JPH0565232A - 動脈血栓症を処置するための製薬組成物の調製のためのスタフイロキナーゼの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 動物血栓、例えば心筋梗塞症の処置のための
医薬組成物の調製のためのスタフィロキナーゼの用途に
関する。スタフィロキナーゼは、血小板リッチな血餅の
溶解に対する血栓崩壊剤として特に有用であることが示
される。さらに、スタフィロキナーゼは、ストレプトキ
ナーゼと異なり、繰り返し投与により抗体誘導を誘導し
ない。 【構成】 薬効有効量のスタフィロキナーゼを含有して
なる動脈血栓の処置のための医薬組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は動脈血栓症を処置するた
めの製薬組成物の調製のためのスタフィロキナーゼの使
用に関する。より詳しくは、心筋梗塞を処置するための
製薬組成物の調製のためのスタフィロキナーゼの使用に
関する。

【０００２】

【従来の技術】心血管性疾患の血栓性合併症は死及び無
力の主原因であり、従って、血栓崩壊は、心筋梗塞、脳
血管性血管血栓性及び静脈血栓塞栓症のような生命を脅
かす疾患の結果に有利に影響する。血栓崩壊剤は血液中
の線維素溶解系の不活性前酵素、プラプミノーゲンを蛋
白分解酵素プラスミンに変換するプラスミノーゲンアク
チベータである。プラスミンは、血餅のフィブリンを溶
解するが、又、止血系の正常成分を崩壊させて、いわゆ
る溶解状態に導く。しかしながら、生理的線維素溶解
は、プラスミノーゲンアクチベータ、フィブリン、プラ
スミン(オーゲン)及びα₂−抗プラスミンの間の特異分
子相互作用の結果としてフィブリン志向である。

【０００３】最近、治療に用いられた血栓崩壊剤の一つ
はストレプトキナーゼである。ストレプトキナーゼはβ
−溶血連鎖球菌により分泌されるＭr４５,０００蛋白で
ある。それは、血栓崩壊治療に用いられるが、その投与
は、広範囲の全身性フィブリノーゲン衰弱と関連してい
る。発達している(evolving)急性心筋梗塞の患者におけ
る冠動脈血栓崩壊に対するその効力は限られ、９０分以
内に約５０％冠動脈再疎通になる。ストレプトキナーゼ
への暴露は処理患者の約５％にアレルギー反応を誘発し
て一貫して特異抗体形成を誘導し、それは、数ケ月以内
にその再使用を妨げる。さらにストレプトキナーゼ抗体
は、その血栓崩壊能力を限定する血小板活性化及びスロ
ンボキサン生成を促す。

【０００４】

【発明の目的・効果等】スタフィロキナーゼが、発達し
ている急性心筋梗塞を含む、例えば血小板リッチな動脈
血栓性疾患の患者に見られる血小板リッチな血餅への有
効な血栓崩壊剤であることが今や見い出された。ヒヒ及
びイヌでの実験は、前から存在する抗体がスタフィロキ
ナーゼに対して証明されないし、静脈内投与に続く抗体
を中和することの誘発もないことを示した。

【０００５】ハムスター肺塞栓症モデルにおいて、スタ
フィロキナーゼは、ストレプトキナーゼよりもμl当り
１,５００,０００血小板を含む血餅に対してより効果的
であることを示した。さらに、イヌにおいて、スタフィ
ロキナーゼによる動脈側(side)再疎通で、ストレプトキ
ナーゼによるよりも、より速やかで、より頻繁で、より
持続することが示された。

【０００６】即ち、本発明は、スタフィロキナーゼがス
トレプトキナーゼに対する実用的なもう一つの血栓崩壊
剤であり、後者の望ましくない副作用のないことを示
す。

【０００７】活性成分にスタフィロキナーゼを含み、ヒ
ト又は獣医の実施での動脈血栓症を処置するための製薬
組成物は、粉末又は溶液の形をとり、又、静脈内、動脈
内又は筋肉内投与に用いうる。かかる組成物は、活性化
合物を中性特性の製薬上許容しうる賦形剤(例えば、水
性又は非水性溶媒、安定剤、乳化剤、デタージエント、
添加剤)及びさらに要すれば色素と混同(例えば、混合、
溶解等)することにより調製しうる。治療組成物におけ
る活性成分の濃度は、疾患の特性及び投与のモードに依
存し、０．１％と１００％の間に広く変わりうる。さら
に、投与されるべき活性成分の用量は、体重kg当り０．
０５mgと１０mgの間に変わりうる。

【０００８】本発明は、以下の実施例でより詳細に示さ
れるが、これらは、本発明の範囲に対する限定を意図す
るものではない。

【０００９】実施例１ ハムスター肺塞栓症モデルにおける血小板リッチ及び血
小板濃縮(enriched)ヒト血漿血餅の血栓崩壊 血小板リッチヒト血漿血餅インビボに対するスタフィロ
キナーゼ及びストレプトキナーゼの血栓崩壊能力の評価
を、スタッセン、ジェイ・エム等、フィブリノリシス４
(補遺２)、１５−２１、１９９０に記載されるようにヘ
パリン添加ハムスターにおける肺塞栓症モデルを用いて
実施した。血小板リッチ血餅を、新鮮な血小板リッチヒ
ト血漿(血小板カウント３×１０⁵／μl)から又は、¹²⁵
Ｉ−標識フィブリノーゲンの痕跡を含む血小板濃縮ヒト
血漿(血小板カウント１．５×１０⁶／μl)から調製し
た。血小板リッチヒト血漿を、１０分間１００gで遠心
により酸−クエン酸塩−デキストロース上に集めた新鮮
な血液の１０ml試料から得た。血小板リッチ上清血漿
(約３ml)を除いて、２分間５００gで遠心して血小板ペ
レットを得た。血小板ペレットを２００μl血小板プア
のＡＣＤ血漿に再び懸濁し、５分間、１,０００gで遠心
した血液から得た。再懸濁した血小板ペレットの血小板
カウントを測定し、血小板プアクエン酸を加えた血漿で
３００,０００／μl(血小板リッチ血漿)又は１,５００,
０００(血小板濃縮血漿)の血小板カウントに調節した。

【００１０】５０μl¹²⁵Ｉ−フィブリン標識ヒト血小板
リッチ又は血小板濃縮血漿血餅を上記のようにインビト
ロで生成し、ヘパリン添加、非近交系ハムスターの頸静
脈に注射した。スタフィロキナーゼ又はストレプトキナ
ーゼは６０分にわたって静脈内に注入し、溶解を、血餅
に最初に取り込まれた放射活性と肺及び心臓における残
余放射活性の間の差として注入の終わりの３０分後に測
定した。実験の終わりに取った血液試料からの血漿にお
けるフィブリノーゲン及びα₂−抗プラスミンレベル
は、クラウス・エイ・、アクタ・ハエマト・ロジク、１
７、２３７−２４６。１９５７; 及びエディィ・ジェイ
等、プログレス・イン・ケミカル・フィブリノシス・ア
ンド・スロンボリシス、ダビドソン・ジェイ・エフ等、
第３巻、レイブン・プレス、ニュー・ヨーク、３１５−
３２２、１９７８に記載されるように測定した。

【００１１】ハムスター静脈血栓症モデルにおける試薬
の血栓崩壊能力(パーセント血餅溶解対体重kg当り投与
された化合物の用量)は以下のように測定した。パーセ
ント溶解対mg／kgにおける用量の値は、統計的プログラ
ムグラフィット(エリサクス社、ミドルセックス、英国)
を用いる指数に変化したＳ字状関数 このプログラムは、以下のパラメーターを測定させる。
パーセントにおいて成し遂げられた最大溶解(Ｃ); 血
餅溶解の比が最大であるkg体重当り投与されたmg化合物
における用量(b); kg体重当り投与されたmg化合物当り
のパーセント溶解における。血餅溶解の最大比率(Ｚ＝a
c／１・eb)。これらのパラメーターは平均±ＳＥＭとし
て得られ、これらのパラメーターの間の差の有意差はス
チューデントのt検定を用いて測定した。重量基準で測
定した相対能力パラメーターをストレプトキナーゼに対
し４５,０００及びスタフィロキナーゼに対し１５,５０
０の分子量に基づく、モル量に変換するため、スタフィ
ロキナーゼのb値; ストレプトキナーゼのそれらの相対
は因子３及び因子３により割られたＺ値を乗じなければ
ならない。

【００１２】化合物の相対血栓崩壊能力(kg体重当り投
与されたmg化合物当りのパーセント溶解)は、又、以下
の方法で示された。個体用量−反応データ(パーセント
溶解対mg／kgでの用量)は、背景溶解のため修正され、
修正データは、元を通って進められた直線状回帰直線と
一致した。回帰直線勾配間の差の有意差はスチューデン
トの検定を用いて測定した。結果は第１表にまとめた。
比較のため、血小板プアヒト血漿血餅で得た結果も含め
る。これらの結果は、詳細に他で報告されよう(リーネ
ン等、スロンボシス・アンド・ハエモスタシス、投稿
中)。第１表は、肺動脈における血小板リッチヒト血漿
血餅を伴うハムスターにおいて、生理食塩水注入を伴う
２５実験は、９０分で１８±２パーセント(平均±ＳＥ
Ｇ)の自然溶解に対する値を生じた。実験の終わりでフ
ィブリノーゲンレベルは基線値の１６０±１３パーセン
トで、α₂−抗プラスミンレベルは９５±５パーセント
であった。スタフィロキナーゼで、３ハムスターの群に
おける注入の開始後９０分で溶解は２７μg／kgで３８
±１７パーセントから９０μg／kgで７５±９パーセン
トに増加した。２７μg／kgの用量でストレプトキナー
ゼは９０分で３４±４パーセント溶解となり、一方、８
０μg／kgの濃度は９０±１パーセント溶解を起こし
た。肺動脈における血小板濃縮ヒト血漿を伴うハムスタ
ーでは、生理食塩水を伴う５実験は１９０分で１９±４
パーセント(平均±ＳＥＭ)の自然溶解のための値を生じ
た。フィブリノーゲンレベルは、基本線の１１０±１５
パーセントで、α₂−抗プラスミンは基本線の１４０±
１５パーセントであった。スタフィロキナーゼで、注入
の開始後９０分での溶解は、２７μg／kgで２３±３パ
ーセントから１６０μg／kgで８８±１パーセントに増
加した。８０μg／kgの用量でストレプトキナーゼは３
０±４パーセント溶解となり、５００μg／kgの用量で
６９±１１パーセント溶解となった。フィブリノーゲン
及びα₂−抗プラスミンレベルは、スタフィロキナーゼ
及びストレプトキナーゼの注入後、有意に下がらなかっ
た。

【００１３】指数に変化したＳ字状関数による用量−応
答の一致は第１表にまとめたようにＺ(血餅溶解の最大
比率)、b(最大溶解が起きる用量)及びc(達した最大溶
解)の値を生じた。ヒト血漿血餅へのスタフィロキナー
ゼの血栓崩壊能力は血小板数を増加することで変化しな
かった。血小板プア及び血小板リッチ血餅へのストレプ
トキナーゼの能力はスタフィロキナーゼのそれ(重量基
準)に類似するけれども、ストレプトキナーゼは、血小
板濃縮血漿血餅に対する明らかに減少した反応性を有し
た。結果は図１にも示され、血小板リッチ血漿血餅(３
００,０００血小板／μl)からなる(パネルＡ)又は血小
板濃縮ヒト血漿血餅(１,５００,０００血小板／μl)か
らなる(パネルＢ)、肺塞栓症を伴うハムスターにおい
て、スタフィロキナーゼ(●)及びストレプトキナーゼ
(■)の血栓崩壊能力(注入されたmg／kg化合物当りのパ
ーセント溶解)を示す。データは第１表にまとめたよう
に平均±ＳＥＭを表わし、関数 と一致する。データの直線状回帰分析は、ストレプトキ
ナーゼの有意に減少した血栓崩壊能力を確認されたが、
血小板濃縮血漿血餅に対するスタフィロキナーゼについ
てはされなかった(データ示さず)。

【００１４】実施例２ 混合大腿部静脈血餅及び血小板濃縮大腿部動脈外転移植
血栓を伴うイヌでの血栓崩壊 大腿部血栓崩壊モデルは、ジャング・イイ・ケイ等、サ
ーキュレーション７９、９２０−９２８、１９８９に記
載されるようにウサギ大腿部外転移植血栓崩壊モデルか
ら修飾した。体重１０−２０kgの大人の雑種犬を０．２
５mg／kgフルアニゾンを筋肉内に予め与え、必要ならば
挿管して人工的に通気して、３０mg／kg静脈内ペントバ
ルビタールナトリウム、次いで６０mgボーラスで麻酔し
た。セファシダール(１g)を静脈内に与えた。カテーテ
ルを血液サンプリングのため左頸部静脈に、犬の注入の
ため、上腕静脈に挿入した。左頸動脈を暴露して分離し
た。次いで、左頸動脈の３cm断片を切断し、裏返して生
理食塩水に浸漬した。次いで、左頸動脈を連続血圧モニ
ターリングのためカニューレ挿入した。右大腿部動脈を
鼠径部で暴露し、側枝が存在するとき連絡した。右大腿
部動脈の基線血流を電磁流プローブ(メデラート・デュ
ールン、ベルギー)で測定した。次いで、左頸動脈から
裏返した断片を７−０ナイロン(ＤＧアトラウマティク
(商標)アメリカン・サイアナミド・カンパニー、ダンブ
リィ、コネチカット)で１２−１６中断された縫合系を
用いて端から端へ吻合により横に開切した大腿部動脈に
挿入した。横に開切した動脈の基部及び端部末を閉ざす
微小血管クランプを次いで放した。裏返した切片は血栓
形成させて閉塞血栓の安定性を１時間モニターした。外
科手順は無菌条件下に実施された。血栓崩壊剤又はプラ
シーボの注入の開示から閉塞移植切片の再流までの時間
として取られる再疎通時間は、電磁流プローブで測定し
た。血液流は、３時間連続的に記録して再閉塞又は安定
再流を立証した。

【００１５】静脈血餅は、コリニンガー・シー等、クリ
ン・インベスト、６９、５７３−５８０、１９８２に記
載されるように左大腿部静脈に生成した。要するに、大
腿部静脈を、鼠径靭帯と端部分岐の間で分離し、カニュ
ーレ挿入した主な筋皮枝を除いて全ての側枝を注意して
連結した。内腔内への羊毛製系の導入後、４cmの切片の
大腿部静脈を二つの静脈クランプの間で分離し、空に
し、側枝カテーテルを経て生理食塩水で洗った。次い
で、切片を痕跡量の¹²⁵Ｉ−標識ヒトフィブリノーゲ
ン、０．６−１．２mlの新鮮な血液及び２単位のスロン
ビン溶液の混合物で満たした。静脈管クランプを右大腿
部動脈血餅が６０分間安定したのち、開放し、注入プロ
トコールを約１分後開始した。静脈血餅の放射性同位元
素量は、分離静脈切片に注入された¹²⁵Ｉの元の量か
ら、静脈切片の周りに置かれた綿スワブ上に吸収された
放射性同位元素を引くことにより計算し、血栓から血流
に流れ出た放射性コードをクランプの除去後、１分測定
した。血栓崩壊剤又はプラシーボの注入開始２時間後、
大腿部静脈の血栓形成切片を両側で連結し、除去し、そ
の放射性同位元素量を測定した。血餅溶解の程度は、静
脈切片における残余放射活性として測定し、血餅に元々
含まれる放射活性のパーセントで表わした。同位元素回
収バランスは(血管外分布に対し３を乗じた)、実験の終
わりでの全血液放射活性の和と、血餅に元から存在した
回収された血栓における放射活性と比較することにより
表わした。

【００１６】ヘパリンの静脈内ボーラス注射を受けた
(１時間当り１００u／kg３時間)全ての動物は右大腿部
動脈クランプの及び血栓崩壊剤の注入の開始前１０分ア
スピリン(５mg／kg)の除去前、開始した。６０分間安定
な動脈移植閉塞を伴う１３匹の犬を１６ないし３２μg
／kgスタフィロキナーゼ又は２５０ないし５００μg／k
gアスピリンとヘパリンは与えたが、血栓崩壊剤は与え
ない５匹のコントロール犬では、動脈閉塞が観察期間に
わたって持続した。３匹の犬で３２μg／kgの、１匹で
６２μg／kgの用量でスタフィロキナーゼの注入は、３
６±９分の再疎通への時間で全ての犬に再流と結びつ
き、これは、全ての犬で持続性の開放が続いた。３匹の
犬において１６μg／kgの用量でのスタフィロキナーゼ
の注入は３０±３分以内に再疎通を生じ、２匹の動物で
短期間で続いて再閉塞と再流が起きた。３匹の犬での５
００μg／kgの用量でのストレプトキナーゼの注入は、
２匹の犬で再流と結びつき、これは、１匹について持続
性の開放が続き、一方、３匹の犬で２５０μg／kgの用
量で９７±３分以内に再流を生じたが、これは、全ての
動物で循環再閉塞と再流が続いた。大腿部動脈血流と静
脈血餅溶解データの統計的分析は、スタフィロキナーゼ
が与えられた２つのグループ間にもストレプトキナーゼ
が与えられた２つのグループにも差が認められなかっ
た。従って、各犬の２つの用量で得られたデータは、次
の比較のために結合された。再流に対する時間は、スト
レプトキナーゼのグループが、スタフィロキナーゼのグ
ループより有意に長かった(p＝０．００６)。持続性閉
塞(ＰＯ)、最初の再疎通後の循環再閉塞(ＣＲ)及び最初
の再流後の持続性開放(ＰＰ)の配列に定められた開放状
態を伴うクルスカール−ウォーリス分析は、結合スタフ
ィロキナーゼと結合ストレプトキナーゼ群の間の差に対
してストレプトキナーゼの注入に付した。ヘパリンとア
スピリンは与えたが、血栓崩壊剤は与えない別の５匹の
犬をコントロールした。

【００１７】実験の間、直腸コントロール加温パッドを
体温３７．５℃を保つために用いた。血液ガス容量を決
まりきったようにチェックした。引き続き研究するため
に選択された幾つかの犬では、全てのカテーテルは、注
入後１時間に引き抜き、傷は縫い合わせた。自然呼吸が
戻ったら、気管チューブを除去して動物を、それらのケ
ージに戻した。水和を維持するため５００mlの０．９％
ＮaＣl溶液と１００mlの５％グルコースを傷をふさぐ前
に注入した。

【００１８】鋳型出血時間を研究犬の注射前及び注射６
０及び１２０分後に測定した。出血時間切り目を前足の
足の裏の表面に適用した自動バネ装填装置(シンプレー
トＩＩ, ジェネラル・ダイアグノスティス、モリス・プ
レインス、ニュー・ジャージィ)を用いて行なった。最
初の出血時間の実行の前に切り目部位の部分を洗い、毛
をそり、乾かした。血液試料を注入プロトコールの開始
前、開始後１０、３０、６０及び１２０分及び２４時間
にクエン酸(最終濃度０．１１Ｍ)で集めた。これらの試
料は、血小板カウント及びＡＤＰ(個々に滴定して約２
０μＭ)で誘導されたエクスビボ血小板凝集及びエピネ
フリン(約１０μＭ)とアラキドン酸(０．５mＭ)との組
み合わせの測定に用いた。血漿はフィブリノーゲンレベ
ルの即時測定のために得られ、α₂−抗プラスミン及び
活性化部分トロンボプラスチン時間の続く測定のために
凍結保存した。血小板カウントは、自動細胞カウンター
(セクオイア・ターナー・コーポレーション・マウンテ
ィン・ビュー、カリホルニア)で実施した。血小板凝集
は、標準血小板凝集計(クロノログ・コーポレーショ
ン、ハーバータウン、ペンシルバニア)を用いて血液サ
ンプリング後１時間以内に実施した。フィブリノーゲン
及びα₂−抗プラスミンは、スタッセン、ジェイ・エム
等、フィブリノリシス４(補遺２)、１５−２１、１９９
０に記載されるように測定し、活性化部分トロンボプラ
スミン時間は通常の実験室アッセーにより実施した。

【００１９】グループ間の動脈開放での違いの有意差
は、絶対的データに対するフィッシャーの正確検定ある
いは対の又は非対の値に対するスチューデントのt検定
を用いて比較した。分散のイルスカール−ウォリス非パ
ラメータ分析は、電磁血液流プローブで測定されたよう
に、０＝固執閉塞、１＝循環再閉塞及び再流続く、最初
の再疎通から２＝固執開放続く最初の道づけまで広がる
整然とした可変の大腿部動脈開放の順位で実施した。可
変性の分析のこの形は開放状態可変の非ガウシアンの分
布のゆえに選ばれた。

【００２０】裏返った頸動脈切片の横断大腿部動脈への
挿入後の大腿部動脈血流測定は、第２表にまとめられ
る。１８匹の犬全てで、血流は、管クランプの開放後、
回復し、基線の２０ないし３２％で安定化した。６０分
間持続する移植閉塞は、全ての犬に３０分以内に起き
た。０．０１６のp値を生じた心拍数及び血圧はグルー
プ間で有意に異ならなかった(データ示さず)。

【００２１】大腿部静脈血餅溶解及び同位元素回収も第
２表にまとめた。アスピリンとヘパリンは与えたが、血
栓崩壊剤を与えない５匹のコントロール犬において、明
白な血餅溶解の範囲は８６±６％の計算同位元素回収平
衡を伴う２３±６％であった。１６又は３２μg／kgス
タフィロキナーゼを与えたグループでは、血餅溶解の範
囲は、２５０又は５００μg／kgストレプトキナーゼを
それぞれ与えたグループにおける７１±６及び８１±６
％溶解に比べてそれぞれ７９±１０及び９２±３％であ
った。スタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼグル
ープ間の差は有意でなかった(p＝０．２０)。計算同位
元素回収平衡は全グループにおいて８６と１０８％の間
にわたった。

【００２２】凝集物において、犬でのスタフィロキナー
ゼ及びストレプトキナーゼで得た結果は、スタフィロキ
ナーゼの血栓崩壊能力が、モル基準でストレプトキナー
ゼのそれよりも少なくとも５倍高いことを示す。しかし
ながら、重要なことは、静脈血餅溶解に対して等効果で
ある用量で、スタフィロキナーゼはストレプトキナーゼ
よりも血小板リッチ動脈血栓に対して有意に高い能力を
有したことである。研究犬の注射前に測定した鋳型出血
時間は、平均２ないし１３分であった。出血時間はスタ
フィロキナーゼ又はストレプトキナーゼで顕著には延び
なかった。どちらかといえば、フィブリノーゲンを枯渇
(depleting)するスタフィロキナーゼでよりもフィブリ
ノーゲンと競う(sparing)ストレプトキナーゼでいくら
かより発した。ＡＤＰで誘導されたエクスビボ血小板凝
集はアスピリン及びヘパリンで変わらず、ストレプトキ
ナーゼで及びスタフィロキナーゼで緩慢にそこなった。
エピネフリンとアラキドン酸の組み合わせによる血小板
凝集はアスピリン注射の結果として完全に又はほとんど
完全に阻害された(データ示さず)。血小板数はどのグル
ープにおいても有意に変化しなかった。第３表は鋳型出
血時間、ＡＤＰ・誘導血小板凝集、血小板数及びフィブ
リノーゲン量(g／l)を示す。図２は裏返した大腿部動脈
移植、次いで、スタフィロキナーゼ(ＳＡＫ)、ストレプ
トキナーゼ(ＳＫ)又は食塩水(コントロール)の投与した
イヌにおける大腿部動脈再流及び再閉塞状態の概要表現
である。カッコの間に示される値は、パーセントで静脈
血餅溶解を示す。

【００２３】実施例３ 血漿におけるインビトロスタフィロキナーゼ／ストレプ
トキナーゼ試験 ３．１．ヒト及びヒヒ血漿 アマリィ・エイ等、スロンボシス・エト・ディアテリス
・ヘモラギカ、９、１７５−１８８、１９６３に記載さ
れたように実施されたスタフィロキナーゼ／ストレプト
キナーゼ試験、インビトロは、ヒト又はヒヒ血漿に適用
された。スタフィロキナーゼ又はストレプトキナーゼの
濃度を増加して(ストレプトキナーゼの２００ないし１
００,０００単位／ml又はスタフィロキナーゼの０．２
ないし１,０００μg／mlを含む５０μl容量)を３５０μ
lクエン酸処理血漿に加え、直ちにトロンビン(５０ＮＩ
Ｈ単位／ml)及びＣaＣl₂(２５mＭ)を含む１００μlの混
合物を添加した。

【００２４】８人の健康なヒトボランティアから得た血
漿試料において、２０分の血餅溶解時間を生ずるのに要
したスタフィロキナーゼの濃度は、０．７８から４．４
μg／mlに及ぶ個人値を伴う１．８±１．１μg／ml血漿
(平均±ＳＤ)であった。ストレプトキナーゼに対する比
較値は、０．１０から１．０μg／mlに及ぶ個人値を伴
う０．５０±０．３６μg／ml(平均±ＳＤ)であった。
冠動脈疾患を伴う患者から得た１４血漿試料において、
これらの値はスタフィロキナーゼに対して１．６±０．
６μg／ml(１．０ないし２．０μg／ml)とストレプトキ
ナーゼに対して０．４２±０．２８μg／ml(０．１４な
いし１．０μg／ml)であった。ヒヒ血漿において、２０
分で血餅溶解に要したスタフィロキナーゼの濃度は２．
０から４．７μg／mlに及ぶ個体値を伴う２．０±１．
０μg／ml(平均±ＳＤ:n＝６)であった。ストレプトキ
ナーゼに対して、対応値は５３から９３μg／mlに及ぶ
個体値を伴う６８±１１μg／ml(平均±ＳＤ;n＝９)で
あった。ストレプトキナーゼに対するヒヒ血漿の高抵抗
はプロティンＡ−セファローズでプールした血漿の吸収
後持続した。さらにヒヒ血漿のヒト血漿への添加(１:１
容量:容量比)はヒト血漿のストレプトキナーゼに対する
反応性を著しくは変えなかった。このことは、この薬物
で予め処理しなかった動物からの血漿のストレプトキナ
ーゼに対する高抵抗は、阻止物質の存在によるものでな
く、ヒヒ血漿線維素溶解系のストレプトキナーゼによる
インビトロに活性化に対する内因性抵抗によることを示
す。

【００２５】従って、ヒヒ血漿におけるスタフィロキナ
ーゼ又はストレプトキナーゼ中和抗体の検出のためのス
タフィロキナーゼ／ストレプトキナーゼ反応性試験は、
３００μlヒト血漿及び５０μl緩衝液の混合物を用いて
修飾し、ヒヒ血漿、ヒヒ血漿吸収プロティンＡ−セファ
ロース又はヒヒＩgＧ溶液(酸pＨでのプロティンＡ−セ
ファロース溶出)を用いた。血漿血餅溶解時間を測定
し、スタフィロキナーゼ対ストレプトキナーゼの濃度に
対してプロットした。この曲線から、２０分で完全血餅
溶解を生じたプラスミノーゲン活性化因子を測定した。
抗体力価は３００μlヒト及び５０μl緩衝液及びヒト血
漿のそれらとヒヒ血漿、ヒヒ血漿吸収プロティンＡ−セ
ファロース又はヒヒＩgＧ溶液の混合物から構成された
血餅を２０分で溶解するのに要する化合物の量における
差として定義された。

【００２６】中和抗体力価は、ヒト血漿に加えられた混
合物のml当りμg又はml当り単位で表わされた。このも
う一つのスタフィロキナーゼ／ストレプトキナーゼ反応
性試験は又、スタフィロキナーゼ又はストレプトキナー
ゼが与えられた動物から得られたイヌ血漿にも適用され
た。基線中和抗体力価はヒヒ血漿ml当り３９±３３単位
ストレプトキナーゼ(平均±ＳＤ、n＝８)で、一方、ス
タフィロキナーゼによる溶解に対してヒト血漿とヒヒ血
漿又は緩衝液との混合物では差は認められなかった。連
続的にアッセーした３匹のヒヒにおいて、ストレプトキ
ナーゼ中和抗体力価は、ストレプトキナーゼ投与後、１
週間以内に１,３００±１,０００単位／mlに増加し、３
週間後に７４０±２００単位に、６週間後に３８０±１
１０単位／mlに減少した。ストレプトキナーゼ投与後、
１週間で得た血漿試料の抗体力価は、プロティンＡ−セ
ファロース溶出液での阻止活性の全回収で、プロティン
Ａ−セファロースによる吸着により１,６００単位／ml
から１０単位／mlに減じた。これらのヒヒにおいて、ス
タフィロキナーゼ−中和抗体は、元の反応性試験及び上
で引用したようにヒヒ血漿又はプロティンＡ−セファロ
ース溶出液の添加による修飾スタフィロキナーゼ反応性
試験を用い、１ないし６週間隔で６３μg／kgスタフィ
ロキナーゼの４回静脈内投与の後、証明されなかった。
図３の左側の２つのバー(それぞれ縞とオープン)は、ヒ
ヒに対するスタフィロキナーゼ(縞のバー)及びストレプ
トキナーゼ(オープンバー)の投与に続く頸静脈血餅溶解
を示す。右側のバーは、繰り返し投与での体外ループ結
果を示す。スタフィロキナーゼ(●)及びストレプトキナ
ーゼ(■)に体する抗体力価も又示す。

【００２７】３．２．イヌ血漿 ループしたイヌ血漿において、２０分での血餅溶解に要
するスタフィロキナーゼの濃度は、０．１７μg／ml
で、ストレプトキナーゼに対する対応値は４７単位／ml
であった。別のスタフィロキナーゼ／ストレプトキナー
ゼ反応性試験で、イヌ血漿のストレプトキナーゼ中和活
性は７３±１０単位／ml(n−１２)であることが判っ
た。５００μg／kgストレプトキナーゼが与えられた２
匹のイヌでは、力価は、基線での６８±４単位から９日
後１６０±１０単位(p＜０．００１)に増加し、一方、
スタフィロキナーゼが与えられた２匹のイヌでは、スト
レプトキナーゼ中和抗体での有意な増加は、９日で見ら
れなかった(それぞれ７５±７及び９０±１４単位、p＝
０．３１)。ストレプトキナーゼ中和活性はイヌ血漿の
Ｉgフラクション(プロティンＡ−セファロース溶出液)
基線で又はスタフィロキナーゼ投与後検出されなかっ
た。しかしながら、ストレプトキナーゼ投与後、９日以
内に誘導された中和活性は、Ｉg溶出液に完全に回収さ
れた。このアッセーで、スタフィロキナーゼ−中和活性
はイヌ血漿のＩgフラクションにおいて、基線で又は３
２μg／kgスタフィロキナーゼ投与後９日で示さなかっ
た。

【００２８】実施例４ ヒヒにおけるインビボ頸静脈血栓症及び体外ループ血栓
症モデル ４．１．頸静脈血栓症モデル スタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼのインビボ
血栓崩壊性質をヒヒ(パピオ・ハマトラエウス)で比較し
た。０．２ml¹²⁵Ｉ−フィブリン標識自己全血餅をコル
ン等、サーキュレーション８２; １７４４−１７５３、
１９９０に記載されるように麻酔及び外科手術のための
手順を用いて分離頸静脈切片に生じた。プラスミノーゲ
ン活性化因子を１０％の５分にわたるゆっくりした静脈
注射で、次いで５５分かけて残り９０％用量の連続的注
入により静脈投与した。血栓崩壊を注入後３０分で、頸
静脈切片に残る放射活性の測定により定量した。別に血
栓崩壊の比をスタッセン・ジェイ・エム等、フィブリノ
リシス４(補遺２)、１５−２１、１９９０に既に記載さ
れるように外側のガンマ計算により連続的にモニターし
た。各ヒヒは２日の間隔で２回用い、ランダムにスタフ
ィロキナーゼ又はストレプトキナーゼで第１注入に、そ
して、他の薬剤で第２注入に付した。外科手術手順の失
敗は起こらず、研究は全９匹のヒヒからなった。４匹の
ヒヒにおいて、背景値を得るために、自然の血餅溶解の
率が血栓崩壊剤の注入前９０分間体外ガンマ計算した。

【００２９】血液試料を実験開始前、３０、６０及び９
０分に取った。これらの試料は放射活性、フィブリノー
ゲン及びα₂−抗プラスミンの測定に用いた(データ示さ
ず)。同位元素回収平衡は、実験の終わりに、静脈切片
に回収された同位元素量及び血液中のそれ(血管外分布
を補正するため因子３を乗ずる)を加えることによりな
した。頸静脈に誘導された自己全血餅を伴うヒヒにスタ
フィロキナーゼ又はストレプトキナーゼの６０分にわた
る静脈内注入に続く用量反応曲線を測定した(示さず)。
４つのコントロール実験において、連続的外側ガンマ計
算により測定されるように、９０分での背景溶解は３±
１％であった。スタフィロキナーゼ又はストレプトキナ
ーゼの全身注入は進行用量依存血餅溶解となった。血餅
溶解の範囲は、エクスビボ同位元素回収により測定され
るように、３２μg／kgスタフィロキナーゼで２７±１
１％(n＝３)であり、１２５μg／kgの用量で６８±１５
％(n＝３)に増加し、これに比べ、１２５μg／kgストレ
プトキナーゼで３７±１５％(n＝３)及び５００μg／kg
ストレプトキナーゼで６７±９％(n＝３)であった。同
位元素平衡は８６±１０及び９７±３％の間に及び(デ
ータ示さず)、血餅の有意な部分は塞栓形成により失わ
れなかったことが確認された。フィブリノーゲン及びα
₂−抗プラスミンレベルはどのグループでも減少しなか
った。活性部分トロンボプラスチン時間は全ての動物に
おいて、スタフィロキナーゼ又はストレプトキナーゼ注
入の開始後６０及び９０分で測定して５８±１３(平均
±ＳＥＭ、n＝１８)の基線値から＞３分に延長した(デ
ータ示さず)。

【００３０】連続外側ガンマ計算は、ゆっくりした開始
溶解、注入期間の後半の間の促進及び注入の終わりの３
０分観察の間の安定化(levelling−off)により特徴づけ
られるＳ字形溶解対時間曲線を示した。類似モル濃度で
のスタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼで得られ
た曲線の形は非常に似ていた。

【００３１】９０分で指数的に変形したＳ字形機能を伴
う血餅溶解の用量−応答データの適合は、b、z及びcに
対する値を生じた。スタフィロキナーゼの血栓崩壊能力
は、低b−値により及び高z−値により明らかにされるよ
うに、ストレプトキナーゼのそれよりもいくらか高い傾
向があった。エクスビボ同位元素回収方法で、b値は、
スタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼに対し、そ
れぞれ０．０３７±０．００８及び０．１１±０．０３
mg／kg(p＝０．０２４)でz値はそれぞれmg／kg当り１,
５００±８５０及び２９０±１２０パーセント溶解(p＝
０．１６)であった。外部ガンマ計算により得られた対
応値は、b−値に対してそれぞれ０．０３７±０．０１
４及び０．１４±０．０５mg／kg(p＝０．０６)で、z−
値に対してそれぞれmg／kg当り１,８００±２,１００及
び１７０±９６パーセント溶解であった。しかしなが
ら、スタフィロキナーゼ及びストレプトキナーゼの間の
分子量の差から、モル基準でのそれらの血栓崩壊能力は
事実上同一であった。

【００３２】４．２．体外ループ血栓症モデル スタフィロキナーゼまたはストレプトキナーゼインビボ
の反復注入の血栓崩壊性質も、体外動静脈ループに挿入
された、組み合わせた０．３ml ¹²⁵Ｉ−フィブリン標識
自己血漿血餅及び０．３ml ¹²⁵Ｉ−フィブリン標識プー
ルしたヒヒ血漿血餅を伴うヒヒ(パピオ・ハマドラエウ
ス)で比較した。従って、暴露した前方脛骨動脈は４フ
レンチカテーテル(ポーテックス・ホワイト、ホーテッ
クス、ハイテ、英国)を挿入し、２つの皮下注射器を経
てカテーテル挿入上腕静脈に連結した。体外ループを通
る血流はぜん動ポンプで１０ml／分に維持した。プール
したヒヒ血漿からの血餅は、基部の注射器に導入し、自
己血漿からの血餅は端部の注射器に導入した。血漿血餅
は、０．３ml血漿を痕跡量の(約１．５ＵＣi)¹²⁵Ｉ−標
識ヒトフィブリノーゲン溶液(アマーシャム、バッキン
グハムシャー、英国)、０．０７mlのウシトロンビン(１
５ＮＩＨ単位／ml)と０．５Ｍ ＣaＣl₂の混合物を混合
することにより調製し、３０分間３７℃でインキュベー
トした。注入の開始３０分前、７．５mg／kgリドグレル
(組み合わされたトロンボキサンシンターゼ阻害剤及び
プロスタグランジンエンドパーオキシドレセプター拮抗
物質)を体外ループにおける血小板沈澱を防ぐために静
脈内ボーラスとして投与した。ヒヒはヘパリンで(３０
０単位／kg、次いで実験を通して１時間当り６０単位／
kgの連続注入)抗凝固処理した。動物はランダムに１時
間にわたって６３μg／kgスタフィロキナーゼでまたは
２５０μg／kgストレプトキナーゼで注入、次いで注入
の終わりから３０分他の薬剤での第２注入に割り当て
た。２つの注入の間に体外ループにおける標識血漿血餅
を新鮮な血餅で置き換えた。血栓崩壊剤を１０％ボーラ
ス及び９０％注入として１時にわたり静脈内に与えた。

【００３３】３匹のヒヒで、スタフィロキナーゼ及びス
トレプトキナーゼ投与を最初の投与後、６週、７週、１
４週及び１４ 1/2週繰り返した。これらの動物におい
て、６３μg／kgスタフィロキナーゼ及び２５０μg／kg
ストレプトキナーゼによる溶解を体外動静脈ループで誘
導された血漿血餅で測定した(データ示さず)。６３μg/
kgスタフィロキナーゼによる溶解は頸静脈モデルで６６
±７％(平均±ＳＥＭ、n＝３)で、最初の投与後６、
７、１４及び１４ 1/2週で測定した体外ループにおい
て、それぞれ、７８±６、８０±５、７８±１、及び７
０±９％であった。これらの値は有意に異ならなかっ
た。頸静脈モデルにおける２５０μg／kgストレプトキ
ナーゼによる溶解は５４±５％(n＝３)で６、７、１４
及び１４ 1/2週後、体外ループにおいて、それぞれ、２
４±８、２９±９、５７±２及び２３±７％であった。
基線頸静脈血餅溶解と６週での体外血餅溶解の間の差は
有意であった(p＝０．０４)。第７と第１４週の間で、
２９±９から５７±２％(p＝０．０３)に有意に回収さ
れたストレプトキナーゼに対する反応性は、基線頸静脈
血餅溶解値に類似となり、しかし、再度新しくストレプ
トキナーゼ投与後３日である１４ 1/2週で、０．２５mg
／kgストレプトキナーゼによる血餅溶解は再び有意に減
じた(５７±２から２３±７％へ(p＝０．００３))。

【００３４】図３の右側の４組のバーは、体外ループモ
デルにおけるヒヒへのスタフィロキナーゼ(縞バー)及び
ストレプトキナーゼ(オープンバー)の繰り返し投与に続
く血漿血餅溶解実験の結果を示す。スタフィロキナーゼ
(●)及びストレプトキナーゼ(□)に対する抗体力価も示
す。図はストレプトキナーゼに比べてスタフィロキナー
ゼのより高い血餅溶解能力及びより低い抗体力価を非常
に明らかに示す。これらのデータは、ヒヒにおけるスト
レプトキナーゼ投与が、ヒトに観察されるように、再度
新しい投与による血餅溶解に対する結合耐性による中和
抗体形成を誘導することを示す。中和抗体は、ヒト又は
ヒヒ血漿には示されず、スタフィロキナーゼ投与での中
和抗体の誘導は示されず、スタフィロキナーゼの繰り返
し投与による血餅溶解は、ずっと変わらなかった。上記
実施例はストレプトキナーゼに対する比較で、スタフィ
ロキナーゼが、心筋梗塞症のような動物血栓性疾患に見
られるような血小板リッチな血餅に対し、有効なプラス
ミノゲーンアクチベーターであること、及び抗体生成を
誘導せず、従って、繰り返し投与が可能であることを示
す。

【表１】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】

【表６】

【表７】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】 肺塞栓症を伴うハムスターにおいてスタフィ
ロキナーゼ及びストレプトキナーゼの血栓崩壊能力を示
す。

【図２】 スタフィロキナーゼ又はストレプトキナーゼ
を投与したイヌにおける大腿部動物再流及び再閉塞状態
の概要表現である。

【図３】 ヒヒに対するスタフィロキナーゼ及びストレ
プトキナーゼの投与に続く頸静脈血餅溶解、及び繰り返
し投与での体外ループ血漿血餅溶解実験結果を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 592051486 デジレ・ジヨゼ・コレン ＤＥＳＩＲＥ ＪＯＳＥ ＣＯＬＬＥＮ ベルギー、ベー−3020ウインクセーレ−ヘ レント、シヨーンジヒトラーン20番 (72)発明者 デジレ・ジヨゼ・コレン ベルギー、ベー−3020ウインクセーレ−ヘ レント、シヨーンジヒトラーン20番 (72)発明者 ジヤン−マリー・スターセン ベルギー、ベー−3012ウイルセーレ、ヨゼ フ・ラフオートストラート５番 (72)発明者 アンリ・ロジエ・レイネン ベルギー、ベー−3020ヘレント、アカシア ラーン50アー番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動脈血栓症を処置するための製薬組成物
   の調製のためのスタフィロキナーゼの使用。
2. 【請求項２】 動脈血栓症が心筋梗塞である動脈血栓症
   を処置するための製薬組成物の調製のためのスタフィロ
   キナーゼの使用。
3. 【請求項３】 スタフィロキナーゼが組換えスタフィロ
   キナーゼである先行請求項のいずれか一つのスタフィロ
   キナーゼの使用。