JPH0565286A - 抗悪性腫瘍剤の測定法および試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 抗悪性腫瘍剤である式（Ｉ） 【化１】 ［式中、ｎは１〜６の整数を示す］で表わされる化合物
またはその塩の測定法および試薬。 【構成】 試料中の式（Ｉ）の化合物またはその塩の免
疫化学的測定に有用な、式（Ｉ）の化合物またはその塩
に対する特異抗体、標識化化合物、これらを用いる測定
法および測定キット。式（Ｉ）の化合物中、ｎが１のも
のは抗悪性腫瘍剤として有用であり、その免疫化学的測
定は該抗悪性腫瘍剤の臨床における使用に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗悪性腫瘍活性を有す
る式（Ｉ）

【化２】 ［式中、ｎは１〜６の整数を示す］で表わされる化合物
またはその塩に対する抗体およびこれを利用する免疫化
学的測定法ならびに試薬キットに関する。

【０００２】

【従来の技術】式（Ｉ）において、nが１の化合物、す
なわち、（＋）−Ｎ−［４−［３−（２,４−ジアミノ
−７Ｈ−ピロロ［２,３−d］ピリミジン−５−イル）−
プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸（以下、Ｔ
ＮＰ−３５１と略す）は、強い抗悪性腫瘍活性を有する
ことが知られており（特開平２−１６７２８１号）、ヒ
トの腫瘍や移植癌に対して強い増殖抑制効果と広い活性
を有している。

【０００３】一方、臨床における薬物投与による最大の
薬効をあげるために、また、副作用を最少限に止める為
にも、血中もしくは体液中の薬物やその代謝産物の濃度
を測定し、投与する薬物量を制御することが必要であ
る。また、治療効果を観察しながら、薬用量を決定する
には、日常の検査のために、測定感度が高く、かつ、使
用が容易な薬物の測定方法が必要とされる。

【０００４】

【発明が解決すべき課題】ＴＮＰ−３５１を抗悪性腫瘍
剤として用いるに際し、検体中のＴＮＰ−３５１やその
代謝産物を測定できる感度の高い、かつ、使用が容易な
方法は未だ見当たらない。

【０００５】本発明者らは、多くの検討を加えた結果、
ＴＮＰ−３５１やその代謝産物に対する抗体を得、それ
を利用する免疫化学的測定法を確立し、本抗悪性腫瘍剤
を正確かつ簡便に定量するための試薬キットを作製する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は式（Ｉ）で表わ
される化合物またはその塩に特異的に反応する抗体およ
び式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の標識化化
合物を提供するものである。また、本発明は、式（Ｉ）
で表わされる化合物またはその塩を測定するに際し、該
抗体および該標識化化合物を用いて免疫化学的方法によ
り測定を行うことを特徴とする式（Ｉ）で表わされる化
合物またはその塩の測定法および該抗体と該標識化化合
物を必須成分として構成されることを特徴とする式
（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の免疫化学的測
定キットを提供するものである。

【０００７】式（Ｉ）の化合物のうち、ｎが２以上のも
の、特にｎが２または３のものはＴＮＰ−３５１の投与
により生体中に見出される活性代謝産物である。また、
式（Ｉ）の化合物の塩として、塩基の塩としては、アル
カリ金属、アルカリ土類金属、非毒性金属、アンモニウ
ムおよび置換アンモニウム、例えば、ナトリウム、カリ
ウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニ
ウム、亜鉛、アンモニウム、トリメチルアンモニウム、
トリエチルアンモニウム、トリエタノールアンモニウ
ム、ピリジニウム、置換ピリジニウムなどの塩が挙げら
れる。酸の塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リ
ン酸、ホウ酸などとの鉱酸塩、シウ酸、酒石酸、酢酸、
トリフルオロ酢酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホ
ン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸
などとの有機酸塩が挙げられる。

【０００８】本発明の抗体は式（Ｉ）で表わされる化合
物またはその塩を以下のごとく、動物に接種して得るこ
とができる。

【０００９】例えば、ＴＮＰ−３５１は分子式Ｃ₂₁Ｈ₂₄
Ｎ₆Ｏ₅で表わされ、分子量４４０．４６であり、いわゆ
るハプテンと総称されるグループに分類される。したが
って、このようなパプテンはそれ自身動物に免疫しても
抗体の得られないことが多く、適当なキャリア蛋白と結
合させた後、動物に接種される。

【００１０】ＴＮＰ−３５１をキャリア用タンパクとを
結合させる方法としては自体公知の方法を用いることが
できる。例えば、ＴＮＰ−３５１に存在するカルボキシ
ル基とキャリアタンパクに存在するアミノ基とを直接化
学的に結合させる方法として、カルボジイミド法が好適
な例として挙げられる［アンチミクロバイアル・エイジ
ェンツ・アンド・ケモテラピー（ＡntimicrobialＡgent
s and Ｃhemotherapy）第７巻、第４２頁（１９７５
年）および同第１０巻、第６５２頁（１９７６年）］。
また、ＴＮＰ−３５１とキャリアタンパクの間に公知技
術に従ってジアミン系化合物を介在させてもよい。ここ
においてキャリア用タンパクとは、単独では抗体産生を
誘導することができないペプチドなど、ハプテン（低分
子量物質）に対する抗体を産生させるためにハプテンと
結合させて用いられるものをいい、その例としては、例
えば、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、牛チロ
グロブリン、破傷風トキソイド、ヘモシアニンおよびポ
リアミノ酸などが挙げられる。

【００１１】キャリア用タンパクに結合させるＴＮＰ−
３５１は等モルから５０倍モル量が適当であり、約４倍
モルから約２０倍モル量が良好な結果を与える場合が多
い。

【００１２】ＴＮＰ−３５１キャリアタンパク複合体
（以下、縮合生成物と略称することもある）は人以外の
温血動物に接種される。ＴＮＰ−３５１に特異的に反応
する抗体の製造に用いられる人以外の温血動物として
は、例えば、哺乳温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラッ
ト、マウス、モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類
（例、ニワトリ、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）な
どが挙げられる。

【００１３】該縮合生成物を人以外の温血動物に接種す
るには、接種する縮合生成物の量は抗体産生するに有効
な量でよく、例えば、ウサギに１回２mgの縮合生成物を
等容量（１ml）の生理食塩水およびフロインドの完全ア
ジュバントで乳化して、背部ならびに後肢掌皮下に２〜
４週間おきに約５回接種すると抗体を産生させ得る。

【００１４】このようにして、温血動物中に形成された
抗体を採取する方法としては、例えば、ウサギでは、通
常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取し、
遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清は、
通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるアフィ
ニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収するこ
とによりポリクローナル抗体を精製することができる。

【００１５】他の式（Ｉ）の化合物およびその塩に特異
的に反応する抗体も同様にして得られる。

【００１６】また、ミルスタイン（Ｍilstein）らの方
法［ネイチャー（Ｎature）、第２５６巻（１９７
５）、第４９５頁］に記載の方法と同様の方法により得
られるモノクローナル抗体も利用できる。即ち、該モノ
クローナル抗体は、免疫原のポリペプチドまたは蛋白複
合体で哺乳動物を免疫し、取りだした脾臓細胞と同種ま
たは異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリ
ドーマとし、これをクローン化し、ここで得られたハイ
ブリドーマを哺乳動物に接種し、モノクローナル抗体を
生成蓄積せしめ、これを採取して製造される。

【００１７】抗体分子は、ＩgＧ（免疫グロブリンＧ）
でもよく、または、そのフラクション｛例、Ｆ(ab')₂,
Ｆab'もしくはＦab｝であってもよい。

【００１８】このようにして得られた抗体は、ＴＮＰ−
３５１やその代謝物である式（Ｉ）の化合物およびその
塩の免疫化学的測定法における試薬として用いることが
できる。

【００１９】ＴＮＰ−３５１の免疫化学的測定法によっ
て、生体組織や体液中のＴＮＰ−３５１やその代謝産物
の検出・定量が可能となる。これにより、前記のごと
く、例えば、種々の組織や体液中のＴＮＰ−３５１を検
出・定量することにより、ＴＮＰ−３５１の生体内動態
の解析が可能となるとともに、精確な検出・定量が可能
になる。これにより、臨床における最大の薬効をあげる
にも、また、副作用を最少限に止めるためにも、血中も
しくは体液中の薬物濃度を測定し、投与する薬物量を制
御することができる。

【００２０】ＴＮＰ−３５１等の免疫化学的測定法とし
ては自体公知の方法が挙げられる（入江実編“ラジオイ
ムノアッセイ”、講談社、１９７４年、入江実編“続ラ
ジオイムノアッセイ”、講談社サイエンティフィク、１
９７９年、石川栄治他編“酵素免疫測定法”、医学書
院、１９８７年）。

【００２１】免疫測定法は、反応形式として競合法と非
競合法に分類され、Ｂ／Ｆ分離の有無により不均一系
（ヘテロジニアス系）と均一系（ホモジニアス系）とに
分類される。本発明のＴＮＰ−３５１等の免疫化学的測
定法としては、理論的にはいずれの方法でも用いること
は可能であるが、実際的には競合法における不均一系も
しくは均一系が有利である。

【００２２】ＴＮＰ−３５１等の測定において用いられ
る本発明の抗体としては、溶液中の抗体もしくは担体上
に保持された抗体が挙げられる。該担体としては、例え
ば、ゲル粒子｛例、アガロースゲル［例、セファロース
４Ｂ、セファロース６Ｂ、（ファルマシア・ファインケ
ミカル社、スェーデン）製］、デキストランゲル［例、
セファデックスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、
セファデックスＧ−２００（ファルマシア・ファインケ
ミカル社、スェーデン）製］、ポリアクリルアミドゲル
［例、バイオゲルＰ−３０、バイオゲルＰ−６０、バイ
オゲルＰ−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社、
米国））製］｝、セルロース粒子［例、アビセル（旭化
成製）、イオン交換セルロース（例、ジエチルアミノエ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース）］、物
理的吸着剤［例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッ
ド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキルガラスロ
ッド）、シリコン片、ステンレス系樹脂（例、ポリスチ
レン球、ポリスチレン粒子）、イムノアッセイ用プレー
ト（例、ヌンク社、デンマーク）製］、イオン交換樹脂
｛例、弱酸性イオン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲ
Ｃ−５０（ローム・アンドハース社、米国）製、ゼオカ
ーブ２２６（パームチット社、西ドイツ）製、弱塩基性
陰イオン交換樹脂［例、アンバーライトＩＲ−４Ｂ、ダ
ウエックス３（ダウケミカル社、米国）製］｝などが挙
げられる。

【００２３】担体に抗体を保持させるには、公知の常套
手段を応用し得るが、例えば、「代謝」、第８巻（１９
７１年）、第６９６頁に記載されているブロムシアン
法、グルタールアルデヒド法などが挙げられる。また、
より簡便な方法として物理的に抗体表面に吸着させても
よい。

【００２４】本発明の標識化化合物は式（Ｉ）の化合物
またはその塩に標識剤を結合させたもので、標識剤とし
ては放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、スピ
ン化合物、金属コロイドなどが挙げられる。

【００２５】放射性同位元素としてはたとえば¹²⁵Ｉ,
¹³¹Ｉ,³Ｈ,¹⁴Ｃなどが、酵素としては、安定で比活性の
大きなものが好ましく、その例としては、（１）カルボ
ヒドラーゼ［例、グリコシダーゼ（例、β−ガラクトシ
ダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、
β−フルクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、α−グ
ルコシダーゼ、α−マンノシダーゼ）、アミラーゼ
（例、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、イソアミラー
ゼ、グルコアミラーゼ、タカアミラーゼＡ）、セルラー
ゼ、リゾチーム］、（２）アミラーゼ（例、ウレアー
ゼ、アスパラギナーゼ）、（３）エステラーゼ［例、コ
リンエステラーゼ（例、アセチルコリンエステラー
ゼ）、ホスファターゼ（例、アルカリホスファター
ゼ）、スルファターゼ、リパーゼ］、（４）ヌクレアー
ゼ（例、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアー
ゼ）、（５）鉄・ポルフイリン酵素（例、カタラーゼ、
ペルオキシダーゼ、チトクロームオキシダーゼ）、
（６）銅酵素（例、チロシナーゼ、アスコルビン酸オキ
シダーゼ）、（７）脱水素酵素（例、アルコール脱水素
酵素、リンゴ酸脱水素酵素、乳酸脱水素酵素、イソクエ
ン酸脱水素酵素）などが、蛍光物質としては、フルオレ
スカミン、フルオレッセンスイソチオシアネートなど
が、発光物質としてはルミノール、ルミノール誘導体、
ルシフエリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。
スピン化合物としては、各種ニトロキシド、ラジカル
類、金属コロイドとしては、金コロイド、セレンコロイ
ド等が挙げられる。

【００２６】式（Ｉ）の化合物およびその塩に標識剤を
結合させるには自体公知の方法で行なうことができる。
例えば、ＴＮＰ−３５１のアミノ基もしくはカルボキシ
ル基を利用して標識剤と化学的に結合させることができ
る。例えばグルタルアルデヒド法、トルエンジイソシア
ネート法、水溶性カルボジイミド法、活性エステル法さ
らにＮ−サクシニミジル−マレイミド−カルボキシレー
ト誘導体を用いる方法などが挙げられる［イムノケミス
トリー（Ｉmmunochemistry）、第６巻、第４３頁（１９
６９年）、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ
ournal of Ｂiochemistry）、第８４巻、第４９１頁
（１９７８年）および同第９２巻、第５８５頁（１９８
２年）］。また、所望により標識剤を導入するためにス
ペーサーを導入してもよい。例えば、常套手段であるク
ロラミンＴ法［ネーチャー、第１９４巻（１９６２
年）、第４９５頁］、過ヨウ素酸法［ジャーナル・オブ
・ヒストケミストリー・アンド・シトケミストリー（Ｊ
ounal of Ｈistochemistry andＣytochemistry）、第２
２巻（１９７４年）、第１０８４頁］、マレイミド法
［ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊounal of
Ｂiochemistry）、第７９巻（１９７６年）、第２３３
頁］など公知の方法が用いられる。

【００２７】本発明の測定法は、前記のごとく、いずれ
の免疫化学的測定法も採用できるが、競合法における不
均一系もしくは均一系を採用することが好ましい。以
下、ＴＮＰ−３５１を例として本発明の測定法を説明す
る。

【００２８】競合法による特異的免疫化学的測定方法を
実施するには、例えば、未知量のＴＮＰ−３５１を含有
する試料（例、血液、血清、血しょう、脊髄液、尿、組
織抽出液等）に一定量の標識化ＴＮＰ−３５１と、一定
量の特異抗体を反応させた後、物理的もしくは化学的に
抗種抗体を結合させた固相を加えて反応させる。つい
で、通常、固相を良く洗浄し、固相上に結合している標
識剤の活性を測定する。標識剤が放射性同位元素である
場合、ウエルカウンターもしくは液体シンチレーション
カウンターで測定する。標識剤が酵素である場合、基質
を加えて放置し、比色法もしくは蛍光法で酵素活性を測
定する。標識剤が蛍光物質、発光物質であっても、それ
ぞれ公知の方法に従って測定する。

【００２９】本発明の測定法のＥＩＡの例として、標識
剤が西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の場合につ
いて以下に具体的に説明するが、ＨＲＰに限定されるも
のではない。 （１）:被検液に一定量のＨＲＰで標識したＴＮＰ−３
５１を一定量加えて混和する。 （２）:標識されたＴＮＰ−３５１の一定量に対応する
一定量の抗体を加えて混和し、競合反応をさせる。 （３）:（２）で得られた反応生成物に（２）の抗体を
作製する時に使用した動物のイムノグロブリンに対する
異種抗体（以下抗種抗体と略称する）を固定した固相を
加えて一定温度で一定時間反応させる。 （４）:固相は良く洗浄し、ＨＲＰ活性を測定する。 （５）:前記（１）〜（４）の操作を既知量のＴＮＰ−
３５１の標準溶液に対してあらかじめ行い、ＴＮＰ−３
５１濃度とＨＲＰ活性の関係を標準曲線として作成して
おく。 （６）:未知量の分析対象物（被検試料）について得ら
れたＨＲＰ活性を標準曲線にあてはめ、分析対象物中の
抗体と反応する被測定物質の量を測定する。

【００３０】本発明の測定法には、本発明の抗体および
標識化合物を必須成分として構成される測定キットを用
いることができ、本発明はかかる測定キットを提供す
る。以下、ＴＮＰ−３５１を例として本発明の測定キッ
トを説明する。

【００３１】本発明の、例えば、競合法による免疫化学
的測定法の実施に用いる定量用キットとしては、例え
ば、以下の（１）〜（７）の試薬からなるものが挙げら
れる。 （１）ＴＮＰ−３５１を含む標準溶液 （２）標識化されたＴＮＰ−３５１ （３）被測定物質に対する特異抗体 （４）（３）の特異抗体に対する抗種抗体を結合させた
固相 （５）これら（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に用
いることができる緩衝剤であればいずれもよいが、その
一例としてはpＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン
緩衝液が挙げられる。） （６）インキュベーション後、固相の洗浄に用いる緩衝
液（該固相の洗浄に用いることができる緩衝剤であれば
いずれもよいが、その一例としては、pＨ６〜９のリン
酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられる。） （７）標識剤として酵素を用いる場合は、酵素の測定に
必要な試薬［その一例として蛍光法によるペルオキシダ
ーゼ活性の場合、酵素基質としてp−ハイドロキシフェ
ニル酢酸と過酸化水素、比色法の場合、o−フェニレン
ジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解に用いる緩衝液
（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素反応停止液が挙
げられる。さらに発光法の場合、ルミノール類,酸化剤
（好ましくは過酸化水素）および化学発光増強剤などが
挙げられる。］

【００３２】また、標識剤に発光性物質を用いる場合
は、該発光性物質を測定する材料。その一例としてルミ
ノールでは酸化剤（好ましくは過酸化水素）、触媒（ミ
クロパーオキシダーゼまたは次亜塩素酸塩など）および
触媒の溶解に用いる緩衝液（好ましくは水酸化ナトリウ
ム液または炭酸緩衝液）などが挙げられる。

【００３３】上記のキットはたとえば下記の方法により
使用するのが好ましい。標準溶液もしくは被検液１０〜
２００μlに試薬（２）の約１０〜２００μlを加えてよ
く混和した後、試薬（３）の約１０〜２００μlを加え
てよく混和させる。つぎに試薬（４）を加えた後、約０
〜４０℃で約１０分〜２日間反応させる。反応後、固相
を試薬（６）で洗浄し固相上に結合している標識剤の活
性を測定する。標識剤が放射性同位元素である場合、公
知方法に従ってウエルカウンターもしくは液体シンチレ
ーションカウンターで測定する。標識剤が酵素である場
合、それぞれ公知の方法で酵素活性を測定する（例え
ば、辻章夫ら、蛋白質核酸酵素、別冊 Ｎo．３１（１
９８７年）、第５１頁に記載されている）。

【００３４】標識剤が蛍光物質、発光性物質であって
も、それぞれ公知の常套手段によって測定し得る。

【００３５】本発明の測定用キットにおける各試薬は常
法に従って、このような試薬として通常用いられる固体
ないし液体の剤形とすることができ、また、複数の試薬
を１つの剤形にまとめてもよい。

【００３６】さらに、本発明の簡便な測定系として、未
知量のＴＮＰ−３５１を含有する試料に一定量の標識化
ＴＮＰ−３５１と一定量の固相化された抗ＴＮＰ−３５
１抗体を反応させ、固相上に結合している標識剤の活性
を測定する方法ならびにキットが挙げられる。また、ホ
モジニアス系として、例えば、抗原抗体反応の結果、標
識剤としての酵素の活性の変化量や蛍光偏光度の変化量
を計測する原理に基づく方法も容易に実施できる。

【００３７】

【実施例】以下に参考例および実施例を挙げて、本発明
をさらに詳しく説明するが、これらは例示、説明のため
のものであって何ら限定を意味するものではない。 参考例１ ４−（４−メトキシ−３−ブテニル）安息香酸ｔｅｒｔ
−ブチルの製造 （メトキシメチル）トリフェニルホスホニウムクロリド
（３．７７ｇ）のトルエン溶液（１２ｍｌ）に０℃でカ
リウムｔｅｒｔ−ブトキシドの１．０モルテトラヒドロ
フラン溶液（１１．０ｍｌ）を加え、１０分間撹拌後、
同温度で４−（３−オキソプロピル）安息香酸ｔｅｒｔ
−ブチル（２．３４ｇ）のトルエン溶液（１０ｍｌ）を
滴下し、０℃で２０分間撹拌した。反応液にエーテル
（４０ｍｌ）を加えて有機層を分取し、有機層は水、飽
和食塩水で順次洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し
た。減圧下に溶媒を留去、得られた残渣にヘキサンを加
えて生じたトリフェニルホスフィンオキシドを濾去し
た。濾液は減圧下に濃縮し、残渣をカラムクロマトグラ
フィー（シリカゲル８０ｇ、エーテル−ヘキサン＝１：
２０）で精製すると表題化合物（１．９２ｇ）が得られ
た。 ＩＲ（Ｎｅａｔ）：２９８０，２９４５，１７１５，１
６５５，１６１０，８５０ｃｍ^{-1 1} Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．５９（９Ｈ，ｓ），
２．２４（１．２Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，７Ｈｚ），
２．３９（０．８Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，７Ｈｚ），
３．４８（１．８Ｈ，ｓ），３．５６（１．２Ｈ，
ｓ），４．３３（０．４Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈ
ｚ），４．７１（０．６Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３Ｈｚ，７Ｈ
ｚ），５．８８（０．４Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ），６．２
８（０．６Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），７．２１（２Ｈ，
ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．９１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈ
ｚ）。

【００３８】参考例２ ４−［４，４−ジシアノ−３−（ジメトキシメチル）ブ
チル］安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造 アルゴン雰囲気下、ブロモマロノニトリル（１．２７
ｇ）および参考例１の化合物（１．９１ｇ）をジクロロ
メタン（６６ｍｌ）に溶解し、モレキュラーシーブ（３
Ａ、１．０ｇ）を加えた後、フィルターをはずした分析
用紫外線ランプで紫外線を２時間照射した。反応液にメ
タノール（４ｍｌ）を加えて１０分間撹拌後、２規定炭
酸カリウム水溶液（５ｍｌ）を含む氷水に注加し、ジク
ロロメタンで抽出、有機層は水洗後無水硫酸ナトリウム
で乾燥した。減圧下に溶媒を留去し、得られた残渣をカ
ラムクロマトグラフィー（シリカゲル７５ｇ，酢酸エチ
ル−ヘキサン＝１：１０）で精製すると表題化合物
（２．０８ｇ）が無色油状物として得られた。 ＩＲ（Ｎｅａｔ）：２９８０，２９４５，２８４０，２
２５０，１７１０，１６０６，８４５ｃｍ^{-1 1} Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．６０（９Ｈ，ｓ），
１．９０−２．２０（２Ｈ，ｍ），２．２０−２．３２
（１Ｈ，ｍ），２．８９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），
３．３９（３Ｈ，ｓ），３．４６（３Ｈ，ｓ），４．１
３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），４．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝５Ｈｚ），７．２８（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．
９５（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）。

【００３９】参考例３ ４−（５−メトキシ−４−ペンテニル）安息香酸ｔｅｒ
ｔ−ブチルの製造 参考例１と同様にして、４−（４−オキソブチル）安息
香酸ｔｅｒｔ−ブチル（９９３ｍｇ）を（メトキシメチ
ル）トリフェニルホスホニウムクロリドで処理すると表
題化合物（９１８ｍｇ）が無色油状物として得られた。 ＩＲ（Ｎｅａｔ）：２９８０，２９４０，２８６０，１
７１０，１６６０，１６０３，８６０，８４５ｃｍ^{-1 1} Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．５５−１．７６（２
Ｈ，ｍ），１．５９（９Ｈ，ｓ），１．９６（０．６
Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，７Ｈｚ），２．１０（０．４
Ｈ，ｔｄｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，７Ｈｚ，７Ｈｚ），２．６６
（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ），３．５１（１．８Ｈｚ，
ｓ），３．５９（１．２Ｈ，ｓ），４．３５（０．４
Ｈ，ｔｄ，Ｊ＝７Ｈｚ，６Ｈｚ），４．７３（０．６
Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１３Ｈｚ，７Ｈｚ），５．９１（０．４
Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈｚ），６．２９（０．６
Ｈ，ｄ，Ｊ＝１３Ｈｚ），７．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８
Ｈｚ），７．８９（０．８Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．
９０（１．２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）。

【００４０】参考例４ ４−［５，５−ジシアノ−４−（ジメトキシメチル）ペ
ンチル］安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造 参考例２と同様にして、参考例３の化合物（２７６ｍ
ｇ）をブロモマロノニトリルと反応させることにより表
題化合物（２０２ｍｇ）が無色油状物として得られた。 ＩＲ（Ｎｅａｔ）：２９７５，２９３０，２２４５，１
７１０，１６０５，８６０，８４５ｃｍ^{-1 1} Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）δ：１．５９（９Ｈ，ｓ），
１．６０−１．９２（４Ｈ，ｍ），２．２０−２．３０
（１Ｈ，ｍ），２．７３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ），
３．４０（３Ｈ，ｓ），３．４５（３Ｈ，ｓ），４．１
１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ），４．３１（１Ｈ，ｄ，Ｊ
＝５Ｈｚ），７．２４（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ），７．
９３（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ）。

【００４１】実施例１ ＴＮＰ−３５１牛血清アルブミンの製造 ＴＮＰ−３５１（２５mg）と牛血清アルブミン（２０m
g）とを蒸留水２mlに溶解し、該溶液に氷冷下、１−エ
チル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイ
ミド・塩酸塩（ＥＣＤＩ）（５０mg）を蒸留水１mlに溶
かした溶液を滴下した。室温（２５℃）で４時間〜１晩
反応させた後、蒸留水に対して４℃で透析した。これを
生理食塩水にて（３０ml）に希釈し、１mlずつ分注し、
−４０℃で凍結保存した。

【００４２】実施例２ 抗ＴＮＰ抗血清の作製 実施例１で調製したＴＮＰ−３５１蛋白結合体溶液２ml
に等量のフロインドコンプリートアジュバンドを加え、
懸濁させた懸濁液をニュージランド白色雌ウサギの背部
の皮下および足蹠内に注射して免疫した。２〜３週間毎
に７回免疫し、最終免疫後１週間目に全採血し、室温で
１時間放置後遠心分離により血清を採取し、５６℃３０
分間加熱処理を行ない抗ＴＮＰ−３５１抗血清を得た。
抗血清は−２０℃に凍結保存した。

【００４３】抗ＴＮＰ−３５１抗血清の評価 実施例１と同様な方法により、ＴＮＰ−３５１−牛γ−
グロブリン複合体を作製した。すなわち、ＴＮＰ−３５
１（２５mg）と牛γ−グロブリン（２０mg）とを蒸留水
（２ml）に溶解し、これにＥＤＡＣ（５０mg）を加え
て、室温で撹拌後、暗所室温で２４時間放置した。続い
て、蒸留水に対して４℃で透柝し、目的物質を含む溶液
を得た。さらにＴＮＰ−３５１と類似化合物であるメソ
トレキセート（Ｍethotrexate:ＭＴＸ）についても同様
に複合体を作製した。このようにして得られたＴＮＰ−
３５１−牛γ−グロブリン複合体を抗原として酵素標識
抗体測定法（Ｅnzyne−linked Ｉmmunoabsorbant Ａs
say:ＥＬＩＳＡ）により、実施例２と同様にして作製し
た抗ＴＮＰ−３５１ウサギ抗血清の抗体価および特異性
について調べた。

【００４４】（１） 抗体価の測定 一定濃度に希釈（１:１００）した抗原（ＴＮＰ−３５
１−牛γ−グロブリン複合体）および牛γ−グロブリン
（陰性コントロール）を９６ウエルイムノプレートに吸
着させ（５０μl／ウエル:４℃,一晩）、リン酸緩衝液
（ＰＢＳ,pＨ７．２）で３回洗浄後、０．５％卵白アル
ブミン−ＰＢＳでブロッキング（１００μl／ウエル:室
温、１時間）した。これを０．０５％ツイーン（Ｔwee
n）２０−ＰＢＳ（Ｔween−ＰＢＳ）で３回洗浄した
後、２あるいは１０倍階段希釈した被検血清を各ウエル
に入れて（５０μl）、室温で１時間あるいは４℃で一
晩反応させた。Ｔween−ＰＢＳで４回洗浄後、酵素（ho
rseradish peroxidase:ＨＲＰ）標識抗ウサギ免疫グロ
ブリン液（１:２００）を入れ（５０μl／ウエル）、室
温で１時間反応させ、Ｔween−ＰＢＳで洗浄した後、基
質液（ＡＢＴＳ液）を各ウエルに１００μl入れ、発色
後に４１４nmでの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定し
た。吸光度１．０以上を陽性とした。なお、陰性コント
ロールとしては正常ウサギ血清を用いた。

【００４５】（２） 抗体の特異性の評価 前記のようにして作製したＴＮＰ−３５１−牛γグロブ
リン複合体およびＭＴＸ−牛γ−グロブリン複合体を抗
原とし、ＰＢＳで２倍階段希釈して９６ウエルイムノプ
レートに吸着させ、（１）の場合と同様な方法でＥＬＩ
ＳＡを行った。なお、抗血清は、一定濃度（１:１００
あるいは１:５００）に希釈して用いた。反応後、抗原
の各希釈における吸光度を測定し、これをＴＮＰ−３５
１とＭＴＸ間で比較、抗血清の特異性（交差反応の有
無）を判定した。

【００４６】実施例３ 抗ＴＮＰ−３５１抗血清の精製 ＥＡＨ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂを５
００ｍＭ塩化ナトリウムと蒸留水（ｐＨ６．４）で洗浄
後、これに蒸留水５０ｍｌに溶解したＴＮＰ−３５１
（６１ｍｇ）と蒸留水１ｍｌに溶解した１−エチル−３
−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩
酸塩（ＥＤＣ）（１１４ｍｇ）を滴下した。ｐＨを６．
４に調整し室温（２５℃）で２時間反応させ、ＴＮＰ−
３５１−セファロース４Ｂを作製した。１５ｍＭホウ酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＴＮＰ−
３５１−セファロース４Ｂを用いて、実施例２で作製し
た抗血清をアフィニティー精製した。６Ｍ塩酸グアニジ
ン水溶液（ｐＨ６．１）で溶出した画分をとって、１５
ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、
精製抗ＴＮＰ−３５１抗血清とした。

【００４７】実施例４ ［¹⁴Ｃ］ＴＮＰ−３５１の製造 アルゴン雰囲気下、［¹⁴Ｃ］グアニジン塩酸塩（５０m
Ｃi、０．９１mmol、比放射能:５５mＣi／mmol）をtert
−ブチルアルコール（１．５ml:モレキュラーシーブス
４Ａで乾燥）に懸濁液し、カリウムtert−ブトキシドの
１．５モル−乾燥テトラヒドロフラン溶液（９１２μ
l）を加えた後、１０分間撹拌した。この溶液に４−
［５,５−ジシアノ−４−（ジメトキシメチル）ペンチ
ル］安息香酸tert−ブチル（２８３．１mg）のtert−ブ
チルアルコール溶液（４．５ml:モレキュラーシーブス
４Ａで乾燥）を加えて、２時間加熱還流した。反応液を
水（２０ml）に注加し、ジクロロメタン（２０ml×３）
で抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後、減
圧下に溶媒を留去した。得られた残渣をカラムクロマト
グラフィー（担体：１５g［フジデビソン社製ＢＷ−３
００］、展開溶媒：ジクロロメタン：メタノール＝３
０：１→１５：１）で精製すると４−［４−（２,４,６
−トリアミノ［２−¹⁴Ｃ］ピリミジン−５−イル）−
５,５−ジメトキシペンチル］安息香酸tert−ブチル
（１７４．２mg）が白色非晶質粉末として得られた。

【００４８】このもの全量をトリフルオロ酢酸（８４６
μl）に溶解し、これに水（１７mg）を加えた後、室温
で２時間撹拌放置した。減圧下にトリフルオロ酢酸を留
去し、さらに７０℃で４時間半、真空乾燥した。得られ
た残渣全量とＬ−グルタミン酸ジエチル塩酸塩（１４
５．４mg）とをジメチルホルムアミド（１．７ml:モレ
キュラーシーブス４Ａで乾燥）に懸濁し、０℃に冷却し
た後、シアノリン酸ジエチル（６９．３mg）のジメチル
ホルムアミド溶液（１．７ml:モレキュラーシーブス４
Ａで乾燥）を加えて、１５分間撹拌した。ついで、同温
度下、トリエチルアミン（１８４．３mg）のジメチルホ
ルムアミド溶液（１．７ml:モレキュラーシーブス４Ａ
で乾燥）を１０分間で滴下し、０℃で３０分間、室温で
２時間撹拌放置した。減圧下に溶媒を留去し、得られた
残渣をカラムクロマトグラフィー［担体：１５g（フジ
デビソン社製ＢＷ−３００）、展開溶媒：濃アンモニア
水と分液したジクロロメタン→濃アンモニア水と分液し
たジクロロメタン：エタノール＝４０：１→３０：１］
で精製すると、［¹⁴Ｃ］Ｎ−［４−［３−（２,４−ジ
アミノ−７Ｈ−ピロロ［２,３−d］ピリミジン−５−イ
ル）プロピル］ベンゾイル］−Ｌ−グルタミン酸ジエチ
ル（１３６．８mg）が白色結晶として得られた。

【００４９】このジエステル全量を水−テトラヒドロフ
ラン混合液（２:１、５．１ml）に溶解し、１Ｎ水酸化
ナトリウム水溶液（８４８μl）を加えた後、室温で１
時間撹拌した。減圧下に内容量を１．６mlまでに濃縮
し、生じた不溶物をミリポアフィルターで濾去した。濾
液を０℃に冷却し、酢酸（１６４μl）を加えて生じた
結晶を濾取、氷水でよく洗浄した。得られた結晶を減圧
下７０℃で４時間半乾燥すると、［¹⁴Ｃ］ＴＮＰ−３５
１（９４．０mg、総放射能:１１．７mＣi、比放射能:５
４．８mＣi／mmol）が白色結晶として得られた。本品
は、高速液体クロマトグラフィーおよび薄層クロマトグ
ラフィーで分析・同定した結果、特開平２−１６７２８
１に記載の方法で合成した標品ＴＮＰ−３５１と完全に
一致した。

【００５０】実施例５ ＨＲＰ標識化ＴＮＰ−３５１の作製 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（５mg）を蒸留
水（１μl）に溶解し、これに０．１Ｍ ＮaＩＯ₄溶液
（１μl）を加えて、室温（２５℃）で約２０分間撹拌
した。これを１mＭ酢酸ナトリウム緩衝液（pＨ４．２）
で平衡化しておいたセファデックス（Ｓephadex）Ｇ−
２５カラム（１．５×１２cm）（ファルマシア社製）に
通した。このようにして得られたＮaＩＯ₄処理ＨＲＰ
（２mg／ml）１mlに対して、１０mＭ炭酸ナトリウム緩
衝液（pＨ９．５）に溶解したＴＮＰ−３５１溶液（４m
g／ml）を１ml加えて、撹拌、混和した（pＨは前記炭酸
緩衝液でpＨ９．５に調整）。室温で１時間撹拌したの
ちＮaＢＨ₄溶液（４mg／ml）を０．１ml加え、混和後、
４℃で１時間静置。さらに、この混和物を２０mＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、pＨ７．０）に透析した
のち、ＰＢＳで平衡化したセファクリル（Ｓephacryl）
Ｓ−２００カラム（２．５×９０cm）（ファルマシア社
製）を用いてゲル濾過した。酵素活性の最も高い画分
（第１ピーク）をとってＨＲＰ−ＴＮＰ−３５１複合体
とした。

【００５１】実施例６ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識化ＴＮＰ−３５１の作製 ＴＮＰ−３５１（２．０mg）および（３．０mg）のm−
マレイミジル安息香酸およびジクロロヘキシルカルボジ
イミド（４μｇ）をテトラヒドロフラン（２ｍｌ）に加
えて混合し、４℃、４０時間反応させた。この反応液を
約１／１０量になるまで濃縮し、β−ガラクトシダーゼ
（２０μg）を含むリン酸緩衝液（０．１Ｍ、pＨ７．
０）（３ml）に加えて２５℃で３０分間反応させた。つ
いで、０．１Ｍ ＮaＣl、１mＭ ＭgＣl₂−０．１％Ｂ
ＳＡ−０．１％ＮaＮ₃−０．０２Ｍリン酸緩衝液（pＨ
７．０）（以下ＢufferＡと称する）で平衡化したセフ
ァロース６Ｂカラム（ファルマシア社製）（２×３８c
m）を用いてＢufferＡで溶出した。酵素活性の最も高い
画分をとってβ−ガラクトシダーゼ−ＴＮＰ−３５１複
合体とした。

【００５２】実施例７ β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識化ＴＮＰ−３５１の作製 ＴＮＰ−３５１ １．０ｍｇを０．０５Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）０．５ｍｌおよびＤＭＳＯ ０．５ｍｌ
に溶解し、この溶液に７８０μｇのｍ−マレイミドベン
ゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを含む
ＴＨＦ５０μｌを添加して３０℃で３０分反応させた。
反応混合液を０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．３）で
平衡させたセファデックスＧ−１５カラム（０．９×５
５ｃｍ）に通し、過剰の試薬とマレイミド化ＴＮＰ−３
５１とを分離した。得られたマレイミド化ＴＮＰ−３５
１溶液を０．５ｍｌを、０．０２Ｍリン酸食塩緩衝液
（ｐＨ７．５）に希釈したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶
液（１ｍｇ／ｍｌ）０．５ｍｌに徐々に添加し、時々振
り混ぜながら５℃で一夜反応させた。反応終了後０．０
２Ｍリン酸食塩緩衝液（ｐＨ７．０）を用いるセファロ
ース６Ｂカラムクロマトグラフィーで精製し、酵素含有
フラクションを分取しβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識化
ＴＮＰ−３５１を得た。

【００５３】実施例８ ＨＲＰ標識化ＴＮＰ−３５１の作製 ＴＮＰ−３５１（８ｍｇ）をＤＭＦ（１００μｌ）に溶
解し、１０℃に保った後、これにクロロぎ酸イソブチル
（２μｌ）を加えて１０℃で３０分間撹拌した。５０ｍ
Ｍ炭酸ナトリウム溶液（１．５ｍｌ）に溶解した西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（１ｍｇ）を加え、１
０℃でさらに４時間撹拌した後、４℃で一昼夜静置し
た。この混和物を１００ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ
塩化マグネシウム、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ルを含む５０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）で
平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２
５カラム（１．０×６０ｃｍ）（ファルマシア社製）を
用いてゲル濾過した。酵素活性の最も高い画分（第１ピ
ーク）をとって１５ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．０）で透析し、ＨＲＰ−ＴＮＰ−３５１標識化とし
た。

【００５４】実施例９ ＴＮＰ−３５１のＥＩＡ 該キットとしては以下の試薬からなる。 （１）ＴＮＰ−３５１を０および１５ｐｇ／ｍｌから１
００ｎｇ／ｍｌまで含む標準溶液 （２）実施例８で得られた標識化されたＴＮＰ−３５１
液 （３）実施例３で得られた精製特異抗体液 （４）（３）の精製特異抗体に対する抗種抗体（抗ウサ
ギイムノグロブリン抗体）を結合させた固相 （５）これら（２）〜（３）の試薬および被検試料の希
釈に用いるリン酸緩衝液（ｐＨ６〜９） （６）インキュベーション後、固相の洗浄に用いる緩衝
液（ｐＨ６〜９のリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液な
ど） （７）ペルオキシダーゼ活性測定用試薬比色法の場合、
ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素。酵素基質の溶解
に用いる緩衝液（好ましくはリン酸緩衝液）および酵素
反応停止液（硫酸）。

【００５５】測定 被検体もしくは（１）液５０μｌ、（２）液５０μｌ、
（３）液５０μｌを混合し、（４）に加えて４℃で２０
時間反応させた。洗浄後、０．０２％過酸化水素と０．
２６％ｏ−フェニレンジアミンを含む０．１Ｍクエン酸
緩衝液１００μｌを加えて室温で２０分間反応させた。
１Ｎ硫酸を１ｍｌ加えて反応を停止させ、４９２ｎｍの
吸光度を測定すると図１の標準曲線が得られた。図１の
縦軸は、ＴＮＰ−３５１非存在下での標識化ＴＮＰ−３
５１の最大結合を示す吸光度値に対する各濃度のＴＮＰ
−３５１存在下での標識化ＴＮＰ−３５１の結合を示す
吸光度値を百分率で表したもの、横軸は、ＴＮＰ−３５
１の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を表す。最小１５ｐｇ／ｍｌの
ＴＮＰ−３５１が検出された。ＴＮＰ−３５１測定系の
添加回収率 血清７検体について、１１ｎｇ／ｍｌ、１．２ｎｇ／ｍ
ｌ、１４０ｐｇ／ｍｌ、１５ｐｇ／ｍｌの濃度のＴＮＰ
−３５１を添加した時の回収率について調べたところ表
１に示した成績が得られた。平均添加回収率は１０３．
１±８．９％であった。

【００５６】

【表１】

【００５７】この測定系に対して、メトトレキサート、
アメソプテリン、ダウノルビミン、ネオロルテノスタチ
ン、シスプラチン、マイトマイシン、アクチノマイシ
ン、ビンクハスチン、ビンブラスチン、ペフレオマイシ
ン、サイクロフォスファミド等の制癌剤はＴＮＰ−３５
１の測定に影響を及ぼさなかった。ＴＮＰ−３５１の基
本骨格と同一の化合物は交叉反応を示した。

【００５８】

【発明の効果】本発明によれば式（Ｉ）の化合物または
その塩が良好な感度で容易に測定でき、ＴＮＰ−３５１
を抗悪性腫瘍剤として使用するに際して非常に有用であ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例９のＴＮＰ−３５１測定における標準
曲線である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（Ｉ） 【化１】 ［式中、ｎは１〜６の整数を示す］で表わされる化合物
   またはその塩に特異的に反応する抗体。
2. 【請求項２】 式（Ｉ）で表わされる化合物またはその
   塩の標識化化合物。
3. 【請求項３】 式（Ｉ）で表わされる化合物またはその
   塩を測定するに際し、請求項１記載の抗体および請求項
   ２記載の標識化化合物を用いて免疫化学的方法により測
   定を行うことを特徴とする式（Ｉ）で表わされる化合物
   またはその塩の測定法。
4. 【請求項４】 請求項１記載の抗体および請求項２記載
   の標識化化合物を必須成分として構成されることを特徴
   とする式（Ｉ）で表わされる化合物またはその塩の免疫
   化学的測定キット。