
ic acid ）／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液を加えることにより２倍に希釈した。希釈し
た溶液を同じ緩衝液で平衡化した１．５cmφ×４cmのＳ
―Sepharose Fast Flow カラム（ファルマシア）に通し
た。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、カラムに吸着し
たＡＰＣを０．０５〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直線グラジ
エントで溶出し、ＡＰＣは素通り画分と、０．３〜０．
５Ｍ ＮａＣｌ画分とに含まれていた。トロンビンは約
０．６Ｍ ＮａＣｌにて溶出されていた。ＡＰＣとトロ
ンビンとはこの操作でほぼ完全に分離することができ
る。ＡＰＣを含む画分を合わせ、約３０mlの０．０２Ｍ
ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０緩衝液をＮａＣｌ濃度
を減少させるために加えた。
０２Ｍ ＭＥＳ（２−（Ｎ−morpholino）ethan Sulfur
ic acid ）／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０、０．０５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ緩衝液を加えることにより２倍に希釈した。希釈し
た溶液を同じ緩衝液で平衡化した１．５cmφ×４cmのＳ
―Sepharose Fast Flow カラム（ファルマシア）に通し
た。カラムを同じ緩衝液で洗浄した後、カラムに吸着し
たＡＰＣを０．０５〜１．０Ｍ ＮａＣｌの直線グラジ
エントで溶出し、ＡＰＣは素通り画分と、０．３〜０．
５Ｍ ＮａＣｌ画分とに含まれていた。トロンビンは約
０．６Ｍ ＮａＣｌにて溶出されていた。ＡＰＣとトロ
ンビンとはこの操作でほぼ完全に分離することができ
る。ＡＰＣを含む画分を合わせ、約３０mlの０．０２Ｍ
ＭＥＳ／Ｔｒｉｓ ｐＨ６．０緩衝液をＮａＣｌ濃度
を減少させるために加えた。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】ＰＣの活性化において遊離されたペプチド
のアミノ酸配列解析 トロンビンによるＰＣの活性化反応において、ＰＣとト
ロンビンを上述の条件で反応させた混合溶液１００μｌ
を遠心型限外濾過装置セントリコン１０（アミコン）を
用いて４℃にて限外濾過した。次いで得られた濾液約８
０μｌに含まれる遊離ペプチドを下記の条件で高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて単離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
のアミノ酸配列解析 トロンビンによるＰＣの活性化反応において、ＰＣとト
ロンビンを上述の条件で反応させた混合溶液１００μｌ
を遠心型限外濾過装置セントリコン１０（アミコン）を
用いて４℃にて限外濾過した。次いで得られた濾液約８
０μｌに含まれる遊離ペプチドを下記の条件で高速液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて単離した。 （条件） カラム：バイダックＣ１８カラム（４．６mm径×２５０
mm長、２１８ＴＰ５４） 溶離液Ａ：０．１％トリフルオロ酢酸、１ｖｏｌ％アセ
トニトリル水溶液 溶離液Ｂ：０．１％トリフルオロ酢酸、９９．９ｖｏｌ
％アセトニトリル 流速：０．５ml／min カラム温度：室温 検出：２１５ｎｍ
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３４】検出されたすべてのピークを分取し、凍結
乾燥後アセトニトリル／水＝１／１（vol ／vol ）100
μｌで再溶解し、４７７Ａプロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ）でアミノ酸配列を解析した
ところ、次の表に示す配列のペプチドが確認された。
乾燥後アセトニトリル／水＝１／１（vol ／vol ）100
μｌで再溶解し、４７７Ａプロテインシーケンサー（ア
プライドバイオシステムズ）でアミノ酸配列を解析した
ところ、次の表に示す配列のペプチドが確認された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３８】活性化プロテインＣのＨ鎖Ｃ末端配列の解
析 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）の緩衝液１mlに溶解してい
る、精製されたｒＰＣ１mg及び活性化ｒＰＣ１mg（重量
は２８０ｎｍにおける吸光度により次式｛「ＰＣ，活性
化ＰＣの重量（mg／ml）」＝「２８０ｎｍにおける吸光
度」÷１．４｝を用いて測定）の溶液に５mgのジチオス
レイトール、４mlの６Ｍグアニジン塩酸−０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ バッファー（ｐＨ８．３）を加え窒素雰囲気下
で６５℃にて４ｈｒ加温することにより重鎖と軽鎖とを
結合しているジスルフィド結合を還元し、重鎖、軽鎖を
分離した。次いでこの溶液に２００μｌの４３mg／mlの
モノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４〜６）を加え、３７℃で
３０min 加温し、ＳＨ基をカルボキシル化することによ
り、ＳＨ基の再酸化を防いだ。この様にして得られた溶
液を、１０倍の８Ｍ 尿素溶液を徐々に加えつつ、限外
濾過膜ＹＭ１０（アミコン）を装着した限外濾過装置
（アミコン）（型番８ＭＣ）にて限外濾過し、溶液中よ
り低分子化合物を除去した。この重鎖と軽鎖とを含む溶
液より重鎖を単離するためにポリＦカラム（デュポン社
製）を用いて逆相液体クロマトグラフィーを下記の条件
で行った。
析 ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−０．１５Ｍ ＮａＣｌ−２０ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）の緩衝液１mlに溶解してい
る、精製されたｒＰＣ１mg及び活性化ｒＰＣ１mg（重量
は２８０ｎｍにおける吸光度により次式｛「ＰＣ，活性
化ＰＣの重量（mg／ml）」＝「２８０ｎｍにおける吸光
度」÷１．４｝を用いて測定）の溶液に５mgのジチオス
レイトール、４mlの６Ｍグアニジン塩酸−０．５Ｍ Ｔ
ｒｉｓ バッファー（ｐＨ８．３）を加え窒素雰囲気下
で６５℃にて４ｈｒ加温することにより重鎖と軽鎖とを
結合しているジスルフィド結合を還元し、重鎖、軽鎖を
分離した。次いでこの溶液に２００μｌの４３mg／mlの
モノヨード酢酸水溶液（ｐＨ４〜６）を加え、３７℃で
３０min 加温し、ＳＨ基をカルボキシル化することによ
り、ＳＨ基の再酸化を防いだ。この様にして得られた溶
液を、１０倍の８Ｍ 尿素溶液を徐々に加えつつ、限外
濾過膜ＹＭ１０（アミコン）を装着した限外濾過装置
（アミコン）（型番８ＭＣ）にて限外濾過し、溶液中よ
り低分子化合物を除去した。この重鎖と軽鎖とを含む溶
液より重鎖を単離するためにポリＦカラム（デュポン社
製）を用いて逆相液体クロマトグラフィーを下記の条件
で行った。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】重鎖を含むピーク（ＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動にて分子量４万〜４万５千のバンド
が確認されたもの）を凍結乾燥し、５０ｍＭ Phosphate
−１Ｍ 尿素 バッファー（ｐＨ８．０）２００μｌを
加えて再溶解し、０．２μｇのエンドプロティナーゼＡ
ｓｐ−Ｎ（ベーリンガーマンハイム）を加え、３７℃で
６ｈｒ加温して、Ｈ鎖中のアスパラギン酸のＮ末端側ペ
プチド結合を切断した。
アミドゲル電気泳動にて分子量４万〜４万５千のバンド
が確認されたもの）を凍結乾燥し、５０ｍＭ Phosphate
−１Ｍ 尿素 バッファー（ｐＨ８．０）２００μｌを
加えて再溶解し、０．２μｇのエンドプロティナーゼＡ
ｓｐ−Ｎ（ベーリンガーマンハイム）を加え、３７℃で
６ｈｒ加温して、Ｈ鎖中のアスパラギン酸のＮ末端側ペ
プチド結合を切断した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】は重鎖Ｃ末端側ペプチドに由来し（アミ
ノ酸 No.240 〜250 ）、はとそのＮ末端とで結合し
ていたペプチドに由来する（アミノ酸 No.232 〜239
）。これらのペプチド断片はｒＰＣ，活性化ｒＰＣ両
者において検出されたが、ｒＰＣにおけるペプチドと
ペプチドとのモル比（ペプチドのモル数÷ペプチド
のモル数，アミノ酸組成分析により測定）を１００と
すると、活性化ｒＰＣにおいては２１であった。
ノ酸 No.240 〜250 ）、はとそのＮ末端とで結合し
ていたペプチドに由来する（アミノ酸 No.232 〜239
）。これらのペプチド断片はｒＰＣ，活性化ｒＰＣ両
者において検出されたが、ｒＰＣにおけるペプチドと
ペプチドとのモル比（ペプチドのモル数÷ペプチド
のモル数，アミノ酸組成分析により測定）を１００と
すると、活性化ｒＰＣにおいては２１であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 横山 誠一 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内 (72)発明者 市川 弥太郎 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社東京研究センター内
Claims (3)
- 【請求項１】天然型活性化ヒトプロテインＣにおける重
鎖の２３９番〜２４６番のアミノ酸のいずれかをＣ末端
とする重鎖を有する、ヒトプロテインＣ又は活性化ヒト
プロテインＣ。 - 【請求項２】天然型活性化ヒトプロテインＣにおける軽
鎖の１４１番〜１５５番のアミノ酸のいずれかをＣ末端
とする軽鎖を有する、請求項１記載のヒトプロテインＣ
又は活性化ヒトプロテインＣ。 - 【請求項３】天然型活性化ヒトプロテインＣにおける軽
鎖の１４９番〜１５５番のアミノ酸のいずれかをＣ末端
とする軽鎖を有する、請求項１記載のヒトプロテインＣ
又は活性化ヒトプロテインＣ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3228687A JPH0564588A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | 短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3228687A JPH0564588A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | 短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564588A true JPH0564588A (ja) | 1993-03-19 |
Family
ID=16880233
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3228687A Pending JPH0564588A (ja) | 1991-08-14 | 1991-08-14 | 短い重鎖を有するヒトプロテインｃおよび活性化ヒトプロテインｃ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0564588A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995011966A1 (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human activated protein c preparation and process for producing the same |
| AU680894B2 (en) * | 1993-06-18 | 1997-08-14 | Immuno Ag | Use of human protein C for prevention and treatment of depositions of thrombocytes |
| EP1084235A4 (en) * | 1998-06-01 | 2002-03-27 | Lilly Co Eli | HUMAN PROTEIN-C POLYPEPTIDE |
-
1991
- 1991-08-14 JP JP3228687A patent/JPH0564588A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU680894B2 (en) * | 1993-06-18 | 1997-08-14 | Immuno Ag | Use of human protein C for prevention and treatment of depositions of thrombocytes |
| WO1995011966A1 (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-04 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human activated protein c preparation and process for producing the same |
| AU680563B2 (en) * | 1993-10-29 | 1997-07-31 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Human activated protein C preparation and process for producing the same |
| KR100383063B1 (ko) * | 1993-10-29 | 2003-07-07 | 사이단호진가가쿠오요비겟세이리요호오겐큐쇼 | 사람활성화단백질c제제및이의제조방법 |
| EP0726311B1 (en) * | 1993-10-29 | 2004-06-30 | Juridical Foundation, The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | Process for preparing human activated protein c |
| EP1084235A4 (en) * | 1998-06-01 | 2002-03-27 | Lilly Co Eli | HUMAN PROTEIN-C POLYPEPTIDE |
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