JPH0566548B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフローサイトメトリーすなわち流動式
血球計数法の分野に関し、さらに詳しくは流動式
血球計数系における特異的結合検定の使用に関す
る。既に多年の間、種々の特異的結合検定法が流
体特に体液中の物質の測定に適用されてきた。こ
こ数年流動式血球計数装置系が入手し得るように
なり、各種の測定特に血液学および細胞免疫学に
おいて使用されている。

動植物の細胞はすべて、維持、成長および特殊
細胞機能のために必要な種々の生化学的反応の化
学的触媒となる非常に多種類のタンパク質酵素を
具えている。これらの酵素の中にはごく僅かの、
ときには唯一種の細胞内にしか存在しないサブセ
ツトがある。

Gomori〔Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，42：23
（1939）〕およびそれと独立にTakamatsu〔Trans.
Soc.Path.Japan，４：277（1939）〕は、適当な物
質または物質の組合せを、そのまたはそれらの物
質から光吸収性で不溶性の生成物を生じ得る酵素
が含まれている細胞中に導入するとその酵素を含
んでいるすべての細胞が選択的に着色（または暗
色化）され、光学顕微鏡で観察することによりこ
の酵素を欠くすべての他の細胞と容易に識別し得
ることを認め、初めて酵素−細胞化学について報
告した。導入される物質は特定の酵素に対する天
然または合成の基質であつてその酵素と反応する
と自ら、または他の導入される試剤物質との反応
によつて、光吸収性および不溶性になるものであ
る。

このような方法が生きている細胞について成功
するためには、通常その導入される物質は(a)細胞
内に入ることができなければならず、(b)細胞に対
し有毒であつてはならず、(c)極めて不溶性な形に
転化しなければならず、かつ(d)その転化は極めて
迅速に起らなければならない。細胞の直径は通常
数ミクロンから数十ミクロンである。水溶液中の
分子は通常この距離を数分の一秒ないし数秒で拡
散する。従つてもし酵素反応の後に不溶形態への
転化が遅れたならばそれは酵素から遥かに離れ
て、ときには細胞の外部に沈積するであろう。生
成物の濃度はそれが反応の場所から拡散する距離
の三乗で減少するので酵素の場所から僅か離れて
も溶解度積を超えることができず、従つてその生
成物が極端に不溶性でない限り細胞は染色されな
いままとなる。

生きている細胞に対して上記の基準の全部、特
に透過性と毒性の基準の組合せを同時に満足する
ことは従来極めて困難であつた。少くともこの理
由から、酵素−細胞化学的方法の大部分は死んだ
細胞に対して適用されてきた。染色されているに
せよされていないにせよ、ある細胞を他の細胞と
識別し得るためには、各細胞の本来の外形および
内部構造の幾分かを保持することが重要である。
この目的のために種々の組織学的および細胞学的
固定剤（固体液）が使用され、このものは、種々
の程度に、細胞を構成しているタンパク質、核酸
および多糖ポリマー類を不溶化する。酵素−細胞
化学的染色の前に使用される固定剤は研究すべき
酵素の触媒的化学活性を破壊してはならない。
Davisら〔J.Histochem.and Cytochem.，７：
291（1959）〕参照。

固定細胞に対しては透過性と毒性の基準は通常
緩和されるがそれにもかかわらず、残りの基準を
同時に満足させることはこれまで極めて困難であ
つた。

初期の酵素−細胞化学的方法、例えば先に述べ
たような方法は従つて、局所化が極めて不十分で
あるため染色生成物の沈殿が特異的酵素を本来含
有していた細胞の内部ばかりでなく外部でもしば
しば生ずるような染色パターンが特徴であつた。
その後何年もの細胞化学者の研究努力の多くは基
質の転化速度が極めて高くかつ転化された（通常
着色した）生成物が極めて不溶性であるような方
法の開発に向けられた。現在では酵素の数ナノメ
ートル以内に生成物をきれいに沈殿させる方法が
知られている。最初の真に高鮮明度の染料を使用
する酵素−細胞化学的染色技法は最初にHoltお
よびQ′Sullivan〔Proc.Roy.Soc.B.，148：465
（1958）〕、DavisおよびOrnstein〔J.Histochem.
and Cytochem.，７：297（1959）〕、Davis〔Proc.
Soc.Exp.Biol.Med.，101：90（1959）〕、Davisら
〔J.Histochem.and Cytochem.，７：291（1959）〕
およびLehrerおよびOrnstein〔J.Biophys，and
Biochem.Cytol.，６：399（1959）〕により報告さ
れた。

特異的結合測定技術は液状媒質中に非常に低濃
度で存在し診断、医学、環境および産業上重要な
種々の有機物質の定量のための極めて有用な分析
方法を提供してきた。特異的結合測定法はリガン
ドすなわち測定すべき結合可能被分析物とそれに
対する結合パートナーとの間の特異的相互作用に
基いている。リガンドおよびその結合パートナー
の一つがハプテンまたは抗原であり他の一つが対
応する抗体である酵素の場合この測定法は免疫検
定法として知られている。

酵素は複合体の形で通常使用される多くの標識
の一つであつて、その複合体においては酵素は被
分析物またはその結合パートナーと同類の低分子
量リガンドによつて結合タンパク質と結びついて
いる。基質が加えられ、結合パートナー相互作用
によつて可能となる程度まで酵素と反応し、検出
可能な応答を与える。免疫−酵素−細胞化学的染
色法においては、細胞の特殊サブセツト上または
中に存在する独得の分子部位に抗体が非常に高い
化学的特異性をもつて選択的に結合することが利
用される。かかる抗体は、高鮮明度の酵素−細胞
化学的方法が使用できる酵素（例えばペルオキシ
ダーゼ酵素、アルカリ性ホスフアターゼ酵素等）
に直接または間接に結合される。このような抗体
および酵素をその標的細胞に適正に結合させる
と、その調勢物は適当な酵素−細胞化学的方法に
よつて染色することができるようになり、その標
識された細胞のみがその上または中に光吸収性
（着色）生成物を蓄積する。このような方法は現
在広く使用されている。細胞特異的抗体との反応
の前に固定剤を使用する場合はその固定剤が検討
対象たる細胞の抗体に結合する部位を破壊しない
ことが重要である。

免疫細胞学において使用される酵素標識特異的
結合技法の一部類は「免疫ペルオキシダーゼ」法
と呼ばれており、これには五つの基本的な方法が
ある。以下の方法のうちで、結合した一次抗体の
各分子当りより多数のペルオキシダーゼ分子を結
合するものが「酸素増幅」により感度を増大させ
る。第一に「直接複合体」法においてはペルオキ
シダーゼ−抗体複合体は組織抗原と直接結合す
る。第二に「間接複合体」法においては一次抗体
は先ず組織抗原に結合し、次に今度はこれにペル
オキシダーゼ−二次抗体（抗一次抗体）複合体が
結合する。第三の「標識抗原」法は本質的に、一
次抗体が組織抗原とペルオキシダーゼに複合した
類似の抗原との両方に結合するサンドイツチ法で
ある。第四の「酵素橋」法においては一次および
二次抗体が上記のように結合され、さらに二次抗
体にはペルオキシダーゼと複合した第三の抗体が
結合する。第五の「ペルオキシダーゼ−抗ペルオ
キシダーゼ」法は酸素橋法に記したと同様である
がさらに、ペルオキシダーゼ−第三抗体の次に抗
ペルオキシダーゼ抗体および過剰のペルオキシダ
ーゼが結合するということが加わる。いずれの方
法においても過酸化水素およびレドツクス色原体
を加えて、酵素−細胞化学的染色により利用し得
るまたは局在化されたペルオキシダーゼの範囲
と、それにより、組織特異的抗原とを明らかにす
る。以上の一般に関してはFaliniら〔Arch.
Pathol.Lab.Med.，107：105（1983）〕を参照され
たい。

アビジンはビタミンＢ複合体の一つであるビオ
チンに対し高い親和力を持つ４個の結合部位を有
する分子量68000の糖タンパク質である。この高
親和性結合は免疫組織学において前記標識抗体法
に代る方法として使用されてきた。最も簡単な方
法においては、ビオチン−一次抗体複合体が直接
細胞抗原と結合し、次に今度はこれにアビジン−
ペルオキシダーゼ複合体が結合する。別の方法に
おいては、組織に結合したビオチニル化一次抗体
が標識されていないアビジンと結合し、次にこれ
にペルオキシダーゼで標識されたビオチンが結合
する。第三の方法においては非複合の一次抗体、
ビオチニル化された二次抗体およびアビジン−ビ
オチン−ペルオキシダーゼ複合体が使用されこの
ため「ABC法」とも呼ばれる。全般については
Faliniら（前出）およびGuesdon，Ｊ−Ｌら〔J.
Histochem.Cytochem.，27：1131−1139（1979）〕
を参照されたい。

以上に記したものの一例はHsu，Ｓ−Ｍら（J.
Histochem.Cytochem.，29：577−580（1981）〕
によつて報告されており、これは特にホルマリン
固定組織中の抗原の同定に対するABC法の使用
に関している。測定はホルマリン固定し、パラフ
イン埋包した甲状腺につき手動により行われた。
連続的に切片を切取り、脱パラフインし、アルコ
ールから水へと通常の組織処理におけると同様に
処理した。切片を「ABC」法によつて処理し、
最後に切片を過酸化水素とジアミノベンジジン四
塩酸水溶液とインキユベートして染色反応を行つ
た。

ヒトの白血球は単球、多形核細胞（PMN）お
よびリンパ球に分類される。リンパ球には二つの
主要な種類がある。第一のもの（胸腺由来細胞す
なわちＴ細胞）は細胞に仲介される応答を生ずる
免疫学的活性があり、第二のもの（骨髄由来細胞
すなわちＢ細胞）は抗体を産生する免疫学的活性
がある。現在Ｔ細胞は「ヘルパー」、「サプレツサ
ー」および「キラー」Ｔ細胞と呼ばれる少くとも
数種の亜類型に分けられることが認められてお
り、それらは（それぞれ）反応を促進し、反応を
抑制し、または異細胞を殺す（溶解する）機能を
持つている。臨床的に興味のあるリンパ球の亜分
類は免疫学的方法による以外は容易に識別できな
い。これらのリンパ球の外表面上の抗原は特異的
抗体によつて識別することができる。これらの抗
原の多くが、細胞の穏和な化学的または物理的処
理によつても抗体結合部位が破壊されそして（ま
たは）細胞表面から抗原が引離される結果となり
得るという意味で著しく脆弱であることが見いだ
されていることを認識し理解することが特に重要
である。

リンパ球が液体中に懸濁された状態で免疫−酵
素−細胞化学的方法により染色される場合、これ
らは通常生きたままで、高鮮明度の方法によつて
染色されてきた。この場合細胞の外部表面上に着
色生成物の微細な斑点を生ずる。生成物のこの分
布は不溶性の着色生成物が酵素分子（すべて細胞
の外部表面上にある）から数ナノメートル以内に
沈殿することから生ずる。生成物の半分またはそ
れ以上は拡散して細胞から離れ去る。この拡散し
た生成物が沈殿する場合その多くは水性媒体中に
遊離懸濁し、細胞から押流されまたは洗い去られ
る。他の部分は細胞の方に拡散してゆき、細胞表
面上の抗体および抗原分子の中間および中に沈殿
してその網目構造内に捕捉されるか、細胞膜上ま
たはその中にまたは、もし膜が生成物を透過し得
るならば、細胞内部に沈殿する。

このように表面上に斑点を有する細胞は同じ量
の着色剤が細胞の上または内部により均一に分布
している細胞に比較して遥かに少量の光しか吸収
しない。Binetら〔Blood Cells，６：371−376
（1980）〕はこのような調製物を流動式血球計数法
によつて調べた（装置に関しては米国特許第
3740143号明細書参照）。このように表面の斑点状
となつた細胞の発する信号は弱過ぎて染色細胞と
非染色細胞との信号をはつきりと分離することが
できない。

さらに、同じ生きているリンパ球の全く同様な
試料にこのような染色を繰返した場合再現性のあ
る染色の度を得ることが非常に困難であることが
発見されたが、これは恐らくリンパ球の表面抗原
に対する損傷およびその損失が一定でないことお
よび生きている細胞が、この種の方法においてし
ばしば必要であるように何回も遠心、洗浄等の処
理を受ける場合に起り得る透過性の変化が一定で
ないことに帰することができる。従つて染色の度
合いが低くしかも一定でないのはある程度、長々
と処理を受けた生きている細胞に対する損傷およ
びその細胞からの損失が不定であることに帰する
ことができると思われる。

本発明の目的はリンパ球の処理法ならびに酵素
−細胞化学的試薬溶液の組成を改変して、これに
より高度に再現性のある応答が得られるように
し、また最初に細胞の外部表面上で生成される検
出可能な酵素生成物の実質的な量が細胞上および
（または）細胞内に沈殿して、流動式血球計数器
内において未染色のおよび他のリンパ球から生ず
る信号と容易に区別できる大きな吸収信号を生ず
るようにすることである。

本発明は不均一性細胞懸濁液中の検討対象細胞
集団を検出する流動式血球計数法を提供するもの
である。この方法は個々別々に、細胞懸濁液を前
記対象細胞集団に対して特異的な一次抗体を含有
して成る試薬および固定剤と合一すること、酵素
をその一次抗体に少くとも一つのリガンドによつ
て結合すること、次に一次抗体の結合した対象細
胞を含有する前記固定細胞懸濁液をそれと検出可
能な反応を行い得る少くとも一種の組成物と合一
すること、このように処理した細胞懸濁液を、実
質的に一度に細胞１個づつ、流動式血球計数器中
で光輻射の照射光束中を通しながら通過する細胞
により散乱および吸収される光を測定すること、
および、少くとも一部これらの細胞によつて散乱
および吸収された光の測定に基いて対象の集団の
細胞を弁別することから成つている。本方法に使
用される抗体およびその他の試薬は細胞試料と、
米国特許第3740143号明細書におけると同様連続
流系内において合一するか、または流動式血球計
数計内における照明点の上流の任意の点で別個の
反応室において合一することができる。

本発明によれば、この方法を種々の集団（主と
して白血球の）の自動化測定に使用するとより大
量の検出可能な形のレドツクス色原体が周囲の媒
質から区別されて検討対象細胞の表面上および
（または）細胞内部に保持されるようにする効果
があることが判明した。従つて細胞集団の弁別を
一層良好に行うことが可能となる。

本発明の方法の有用な点は、使用する検出可能
な種によつて、ある細胞特に白血球が選択的にそ
して濃く着色され他の細胞が染色されないという
ことである。細胞試料は例えば全血のものでも不
均一白血球試料であつてもよい。全血試料は、流
動式血球計数器への導入前にあらかじめ赤血球を
溶解しておいたものが好ましい。

ここで使用する「特異的結合性タンパク質」な
る語は、検討対象の細胞集団に対してのみ特異的
結合親和性を有しそれ以外の物質に対しては持た
ない任意の物質または物質の群を指す。本発明は
その態様の大部分において、免疫化学的に試料と
相互作用する特異的結合検定試薬を含んでいる。
すなわち、試薬および（または）検討対象の細胞
集団内の細胞と結合した抗原の間には抗原−抗体
またはハプテン−抗体の関係がある。従つてかか
る検定は免疫検定と呼ばれ、リガンドとその受容
体、または結合パートナーとの間の特殊な相互作
用は免疫化学的結合である。特記しない限りポリ
クローナルかまたはモノクローナルかの抗体が使
用される。さらに、細胞表面の弁別的特徴と結合
パートナーとの間のその他の結合相互作用がその
他の特異的結合検定の基礎となり得ることは当業
界においてよく理解されているところである。

一次の特異的結合性タンパク質は通常細胞表面
標識抗原に対して特異的な抗体である。かかる抗
原は白血球、腫瘍細胞またはその他の不均一細胞
試料内の、種々の群として区別することが有用な
集団またはサブ集団を弁別するものである。例え
ば、種々のハイブリドーマ細胞系統からのモノク
ローナル抗体をはじめとして、リンパ球の類およ
び亜類を弁別するに有用な数種の抗体が知られて
いる。これらの中には、すべてのヒトＴ細胞、サ
プレツサーＴ細胞、ヘルパーＴ細胞等に対して指
示された特異性を有するマウスモノクローナル抗
体が含まれる。かかる抗体の他のものはヒトのＢ
細胞と特異的反応性を有することが知られてい
る。

生きているリンパ球を長々と取扱うことによる
この細胞に対する損傷および細胞からの損失を防
止、または少くとも減少するため、われわれは細
胞をできるだけ早く固定することにする。固定剤
としては細胞特異的表面抗原の化学的活性も（固
定工程が最初の抗体の付与の前に行われる場合）、
この方法の以後の工程に対して必要な付着された
標識または外部に曝された第二次免疫反応性基の
化学的活性も（固定工程が最初の抗体の付与の後
で行われる場合）破壊することなしに細胞を不溶
化し、かつ細胞を相互にまたはその入つている容
器の壁に付着させることのないものが選ばれる。
モノアルデヒド例えばホルムアルデヒド、パラホ
ルムアルデヒドおよびアクロレイン、およびジア
ルデヒド例えばグルタルアルデヒドの単独使用ま
たは併用が懸濁液内の細胞に対して有用であるこ
とが判明している。例えば、米国特許第3741875
号明細書および第4412004号明細書を参照された
い。

第二次の特異的結合性タンパク質は通常、一次
特異的結合性タンパク質がその一員であるタンパ
ク質の群、通常免疫グロブリン、に対する抗体で
ある。すなわち、この二次抗体は一次抗体群のす
べての抗体と反応しこれに対し特異的である。

好ましい一態様においては、本発明の方法はま
たアビジン分子に結合される酵素を含有して成る
試薬複合体を使用する。本発明の方法の別の一態
様においては酵素がビオチン分子に結合され、次
にこれにアビジン分子が結合して成る試薬複合体
が使用される。かかる使用に適当な酵素の例とし
てはペルオキシダーゼ（例えばわさび大根ペルオ
キシダーゼ）、アルカリ性ホスフアターゼ、およ
びこれらと他の酵素の組合せが挙げられる。

使用されるレドツクス色原体としては、その反
応した形において反応媒質に不溶であることが絶
対必要である。本発明において有用であると確認
されたものの例としては３−アミノ−９−エチル
カルバゾールおよび４−クロロ−１−ナフト−ル
が挙げられる。反応環境に相当溶解する生成物を
生ずる色原体は有用でない。

先に述べた通り本発明によれば、一次抗体、ビ
オチニル化した二次抗体、標識された複合体、酵
素基質およびレドツクス色原体は、分析すべき細
胞試料を本方法を実施すべき流動式血球計数器に
導入する前または導入した後に、この細胞試料と
合一することができる。

細胞試料は流動式血球計数器内の導管ないし分
析流路中を流れている流体流中に導入することが
好ましい。これは好ましくは、導管ないし分析流
路内に流動流体鞘流の流れをつくり、次で前記試
料をこの流動流体鞘流中に導入することから成
る。この鞘流は通常細胞試料懸濁媒質と実質的に
同一の屈折率を有する流体から成るものである。
鞘流搬送流体を使用するこの種流動式血球計数器
の一つがテクニコンヘマログ（Technicon
Hemalog）ＤおよびＨ−6000システムに使用さ
れているが、この装置は日常的の血液学的試験を
すべて処理するものである。ヘマログＤおよびＨ
−6000システムに関する詳細資料はテクニコン
インスツルメント コーポレーシヨン（タリタウ
ン、ニユーヨーク州）から入手できる。

本発明によれば、この方法を種々の集団の（主
としてリンパ球の）自動化測定に使用すると、検
出可能な形のレドツクス色原体が、周囲の媒質ま
たは本分析法が特異的であるリンパ球以外の試料
からの他のリンパ球と区別されて、検討対象のリ
ンパ球集団内に生成しそれに保持される効果があ
ることが認められた。従つて細胞集団を一層良好
に弁別することが可能である。

第１図〜第１１図はそれぞれＨ−6000機器シス
テム（テクニコン インスツルメント コーポレ
ーシヨン、タリタウン、ニユーヨーク州）のペル
オキシダーゼ流路からの二次元表示であつて、吸
収は横軸に、進行方向からの散乱光は横軸に測定
値を示してある。各点は１個の細胞の測定座標を
示している。あらかじめ設定した３個の閾値によ
つて測定者は明確な信号の集団を分離し数えるこ
とができる。吸収低（AL）および吸収高（AH）
は垂直線として、分散低（SL）は水平線として
示す。Ｈ−6000により、SLの上ALの左、ALと
AHの間、およびAHの右のすべての信号に対し
別個の計数が得られる。SLより下の信号は細胞
からの信号より小さなものを示すのでこれはすべ
て無視され、これにより赤血球形骸、血小板等に
よる雑音信号は除去される。

これらのリンパ球標識法はリンパ球を富化した
試料および全血試料のいずれにも適用される。全
血は好中球、好酸球（いずれもPMN）および単
球を含有しており、これらはすべて内因生のペル
オキシダーゼを有している。ペルオキシダーゼ染
色後これらの細胞をペルオキシダーゼで標識し
た、リンパ球と弁別するのに一つ問題が生ずる可
能性がある。後に示すように、好酸球、好中球お
よび若干の単球ははるかに濃く染色されるので、
これらの細胞からの信号と正の（ペルオキシダー
ゼで標識した）リンパ球とはAH閾値により容易
に分離される。ALおよびAH閾値の間にある残
りの弱く着色した単球は対照実験で別個に計数
し、対応する本実験におけるALおよびAH閾値
間の計数から差引くことができる。

また、最良のリンパ球富化試料でも少数の
PMNおよび単球が混入しているのが通例である
（第１〜７図参照）。適当な対照実験数値を同様に
差引くことによつてこの混入は補正される。

以下の実施例は本発明を開発するのに実施した
実験を記載するものである。可能な場合に常に、
標準の市販試薬級化学品を使用した。

例 １ 可視および近赤外光における流動式血球計数法
によるペルオキシダーゼ指示剤標識系を使用する
免疫検定法によるリンパ球サブセツトの検出およ
び計数に関し従来の技術を検討、説明する数個の
実験を行つた。Binetら（前出）により記載され
た方法に従つて、マウス モノクローナル全Ｔ細
胞抗体であるT101（ヒブリテク社、ラジヨーラ、
カリホルニア州）とそれに続いてペルオキシダー
ゼ複合抗マウス二次抗体（カツペル社、コクラン
ビル、ペンシルバニア州）とを使用する「間接複
合体」法を使用した。このようにしてＴ細胞の表
面に結合されたペルオキシダーゼ酵素は二種の異
なるレドツクス色原体すなわち３−アミノ−９−
エチルカルバゾールおよび４−クロロ−１−ナフ
トールのいずれか一方によつて染色した。使用し
た方法の詳細は次の通りである： 実験 Ａ リンパ球富化懸濁液はBoyum，A.〔Scand.J.
Clin.Lab.Invest.，21，Suppl.97：77（1968）〕の
記載と同様にして調製した。リンパ球フラクシヨ
ンを採取し細胞を中性リン酸塩緩衝食塩水
（PBS）中に牛血清アルブミン0.4％を含む液
（PBS／BSA）中において400ｇで10分間３回遠
心洗浄した。上澄液は吸引廃棄した。最後に収獲
した細胞に細胞濃度を10⁷個／mlとするに十分な
PBS／BSAを添加した。この細胞懸濁液のアリ
コート100μを試験管に分注した。濃度10μg／
mlのT101等容（100μ）を試験管に加え４℃で
30分間インキユベートした。次に細胞をPBS／
BSAにより100ｇで45秒間３回遠心洗浄し、上澄
液の99％を廃棄し毎回細胞沈殿物を残した。次に
細胞沈殿物を残留上澄液に再懸濁し100μのペ
ルオキシダーゼを複合させた二次抗体（20μ／
ml）を加え40℃で１時間インキユベートした。
PBS／BSAによる洗浄操作を３回繰返した。

次にこの細胞を再懸濁し、３−アミノ−９−エ
チルカルバゾール（AEC）２mgをジメチルホル
ムアミド（DMF）0.5mlに溶解しこれに0.05M酢
酸塩緩衝液（PH５）9.5mlおよび３％H₂O₂50μ
を加えて得た染色混合物１ml中で室温で10〜20分
インキユベートした。

次に染色混合物中の細胞懸濁液１mlをPBS2ml
で希釈しこの細胞をＨ−6000流動式血球計数器の
流動セル内に導入した。それにはペルオキシダー
ゼ流路の流動セルに通ずる蠕動ポンプの試料管路
を遮断してマニホールドをバイパスし、遮断した
試料管路を直接に、反応済細胞懸濁液の入つた試
験管内底部に位置させた。結果を第１図に示す。

一次抗体を使用しない以外は各工程上記と同様
にして負の対照実験を行つた。対照実験の結果を
第３図に示す。第３図（対照）はリンパ球はすべ
てALの左側にあることを示している。ALとAH
との間の点は混入した単球である。AHの右の点
は混入した好中球および好酸球である。

第１図において、染色されたリンパ球はALを
越えてALとAHとの間にまで分布している。他
のすべての細胞は対照（第３図）と同じ所にあ
る。この染色は、染色されたリンパ球全部を染色
されないリンパ球から区分するには明かに不適当
である。この理由の一部は、これらの生きている
細胞を長々と取扱うことにより細胞表面への損傷
および表面からの損失が一定でないことに帰する
ことができる。

実験 Ｂ 次に、実験Ａにおける染色混合物中のAECの
代りに４−クロロ−１−ナフトール２mgを使用す
る以外実験Ａと全く同様の操作を行つた。Binet
らは４−クロロ−１−ナフトールを含有する彼等
の染色混合物の詳細について特に指示を行つてい
ないが、公表された方法に従うようにつとめた。
結果を第２図に示すがこれは第１図に示した結果
と同様で、染色されたリンパ球と染色されていな
いものとが明瞭に識別できない。なお一次抗体を
省く以外すべての工程を前述と同様にして負の対
照実験を行つた。対照実験の結果は第３図に示し
たものと同様である。

実験 Ｃ この実験においては、固定されていない細胞と
T101とを使用して「酸素橋」法を実施した。こ
の方法はペルオキシダーゼの結合量を増大するも
ので、Binetらの時はまだこの種の系には試験さ
れていなかつた。この実験においては、実験Ａの
ペルオキシダーゼ複合二次抗体の代りに残りの工
程としてビオケニル化二次抗体の添加、次に
PBS／BSAで３回洗浄、次にABC複合体、次に
PBS／BSAでさらに３回洗浄を行う他は実験Ａ
とすべて同じ工程である。ベクタ・ステイン・キ
ツト（ベクタ−ラボラトリーズ、バーリンガム、
カリホルニア州）中の二次抗体とABCとをメー
カーの使用説明書に従つて使用した。第４図に示
すように着色は若干増加したが、第１図および第
２図の場合と同様染色されたリンパ球と染色され
ないものとはやはり明瞭に識別することができな
かつた。

実験 Ｄ Binetらはときに、細胞を完全に処理した後に
（すなわち例１におけるAECによる染色工程の後
に）細胞の固定を行つた。彼らの方法は、AEC
細胞懸濁液１mlに0.7％ホルムアルデヒド１mlを
加え、混合物を室温に10分間放置し、Ｈ−6000流
動セルに導入する前にPBS1mlで希釈するのであ
つた。結果は第１図に示したものと実質的に同一
であつた。

本例は従来の技術が公知のいかなる改良と組合
せてさえもリンパ球の弁別に不十分であることを
示すものである。ここに述べたあらゆる努力にも
かかわらず、正と負とのリンパ球は明確に異つた
集団には分離されず、再現性は不良であつた。

さらにこの従来技術は固定を行わないか、また
は操作手順内の非常に遅い段階で、細胞が途中の
処理工程によつて著しくいためつけられ、着色不
十分な細胞を生じたずつと後で、固定が行われる
ことが特徴であつた。

例 ２ ここに報告する諸実験は、OKT3（オルト・デ
イアグノステイクス社、ラリタン、ニユージアー
ジー州）またはT101（ヒブリテク社、ラジヨー
ラ、カリホルニア州）を使用する「ABC」リン
パ球弁別免疫検定を、前例に述べたと同様にして
調製したリンパ球懸濁液を再び使用して、比較す
るものである。一つの実験（実験Ａ）において
は、二次抗体とのインキユベーツヨシ後に固定工
程を実施した。第二の実験（実験Ｂ）においては
同種の固定を、本発明に従い、二次抗体とのイン
キユベーシヨンの前に実施した。第三の実験（実
験Ｃ）においてはT101を使用する以外第二の実
験と同様の実験を行つた。

実験 Ａ リンパ球富化懸濁液（例１、実験Ａと同様）の
アリコート100μ（細胞後10⁶個）を清浄な試験
管に分注した。牛血清アルブミン0.4％を含むリ
ン酸塩緩衝食塩水（PBS／BSA）100μおよび
OKT3（全Ｔ一次抗体、濃度25μg／ml）5μを加
え、４℃で15分間インキユベートした。エチレン
ジアミン四酢酸（EDTA）0.3％を含むPBS／
BSA（PBS／BSA／EDTA）洗浄液１mlをこれ
に加え、過大な数の血小板を沈殿させることなく
細胞を沈殿させるため混合物を45秒間遠心した。
上澄液の99％を吸引して廃棄し、この洗浄操作
（PBS／BSA／EDTA）をさらに２回繰返した。
これにより、OKT3結合細胞を含む洗浄リンパ球
の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、ベ
クター法によつて希釈した、ビオチン複合抗マウ
ス免疫グロブリン抗体（ベクターラボラトリー
ズ、バーリンガム、カリホルニア州）100μを
添加した。混合物は４℃で15分間インキユベート
した。再び、PBS／BSA／EDTAで３回洗浄を
行つた。これによりOKT3／二次抗体−ビオチン
結合細胞を含有する洗浄リンパ球の沈殿物を得
た。

次に、二次抗体との反応後、細胞を残留上澄液
に再懸濁し0.07M PBS中ホルムアルデヒド4.6％
の液1.0mlを加え、４℃で10分間インキユベート
した。混合物を前と同様に３回洗浄した。これに
より、OKT3／二次抗体−ビオチン結合細胞を含
有する洗浄されたホルムアルデヒド固定されたリ
ンパ球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、ア
ビジン−ビオチン−わさび大根ペルオキシダーゼ
複合体（ABC）100μ（90〜190μg／ml）と共に
４℃で15分間インキユベートした後PBS／
BSA／EDTAを使用して３回洗浄した。これに
より固定されたペルオキシダーゼを担持した細胞
を含有する沈殿物を得た。この沈殿物を残留上澄
液に再懸濁し染色溶液のアリコート1.0mlを加え
た。この染色溶液はメタノール10ml中に３−アミ
ノ−９−エチルカルバゾール（AEC）８mgを含
む液に３％H₂O₂100μを加え0.05M酢酸ナトリ
ウム緩衝液（PH５）で25mlにして調製したもので
ある。室温で10分後、混合物にPBS2.0mlを加え、
蠕動ポンプによつて吸引して直接にＨ−6000の被
鞘流動セルを通し、ペルオキシダーゼ流路で細胞
信号を得た。結果を第５図に示す。また一次抗体
を省く以外は各工程とも前述と同様な負の対照実
験を行つた。この結果は第７図に示す。

第二の抗体との反応後に細胞を固定するこの方
法においては、染色されないリンパ球（ALの左）
と染色されたリンパ球（ALとAHとの間）との
間の分離が若干達成されたことが認められる。か
かる分離は取るに足りぬものである。

実験 Ｂ リンパ球富化懸濁液のアリコート100μを実
験Ａと同様に処理してOKT3結合細胞を含有する
洗浄リンパ球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し
0.07M PBS中ホルムアルデヒド4.6％の液1.0mlを
加え、４℃で10分間インキユベートした。この混
合物をPBS／BSA／EDTAで３回洗浄した。こ
れにより固定一次抗体（OKT3）結合細胞を含有
する洗浄された、ホルムアルデヒド固定リンパ球
の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞をビオチン複合抗マウス免疫
グロブリン抗体、ABC複合体、および実験Ａに
述べた染色溶液と反応させた。室温で10分後、こ
の混合物にPBS2.0mlを加え前述と同様にしてＨ
−6000流動式血球計数器に導入した。結果を第６
図に示す。

実験 Ｃ 一次抗体としてOKT3の代りにT101を使用し
た以外は実験Ｂと全く同様の実験を行つた。結果
は第６図の実験Ｂにおいて得られたものと実質的
に同じである。

以上の通り、実験Ａ，ＢおよびＣは標識された
リンパ球のサブセツトがもはや、例１、第１，２
および４図におけるような非標識サブセツトとの
連続体は形成しないことを示している。すなわち
標識サブセツトは非標識集団とは間隙で分離され
た別個の集団を形成する。この間隙は第５図（二
次抗体後固体）では狭いが第６図（二次抗体前固
定）では非常に広く、流動式血球計数器において
細胞のサブセツトを便利にかつ正確に計数し分類
するのに必要な基本的な条件を満している。間隙
の広さは細胞が操作工程中いかに早い段階で固定
されたかに帰することができる。

例 ３ ここで報告する通り、リンパ球弁別免疫検定を
本発明に従つて、OKT4（オルト・デイアグノス
テイクス社、ラリタン、ニユージヤージー州）ま
たはコウルタークローンT4（コウルター社、ヒア
レア、フロリダ州）を一次抗体として使用して全
血試料についても実施した。一つの実験（実験
Ａ）においては固定工程を一次抗体（OKT4）と
のインキユベーシヨン後、しかし二次抗体とのイ
ンキユベーシヨンの前に行つた。第二の実験（実
験Ｂ）においては同種の固定を一次抗体（コウル
タークローンT4）とのインキユベーシヨンの前
に行つた。

実験 Ａ 抗凝固処理した全血のアリコート100μを清
浄な試験管に分注した。これをOKT4T細胞モノ
クローナル抗体（オルトデイアグノステイツクス
社、ラリタン、ニユージヤージー州）約2.5μg／
mlを含有する冷等張緩衝食塩水100μと混合し、
混合物を４℃で15〜30分間インキユベートした。
次に0.85％NH₄Cl溶液２mlをよくかきまぜながら
室温で添加して赤血球を溶解した。細胞懸濁液を
15分間1000ｇで遠心して白血球を採取した。白血
球を回収しPBS／BSA／EDTA中４℃で２回洗
浄し、洗浄白血球の沈殿物を得た。

次にこれらの細胞を残留上澄液に再懸濁し、デ
キストロース15％を含む0.075Mリン酸塩緩衝7.5
％ホルムアルデヒド溶液（PH6.7）１mlを加えて
固定した。５〜10分後固定した細胞をPBS／
BSA／EDTAで２回洗浄した。次に、固定後、
細胞を残留上澄液に再懸濁し、ビオチニル化二次
抗マウス免疫グロブリン抗体（12.5μg／ml）0.1
mlと室温で15〜30分間インキユベートし、
PBS／BSA／EDTAで２回洗浄した。洗浄した
細胞を残留上澄液に再懸濁し、アビジン−わさび
大根ペルオキシダーゼ複合体（Ａ：HRP）の
PBS溶液（PBSml当りＡ：HRP50〜100μｇ）0.1
mlとインキユベートした。室温で15〜30分後細胞
をPBS／BSA／EDTAで３回洗浄し、４−クロ
ロ−１−ナフトール0.3mg、エタノール16％、H₂
O₂0.01％を0.025Mリン酸塩緩衝液（PH7.5）中に
含有する染色溶液0.5mlと混合し室温で10分間イ
ンキユベートした。染色した細胞懸濁液をリン酸
塩緩衝液で１mlに希釈し、前述したと同様に直接
Ｈ−6000流動セルを通して吸引して第８図に示す
結果を得た。なお、一次抗体を省いた以外は各工
程とも前に記したと同様な負の対照実験を行つ
た。この結果を第９図に示す。

実験 Ｂ 抗凝固処理した全血のアリコート100μを0.85
％NH₄Clで処理して赤血球を収獲し、本例の実
験Ａに述べたと同様にPBS／SBA／EDTAで２
回洗浄した。

次に、再懸濁した沈殿物をデキストロース15％
を含む0.075Mリン酸塩緩衝7.5％ホルムアルデヒ
ド溶液（PH6.7）１mlと混合して室温で５〜10分
間細胞を固定し、PBS／BSA／EDTAで２回洗
浄した。細胞沈殿物を残留上澄液に再懸濁し、
T₄−ビオチニル化した一次抗体（コウルター社、
ヒアレア、フロリダ州）のPBS溶液（メーカー
の使用説明書に従つて原液から希釈したもの）
0.2mlと室温で15〜30分間インキユベートし、
PBS／BSA／EDTAで２回洗浄した。得られた
沈殿物を再懸濁しアビジン−ペルオキシダーゼ
（50〜100μg／mlPBS）0.1mlと室温で15〜30分間
インキユベートし、PBS／BSA／EDTAと２回
洗浄した。得られた沈殿物を再懸濁し、0.025M
リン酸塩緩衝液（PH7.5）中に４−クロロ−１−
ナフトール0.3mg、H₂O₂0.01％、エタノール（ま
たはメタノール）16％を含む染色溶液0.5mlと混
合し、室温で10分間インキユベートした。次に混
合物にPBS2.0mlを加え、前述に述べたと同様に
して、直接Ｈ−6000被鞘流動セルを吸引通過させ
た。その結果を第１０図に示す。また一次抗体を
省く以外各工程とも前述と同様にして負の対照実
験を行つた。その結果を第１１図に示す。

これらの実験は、全血についてもリンパ球富化
懸濁液と同様優れた分離性と再現性が得られるこ
とを示している。すなわち、二つのリンパ球サブ
セツト（その一つは標識されている）は別個の分
離した集団を形成する。PMNはAH閾値の右側
にある。第９図および第１１図は相当数の単球が
ALとAHとの間に来ることを示す。これらはそ
れぞれ第８図および第１０図のAL，AH間の計
数から差引き染色されたリンパ球の数を決定す
る。

これら全血法においても、例２、実験Ｂ（第６
図）におけると同様早期固定により非染色リンパ
球と染色リンパ球との間に大きく有用な間隙が得
られる。

【図面の簡単な説明】

第１〜１１図は流動式血球計数器を通過する細
胞懸濁液中の個々の白血球の二次元プロツトにお
ける散乱−分散パターンを示す説明図である。図
中、各白血球は黒点で表わされる。第１，２およ
び４図は未固定の白血球富化細胞懸濁液の処理に
従前技術の方法を使用して得た結果に係る。第３
図はかかる従前技術の方法に対する非標識対照実
験の結果に係る。第５および第６図は細胞懸濁液
の固定を、二次抗体を白血球に作用させる後およ
び前にそれぞれ行う場合に得られる結果に係る。
第７図は第５，６図に示したプロセスに対する非
標識対照実験の結果に係る。第８および第１０図
は全血を使用して本発明に従つて得られた結果
で、それぞれ一次抗体を白血球に作用させるすぐ
後および前に細胞固定を行う場合の結果に係る。
第９および第１１図はそれぞれ第８および第１０
図に対する非標識対照実験の結果に係る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 種種のクラスの白血球を含有する不均一な全
   血細胞懸濁液中の興味あるリンパ球の母集団（ポ
   ピユレーシヨン）を検出するフローサイトメトリ
   ー法であつて、赤血球は測定の前に溶血する方法
   において、 (a) 第１に、前記全血細胞懸濁液を、ホルムアル
   デヒド約7.5％まで及び糖約15％までを含んで
   成る第１の試薬と、約10分間まで反応させて前
   記全血細胞懸濁液中の細胞を固定及び安定化
   し、 (b) 次に前記工程(a)の固定した細胞懸濁液を第２
   の試薬と共にインキユベートし、ここで第２の
   試薬は前記リンパ球母集団のＴリンパ球又はＢ
   リンパ球表面抗原に対して特異的である一次抗
   体を含んで成るものであり、こうして前記細胞
   懸濁液中に一次抗体で標識された固定化された
   リンパ球母集団を形成し、 (c) 次にこの工程(b)の一次抗体標識固定化リンパ
   球母集団を、前記一次抗体の免疫グロブリンク
   ラスに対して特異的である酵素リガンド複合体
   と反応させて、前記酵素リガンド複合体が前記
   一次抗体標識固定リンパ球母集団に結合した細
   胞懸濁液を形成し、 (d) 次にこの工程(c)の細胞懸濁液を、前記酵素と
   反応する少くとも１種の組成物と反応させて、
   前記リンパ球母集団を着色し、 (e) 次にこの工程(d)の細胞懸濁液を、実質的に一
   度に１個ずつ光束中を通過させながら、通過す
   る細胞による光散乱及び光吸収を測定し、そし
   て (f) 光散乱及び光吸収の応答の強度に部分的に基
   いて、着色した及び着色してない細胞を弁別
   し、ここで着色した細胞は前記不均一全血細胞
   懸濁液中の興味あるリンパ球母集団の存在を示
   すものである、フローサイトメトリー法。 ２ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(a)の前に予
   め溶血する前項１に記載の方法。 ３ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(a)の後に溶
   血する前項１に記載の方法。 ４ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(b)の後に溶
   血する前項３に記載の方法。 ５ 工程(b)の第２試薬の一次抗体がモノクロナー
   ル抗体である前項４に記載の方法。 ６ 工程(c)として、 （c′）工程(b)の一次抗体標識固定リンパ球母集
   団を、一次抗体に対して特異的なビオチニル化し
   た二次抗体と共にインキユベートして、一次抗体
   に結合させ、そして（c″）次に工程（c′）の細胞
   混合物を、ビオチンに対して特異的に結合する第
   ２の酵素リガンド複合体と反応させる 工程を含む前項１に記載の方法。 ７ ビオチニル化した第２抗体がポリクロナール
   抗体である前項６に記載の方法。 ８ 第２酵素リガンド複合体のリガンドがアビジ
   ンである前項６に記載の方法。 ９ 酵素アビジン複合体がペルオキシダーゼ−ア
   ビジン複合体である前項８に記載の方法。 １０ 酵素アビジン複合体がアルカリ性ホスフア
   ターゼ−アビジン複合体である前項８に記載の方
   法。 １１ 酵素リガンド複合体がアビジン−ビオチン
   −酵素複合体を含んで成る前項１に記載の方法。 １２ 酵素がペルオキシダーゼである前項１１に
   記載の方法。 １３ 酵素がアルカリ性ホスフアターゼである前
   項１１に記載の方法。 １４ 酵素を色原体と反応させ、そして少くとも
   １種の組成物として３−アミノ−９−エチルカバ
   ゾール及び４−クロロ−１−ナフトールから成る
   群から選んだ色原体を含有するものを使う前項１
   に記載の方法。 １５ 糖がデキストロースである前項１に記載の
   方法。 １６ 種種のクラスの白血球を含有する不均一な
   全血細胞懸濁液中の興味あるリンパ球の母集団
   （ポピユレーシヨン）を検出するフローサイトメ
   トリー法であつて、赤血球は測定の前に溶血する
   方法において、 (a) 第１に、前記全血細胞懸濁液を、前記リンパ
   球母集団のＴリンパ球又はＢリンパ球表面抗原
   に対して特異的である一次抗体を含んで成る試
   薬と共にインキユベートして前記細胞懸濁液中
   に一次抗体で標識されたリンパ球母集団を形成
   し、 (b) 次に前記工程(a)の細胞懸濁液をホルムアルデ
   ヒド約7.5％まで及び糖約15％までを含んで成
   る第１の試薬と、約10分間まで反応させて前記
   細胞懸濁液中の細胞を固定及び安定化し、 (c) 次にこの工程(b)の一次抗体標識固定化リンパ
   球母集団を、前記一次抗体の免疫グロブリンク
   ラスに対して特異的である酵素リガンド複合体
   と反応させて、前記酵素リガンド複合体が前記
   一次抗体標識固定リンパ球母集団に結合した細
   胞懸濁液を形成し、 (d) 次にこの工程(c)の細胞懸濁液を、前記酵素と
   反応する少くとも１種の組成物と反応させて、
   前記リンパ球母集団を着色し、 (e) 次にこの工程(d)の細胞懸濁液を、実質的に一
   度に１個ずつ光束中を通過させながら、通過す
   る細胞による光散乱及び光吸収を測定し、そし
   て (f) 光散乱及び光吸収の応答の強度に部分的に基
   いて、着色した及び着色してない細胞を弁別
   し、ここで着色した細胞は前記不均一全血細胞
   懸濁液中の興味あるリンパ球母集団の存在を示
   すものである、フローサイトメトリー法。 １７ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(a)の前に
   予め溶血する前項１６に記載の方法。 １８ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(a)の後に
   溶血する前項１６に記載の方法。 １９ 全血細胞懸濁液中の赤血球を工程(b)の後に
   溶血する前項１８に記載の方法。 ２０ 工程(a)の試薬の一次抗体がモノクロナール
   抗体である前項１６に記載の方法。 ２１ 工程(c)として、 （c′）工程(b)の一次抗体標識固定リンパ球母集
   団を、一次抗体に対して特異的なビオチニル化し
   た二次抗体と共にインキユベートして、一次抗体
   に結合させ、そして（c″）次に工程（c′）の細胞
   混合物を、ビオチンに対して特異的に結合する第
   ２の酵素リガンド複合体と反応させる 工程を含む前項１６に記載の方法。 ２２ ビオチニル化した第２抗体がポリクロナー
   ル抗体である前項２１に記載の方法。 ２３ 酵素リガンド複合体のリガンドがアビジン
   である前項２１に記載の方法。 ２４ 酵素アビジン複合体がペルオキシダーゼ−
   アビジン複合体である前項２３に記載の方法。 ２５ 酵素アビジン複合体がアルカリ性ホスフア
   タゼ−アビジン複合体である前項２３に記載の方
   法。 ２６ 酵素リガンド複合体がアビジン−ビオチン
   −酵素複合体を含んで成る前項１６に記載の方
   法。 ２７ 酵素がペルオキシダーゼである前項２４に
   記載の方法。 ２８ 酵素がアルカリ性ホスフアターゼである前
   項２６に記載の方法。 ２９ 酵素を色原体と反応させ、そして少くとも
   １種の組成物として３−アミノ−９−エチルカバ
   ゾール及び４−クロロ−１−ナフトールから成る
   群から選んだ色原体を含有するものを使う前項１
   ６に記載の方法。 ３０ 糖がデキストロースである前項１６に記載
   の方法。