JPH05665B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、ハプテンすなわち分子量が約1500未
満の１価の低分子非タンパク質物質の分析に特に
適した粒子凝集反応検定法に関する。 現在粒子凝集反応技術に基づく多種類のイムノ
アツセイが知られている。本質的にそれらの検定
法の定性的または定量的な結果は、免疫反応試薬
を担持している微細粒子の凝集の有無および（ま
たは）その程度によつて決められる。最も一般的
に使う粒子は市販されているいわゆるラテツクス
粒子と呼ばれるものであり、これは微視的または
微視的以下の大きさすなわち約15ミクロン以下、
最も普通には数ミクロンから１ミクロン以下の大
きさのものを使う。検定法の中には凝集塊の存在
を肉眼で観察できるものもあるが、定量結果を得
るためには最終的な反応混合物中の粒子の数（通
常は凝集しなかつた粒子の数）を計数（または測
定）するのが普通である。粒子凝集反応技術に基
づくイムノアツセイについては、英国特許第
1508133号、米国特許第4162895号、第4184849号
および4062935号およびヨーロツパ特許公開第
10932号に記載されているので、詳細については
これらを参照されたい。 抗原およびハプテンに対する粒子凝集反応検定
については米国特許第4184849号に記載されてい
る。この検定法では２種類の粒子状試薬を使う。
この２種類の試薬は一緒に混合すると互いに凝集
するが、検定すべき抗原またはハプテンが存在す
るとその凝集が阻害される。この検定法は実用上
非常に満足すべきものであるが、２種類の粒子状
試薬が必要であつてそれぞれが、行なわれる特定
の検定法に特異的でありさらにそれぞれコントロ
ールされた量で使わなければならないという欠点
がある。このような２種類の試薬を使うために操
作全体がより複雑になり、その点で望ましくな
い。 １種類の粒子状試薬だけを使う、粒子凝集反応
による検定法が１種知られているが、この方法で
はハプテンの検定は充分に行なえない。この方法
［例えば『Methods in Enzymology』第74巻、
第106〜139頁、1981年、J.J.Langone編、
Academic press社、ニユーヨーク］では、検定
すべき抗原を含む試料を、抗体を保持しているラ
テツクス粒子と混合すると抗原が抗体と結合し、
そしてラテツクス粒子の凝集を起こす。この凝集
は、抗原が多価であるために２個またはそれ以上
の抗体分子と同時に結合でき、従つて２個（また
はそれ以上の）ラテツクス粒子間に架橋すること
から生じる。これとは対照的に、ハプテンは１価
であるために１個のラテツクス粒子の抗体と結合
はするが２個またはそれ以上のラテツクス粒子間
で架橋することはできず従つて凝集しない。 １種類だけの粒子状試薬を使う別の粒子凝集反
応検定法が知られていて、これは免疫複合体の検
定用である（前記『Methods in Immunology』
参照）。この検定法では、検定すべき免疫複合体
を含む試料を免疫グロブリンＧ−コーテイングラ
テツクス粒子および一定量の凝集剤と混合する。 ラテツクス上のIgGと遊離の複合体とが、凝集
剤との反応において競合するため、ラテツクス粒
子の凝集の程度から試料中の複合体の量が定量で
きる。この検定法は非常に感度が良く、迅速でし
かも正確である。原則的に同様の操作により、抗
原を検定できる。すなわち検定すべき抗原を含む
試料と、それと同じ抗原を担持しているラテツク
ス粒子および過剰量の抗体とを混合する。次に遊
離の抗原およびラテツクスに結合した抗原が抗体
と結合し複合体を形成するため、そこに一定量の
凝集剤を加えると、試料中に存在していた（遊離
の）抗原の量に応じた程度に粒子の凝集がおこ
る。 理論的にはこのような方法により抗原の検定が
できるが、ハプテンの検定には適当でない。それ
は、ハプテンは抗体に結合して複合体を形成する
が遊離の複合体の凝集剤に対する親和性が非常に
低いからである。さらに、このような方法を使つ
てハプテンの検定を行なえたとしても、凝集剤の
凝集性がその起源によつて大きく変化するため
に、精確な量で使おうとすると再現性を得るのが
むずかしくなる欠点があり、それは特に商業的規
模で多数の検定を行なう際に顕著である。 本発明者は、１種類だけのラテツクス粒子試薬
を使い、凝集剤の使用量の精確な量には依存しな
いで行なう粒子凝集反応検定法を発明した。きわ
しく述べると、遊離のハプテン−抗体複合体は凝
集剤に対して非常に小さな親和性しかもつていな
いが、ハプテンをラテツクス粒子に結合させる
と、例えば(イ)まず担体（例えばタンパク質または
重合体）と複合させた後、ラテツクスとカツプリ
ングさせるか、または(ロ)ラテツクスと直接カツプ
リングさせると、その親和性は驚くほど明らかに
増加する。ラテツクス結合複合体と凝集剤との結
合は強く、そのため（各各複合体を担持してい
る）２個のラテツクス粒子が凝集剤と結合する。
この点は遊離のハプテン−抗体複合体に対する凝
集剤の効果とは対照的であり、後者の場合凝集剤
と複合体の間の親和性が弱いため充分な結合がお
きない。 以上の結果を利用して、ハプテンを以下の方法
で検定できる。検定すべきハプテンまたはその特
異的な類似体を担持しているラテツクス（または
他の粒子）および一定量の抗体と、検定すべきハ
プテンを含む試料とを混合する。遊離のハプテン
と、ラテツクスに結合しているハプテンとが一定
量の抗体上で競合し、複合体を形成するため、抗
体の一部が遊離のハプテンと結合し、残りの抗体
はラテツクスに結合しているハプテンと結合す
る。反応混合物中に含まれている凝集剤は、ハプ
テン−抗体複合体を担持しているレテツクス粒子
だけの凝集をおこす。凝集剤は、ラテツクスに結
合したハプテン、遊離のハプテンおよび遊離のハ
プテン−抗体複合体のいずれとも有意な程度には
結合しない。凝集の有無およびその程度が、検定
すべきハプテンの存在と量を示す。 このハプテンの検定法においては、必要な凝集
剤の量はラテツクス−免疫複合体粒子の有意な程
度の凝集を起こすのに必要な量であればよい。実
際、このハプテン検定用反応混合物の他の成分は
いずれも、凝集剤との結合能は有意な程度ではな
いから、実際に必要な凝集剤はごく少量である。
従つて本発明方法には、ハプテン検定用の高価な
試薬を大変経済的に使える利点がある。さらに凝
集剤を厳密に測定した量で使う必要がまつたくな
いため、検定結果の再現性と精度が向上した。本
発明によれば、（必然的に種々の性質を持つもの
である）凝集剤において競合反応がおこるのでは
なく、抗体において競合反応がおきる。また再現
性のある抗血清の製造法は充分に確立された技術
である。以上により、従来技術における問題点は
解消された。 本発明によれば、検定すべきハプテンを含む液
体試料を (a) 検定すべきハプテンまたはその特異的な類似
体を担持している不活性な微細粒子、 (b) 前記ハプテンに対する『一定量』（この用語
については後に説明する）の抗体、および (c) 凝集剤 と混合し、凝集の程度を測定し、その結果から前
記液体試料中のハプテンを定量することから成
る、前記液体試料中のハプテンを検定する方法を
得る。 次に述べる理論に拘束されるわけではなく、本
発明の範囲がそれに制限されるわけではないが、
ラテツクス結合ハプテン−抗体−複合体の凝集剤
に対する親和性が（遊離のハプテン−抗体複合体
のそれよりも）大きいものは、ラテツクスの表面
近くにハプテン分子がいくつか存在してそれぞれ
抗体と結合するため、（ラテツクス粒子上の抗体
を介して）２個またはそれ以上の架橋によつてラ
テツクス粒子が凝集剤と結合できることによると
考えられる。従つて凝集剤と複合体との間の親和
性は、複合体がラテツクスに結合していると増加
すると考えられる。それはラテツクス粒子表面上
に凝集剤と結合する多価の領域ができるためであ
る。そのような多価領域は当然のことながら遊離
のハプテン抗体複合体の希薄溶液中では生じな
い。実際ハプテンをラテツクス表面上に固定化す
ることにより、ハプテン−抗体複合体は『濃縮』
され、凝集剤への親和性が増加する。 本発明の方法において、抗体の『一定量』と
は、ラテツクス−抗体またはラテツクス−ハプテ
ン凝集反応混合物に抗体を添加した時に、100％
以下好ましくは40〜80％最も好ましくは70〜80％
凝集が起こる量である。ラテツクス−ハプテンの
濃度は、理想的な検定範囲の約50％の濃度のハプ
テン溶液に粒子を添加した時にその約50％が凝集
する濃度に調整するが好ましく、凝集剤は過剰量
で使う（凝集剤の濃度の±10％の変動は、凝集し
なかつた粒子の濃度測定において認識できるほど
の変化を与えない）。 前記のように好ましい範囲内で結果を得るため
には通常、検定すべきハプテンごとに予備試験や
実験が必要であるが、実際にはそのような試験は
標準曲線（または他の標準値）を得るための操作
に含まれるものであり、それによつて検定すべき
ハプテンの量の絶対値が凝集の程度から読み取れ
る。前記のような予備試験は、特定の検定用の凝
集剤の最適量を知るためにも使われる。 本発明方法はハプテンの検定に広く利用でき
る。本発明方法によつて有利に検定できる特定の
ハプテンとしては、薬物および薬物代謝物例えば
テオフイリン、バルビトン、フエニルヒダントイ
ン、ジゴキシン、ジギトキシンおよびゲンタマイ
シン、細胞内伝達体例えばサイクリツク−AMP
およびサイクリツク−GMP、プロスタグランジ
ンおよびプロスタグランジン代謝物、ホルモン類
例えば視床下部および松果体ホルモン例えば向甲
状腺ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出
ホルモン、ソマトスタチン、メラトニン、サブス
タンス−Ｐ、ニユーロテンシン、脳下垂体ホルモ
ン例えばオキシトシンおよびバソプレツシン、甲
状腺ホルモン例えばチロキシンおよびトリヨード
チロニン、消化管系のホルモン、例えばセロトニ
ン、スイ臓ホルモン、およびステロイドホルモン
例えばエストラジオール、プロゲステロン、テス
トステロン、アルドステロンおよびコルチゾー
ル、ビタミン例えばB12、葉酸、ビタミンＤ代謝
物、および細菌またはウイルス起源のハプテン例
えば白血症ウイルスの糖脂質が挙げられる。特定
のハプテンを検定するための液体は通常、生物起
源のもの例えばヒトまたは動物の体液例えば血
清、睡液または尿である。 粒子状試薬としては、これまで述べてきたよう
にラテツクス粒子が普通であるが、あまり好まし
くはないが他の粒子例えば寒天ゲル、セフアデツ
クスゲルまたはベントナイトも使える。粒子に
は、検定すべきハプテンと同じハプテンまたはそ
の特異的な類似体を担持させる。ハプテン担持粒
子の製造法は当分野で公知である。粒子上の適当
なコーテイングにハプテンを吸着させることもで
きるし、架橋化剤によつて化学的にカツプリング
させることもできる。まれには、ラテツクス粒子
自身のポリマーにハプテンを直接カツプリングさ
せることができる。粒子に結合したハプテンが抗
体にとつてアクセスできるものである限り、ハプ
テン担持粒子の製造法は重大なことではない。英
国特許第2013688Aに記載されている方法により、
ハプテンを適当に粒子とカツプリングさせること
ができる。 本発明方法において使用する抗体を常法により
生産できる。 凝集剤は好ましくはリチウム因子（RF）であ
るが、他の凝集剤例えば補体成分、いわゆる
Clq、マウス血清またはマウス腹水を使用するこ
ともできる。これらの凝集剤は前記の特許明細書
中に記載されている。ハプテンの検定において
は、抗体が粒子上のハプテンと結合している粒子
の凝集を凝集剤がひきおこす。ハプテンのみを持
つ他の粒子は凝集しない。凝集剤は遊離のハプテ
ン−抗体複合体とは有意な程度の反応はおこさな
い。 イムノアツセイにおいて、妨害、特に（生物起
源の液体の場合）非特異的タンパク質−タンパク
質相互作用による妨害が生じ得るということは周
知である。ヨーロツパ特許出願公開第38181号明
細書に記載のように前記相互作用はケイオトロピ
ツク剤の使用により減ずることができ、この助剤
を本発明の方法に使用することもできる。タンパ
ク質妨害を排除するための別の技術としては、液
体試料をタンパク質分解酵素（例えばペプシン）
で（検定前に）処理し、望ましくないまたは妨害
をおこすタンパク質を消化する技術もある。この
技術はヨーロツパ特許出願第81305261.0明細書に
記載のようにハプテンを検定する場合に使用する
こともできる。 本発明方法において、検定すべきハプテンの存
在の有無および（または）量は凝集の存在および
（または）程度からにそして標準物質に関する測
定結果から決定される。どんな程度でどのような
凝集が起こつたかどうかを評価するために、好ま
しくは反応混合物中に凝集しないで残つている粒
子の数をカウントする。前記の選択的カウンテイ
ングは例えばテクニコンオートカウンターシステ
ムまたは類似のシステムの使用により行なうこと
ができる。（『テクニコン』および『オートカウン
ター』は登録商標である。）選択的カウンテイン
グが好ましけれども、凝集の程度の評価は他の方
法、例えば凝集塊を凝集していない粒子から分離
し、そして重量を計るかまたは量を測定すること
により行うことができる。 本発明方法は手動または連続的な自動化方法例
えばテクニコンPACIA法により行うことができ
る。 本発明をより十分に理解するために以下に、本
発明を単に説明する意味でジゴキシンの検定例を
記載する。 例においては添付図面を参照されたい。 第１図は本発明方法を行うための装置の１形態
の簡略化した線図的説明である。 第２図はジゴキシン量（μg／）に対してプ
ロツトした凝集の阻害％の線図、すなわち、
PACIAによるジゴキシン定量のための校正曲線
である。 第３図はPACIA法により決定した検定結果と
（同一の試料を）ラジオイムノアツセイにより決
定した検定結果との相関を示すプロツトの線図で
ある（Ｎ＝109、ｒ＝0.943）。 例 Ａ 試薬 グリシン緩衝食塩水（GBS） NaOHによりPH9.2に調整した、0.1M NaCl、
0.17mol／Ｌグリシンおよび0.04g／LNaアジドを
含有する溶液。 GBS−BSA GBS中の10g／Ｌウシ血清アルブミン
［Biograde from Calbiochem社（San Diego，
CA）製。 HCl−ペプシン ２度結晶化した4g／Ｌペプシン（Sigma
Chemical Co.、St.Louis，MO.製）を含有する
0.15mol／LHCl。０〜４℃に保存したこの溶液
は約１日間安定である。 IgG抗ジゴキシン IgGをジゴキシン−ウシフイブリノゲン結合体
に対して調整したウサギ抗血清からのリバノール
沈殿により抽出する。この血清１mlは250000回の
検定を行なうに十分である。 RF １／3000のラテツクス凝集タイター（titer）
（ラテツクスRF試薬、Behringwerke AG.
Marburg／Lahn，West Germany製）によりプ
ラズマフアレーシスにかけたリウマチ患者の全血
清。 凝集混合物 抗ジゴキシンIgGをRFおよびGBS−BSAと混
合してRFに対して1/50の最終タイターおよび出
発抗血清中のIgGの1/4000の濃度を得る。この混
合物はアリコート１ml中に−20℃で貯蔵され、60
回の検定に十分である。 ラテツクス 0.8μのカルボキシル化したポリスチレン粒子
（10％ Ｗ／Ｖ−Estapor Ｋ 150、ロツトNo.
314）。 BSA−ジゴキシン結合体 過ヨウ素酸塩法により調整する。 ジゴキシン−BSA−ラテツクス カルボキシル化したラテツクス500μをPH8.1
の0.02mol／Ｌホウ酸塩緩衝食塩水（BBA）５ml
中で洗浄し、遠心分離し、BBS １ml中に再懸濁
し、そして１−エチル−３−（３−ジメチル−ア
ミノ−プロピル）−カルボジイミドHCl 25mgと45
分かきまぜて室温でインキユベートすることによ
り活性化する。遠心分離し、そしてBBS1ml中に
再懸濁した後、活性化したラテツクスを9g／Ｌ
食塩水中のBSA−ジゴキシン結合体の10g／Ｌ溶
液25μとゆつくりかきまぜながら、４℃で一夜
インキユベートする。GBS−BSA 250μの添加
後、粒子を遠心分離し、GBS−BSAで３回洗浄
し、GBS−BSA 10ml中に再懸濁し、そして
Branson Sonifier B12中で数秒間超音波により
処理する。３週間以内に使用するならば、ジゴキ
シン−BSA−ラテツクスを４℃で貯蔵する。よ
り長く貯蔵するには、試薬をさらに処理すること
なく凍結乾燥する。使用する前にラテツクス懸濁
液をEDTA5mMを含有するGBS、60g／ポリ
エチレングリコール6000（Merck，Darmstadt，
West Germany製）および半飽和のNaClで1/4
希釈する。 Ｂ 標準物質および試料 ジゴキシンをエタノールに溶解して1g／Ｌの
濃度にする。標準物質を調整するために、次にこ
の溶液を正常ヒト血清のプールで希釈する。 乳状脂粒は一般にラテツクスのカウントを妨害
しない。しかし、血清試料が凍結されている場
合、変性リポタンパク質により生成したいくらか
の粒子はそれらがラテツクス粒子であるかのよう
にカウントされることができる。本発明方法の大
部分は凍結した血清について行うので、それらを
最初に処理してこの妨害可能な原因を除去する。
約200μの試料をかきまぜながらFreon 113
（Serva，Heidelberg，W.Germany製）100μと
混合し、そして次に5000rev／minで５分間遠心
分離する。 試料のタンパク質分解酵素による消化のために
（タンパク質を分解するため）澄明な上澄み液の
アリコート約100μをHCl−ペプシン300μと37
℃で10分間インキユベートする。次に2mol／Ｌ
TRIS［トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミン］20μの添加により消化を停止する。タン
パク質分解酵素による消化を全く同じ方法で標準
物質に対しても施す。 Ｃ 装置 この実験はテクニコンPACIA自動システムを
使つて行う。このシステムは文献（例えば前記の
『Method in Enzymology』参照）中に記載され
ているが、その簡略化した図を添付図面の第１図
に示す。第１図に関して、システムは実質的に４
つの手段、DIAS手段１、ポンプ２、オートカウ
ンター３および電子的モジユール４から成る。
DIAS手段１（DIASとは希釈機−インキユベー
ター−かきまぜ機−サンプラーの意味である）は
垂直軸のまわりで回転するように設置された水平
の回転トレー１０から成り、そしてその中に試料
管１１を受け取る一連の装置を持つている。トレ
ー１０の円周のまわりは各各の管に試薬を添加す
るプローブを包含する場所１２，１３，１４，１
５が配置されている。管１１は温度調節箱中、ト
レー１０の下方に位置している。もう１つの場所
１６で、最終反応混合物が試料として採取され、
この試料はその中で例えばさらに希釈および脱気
泡化されてもよいマニホルドを通過し、ポンプ２
を経て凝集していない粒子のみをカウントするた
めにオートカウンター３に通す。モジユール４は
結果をプリントアウトするかまたは表示する。
DIAS手段１中で、試料管１１はかきまぜられ、
粒子を懸濁状態に保つ。 Ｄ PACIA法 処理した血清の未測定量約200μを試料管１
１中にピペツトで測り入れ、そしてサンプラート
レーの内部の列に置く。場所１２からのプローブ
は試料100μを別の試料管（いわゆる反応管）
中に吸い出し、次に凝集した混合物15μおよび
ラテツクス結合体15μ場所１３および１４で次
次添加する。トレーを回転させながら37℃で25分
間インキユベーシヨンした後、懸濁液をGBS0.88
mlの添加により希釈し（場所１５）、そして88μ
をマニホルド中に吸い出し（場所１６）、そこ
で懸濁液はさらに１ml／LTween２０を含有する
GBSにより20回希釈される。脱気泡化した後、
得られた流出液をオートカウンター３に通す。凝
集していない粒子の濃度はレコーダ−のピーク高
度により表示される。この装置により50回分析／
時が達成される。 試料の予備的なペプシン消化は手動で行われ
る。 Ｅ ラジオイムノアツセイ（RIA）（比較） RIAはCorning Medical，Corning Grass
Works，Medfield，Massachusetts，U.S.A.から
のIMMOPHASEキツトを使つて行われる。 Ｆ 結果 校正曲線 高感度を達成するため、抗ジゴキシンIgGの高
希釈液（1/4000）を使い、このものは凝集剤の不
在下に得られる粒子の総数の少くとも30％の粒子
数の減少をRFの存在下与える。ジゴキシンの添
加量が増加すると、凝集していない粒子数の漸進
的増加が起こる（第２図）。ジゴキシンの不在下
で得られる小さなピークは日ごとにわずかに変化
する。類似の校正曲線が得られることから、反応
の程度を凝集剤の不在下で得られたピーク高さと
阻害剤の不在下で得られたピーク高さとの差に相
当する全阻害のパーセンテージとして表示する。
校正曲線は0.4μg／Ｌから6μg／Ｌに広げられる。 妨害 予備的なペプシン処理に抵抗する非特異的凝集
剤によりおこる可能性のある妨害をチエツクする
ため、ジゴキシ−BSA−ラテツクスを使用して
49人の患者の血清の凝集活性を試験する。この
際、凝集混合物は一般に抗ジゴキシンIgGおよび
RFを希釈するのに使用する緩衝液により置換さ
れている。凝集していない粒子の平均濃度に対す
るCV（Coefficient of Variation：変動係数）は
1.7％である。また、ジゴキシンが欠けている別
の11人の患者の血清を使用して、抗ジゴキシン
IgGおよびRFの混合物により生成した凝集上の
可能な非特異的阻害効果を試験する。平均ピーク
高度に対するCVは3.7％である。 回復 ジゴキシンを血清100個にその量を増やしなが
ら添加して0.6μg／Ｌから5.8μg／Ｌの範囲の濃度
レベル10種を得る。（表１）。PACIA結果と公知
値との間の相関はｒ＝0.989（ｙ＝0.07＋１／03
×）である。 RIAに対する相関 血清109個をPACIAにより２回検定し、そして
２回の結果の平均をRIAに対する相関に使用する
（第３図）０から5.7μg／Ｌの間の値の係数はｒ＝
0.943（PACIA結果＝0.37＋0.68RIA結果）であ
る。 精度 イントラーおよびインターアツセイの精度は治
療上の値の大部分の範囲（第２図）をカバーする
濃度で試料を使つて研究される。イントラアツセ
イCVおよびインターアツセイCVの最大値はそれ
ぞれ12.5％および8.9％である。比較的高いイン
トラアツセイCVはドリフトによる一連の検定に
対して説明することができる。例えば、1.10μg／
Ｌでスパイク（spike）した試料に対して得られ
た結果（CV＝10.9）は0.93μg／Ｌから1.30μg／
Ｌの時間で直線的に増加する。しかし、別の系列
においては、ドリフトはより明確ではなく、そし
てインプレシジヨンは数個の検定のみで生じる。
例えば1.25μg／Ｌ血清（CV＝12.0）において、
３つの結果は1.60μg／Ｌ、1.60μg／Ｌおよび
1.55μg／Ｌである。 ここで、イントラーアツセイとは同一のアツセ
イ（検定）における試料間の結果の変動を、イン
ターアツセイとは異なるアツセイにおける試料間
の結果の変動を、ドリフトとは通常電気的または
電子的測定による結果が時間の経過と共に連続的
に単一方向に増加または減少する動きを示すこと
を、スパイクとは混合または接触することを、そ
れぞれ意味する。インプレシジヨンが生じるとは
CVが高い測定結果が得られたことを、意味し、
インプレシジヨンが数個の検定のみで生じたこと
は、他の大多数の検定において得られた結果は非
常に良く似たものである（すなわちインプレシジ
ヨンが低い、換言すればプレシジヨンが高い）こ
とを意味する。SDは標準偏差（Standard
Deviation）を意味する。
満の１価の低分子非タンパク質物質の分析に特に
適した粒子凝集反応検定法に関する。 現在粒子凝集反応技術に基づく多種類のイムノ
アツセイが知られている。本質的にそれらの検定
法の定性的または定量的な結果は、免疫反応試薬
を担持している微細粒子の凝集の有無および（ま
たは）その程度によつて決められる。最も一般的
に使う粒子は市販されているいわゆるラテツクス
粒子と呼ばれるものであり、これは微視的または
微視的以下の大きさすなわち約15ミクロン以下、
最も普通には数ミクロンから１ミクロン以下の大
きさのものを使う。検定法の中には凝集塊の存在
を肉眼で観察できるものもあるが、定量結果を得
るためには最終的な反応混合物中の粒子の数（通
常は凝集しなかつた粒子の数）を計数（または測
定）するのが普通である。粒子凝集反応技術に基
づくイムノアツセイについては、英国特許第
1508133号、米国特許第4162895号、第4184849号
および4062935号およびヨーロツパ特許公開第
10932号に記載されているので、詳細については
これらを参照されたい。 抗原およびハプテンに対する粒子凝集反応検定
については米国特許第4184849号に記載されてい
る。この検定法では２種類の粒子状試薬を使う。
この２種類の試薬は一緒に混合すると互いに凝集
するが、検定すべき抗原またはハプテンが存在す
るとその凝集が阻害される。この検定法は実用上
非常に満足すべきものであるが、２種類の粒子状
試薬が必要であつてそれぞれが、行なわれる特定
の検定法に特異的でありさらにそれぞれコントロ
ールされた量で使わなければならないという欠点
がある。このような２種類の試薬を使うために操
作全体がより複雑になり、その点で望ましくな
い。 １種類の粒子状試薬だけを使う、粒子凝集反応
による検定法が１種知られているが、この方法で
はハプテンの検定は充分に行なえない。この方法
［例えば『Methods in Enzymology』第74巻、
第106〜139頁、1981年、J.J.Langone編、
Academic press社、ニユーヨーク］では、検定
すべき抗原を含む試料を、抗体を保持しているラ
テツクス粒子と混合すると抗原が抗体と結合し、
そしてラテツクス粒子の凝集を起こす。この凝集
は、抗原が多価であるために２個またはそれ以上
の抗体分子と同時に結合でき、従つて２個（また
はそれ以上の）ラテツクス粒子間に架橋すること
から生じる。これとは対照的に、ハプテンは１価
であるために１個のラテツクス粒子の抗体と結合
はするが２個またはそれ以上のラテツクス粒子間
で架橋することはできず従つて凝集しない。 １種類だけの粒子状試薬を使う別の粒子凝集反
応検定法が知られていて、これは免疫複合体の検
定用である（前記『Methods in Immunology』
参照）。この検定法では、検定すべき免疫複合体
を含む試料を免疫グロブリンＧ−コーテイングラ
テツクス粒子および一定量の凝集剤と混合する。 ラテツクス上のIgGと遊離の複合体とが、凝集
剤との反応において競合するため、ラテツクス粒
子の凝集の程度から試料中の複合体の量が定量で
きる。この検定法は非常に感度が良く、迅速でし
かも正確である。原則的に同様の操作により、抗
原を検定できる。すなわち検定すべき抗原を含む
試料と、それと同じ抗原を担持しているラテツク
ス粒子および過剰量の抗体とを混合する。次に遊
離の抗原およびラテツクスに結合した抗原が抗体
と結合し複合体を形成するため、そこに一定量の
凝集剤を加えると、試料中に存在していた（遊離
の）抗原の量に応じた程度に粒子の凝集がおこ
る。 理論的にはこのような方法により抗原の検定が
できるが、ハプテンの検定には適当でない。それ
は、ハプテンは抗体に結合して複合体を形成する
が遊離の複合体の凝集剤に対する親和性が非常に
低いからである。さらに、このような方法を使つ
てハプテンの検定を行なえたとしても、凝集剤の
凝集性がその起源によつて大きく変化するため
に、精確な量で使おうとすると再現性を得るのが
むずかしくなる欠点があり、それは特に商業的規
模で多数の検定を行なう際に顕著である。 本発明者は、１種類だけのラテツクス粒子試薬
を使い、凝集剤の使用量の精確な量には依存しな
いで行なう粒子凝集反応検定法を発明した。きわ
しく述べると、遊離のハプテン−抗体複合体は凝
集剤に対して非常に小さな親和性しかもつていな
いが、ハプテンをラテツクス粒子に結合させる
と、例えば(イ)まず担体（例えばタンパク質または
重合体）と複合させた後、ラテツクスとカツプリ
ングさせるか、または(ロ)ラテツクスと直接カツプ
リングさせると、その親和性は驚くほど明らかに
増加する。ラテツクス結合複合体と凝集剤との結
合は強く、そのため（各各複合体を担持してい
る）２個のラテツクス粒子が凝集剤と結合する。
この点は遊離のハプテン−抗体複合体に対する凝
集剤の効果とは対照的であり、後者の場合凝集剤
と複合体の間の親和性が弱いため充分な結合がお
きない。 以上の結果を利用して、ハプテンを以下の方法
で検定できる。検定すべきハプテンまたはその特
異的な類似体を担持しているラテツクス（または
他の粒子）および一定量の抗体と、検定すべきハ
プテンを含む試料とを混合する。遊離のハプテン
と、ラテツクスに結合しているハプテンとが一定
量の抗体上で競合し、複合体を形成するため、抗
体の一部が遊離のハプテンと結合し、残りの抗体
はラテツクスに結合しているハプテンと結合す
る。反応混合物中に含まれている凝集剤は、ハプ
テン−抗体複合体を担持しているレテツクス粒子
だけの凝集をおこす。凝集剤は、ラテツクスに結
合したハプテン、遊離のハプテンおよび遊離のハ
プテン−抗体複合体のいずれとも有意な程度には
結合しない。凝集の有無およびその程度が、検定
すべきハプテンの存在と量を示す。 このハプテンの検定法においては、必要な凝集
剤の量はラテツクス−免疫複合体粒子の有意な程
度の凝集を起こすのに必要な量であればよい。実
際、このハプテン検定用反応混合物の他の成分は
いずれも、凝集剤との結合能は有意な程度ではな
いから、実際に必要な凝集剤はごく少量である。
従つて本発明方法には、ハプテン検定用の高価な
試薬を大変経済的に使える利点がある。さらに凝
集剤を厳密に測定した量で使う必要がまつたくな
いため、検定結果の再現性と精度が向上した。本
発明によれば、（必然的に種々の性質を持つもの
である）凝集剤において競合反応がおこるのでは
なく、抗体において競合反応がおきる。また再現
性のある抗血清の製造法は充分に確立された技術
である。以上により、従来技術における問題点は
解消された。 本発明によれば、検定すべきハプテンを含む液
体試料を (a) 検定すべきハプテンまたはその特異的な類似
体を担持している不活性な微細粒子、 (b) 前記ハプテンに対する『一定量』（この用語
については後に説明する）の抗体、および (c) 凝集剤 と混合し、凝集の程度を測定し、その結果から前
記液体試料中のハプテンを定量することから成
る、前記液体試料中のハプテンを検定する方法を
得る。 次に述べる理論に拘束されるわけではなく、本
発明の範囲がそれに制限されるわけではないが、
ラテツクス結合ハプテン−抗体−複合体の凝集剤
に対する親和性が（遊離のハプテン−抗体複合体
のそれよりも）大きいものは、ラテツクスの表面
近くにハプテン分子がいくつか存在してそれぞれ
抗体と結合するため、（ラテツクス粒子上の抗体
を介して）２個またはそれ以上の架橋によつてラ
テツクス粒子が凝集剤と結合できることによると
考えられる。従つて凝集剤と複合体との間の親和
性は、複合体がラテツクスに結合していると増加
すると考えられる。それはラテツクス粒子表面上
に凝集剤と結合する多価の領域ができるためであ
る。そのような多価領域は当然のことながら遊離
のハプテン抗体複合体の希薄溶液中では生じな
い。実際ハプテンをラテツクス表面上に固定化す
ることにより、ハプテン−抗体複合体は『濃縮』
され、凝集剤への親和性が増加する。 本発明の方法において、抗体の『一定量』と
は、ラテツクス−抗体またはラテツクス−ハプテ
ン凝集反応混合物に抗体を添加した時に、100％
以下好ましくは40〜80％最も好ましくは70〜80％
凝集が起こる量である。ラテツクス−ハプテンの
濃度は、理想的な検定範囲の約50％の濃度のハプ
テン溶液に粒子を添加した時にその約50％が凝集
する濃度に調整するが好ましく、凝集剤は過剰量
で使う（凝集剤の濃度の±10％の変動は、凝集し
なかつた粒子の濃度測定において認識できるほど
の変化を与えない）。 前記のように好ましい範囲内で結果を得るため
には通常、検定すべきハプテンごとに予備試験や
実験が必要であるが、実際にはそのような試験は
標準曲線（または他の標準値）を得るための操作
に含まれるものであり、それによつて検定すべき
ハプテンの量の絶対値が凝集の程度から読み取れ
る。前記のような予備試験は、特定の検定用の凝
集剤の最適量を知るためにも使われる。 本発明方法はハプテンの検定に広く利用でき
る。本発明方法によつて有利に検定できる特定の
ハプテンとしては、薬物および薬物代謝物例えば
テオフイリン、バルビトン、フエニルヒダントイ
ン、ジゴキシン、ジギトキシンおよびゲンタマイ
シン、細胞内伝達体例えばサイクリツク−AMP
およびサイクリツク−GMP、プロスタグランジ
ンおよびプロスタグランジン代謝物、ホルモン類
例えば視床下部および松果体ホルモン例えば向甲
状腺ホルモン放出ホルモン、ゴナドトロピン放出
ホルモン、ソマトスタチン、メラトニン、サブス
タンス−Ｐ、ニユーロテンシン、脳下垂体ホルモ
ン例えばオキシトシンおよびバソプレツシン、甲
状腺ホルモン例えばチロキシンおよびトリヨード
チロニン、消化管系のホルモン、例えばセロトニ
ン、スイ臓ホルモン、およびステロイドホルモン
例えばエストラジオール、プロゲステロン、テス
トステロン、アルドステロンおよびコルチゾー
ル、ビタミン例えばB12、葉酸、ビタミンＤ代謝
物、および細菌またはウイルス起源のハプテン例
えば白血症ウイルスの糖脂質が挙げられる。特定
のハプテンを検定するための液体は通常、生物起
源のもの例えばヒトまたは動物の体液例えば血
清、睡液または尿である。 粒子状試薬としては、これまで述べてきたよう
にラテツクス粒子が普通であるが、あまり好まし
くはないが他の粒子例えば寒天ゲル、セフアデツ
クスゲルまたはベントナイトも使える。粒子に
は、検定すべきハプテンと同じハプテンまたはそ
の特異的な類似体を担持させる。ハプテン担持粒
子の製造法は当分野で公知である。粒子上の適当
なコーテイングにハプテンを吸着させることもで
きるし、架橋化剤によつて化学的にカツプリング
させることもできる。まれには、ラテツクス粒子
自身のポリマーにハプテンを直接カツプリングさ
せることができる。粒子に結合したハプテンが抗
体にとつてアクセスできるものである限り、ハプ
テン担持粒子の製造法は重大なことではない。英
国特許第2013688Aに記載されている方法により、
ハプテンを適当に粒子とカツプリングさせること
ができる。 本発明方法において使用する抗体を常法により
生産できる。 凝集剤は好ましくはリチウム因子（RF）であ
るが、他の凝集剤例えば補体成分、いわゆる
Clq、マウス血清またはマウス腹水を使用するこ
ともできる。これらの凝集剤は前記の特許明細書
中に記載されている。ハプテンの検定において
は、抗体が粒子上のハプテンと結合している粒子
の凝集を凝集剤がひきおこす。ハプテンのみを持
つ他の粒子は凝集しない。凝集剤は遊離のハプテ
ン−抗体複合体とは有意な程度の反応はおこさな
い。 イムノアツセイにおいて、妨害、特に（生物起
源の液体の場合）非特異的タンパク質−タンパク
質相互作用による妨害が生じ得るということは周
知である。ヨーロツパ特許出願公開第38181号明
細書に記載のように前記相互作用はケイオトロピ
ツク剤の使用により減ずることができ、この助剤
を本発明の方法に使用することもできる。タンパ
ク質妨害を排除するための別の技術としては、液
体試料をタンパク質分解酵素（例えばペプシン）
で（検定前に）処理し、望ましくないまたは妨害
をおこすタンパク質を消化する技術もある。この
技術はヨーロツパ特許出願第81305261.0明細書に
記載のようにハプテンを検定する場合に使用する
こともできる。 本発明方法において、検定すべきハプテンの存
在の有無および（または）量は凝集の存在および
（または）程度からにそして標準物質に関する測
定結果から決定される。どんな程度でどのような
凝集が起こつたかどうかを評価するために、好ま
しくは反応混合物中に凝集しないで残つている粒
子の数をカウントする。前記の選択的カウンテイ
ングは例えばテクニコンオートカウンターシステ
ムまたは類似のシステムの使用により行なうこと
ができる。（『テクニコン』および『オートカウン
ター』は登録商標である。）選択的カウンテイン
グが好ましけれども、凝集の程度の評価は他の方
法、例えば凝集塊を凝集していない粒子から分離
し、そして重量を計るかまたは量を測定すること
により行うことができる。 本発明方法は手動または連続的な自動化方法例
えばテクニコンPACIA法により行うことができ
る。 本発明をより十分に理解するために以下に、本
発明を単に説明する意味でジゴキシンの検定例を
記載する。 例においては添付図面を参照されたい。 第１図は本発明方法を行うための装置の１形態
の簡略化した線図的説明である。 第２図はジゴキシン量（μg／）に対してプ
ロツトした凝集の阻害％の線図、すなわち、
PACIAによるジゴキシン定量のための校正曲線
である。 第３図はPACIA法により決定した検定結果と
（同一の試料を）ラジオイムノアツセイにより決
定した検定結果との相関を示すプロツトの線図で
ある（Ｎ＝109、ｒ＝0.943）。 例 Ａ 試薬 グリシン緩衝食塩水（GBS） NaOHによりPH9.2に調整した、0.1M NaCl、
0.17mol／Ｌグリシンおよび0.04g／LNaアジドを
含有する溶液。 GBS−BSA GBS中の10g／Ｌウシ血清アルブミン
［Biograde from Calbiochem社（San Diego，
CA）製。 HCl−ペプシン ２度結晶化した4g／Ｌペプシン（Sigma
Chemical Co.、St.Louis，MO.製）を含有する
0.15mol／LHCl。０〜４℃に保存したこの溶液
は約１日間安定である。 IgG抗ジゴキシン IgGをジゴキシン−ウシフイブリノゲン結合体
に対して調整したウサギ抗血清からのリバノール
沈殿により抽出する。この血清１mlは250000回の
検定を行なうに十分である。 RF １／3000のラテツクス凝集タイター（titer）
（ラテツクスRF試薬、Behringwerke AG.
Marburg／Lahn，West Germany製）によりプ
ラズマフアレーシスにかけたリウマチ患者の全血
清。 凝集混合物 抗ジゴキシンIgGをRFおよびGBS−BSAと混
合してRFに対して1/50の最終タイターおよび出
発抗血清中のIgGの1/4000の濃度を得る。この混
合物はアリコート１ml中に−20℃で貯蔵され、60
回の検定に十分である。 ラテツクス 0.8μのカルボキシル化したポリスチレン粒子
（10％ Ｗ／Ｖ−Estapor Ｋ 150、ロツトNo.
314）。 BSA−ジゴキシン結合体 過ヨウ素酸塩法により調整する。 ジゴキシン−BSA−ラテツクス カルボキシル化したラテツクス500μをPH8.1
の0.02mol／Ｌホウ酸塩緩衝食塩水（BBA）５ml
中で洗浄し、遠心分離し、BBS １ml中に再懸濁
し、そして１−エチル−３−（３−ジメチル−ア
ミノ−プロピル）−カルボジイミドHCl 25mgと45
分かきまぜて室温でインキユベートすることによ
り活性化する。遠心分離し、そしてBBS1ml中に
再懸濁した後、活性化したラテツクスを9g／Ｌ
食塩水中のBSA−ジゴキシン結合体の10g／Ｌ溶
液25μとゆつくりかきまぜながら、４℃で一夜
インキユベートする。GBS−BSA 250μの添加
後、粒子を遠心分離し、GBS−BSAで３回洗浄
し、GBS−BSA 10ml中に再懸濁し、そして
Branson Sonifier B12中で数秒間超音波により
処理する。３週間以内に使用するならば、ジゴキ
シン−BSA−ラテツクスを４℃で貯蔵する。よ
り長く貯蔵するには、試薬をさらに処理すること
なく凍結乾燥する。使用する前にラテツクス懸濁
液をEDTA5mMを含有するGBS、60g／ポリ
エチレングリコール6000（Merck，Darmstadt，
West Germany製）および半飽和のNaClで1/4
希釈する。 Ｂ 標準物質および試料 ジゴキシンをエタノールに溶解して1g／Ｌの
濃度にする。標準物質を調整するために、次にこ
の溶液を正常ヒト血清のプールで希釈する。 乳状脂粒は一般にラテツクスのカウントを妨害
しない。しかし、血清試料が凍結されている場
合、変性リポタンパク質により生成したいくらか
の粒子はそれらがラテツクス粒子であるかのよう
にカウントされることができる。本発明方法の大
部分は凍結した血清について行うので、それらを
最初に処理してこの妨害可能な原因を除去する。
約200μの試料をかきまぜながらFreon 113
（Serva，Heidelberg，W.Germany製）100μと
混合し、そして次に5000rev／minで５分間遠心
分離する。 試料のタンパク質分解酵素による消化のために
（タンパク質を分解するため）澄明な上澄み液の
アリコート約100μをHCl−ペプシン300μと37
℃で10分間インキユベートする。次に2mol／Ｌ
TRIS［トリス（ヒドロキシメチル）メチルア
ミン］20μの添加により消化を停止する。タン
パク質分解酵素による消化を全く同じ方法で標準
物質に対しても施す。 Ｃ 装置 この実験はテクニコンPACIA自動システムを
使つて行う。このシステムは文献（例えば前記の
『Method in Enzymology』参照）中に記載され
ているが、その簡略化した図を添付図面の第１図
に示す。第１図に関して、システムは実質的に４
つの手段、DIAS手段１、ポンプ２、オートカウ
ンター３および電子的モジユール４から成る。
DIAS手段１（DIASとは希釈機−インキユベー
ター−かきまぜ機−サンプラーの意味である）は
垂直軸のまわりで回転するように設置された水平
の回転トレー１０から成り、そしてその中に試料
管１１を受け取る一連の装置を持つている。トレ
ー１０の円周のまわりは各各の管に試薬を添加す
るプローブを包含する場所１２，１３，１４，１
５が配置されている。管１１は温度調節箱中、ト
レー１０の下方に位置している。もう１つの場所
１６で、最終反応混合物が試料として採取され、
この試料はその中で例えばさらに希釈および脱気
泡化されてもよいマニホルドを通過し、ポンプ２
を経て凝集していない粒子のみをカウントするた
めにオートカウンター３に通す。モジユール４は
結果をプリントアウトするかまたは表示する。
DIAS手段１中で、試料管１１はかきまぜられ、
粒子を懸濁状態に保つ。 Ｄ PACIA法 処理した血清の未測定量約200μを試料管１
１中にピペツトで測り入れ、そしてサンプラート
レーの内部の列に置く。場所１２からのプローブ
は試料100μを別の試料管（いわゆる反応管）
中に吸い出し、次に凝集した混合物15μおよび
ラテツクス結合体15μ場所１３および１４で次
次添加する。トレーを回転させながら37℃で25分
間インキユベーシヨンした後、懸濁液をGBS0.88
mlの添加により希釈し（場所１５）、そして88μ
をマニホルド中に吸い出し（場所１６）、そこ
で懸濁液はさらに１ml／LTween２０を含有する
GBSにより20回希釈される。脱気泡化した後、
得られた流出液をオートカウンター３に通す。凝
集していない粒子の濃度はレコーダ−のピーク高
度により表示される。この装置により50回分析／
時が達成される。 試料の予備的なペプシン消化は手動で行われ
る。 Ｅ ラジオイムノアツセイ（RIA）（比較） RIAはCorning Medical，Corning Grass
Works，Medfield，Massachusetts，U.S.A.から
のIMMOPHASEキツトを使つて行われる。 Ｆ 結果 校正曲線 高感度を達成するため、抗ジゴキシンIgGの高
希釈液（1/4000）を使い、このものは凝集剤の不
在下に得られる粒子の総数の少くとも30％の粒子
数の減少をRFの存在下与える。ジゴキシンの添
加量が増加すると、凝集していない粒子数の漸進
的増加が起こる（第２図）。ジゴキシンの不在下
で得られる小さなピークは日ごとにわずかに変化
する。類似の校正曲線が得られることから、反応
の程度を凝集剤の不在下で得られたピーク高さと
阻害剤の不在下で得られたピーク高さとの差に相
当する全阻害のパーセンテージとして表示する。
校正曲線は0.4μg／Ｌから6μg／Ｌに広げられる。 妨害 予備的なペプシン処理に抵抗する非特異的凝集
剤によりおこる可能性のある妨害をチエツクする
ため、ジゴキシ−BSA−ラテツクスを使用して
49人の患者の血清の凝集活性を試験する。この
際、凝集混合物は一般に抗ジゴキシンIgGおよび
RFを希釈するのに使用する緩衝液により置換さ
れている。凝集していない粒子の平均濃度に対す
るCV（Coefficient of Variation：変動係数）は
1.7％である。また、ジゴキシンが欠けている別
の11人の患者の血清を使用して、抗ジゴキシン
IgGおよびRFの混合物により生成した凝集上の
可能な非特異的阻害効果を試験する。平均ピーク
高度に対するCVは3.7％である。 回復 ジゴキシンを血清100個にその量を増やしなが
ら添加して0.6μg／Ｌから5.8μg／Ｌの範囲の濃度
レベル10種を得る。（表１）。PACIA結果と公知
値との間の相関はｒ＝0.989（ｙ＝0.07＋１／03
×）である。 RIAに対する相関 血清109個をPACIAにより２回検定し、そして
２回の結果の平均をRIAに対する相関に使用する
（第３図）０から5.7μg／Ｌの間の値の係数はｒ＝
0.943（PACIA結果＝0.37＋0.68RIA結果）であ
る。 精度 イントラーおよびインターアツセイの精度は治
療上の値の大部分の範囲（第２図）をカバーする
濃度で試料を使つて研究される。イントラアツセ
イCVおよびインターアツセイCVの最大値はそれ
ぞれ12.5％および8.9％である。比較的高いイン
トラアツセイCVはドリフトによる一連の検定に
対して説明することができる。例えば、1.10μg／
Ｌでスパイク（spike）した試料に対して得られ
た結果（CV＝10.9）は0.93μg／Ｌから1.30μg／
Ｌの時間で直線的に増加する。しかし、別の系列
においては、ドリフトはより明確ではなく、そし
てインプレシジヨンは数個の検定のみで生じる。
例えば1.25μg／Ｌ血清（CV＝12.0）において、
３つの結果は1.60μg／Ｌ、1.60μg／Ｌおよび
1.55μg／Ｌである。 ここで、イントラーアツセイとは同一のアツセ
イ（検定）における試料間の結果の変動を、イン
ターアツセイとは異なるアツセイにおける試料間
の結果の変動を、ドリフトとは通常電気的または
電子的測定による結果が時間の経過と共に連続的
に単一方向に増加または減少する動きを示すこと
を、スパイクとは混合または接触することを、そ
れぞれ意味する。インプレシジヨンが生じるとは
CVが高い測定結果が得られたことを、意味し、
インプレシジヨンが数個の検定のみで生じたこと
は、他の大多数の検定において得られた結果は非
常に良く似たものである（すなわちインプレシジ
ヨンが低い、換言すればプレシジヨンが高い）こ
とを意味する。SDは標準偏差（Standard
Deviation）を意味する。
【表】
【表】
ジゴキシンの出発溶液は正常な血清のプール中
で調整され、１容量を試験すべき種種の各各の血
清９容量に添加する。回復率はジゴキシンの濃度
ごとに10種の異なる血清上で計算される。最初の
３群は同じ10個の血清で製造するが、他の７群は
異なる血清で製造する。
で調整され、１容量を試験すべき種種の各各の血
清９容量に添加する。回復率はジゴキシンの濃度
ごとに10種の異なる血清上で計算される。最初の
３群は同じ10個の血清で製造するが、他の７群は
異なる血清で製造する。
【表】
第１図は本発明の方法を行うための装置の１形
態の簡略化した線図的説明図である。第２図はジ
ゴキシン量（μg／）に対してプロツトした凝
集の阻害％の線図、すなわち、PACIAによるジ
ゴキシン定量のための校正曲線の線図である。第
３図はPACIA法により決定した検定結果と（同
一の試料を）ラジオイムノアツセイにより決定し
た検定結果との相関を示すプロツトの線図である
（Ｎ＝109、ｒ＝0.943）。
態の簡略化した線図的説明図である。第２図はジ
ゴキシン量（μg／）に対してプロツトした凝
集の阻害％の線図、すなわち、PACIAによるジ
ゴキシン定量のための校正曲線の線図である。第
３図はPACIA法により決定した検定結果と（同
一の試料を）ラジオイムノアツセイにより決定し
た検定結果との相関を示すプロツトの線図である
（Ｎ＝109、ｒ＝0.943）。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 検定すべきハプテンを含む液体試料と、(i)試
薬を担持している微細不活性粒子、(ii)凝集剤およ
び(iii)他の試薬少なくとも１種とを混合し、粒子の
凝集の程度から前記ハプテンの存在の有無および
その量を検定する、 ことから成る、前記液体試料中のハプテンの検定
法において、 (a) 前記微細粒子が、検定すべきハプテンと同じ
ハプテンまたはその特異的な類似体を担持して
おり、 (b) 前記の他の試薬が検定すべきハプテンに対す
る抗体であり、 (c) 混合物に加える前記(b)の抗体の量が、粒子を
100％凝集させるに必要な量より少なく、そし
て (d) 前記凝集剤は、ハプテンまたはハプテン類似
体を担持する粒子であつてそのハプテンまたは
ハプテン類似体と前記抗体とが複合体を形成し
ている粒子を凝集させるが、このような複合体
を形成していない粒子、このような複合体を形
成していないハプテンまたは遊離のハプテン−
抗体複合体は凝集させないものであり、リウマ
チ因子（RF）、補体成分（Clq）、マウス血清ま
たはマウス腹水から選んだものである ことを特徴とする、液体試料中のハプテンの検定
法。 ２ 前記抗体を、前記粒子の40〜80％を凝集させ
る量で使う、前項１に記載の方法。 ３ 凝集していない粒子を計数することによつて
凝集の程度を測定する、前項１に記載の方法。 ４ 薬物、薬物代謝物、細胞内伝達体、ホルモ
ン、ビタミンおよび細菌起源またはウイルス起源
のハプテンであるハプテンから成る群から選んだ
ハプテンを検定する、前項１に記載の方法。 ５ 液体試料としてヒトまたは動物の体液を使
う、前項１に記載の方法。 ６ 検定すべきハプテンが非タンパク質であつ
て、しかも検定を妨害する可能性のある１種また
はそれ以上のタンパク質を液体試料が含む場合
に、その妨害作用を除くために前記の１種または
それ以上のタンパク質を消化するタンパク質分解
酵素を液体試料に加えて行なう、前項１に記載の
方法。 ７ 非特異的なタンパク質−タンパク質相互作用
による検定の妨害効果を減らすために、前記試料
に１種またはそれ以上のケイオトロピツク剤を加
えて行なう、前項１に記載の方法。 ８ ヒト体液試料中の、薬物、薬物代謝物、細胞
内伝達体、ホルモン、ビタミンおよび細菌起源ま
たはウイルス起源のハプテンであるハプテンから
成る群から選んだハプテンを検定する検定法であ
つて、 (イ) 前記試料と、 (ロ) 検定すべきハプテンと同じハプテンまたはそ
の特異的な類似体を担持している微細不活性粒
子と、 (ハ) リウマチ因子（RF）、補体成分（Clq）、マウ
ス血清およびマウス腹水から成る群から選んだ
凝集剤と、 (ニ) 前記粒子の40〜80％を凝集させる量の、前記
ハプテンに対する抗体と、 の混合物を形成し、この混合物をインキユベート
し、未凝集の粒子の数を計数しそしてその結果か
ら標準値を参照して試料中のハプテンの量を定め
ることを特徴とする、前項１に記載の方法。 ９ ハプテンがジゴキシンである前項８に記載の
方法。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8108112 | 1981-03-16 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57206859A JPS57206859A (en) | 1982-12-18 |
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-
1982
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- 1982-03-12 EP EP82301265A patent/EP0061857B1/en not_active Expired
- 1982-03-16 JP JP57040319A patent/JPS57206859A/ja active Granted
- 1982-03-16 CA CA000398498A patent/CA1174596A/en not_active Expired
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