JPH0565108B2 - - Google Patents
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- JPH0565108B2 JPH0565108B2 JP62163980A JP16398087A JPH0565108B2 JP H0565108 B2 JPH0565108 B2 JP H0565108B2 JP 62163980 A JP62163980 A JP 62163980A JP 16398087 A JP16398087 A JP 16398087A JP H0565108 B2 JPH0565108 B2 JP H0565108B2
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- reaction
- analysis
- sugar
- complex
- borane
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H23/00—Compounds containing boron, silicon or a metal, e.g. chelates or vitamin B12
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
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- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Description
〔産業上の利用分野〕
本発明は、糖及び糖鎖の螢光標識方法に関し、
更に詳細には糖及び糖鎖の還元末端を定量的に螢
光標識し、pmol若しくはそれ以上の高感度にて
分析する方法に関する。 〔従来の技術〕 近年複合糖質の生理活性とその糖鎖構造との関
係の研究や遺伝子工学を用いて調製した糖タンパ
ク質と天然の糖タンパク質の糖鎖構造やその機能
の相違を調べる目的等でその構造の解析が必要と
なつてきている。しかし生体より調製した試料は
微量しか得られないことが多く、高感度の解析法
が要求されている。 現在行われている糖鎖の微量分析の方法は還元
末端を糖アルコールに変換する際に〔3H〕ラベ
ルを導入しその放射能活性を利用するものである
〔C.J.リアング（C.J.Liang）、K.ヤマシタ（K.
Yamashita）、C.G.ミユーレンベルク（C.G.
Muellenberg）、H.シチ（H.Shichi）及びA.コバ
タ（A.Kobata）、ジヤーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）第254巻、
第6414頁（1979）、又はS.タカサキ（S.
Takasaki）、T.ミズオチ（T.Mizuochi）及びA.
コバタ、メソツズ イン エンザイモロジー
（methods in Enzymol.）第83巻、第263頁
（1982）参照〕。検出感度はpmolレベルであり、
良好であるが、放射性物質を用いるため数々の制
約がある。そこで注目されるのが、ピリジルアミ
ノ基を用いて螢光標識する方法である〔S.ハセ
（S.Hase）、T.イブキ（T.Ibuki）及びT.イケナカ
（T.Ikenaka）、ジヤーナル オブ バイオケミス
トリー（J.Biochem.）第95巻、第197〜203頁
（1984）、以下、従来法と称する〕。従来法では、
糖又は糖鎖の還元末端に塩酸を用いてピリジルア
ミノ基を導入してシツフ塩基とし、次いで不揮発
性のボランコンプレツクスで還元後320nｍの励
起波長を照射し、400nｍの螢光を検出するもの
で感度はpmolレベルである。 上記方法を用いれば、微量分析の分野で最も優
れた手段の１つである高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）による分析が簡単に行え、しかも感
度は放射性物質を用いた場合と同等か又はそれ以
上である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら上記従来法では、目的とする化合
物の反応収率が原料糖類に対し75〜85％と低く定
量的でなかつた。またケトースに対する従来法の
反応収率は約10％程度であり、非常に不都合であ
つた。しかも従来法ではシツフ塩基の生成収量を
多くするため、原料糖類に対して大過剰量のピリ
ジルアミンを用い、更にナトリウムシアノボロハ
イドライド（NaBH3CN）を還元剤として大過
剰量用いている。したがつて螢光標識された糖類
を分析する際、余剰のピリジルアミンと
NaBH3CNをカラムクロマト操作により除去し
なければならず、その操作には時間と技術を必要
とし、更に高感度分析への妨げとなつている。 上記現状にかんがみ、本発明の目的は、螢光標
識化の反応収率を向上させ、更に操作を簡便に
し、一層の高感度化を可能とする糖類の微量分析
を行うための螢光標識方法を提供することにあ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は糖類の螢光標識
方法に関し、アミノ基を有する螢光物質を糖類の
還元末端に標識化する反応を行うに際し、対イオ
ンとして実質上水を含まない酸を用いることを特
徴とする。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明における糖類としては例えば単糖、オリ
ゴ糖、多糖又は糖タンパクや糖脂質のような複合
糖質が挙げられる。糖タンパクや糖脂質のような
複合糖質より糖鎖を切出す方法としては公知法で
あるヒドラジン分解−Ｎ−アセチル化、トリフル
オロアセトリシス、アルカリ処理、酵素消化（エ
ンドグリコシダーゼ、グリコペプチダーゼ等）な
どがある。 本発明者らは鋭意検討の結果、従来法のシツフ
塩基の形成反応、すなわち螢光標識導入反応の段
階で用いられていた塩酸に換えて、実質上水を含
まない酸、例えば実質上無水の無機酸（有機溶媒
に溶解させた無機酸、例えばピリジンに溶解させ
たフツ化水素酸を含む）、有機酸〔例えば酢酸、
トリフルオロ酢酸（TFA）〕を用いることにより
良い結果が得られることを見出した。すなわち、
その反応とは、糖又は糖鎖である化合物に対して
過剰量のアミノ基をもつ螢光物質（例えば２−ア
ミノピリジン、２−アミノキノリン）を実質上無
水の酸中にて反応させるものである。 上記酸のうち酢酸が好ましいが、水を含まない
他の酸（例えばTFA）でも良い。 標準的な反応条件は常温〜100℃、数分〜１時
間で、好ましくは約90℃、15分間である。この反
応において定量的にシツフ塩基を生成させ、減圧
濃縮乾固と共沸操作にて系を純化する。 該シツフ塩基の還元を行う際しては、通常のシ
ツフ塩基の還元剤を用いることができるが、中で
もボランコンプレツクスが好ましい。ボランコン
プレツクスは通常のものでも良いが、後工程のた
めには揮発性のボランコンプレツクスが好まし
く、例えばボランピリジンコンプレツクス、ボラ
ントリエチルアミンコンプレツクス、ボランジメ
チルアミンコンプレツクスが挙げられる。還元の
標準的な反応条件は常温〜100℃、１時間〜10時
間で、好ましくは約90℃１時間である。反応後、
減圧濃縮、共沸操作により不純物を除き、適当な
溶媒に溶かし、HPLC分析に供する。 本発明方法によれば螢光標識化反応収率がアル
ドース（アミノ糖を含む）、ケトースの区別なく
定量的となり、更に揮発性の試薬を用いた場合、
その除去操作も簡便に行うことが可能となつた。 〔実施例〕 以下に、本発明の実施例を示し、本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものでない。 実施例 １ Ｎ−アセチルグルコサミンの螢光標識 Ｎ−アセチルグルコサミン11.06mg（和光純薬
製のものをメタノールより再結晶させたもの）を
水100mlに溶解した。そのうち2μ（Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを1nmol含む）を反応チユーブに
入れ凍結乾燥にて水を除き、ピリジルアミノ化剤
（２−アミノピリジンの23M酢酸溶液）を10μ
加えた。封管した後、90℃にて保温した。15分
後、開管し、減圧濃縮とトリエチルアミンを用い
た共沸操作により余剰の試薬及び酢酸を留去し
た。残渣に50μのメタノールを加え溶解し、ボ
ラン・ピリジンコンプレツクス（アルドリツチ社
製）を2μ加え密封した。90℃にて１時間放置
し還元反応を行つた。反応後開封し、減圧濃縮と
共沸操作にて試薬及び溶媒を留去した。残渣を
200μの水に溶解させ、そのうち2μ（10pmol
相当）をHPLCにて分析した〔H.タケモト（H.
Takemoto）、S.ハセ及びT.イケナカ、アナリチ
カル バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第
145巻、第245頁（1985）〕。第１図にそのクロマト
グラムを、溶出時間（分、横軸）と螢光強度（縦
軸）との関係の図として示す。なお、カラムは、
ウルトラスフエアC18（ベツクマン社製）（4.6×
250mm）を用い、溶媒は0.025Mクエン酸ナトリウ
ム緩衝液・0.1％アセトニトリル含有（PH4.0）
で、流量0.8ml／分とした。また、このピークの
面積より螢光標識反応収率を求めた結果、螢光標
識化率94.1％であつた。 実施例 ２ フラクトースの螢光標識 フラクトース9.01mg（和光純薬製）を秤量し、
水100mlに溶解した。そのうち2μ（フラクトー
ス1nmolを含む）を反応チユーブに入れ以下の操
作は前述した実施例１のＮ−アセチルグルコサミ
ンの場合と同様の条件にて行い、同様の分析を行
つた。そのクロマトグラムを、第２図に第１図と
同様な関係の図として示す。また、このピーク面
積より螢光標識反応収率を求めた結果、螢光標識
化率92.3％であつた。 実施例 ３ フエツイン（ウシ胎児血清由来糖タンパク）の
糖鎖の分析 (1) フエツイン糖鎖の単離 フエツイン（シグマ社）480μｇ（1nmol）を
常法に従つてヒドラジン分解し、次いでＮ−ア
セチル化を行つた〔S.ハセ、T.イケナカ及び
Y.マツシマ（Y.Matsushima）、ジヤーナル
オブ バイオケミストリー第90巻、第407〜414
頁（1981）、又はS.タカサキ、T.ミズオチ及び
A.コバタ、メソツズ イン エンザイモロジ
ー、第83巻、第263頁（1982）参照〕。この糖鎖
とタンパク質の分解物を含む反応液を凍結乾燥
した。この凍結乾燥物にメタノール45μと、
5Mの２−アミノピリジンの酢酸溶液を5μ加
え、溶解し、90℃にて１分間反応させた後溶媒
を留去し、トリエチルアミンにて４回共沸する
ことにより未反応の２−アミノピリジンを除い
た。その残渣にメタノールを50μ加え溶解し
た後、ボラン・ピリジンコンプレツクス（アル
ドリツチ社）を2μ加え密封し90℃にて１時
間還元反応を行つた。反応後溶媒及び試薬を共
沸操作にて除去した。得られた残渣を周知の方
法〔S.ハセ、K.オカワ（K.Okawa）及びT.イ
ケナカ、ジヤーナル オブ バイオケミストリ
ー、第91巻、第735頁（1982）〕で逆相カラム
〔コスモシル5C18（半井化学）、4.6×250mm〕を
用いたHPLCにて、溶媒として0.1M酢酸アン
モニウム緩衝液、PH4.0（０％→0.5％のｎ−ブ
タノールのグラジエント）を用い、単離分取
し、酵素的、機器分析的手法による確認により
糖鎖Ａを得た。第３図は、そのカラムクロマト
分析結果を第１図と同様な関係で示す図であ
る。この溶出時間より、糖鎖Ａはコンプレツク
スタイプの構造をもつものと推定された。 (2) フエツインより得られた糖鎖Ａの組成分析 前記(1)に示したようにして得られた糖鎖Ａを
次に述べる２種類の方法にて加水分解し、それ
ぞれ２−アミノピリジンを用いて螢光標識を導
入し、分析した。 (a) 中性糖の分析 糖鎖100pmolを4M TFA水溶液60μに溶
解し、100℃で３時間加水分解した。反応液
を濃縮乾固し、その残渣を200μの10％ピ
リジン−メタノール溶液に溶解し、10μの
無水酢酸を添加し、数分間室温にて放置後
10-3トルの減圧下、濃縮乾固した。残渣をメ
タノール45μに溶解し、5Mの２−アミノ
ピリジンの酢酸溶液5μを加え90℃にて15
分間反応させた。その反応液を10-3トルの減
圧下濃縮乾固し、トリエチルアミンにて４回
共沸することにより未反応の２−アミノピリ
ジンを除いた。その残渣にメタノール50μ
を加え溶解後ボラン・ピリジンコンプレツク
スを2μ加え密封し、90℃にて１時間反応
させた。その後、10-3トルの減圧下濃縮乾
固、共沸を繰返し、得られた残渣を周知の方
法〔H.タケモト、S.ハセ及びT.イケナカ、
アナリチカル バイオケミストリー、第145
巻、第245頁（1985）〕にて分析した。結果を
後記第１表に示す。 (b) アイノ糖の分析 糖鎖100pmolを6M HCl 20μ と6M
TFA20μと水20μを加え、100℃、６時間
反応させて加水分解した。以降の操作は前記
(a)に準じた。結果を第１表に示す。なお第１
表は、中性糖・アミノ糖のそれぞれの分析結
果を内部標準（ラムノースを用いた）にて補
正したデータ（mol／mol糖鎖）である。
更に詳細には糖及び糖鎖の還元末端を定量的に螢
光標識し、pmol若しくはそれ以上の高感度にて
分析する方法に関する。 〔従来の技術〕 近年複合糖質の生理活性とその糖鎖構造との関
係の研究や遺伝子工学を用いて調製した糖タンパ
ク質と天然の糖タンパク質の糖鎖構造やその機能
の相違を調べる目的等でその構造の解析が必要と
なつてきている。しかし生体より調製した試料は
微量しか得られないことが多く、高感度の解析法
が要求されている。 現在行われている糖鎖の微量分析の方法は還元
末端を糖アルコールに変換する際に〔3H〕ラベ
ルを導入しその放射能活性を利用するものである
〔C.J.リアング（C.J.Liang）、K.ヤマシタ（K.
Yamashita）、C.G.ミユーレンベルク（C.G.
Muellenberg）、H.シチ（H.Shichi）及びA.コバ
タ（A.Kobata）、ジヤーナル オブ バイオロ
ジカル ケミストリー（J.Biol.Chem.）第254巻、
第6414頁（1979）、又はS.タカサキ（S.
Takasaki）、T.ミズオチ（T.Mizuochi）及びA.
コバタ、メソツズ イン エンザイモロジー
（methods in Enzymol.）第83巻、第263頁
（1982）参照〕。検出感度はpmolレベルであり、
良好であるが、放射性物質を用いるため数々の制
約がある。そこで注目されるのが、ピリジルアミ
ノ基を用いて螢光標識する方法である〔S.ハセ
（S.Hase）、T.イブキ（T.Ibuki）及びT.イケナカ
（T.Ikenaka）、ジヤーナル オブ バイオケミス
トリー（J.Biochem.）第95巻、第197〜203頁
（1984）、以下、従来法と称する〕。従来法では、
糖又は糖鎖の還元末端に塩酸を用いてピリジルア
ミノ基を導入してシツフ塩基とし、次いで不揮発
性のボランコンプレツクスで還元後320nｍの励
起波長を照射し、400nｍの螢光を検出するもの
で感度はpmolレベルである。 上記方法を用いれば、微量分析の分野で最も優
れた手段の１つである高速液体クロマトグラフイ
ー（HPLC）による分析が簡単に行え、しかも感
度は放射性物質を用いた場合と同等か又はそれ以
上である。 〔発明が解決しようとする問題点〕 しかしながら上記従来法では、目的とする化合
物の反応収率が原料糖類に対し75〜85％と低く定
量的でなかつた。またケトースに対する従来法の
反応収率は約10％程度であり、非常に不都合であ
つた。しかも従来法ではシツフ塩基の生成収量を
多くするため、原料糖類に対して大過剰量のピリ
ジルアミンを用い、更にナトリウムシアノボロハ
イドライド（NaBH3CN）を還元剤として大過
剰量用いている。したがつて螢光標識された糖類
を分析する際、余剰のピリジルアミンと
NaBH3CNをカラムクロマト操作により除去し
なければならず、その操作には時間と技術を必要
とし、更に高感度分析への妨げとなつている。 上記現状にかんがみ、本発明の目的は、螢光標
識化の反応収率を向上させ、更に操作を簡便に
し、一層の高感度化を可能とする糖類の微量分析
を行うための螢光標識方法を提供することにあ
る。 〔問題点を解決するための手段〕 本発明を概説すれば、本発明は糖類の螢光標識
方法に関し、アミノ基を有する螢光物質を糖類の
還元末端に標識化する反応を行うに際し、対イオ
ンとして実質上水を含まない酸を用いることを特
徴とする。 以下、本発明を詳細に説明する。 本発明における糖類としては例えば単糖、オリ
ゴ糖、多糖又は糖タンパクや糖脂質のような複合
糖質が挙げられる。糖タンパクや糖脂質のような
複合糖質より糖鎖を切出す方法としては公知法で
あるヒドラジン分解−Ｎ−アセチル化、トリフル
オロアセトリシス、アルカリ処理、酵素消化（エ
ンドグリコシダーゼ、グリコペプチダーゼ等）な
どがある。 本発明者らは鋭意検討の結果、従来法のシツフ
塩基の形成反応、すなわち螢光標識導入反応の段
階で用いられていた塩酸に換えて、実質上水を含
まない酸、例えば実質上無水の無機酸（有機溶媒
に溶解させた無機酸、例えばピリジンに溶解させ
たフツ化水素酸を含む）、有機酸〔例えば酢酸、
トリフルオロ酢酸（TFA）〕を用いることにより
良い結果が得られることを見出した。すなわち、
その反応とは、糖又は糖鎖である化合物に対して
過剰量のアミノ基をもつ螢光物質（例えば２−ア
ミノピリジン、２−アミノキノリン）を実質上無
水の酸中にて反応させるものである。 上記酸のうち酢酸が好ましいが、水を含まない
他の酸（例えばTFA）でも良い。 標準的な反応条件は常温〜100℃、数分〜１時
間で、好ましくは約90℃、15分間である。この反
応において定量的にシツフ塩基を生成させ、減圧
濃縮乾固と共沸操作にて系を純化する。 該シツフ塩基の還元を行う際しては、通常のシ
ツフ塩基の還元剤を用いることができるが、中で
もボランコンプレツクスが好ましい。ボランコン
プレツクスは通常のものでも良いが、後工程のた
めには揮発性のボランコンプレツクスが好まし
く、例えばボランピリジンコンプレツクス、ボラ
ントリエチルアミンコンプレツクス、ボランジメ
チルアミンコンプレツクスが挙げられる。還元の
標準的な反応条件は常温〜100℃、１時間〜10時
間で、好ましくは約90℃１時間である。反応後、
減圧濃縮、共沸操作により不純物を除き、適当な
溶媒に溶かし、HPLC分析に供する。 本発明方法によれば螢光標識化反応収率がアル
ドース（アミノ糖を含む）、ケトースの区別なく
定量的となり、更に揮発性の試薬を用いた場合、
その除去操作も簡便に行うことが可能となつた。 〔実施例〕 以下に、本発明の実施例を示し、本発明を具体
的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定さ
れるものでない。 実施例 １ Ｎ−アセチルグルコサミンの螢光標識 Ｎ−アセチルグルコサミン11.06mg（和光純薬
製のものをメタノールより再結晶させたもの）を
水100mlに溶解した。そのうち2μ（Ｎ−アセチ
ルグルコサミンを1nmol含む）を反応チユーブに
入れ凍結乾燥にて水を除き、ピリジルアミノ化剤
（２−アミノピリジンの23M酢酸溶液）を10μ
加えた。封管した後、90℃にて保温した。15分
後、開管し、減圧濃縮とトリエチルアミンを用い
た共沸操作により余剰の試薬及び酢酸を留去し
た。残渣に50μのメタノールを加え溶解し、ボ
ラン・ピリジンコンプレツクス（アルドリツチ社
製）を2μ加え密封した。90℃にて１時間放置
し還元反応を行つた。反応後開封し、減圧濃縮と
共沸操作にて試薬及び溶媒を留去した。残渣を
200μの水に溶解させ、そのうち2μ（10pmol
相当）をHPLCにて分析した〔H.タケモト（H.
Takemoto）、S.ハセ及びT.イケナカ、アナリチ
カル バイオケミストリー（Anal.Biochem.）第
145巻、第245頁（1985）〕。第１図にそのクロマト
グラムを、溶出時間（分、横軸）と螢光強度（縦
軸）との関係の図として示す。なお、カラムは、
ウルトラスフエアC18（ベツクマン社製）（4.6×
250mm）を用い、溶媒は0.025Mクエン酸ナトリウ
ム緩衝液・0.1％アセトニトリル含有（PH4.0）
で、流量0.8ml／分とした。また、このピークの
面積より螢光標識反応収率を求めた結果、螢光標
識化率94.1％であつた。 実施例 ２ フラクトースの螢光標識 フラクトース9.01mg（和光純薬製）を秤量し、
水100mlに溶解した。そのうち2μ（フラクトー
ス1nmolを含む）を反応チユーブに入れ以下の操
作は前述した実施例１のＮ−アセチルグルコサミ
ンの場合と同様の条件にて行い、同様の分析を行
つた。そのクロマトグラムを、第２図に第１図と
同様な関係の図として示す。また、このピーク面
積より螢光標識反応収率を求めた結果、螢光標識
化率92.3％であつた。 実施例 ３ フエツイン（ウシ胎児血清由来糖タンパク）の
糖鎖の分析 (1) フエツイン糖鎖の単離 フエツイン（シグマ社）480μｇ（1nmol）を
常法に従つてヒドラジン分解し、次いでＮ−ア
セチル化を行つた〔S.ハセ、T.イケナカ及び
Y.マツシマ（Y.Matsushima）、ジヤーナル
オブ バイオケミストリー第90巻、第407〜414
頁（1981）、又はS.タカサキ、T.ミズオチ及び
A.コバタ、メソツズ イン エンザイモロジ
ー、第83巻、第263頁（1982）参照〕。この糖鎖
とタンパク質の分解物を含む反応液を凍結乾燥
した。この凍結乾燥物にメタノール45μと、
5Mの２−アミノピリジンの酢酸溶液を5μ加
え、溶解し、90℃にて１分間反応させた後溶媒
を留去し、トリエチルアミンにて４回共沸する
ことにより未反応の２−アミノピリジンを除い
た。その残渣にメタノールを50μ加え溶解し
た後、ボラン・ピリジンコンプレツクス（アル
ドリツチ社）を2μ加え密封し90℃にて１時
間還元反応を行つた。反応後溶媒及び試薬を共
沸操作にて除去した。得られた残渣を周知の方
法〔S.ハセ、K.オカワ（K.Okawa）及びT.イ
ケナカ、ジヤーナル オブ バイオケミストリ
ー、第91巻、第735頁（1982）〕で逆相カラム
〔コスモシル5C18（半井化学）、4.6×250mm〕を
用いたHPLCにて、溶媒として0.1M酢酸アン
モニウム緩衝液、PH4.0（０％→0.5％のｎ−ブ
タノールのグラジエント）を用い、単離分取
し、酵素的、機器分析的手法による確認により
糖鎖Ａを得た。第３図は、そのカラムクロマト
分析結果を第１図と同様な関係で示す図であ
る。この溶出時間より、糖鎖Ａはコンプレツク
スタイプの構造をもつものと推定された。 (2) フエツインより得られた糖鎖Ａの組成分析 前記(1)に示したようにして得られた糖鎖Ａを
次に述べる２種類の方法にて加水分解し、それ
ぞれ２−アミノピリジンを用いて螢光標識を導
入し、分析した。 (a) 中性糖の分析 糖鎖100pmolを4M TFA水溶液60μに溶
解し、100℃で３時間加水分解した。反応液
を濃縮乾固し、その残渣を200μの10％ピ
リジン−メタノール溶液に溶解し、10μの
無水酢酸を添加し、数分間室温にて放置後
10-3トルの減圧下、濃縮乾固した。残渣をメ
タノール45μに溶解し、5Mの２−アミノ
ピリジンの酢酸溶液5μを加え90℃にて15
分間反応させた。その反応液を10-3トルの減
圧下濃縮乾固し、トリエチルアミンにて４回
共沸することにより未反応の２−アミノピリ
ジンを除いた。その残渣にメタノール50μ
を加え溶解後ボラン・ピリジンコンプレツク
スを2μ加え密封し、90℃にて１時間反応
させた。その後、10-3トルの減圧下濃縮乾
固、共沸を繰返し、得られた残渣を周知の方
法〔H.タケモト、S.ハセ及びT.イケナカ、
アナリチカル バイオケミストリー、第145
巻、第245頁（1985）〕にて分析した。結果を
後記第１表に示す。 (b) アイノ糖の分析 糖鎖100pmolを6M HCl 20μ と6M
TFA20μと水20μを加え、100℃、６時間
反応させて加水分解した。以降の操作は前記
(a)に準じた。結果を第１表に示す。なお第１
表は、中性糖・アミノ糖のそれぞれの分析結
果を内部標準（ラムノースを用いた）にて補
正したデータ（mol／mol糖鎖）である。
以上詳細に説明したとおり、本発明方法により
糖類の螢光標識化の反応を定量的に行うことが可
能となり、更に揮発性の還元剤を用いることによ
り操作が簡便化され、糖類の微量分析が可能とな
つた。
糖類の螢光標識化の反応を定量的に行うことが可
能となり、更に揮発性の還元剤を用いることによ
り操作が簡便化され、糖類の微量分析が可能とな
つた。
第１図は螢光標識化Ｎ−アセチルグルコサミン
の、第２図は螢光標識化フラクトースの各々の
HPLCクロマトグラフ分析結果を示す図、第３図
は螢光標識化フエツインの逆相カラムクロマトグ
ラフ分析結果を示す図である。
の、第２図は螢光標識化フラクトースの各々の
HPLCクロマトグラフ分析結果を示す図、第３図
は螢光標識化フエツインの逆相カラムクロマトグ
ラフ分析結果を示す図である。
Claims (1)
- １ アミノ基を有する螢光物質を糖類の還元末端
に標識化する反応を行うに際し、対イオンとして
実質上水を含まない酸を用いることを特徴とする
糖類の螢光標識方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62163980A JPS6410177A (en) | 1987-07-02 | 1987-07-02 | Fluorescent labeling method for saccharides |
| US07/209,723 US4975533A (en) | 1987-07-02 | 1988-06-22 | Method for the fluorescent labelling of sugars |
| GB8814944A GB2206691B (en) | 1987-07-02 | 1988-06-23 | Method for the fluorescent labelling of sugars |
| DE3821809A DE3821809A1 (de) | 1987-07-02 | 1988-06-28 | Verfahren zur fluoreszenzmarkierung von zuckern |
| SE8802478A SE503507C2 (sv) | 1987-07-02 | 1988-07-01 | Förfarande för fluorescent-märkning av sockerarter |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62163980A JPS6410177A (en) | 1987-07-02 | 1987-07-02 | Fluorescent labeling method for saccharides |
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|---|---|
| JPS6410177A JPS6410177A (en) | 1989-01-13 |
| JPH0565108B2 true JPH0565108B2 (ja) | 1993-09-17 |
Family
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Family Applications (1)
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