JPH0567276B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、電気的方法による細胞融合と核酸導
入を効果的に行うための電気的細胞操作装置に関
するものである。

従来の技術 細胞融合法としては主にポリエチレングリコー
ル（PEG）を用いる化学的融合法が用いられて
いるが、この方法では〓PEGは細胞に対して強
い毒性を持つている、〓融合するにあたり最適な
諸条件を見出すのに手間がかかる、〓融合に際し
て高度な技術が要求され、特定の技術に習熟した
人にしか使えない、〓融合効率が低い等の欠点を
有している。

これに対して、電気的細胞融合法は、高度な技
術が不要で、簡単に効率よく融合させることがで
き、細胞に与える毒性がなく、高活性をもつたま
まの状態で細胞を融合させることができるという
利点がある。

電気的細胞融合法は、1981年西ドイツの
Zimmermannが確立したものであり、その原理
は次の通りである。すなわち、平行電極間に交流
電圧をかけそこに細胞を導入すると、細胞は電流
密度の高い方へ引き寄せられ数珠状にならぶ。こ
の状態で数μsec〜数十μsec単位の直流パルス電流
を電極間にかけることにより細胞膜の電気伝導度
が瞬間的に低下し膜を構成する脂質二重層の過逆
的乱れとその再構成が行われ、その結果細胞融合
が起こるものである。

従来、この電気的融合法には、(a)微小電極法、
(b)平行電極法、(c)上記Zimmermann等の方法等
が知られているが、(a)は融合効率が低く、手間が
かかるという欠点があり、(b)は融合率が低い（１
〜３％）が、一度に大量の細胞融合（プロトプラ
スト）を扱え、融合細胞が電極に付着しないなど
の利点がある。また、(c)は、(a)、(b)に比べ融合率
が高いため、最も実用的な方法として利用されて
いるが、融合細胞が電極表面に付着するため、融
合細胞を傷つけることなく回収するための電極材
料を如何に開発するか及び融合細胞をいかに大量
にしかも迅速に作成するかが重要な課題とされて
いた。

一方、電気的核酸導入法は、1982年に
Neumann等により開発された方法で細胞と核酸
とを混合して電極に懸濁した後、これに数μsec〜
数十μsecの直流パルス電位を印加することによつ
て核酸を細胞内に導入する方法であるが、この場
合にも、導入効率を高めることが重要な課題であ
つた。

発明が解決しようとする問題点 本発明は細胞融合と核酸導入ができる電気的細
胞操作装置の従来の平行電極及び操作チヤンバー
の諸欠点、すなわち、〓融合率や導入率が低い、
〓融合細胞を傷つける、〓細胞が電極に付着す
る、〓融合細胞を大量、迅速に作成できない等の
問題点を一挙に解決するための新規な電極を提供
することを目的とするものである。

問題点を解決するための手段 本発明者達は電極材料と操作チヤンバーの構造
について研究を重ねた結果、電気分解を起こしに
くい化学的に安定な物質を用い、細胞サイズに比
較して表面の凹凸がほとんど無視できる程度の鏡
面状態を有する平板電極を作成した。操作チヤン
バーは、細胞融合及び核酸導入に用いるスペース
部分を切り取つた平板スペーサーをこの二枚の平
板電極で挟む構造にすることにより従来の欠点を
克服した電気的細胞操作装置のための電極を提供
することに成功したものである。

すなわち、本発明は電気的細胞融合又は核酸導
入に用いるチヤンバーの二つの電極に、電圧と周
期を制御可能な発振器からの交流電位とパルス圧
とパルス巾とパルス数を制御可能なパルス発振器
からの直流パルス電位をそれぞれ印加して細胞融
合又は核酸銅導入を行う電気的細胞操作装置にお
いて、電極表面を細胞サイズに比較してほとんど
無視できる程度に均一に平坦で、且つ電気分解を
起こしにくい化学的安定な物質で構成するもの
で、これらの電極は、表面を鏡面研磨したガラ
ス、石英、サフアイヤ、プラスチツク等の非金属
材質や、アルミニウム、ステンレス、銀等の金属
材質等の平板基板に、金、白金等の金属を蒸着し
たものを用いることを特徴とするものである。こ
れらの電極としては、金属平板基板に、金、白
金、チタン等をメツキし表面を鏡面にした該金属
平板を電極としたものでも良く、あるいはまた白
金、チタン、ステンレス等の金属平板を電解研磨
し、該金属平板を電極として用いても良い。

また、機械加工もしくは電解研磨した平板基板
をイオンプレーテイング加工し、該加工を施した
基板を電極として用いても良い。

本発明の操作チヤンバーの構造は、細胞融合又
は核酸導入に用いるスペースに該当する部分を切
り取つた平板スペーサーと、該平板スペーサーを
挟む二枚の平板電極を、組立て分解が容易に出来
るように圧着手段で圧着した構成となつている。
大きさ、厚さ、切り取つたスペースが異なつた複
数の平板スペーサーと、大きさの異なつた複数の
平板スペーサーと、大きさの異なつた複数の平板
電極を用意し、該平板スペーサーを挟む二枚の該
平板電極を組立てることにより、電極間の距離及
びチヤンバー容量を可変に出来るものである。

実施例 本発明の具体例を第１図に模式的に示す。

操作チヤンバーは、平板スペーサー３と、それ
を挟む電極１，２から構成されている。電極１，
２に交流発振器４及びパルス発振器５がつながれ
ており、交流の周期、電圧及びパルス電圧、パル
ス巾はオシロスコープ６でモニターする。この装
置を利用した電気的細胞融合の過程を第２図を用
いて説明する。

上欄には、電極に印加するシグナルシーケンス
を、下欄には、それに対応する細胞融合の過程を
模式的に示す。

過程(1)では電極に電圧が印加さていない。この
状態で細胞を第１図の平板電極１，２に挟まれた
スペーサー３のチヤンバー内に導入する。

過程(2)では発振器４（第１図）からの交流成分
の電位の印加により細胞が数珠状に配列する。

過程(3)では直流パルスにより細胞接触面で細胞
膜の一時崩壊が起きる。

過程(4)では細胞膜の再構成にともなつて細胞融
合が起こる。

従来電気細胞操作装置に使用されている電極及
びチヤンバーは第３図に示すように各種のタイプ
がある。

(a)は、白金線を平行にしたもの。

(b)は、円の中心の電極とこれを同心円上に囲む
電極を配置したもの。

(c)は、大量の融合細胞を得る様に電極を配列し
たもの。

(d)は、異なつた種類の雑種融合細胞作成のも
の。

これらに使用されている電極は、白金線白
金板ステンレス板等でありいずれも表面が平滑
な鏡面状でないため電場電流が不均一になり、か
つその表面に細胞が付着する欠点を有していた。

本発明に於いては、電気分解を起こしにくい物
質の表面を鏡面状にした平行平板電極を用い操作
チヤンバーの構造を工夫することにより、電場そ
のものが均質になるとともに細胞が電極表面に付
着せず電場に均一にさらされた細胞が高い融合率
を示すことが認められた。実施例においては、ガ
ラス基板に金蒸着した二枚の電極でスペーサーを
サンドイツチし、クリツプで圧着している。二枚
の電極には電極線をつけ電位が印加される。

スペーサーは、厚さ200μｍで、中央部分を切
り取つてあるポリビニルクロライド板を用いてい
る。10mm×10mmに切り取つてある部分と両電極に
はさまれた部分が細胞操作のためのスペースにな
る。電極間隔及び操作チヤンバーの容量は、スペ
ーサーの厚みを変えることにより調整可能であ
り、また電極のサイズも自由に大きく出来る。

上記の操作チヤンバーを用い、第１図に示され
る装置で細胞融合並びに核酸導入の実験を行つ
た。

１ 実験方法 (1) 供試材料： タバコ葉肉プロトプラスト（品種；キサン
チNN）およびタバコモザイクウイルス
（TMV）−RNAを供試した。

(2) 細胞融合法： プロトプラストを約２×10⁵／mlで
100μMCaCl₂−0.5Mマンニトールに懸濁し、
電極間隔200μｍの上記チヤンバー内で、周
波数500KHzで電圧400V／cm〜500V／cmの交
流を電極間に印加し細胞を配向配列させた
後、0.6kV／cm〜1.0kV／cmの電位でパルス
巾50μsecの直流パルスを１回与えた。

(3) 核酸導入法： 細胞融合法の場合と同じように、プロトプ
ラストを約２×10⁵／mlで100μMCaCl₂−
0.5Mマンニトールに懸濁し、10μｇ／ml
TMV−RNAを添加した後、交流成分の電
極への印加をせずに、0.6kV／cm〜1.0kV／
cmの電位でパルス巾50μsecの直流パルスを数
回印加した。

２ 実験結果 (1) 予備試薬として融合に及ぼすパルス電圧の
影響を調べたところ、 100μM Ca⁺⁺存在下に、パルス電圧を上げ
ると、400V／cmから融合率が上昇し、
850V／cmでは全プロトプラスト内重連配列
したプロトプラストの約90％以上が融合し
た。

それ以上の電圧では破砕プロトプラストが
増加するため、全体の融合率は低下した（第
５図）。

(2) 本実験として本発明の操作チヤンバーを用
い、上記最適条件下（850V／cmのパルス印
加）で融合実験を行つたところ、全プロトプ
ラストの約46％が融合した。

(3) タバコ葉肉プロトプラストとニンジン根部
プロトプラストを融合させたところ、両者の
雑種融合プロトプラストが形成された。

(4) 核酸導入実験では パルス印加後、プロトプラストをAoki
and Takebe（1669）の培養液中で、28℃、
40時間培養し、蛍光抗体法によつて感染率を
測定したところ、感染率はパルス電圧
400V／cmから上昇し、800V／cmでは全プロ
トプラストの約95％が感染した（第５図）。
この際のプロトプラスト生存率は、パルス処
理前と同じく約95％であつた。

発明の効果 本発明による電極を電気的細胞操作装置に用い
ることにより、高融合率が得られるとともに融合
細胞を全く傷付けることなく、しかも細胞が電極
に付着しない等の優れた効果が明らかになつた。

さらに本発明の電極を用いて核酸導入の実験を
した結果、電気的細胞融合と電気的核酸導入のた
めの最適な電気的条件がほぼ共通であることが明
らかになつた。更に植物のプロトプラストにウイ
ルスRNAを導入した結果、全プロトプラストの
約95％が感染し、従来法に比較して極めて高い核
酸導入率が得られたことから、本発明の電極が核
酸導入にも非常に有効であることが判明した。こ
のことは、遺伝子組換を行つたDNAなどの核酸
を動植物及び微生物細胞に効率的に導入する方法
としても極めて優れていることを示すものであ
る。

本発明は以上の実施例に限定されるものではな
く、例えば、従来広く用いられている電気泳動の
電極として使用することにより効率の良い結果が
得られる。また、細胞電気泳動等の電極としても
そのまま使用可能であり、電気刺激による細胞増
殖の促進装置の電極としても適用出来る。その
他、当業者が容易に変更、適用可能なものに及ぶ
ものであつて、これらの種々の応用が本発明の範
囲内に含まれることは当然である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明を用いる装置全体の概略図で
ある。第２図は、細胞融合の過程と電極間電位波
形との関係を示す模式図である。第３図は、種々
の型をした操作チヤンバーの概略図である。第４
図は、本発明による操作チヤンバーの構造図であ
る。第５図は、本発明による実施例としてプロト
プラストの電気的融合率TMV−RNAによるプ
ロトプラストの核酸導入率及びプロトプラスト破
砕率とパルス電圧との関係を示す図である。 １，２……電極、３……スペーサー、４……交
流発振器、５……パルス発振器、６……オシロス
コープ。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 電気的細胞融合又は核酸誘導に用いるチヤン
   バーの二つの電極に、電圧と周期を制御可能な発
   振器からの交流電位とパルス電圧とパルス巾とパ
   ルス数を制御可能なパルス発振器からの直流パル
   ス電位をそれぞれ印加して細胞融合又は核酸導入
   を行う電気的細胞操作装置に使用するための、電
   極表面粗さまたは凹凸が細胞の直径の約1/30以下
   に平滑であり、金、白金、チタンよりなる群から
   選ばれる少なくとも一種類の物質で構成されてい
   ることを特徴とする電極。 ２ 電極が表面を鏡面研磨したガラス、石英、サ
   フアイヤ、プラスチツク等の非金属材質、または
   アルミニウム、ステンレス、銀等の金属材質の平
   板基板に、金、白金等の金属を蒸着したものであ
   る特許請求の範囲第１項記載の電極。 ３ 電極が金属平板基板に、金、白金、チタン等
   をメツキし表面を鏡面にしたものである特許請求
   の範囲第１項記載の電極。 ４ 電極が白金、チタン、ステンレス等の金属平
   板を電解研磨したものである特許請求の範囲第１
   項記載の電極。 ５ 電極が機械加工もしくは電解研磨した平板基
   板をイオンプレーテイング加工したものである特
   許請求の範囲第１項記載の電極。