JPH0568232B2 - - Google Patents
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- JPH0568232B2 JPH0568232B2 JP60501923A JP50192385A JPH0568232B2 JP H0568232 B2 JPH0568232 B2 JP H0568232B2 JP 60501923 A JP60501923 A JP 60501923A JP 50192385 A JP50192385 A JP 50192385A JP H0568232 B2 JPH0568232 B2 JP H0568232B2
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
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Description
請求の範囲
１ 標的Ｔ細胞として以下の特徴を有するHTク
ローンに、HTLV−ウイルスを感染させ、
HTLV−の正常な細胞変性効果を克服し、該
標的Ｔ細胞の不死の成育能を保持することを特徴
とするHTLV−ウイルスの製造法。 リンパ様白血病の成人由来である。 新生物性異数性Ｔ細胞株である。 OKT3+、OKT4+およびOKT8-の成熟Ｔ細
胞表現型である。 HTLV−の感染に感受性である。 ２ HTクローンがH4クローンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ HTクローンがH9クローンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ HTLV−ウイルスが細胞変性効果を示し、
非形質転換性であるヒト向Ｔリンパ性レトロウイ
ルスの変種を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ５ 標的Ｔ細胞がHTLV−を連続的に大量産
生することができることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ６ 標的Ｔ細胞が共培養によつてHTLV−ウ
イルスに感染されることを特徴とする特許請求の
範囲第１項乃至第５項のいずれかひとつに記載の
方法。 ７ 標的Ｔ細胞が無細胞感染によつてHTLV−
ウイルスに感染されることを特徴とする特許請
求の範囲第１項乃至第６項のいずれかひとつに記
載の方法。 技術分野 本発明は後天性免疫不全症候群（エイズ）、前
エイズの患者および健康なキヤリヤーからの細胞
変性または殺細胞効果を持つ（HTLV−）ヒ
ト向Ｔ細胞レトロウイルス（HTLV群）の連続
的産生のための方法ならびにその再現性のある検
出および分離のための細胞系に関する。リンパ様
白血病の成人から誘導され、HTと名付けられた
ひとつの新生物性異数性Ｔ細胞株は、HTLV−
の感染を受け、HTLV−に高度に感受性で
許容性のＴ細胞集団を生じ、ウイルスの大量培
養、分離および生物学的検出に都合がよい。これ
らは、HTLV−ウイルス感染後、無期限の生
育能を生じ、それを保持可能である。 発明の背景 疫学的データから、後天性免疫不全症候群（エ
イズ）は明らかに密接な接触または血液生成物に
よる水平伝達される感染性剤によつて起ることが
強く示唆される。この病気は日和見感染、主とし
てニユーモシステイスカルシニ（Pneumocystis
carcinii）肺炎およびカボジ内腫によつて証明さ
れてはいるものの、基にある障害は絶対的リンパ
球減少およびヘルパーＴリンパ球（OKT4+）数
の減少による患者の細胞性免疫に影響を与えるこ
とである。その上、この病気発病の完全な臨床的
証明の前に、その前駆症、前エイズが説明できな
い慢性リンパ腺症および／またはヘルパーＴ細胞
の一群を含む白血球減少としてしばしば認められ
る。これは患者の重篤な免疫不全につながり、Ｔ
細胞の特異な一群が感染剤の一次的標的であるこ
とを示唆している。エイズまたは前エイズ患者は
しばしば慢性的に巨大細胞ウイルスまたはＢ型ウ
イルス肝炎に感染しているものの、種々の理由か
ら、これらは明らかに免疫反応不全に関係のない
日和見または偶然の感染と思われる。 エイズの原因はヒトＴ細胞向リンパ性レトロウ
イルス（HTLV）であり、これには本発明以前
にヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルス、
HTLV−およびHTLV−と呼ばれる二種の
主要な性質の良く判つたヒトのレトロウイルスの
群が含まれる。最も一般に分離されるHTLV−
は主として成人Ｔ細胞癌患者から得られる。血
清疫学的研究、試験管内での生物学的効果および
核酸ハイブリダイゼイシヨンのデータから、
HTLV−は病源学的にこの癌に結びつき、こ
れは最初、日本の南部の、更にカリブ地方および
アフリカの成人がかかる。サブグループの
HTLV（HTLV−）は最初、毛細胞白血病のＴ
細胞変種の患者から分離された。現在までの所、
これが新生物病の患者からHTLV−が分離さ
れた唯一のものである。ウイルスの分離および血
清疫学的データから、両サブグループのHTLV
はエイズ患者に見いだされることがある。 下記の事に基いてHTLV群のレトロウイルス
がエイズの病源学的物質であることが証拠に基い
て示唆される：(1)動物のレトロウイルスが免疫不
全の原因になるという先例がある（ネコのネコ白
血病ウイルス）；(2)HTLV群のレトロウイルスは
向Ｔ細胞性である；(3)これらは好んで「ヘルパ
ー」Ｔ細胞（OKT4+）に感染する；(4)細胞合胞
体形成の誘導で見られるような種々のヒトおよび
哺乳動物細胞に細胞変性効果を持つ；(5)これらは
いくつかのＴ細胞機能を変える；(6)ある場合に
は、感染により選択的にＴ細胞を殺す；および(7)
これらは密接な接触または血液生成物によつて伝
達される。HTLV感染細胞の細胞膜抗原に対す
る抗体の存在がエイズ患者の40％以上の血清に見
られた（エセツクス（Essex）等、サイエンス
（Science）、220巻859頁、1983年）。この抗原はそ
れ以後HTLVのエンブローブの部分とされた
（シヨプバツハ（Schopbach）等、サイエンス
（Science）224巻、503頁、５月４日、1984年およ
びリー（Lee）等、プロシーデイングスオブザナ
シヨナルアカデミーオブサイエンシズオブユナイ
テツドステイツオブアメリカ（Proc.Nat.Acad.
Sci.USA）投稿中、種々の分離されたHTLVの
最初の検出と分離によりふたつの初期の進歩が可
能になつた：インターロイキン２（Il−２）とも
呼ばれるＴ細胞生育因子（TCGF）の発見で、こ
れは正常および新生物性の成熟Ｔ細胞の異つた二
群を定常的な選択的生育を可能にする（ラセツテ
イ（Ruscetti）等、ジヤーナルオブイムノロジー
（J.Immunol.）；119巻、131頁、1977年；および
ポイエズ（Poiesz）等、プロシーデイングズオブ
ザナシヨナルアカデミーオブサイエンシズオブユ
ナイテツドステイツオブアメリカ（Proc.Nat.
Acad.Sci.USA）、77巻、6134頁、1980年および
逆転写酵素測定に基くレトロウイルスの鋭敏な検
出法の開発である。HTLVの分離と伝達の方法
にはウイルスに許容性のＴ細胞を使用する共培養
法が含まれる。共培養実験に正常ヒトＴ細胞を使
用すると標的Ｔ細胞のいくつかに対し不朽化（形
質転換）能を持つふたつのサブグループの
HTLVが優先的に得られる。 しかしながら、HTLV変種（今やHTLV−
と名付けられている）は正常Ｔ細胞に対する不朽
化性を欠き、主としてＴ細胞に細胞変性効果を示
し、そして今やエイズの原因と信じられている。
実際に、このような変種は共培養または無細胞伝
達実験において標的としてのこれらの正常Ｔ細胞
を使つてしばしば、しかし一時的に検出される。
細胞変性効果はHTLVの細胞変性変種に対し高
度に感受性で許容性の、したがつて、ウイルスの
感染後も永久に成育する能力を保持する細胞を見
い出すことより克服される。本発明は、この新規
な不朽化Ｔ細胞集団の同定および性質、およびエ
イズおよび前エイズ患者からのこのようなウイル
スを分離し、連続的に高レベルで産生させること
にこれを使用することを明らかにする。 即ち、本発明は、標的Ｔ細胞として以下の〜
の特徴を有するHTクローンに、HTLV−ウ
イルスを感染させ、HTLV−の正常な細胞変
性効果を克服し、該標的Ｔ細胞の不死の成育能を
保持することを特徴とするHTLV−ウイルス
の製造法である。 リンパ様白血病の成人由来である。 新生物性異数性Ｔ細胞株である。 OKT3+、OKT4+およびOKT8-の成熟Ｔ細
胞表現型である。 HTLV−の感染に感受性である。 上記の標的Ｔ細胞は、これらの分離ウイルス
（HTLV−）の伝達に対して感受性の標的であ
り、これにより連続的なウイルスの大量培養が可
能であり、またこのウイルス自身同志の、および
HTLV−やHTLV−との比較に有用な特異
性のある免疫試薬および核酸プローブの開発を可
能にする。HTLV−およびHTLV−と区別
される生物学効果における違いに加えて、
HTLV−はいくつかの免疫学的分析および形
態学的にこれらの公知のHTLV群と異つている。
しかし、この新しいレトロウイルスも向T4リン
パ性であり、逆転写酵素、患者の血清および動物
の超免疫血清を使つた異族性拮抗ラジオイムノア
ツセイで調べた構造蛋白質の交差反応および合胞
体誘導を含む、HTLV−およびHTLV−と
多くの類似した性質を示す。これらの新たに分離
されたウイルスを総称的にHTLV−は名付け
られた。その蛋白質および遺伝学的情報のいくつ
かに検出される差異と共に、HTLV−がＴ細
胞を殺す能力がHTLV群の他のものからこの変
種を明らかに区別している。 寄 託 本発明に相当する細胞株でH9／HTLV−Bと
名付けるものをATCCNo.CRL8543として1984年
４月19日、アメリカンタイプカルチヤーコレクシ
ヨン（American Type Culture Collection）
（エイテイーシーシー、アメリカ合衆国、メリー
ランド20852−1776、ロツクビル、12301パークロ
ーンドライブ（ATCC、12301Parklawn Drive、
Rockville、Maryland20852−1776 USA）に寄
託した。この寄託により寄託物の永続性が確保さ
れ、また一般に容易に入手できる。H9は本発明
にしたがつた代表的で望ましい細胞株である。 一般的説明 感受性細胞株HTは、試験管内感染の前に、
HTLVについても試験され、プロウイルス配列
が欠除していることも含めてすべての点で陰性で
あつた。前エイズまたはエイズ患者から出たＴ細
胞の短期間培養（TCGFを用いて生育）から集め
たHTLV−を含む濃縮培養液に対し、親のHT
細胞（ポリプレン処理した３×106個の細胞）を
繰返し暴露してHTLV−を連続産生させる。
この濃縮液が逆転写酵素（RT）を持つ粒子を含
むことを最初に見た。細胞増殖が下降した時、通
常培養液に暴露して10乃至20日後に、新鮮な（感
染していない）HT親細胞を培養に加える。感染
親細胞株の培養液はRT活性を持つ粒子について
陽性であり、感染細胞数の約20％が前エイズ血友
病患者（患者E.T.）の血清を用いた間接免疫螢
光分析（IFA）に陽性であつた。E.T.からの血清
も破砕HTLV−の蛋白質に対する抗体を含ん
でいたが、HTLV−またはHTLV−感染細
胞の蛋白質と反応しなかつた。 詳細な説明 既に述べたように、異数性HT細胞株はHTLV
−の連続的増殖の望ましい必要条件を示した。
この細胞株はリンパ様白血病の成人患者から出た
新生物異数性Ｔ細胞株で、螢光活性化セルソータ
ーを使用したサイトフルオロメトリーにより調べ
て成熟Ｔ細胞表現型（OKT3+（62％）、OKT4+
（39％）およびOKT8-）について選択したもので
ある。この細胞の培養は20％ウシ胎児血清と抗生
物質を加えたBPMI／1640中で定常的に保持され
る。この培養を実施例１、第２表に示す。H9ク
ローンが望ましく、H4クローンは二番目に望ま
しい。 HTLV−培養液を後天的免疫不全症候群
（エイズ）患者の培養細胞から分離する。患者の
末梢血白血球をFicoll−Hypaque中でバンド形成
させ、５ｇ／mlフアイトヘムアグルチニン
（PHA−Ｐ）を含む生育培地（RPMI1640、20％
ウシ胎児血清、0.29mg／mlグルタミン）で37℃、
48時間、５％CO2雰囲気下に培養する。次いでこ
の白血球に10％精製Ｔ細胞生育因子（TCGF）を
含む生育培地を加える；望みに応じて、細胞の一
部にアルフアーインターフエロンに対するウサギ
抗体を与えた。その後、この白血球の細胞および
生育培地についてHTLVのサブグループ−
の存在を調べる。下記の中のひとつ以上を示す試
料を陽性と考えた：上澄液にMg依存逆転写酵
素活性が繰返し検出される；電子顕微鏡でウイル
スが観察される；陽性血清者または超免疫血清か
らの抗体によつてウイルス関連抗原が細胞内に表
現される；または、逆転写酵素または電子顕微鏡
観察により検出された粒子が新鮮なヒトの中心の
血液（core blood）、骨髄、または末梢血Ｔリン
パ球に伝達される。免疫学的または核酸分析によ
りHTLV−にもHTLV−にも分類されない
すべての分離ウイルスはHTLV−として分類
した。HTLV−産生細胞培養の細胞は確立さ
れた免疫学的手法を使つて性質を調べた所、ほと
んどT4表現型（OKT4、leu3a陽性）を持つＴリ
ンパ球（Ｅロゼツト受容体、OKT／３および
leu／１陽性）である。この過程はガロ（Gallo）
等によりサイエンス（Science）220巻、865−867
頁、1983年にも記載されている。宿主HT細胞お
よび他のクローン化細胞集団の感染は、エイズま
たは前エイズ患者からのＴ細胞培養の濃縮または
非濃縮培養液にこれらの細胞を暴露すること（無
細胞感染）または共培養によつて起り；すなわ
ち、HT細胞はHTLV−陽性Ｔ細胞培養に対し
暴露されることによつて感染される。通常の無細
胞感染方法は次の通りである：２乃至５×106細
胞をCO2インキユベーター中で37℃、30分間、ポ
リプレン（２ｇ／ml）またはDEAEデキストラン
で処理する。次いでそのインキユベーター内で
（CO2／37℃）１時間、ウイルス接種物（0.1乃至
１ml）に暴露する。細胞を定期的に振とうするこ
とによつて懸濁状態に保つ。１時間置いた後に正
規の生育培地を加える。感染培養がHTLV−
に陽性かどうかを培養１、２および３週間後に調
べる。 HT細胞（クローン）の感染も共培養法−HT
細胞をエイズまたは前エイズ患者からのＴ細胞の
短期培養（約５乃至20日）と種々の比率（通常
１：５）で混合する一によつて行う。HTLV−
陽性は、共培養後、種々の間隔（７、14、21日
等）で感染した受容体細胞にウイルス抗原または
ウイルス核酸配列を検出することによつて行う。
混合培養は生育培地で数ケ月間保持される。 共培養を細胞処理のための標準法にする。細胞
を生育させる標準条件は95％の湿度を与えた空気
と５％CO2の雰囲気下の37℃である。操作におい
て、ヒトの血液からの供与細胞が、共培養をする
ための標的細胞（HT新生物性異数性Ｔ細胞）に
作用するウイルスを生成する。レトロウイルス陽
性細胞の共培養はウイルスを産生し、永久の生育
または不滅の生育（HTLV−およびHT9とし
て）；すなわち不死条件が保持される。 実施例 １ 下記の第１表に示すように、単一細胞HTクロ
ーンをポポビツク（Popovic）等によりネオプラ
ズマ（Neoplasma）18巻、257頁、1971年に、お
よびバツク（Bach）等イムノロジカルレビユー
（Immunol.Rev.）54巻、５頁、1981年に記載され
ているようにして、螢光活性化セルソーターを使
つたサイトフルオロメトリーにより調べて成熟Ｔ
細胞表現型（OKT3+（62％）、OKT4+（39％）お
よびOKT8-）を表わす長期培養異数性HT細胞
株から分離した。この培養は20％ウシ胎児血清お
よび抗生物質を含むRPMI／1640で定常的に保持
した。２×105細胞／培養培地mlの濃度で種母添
加した親細胞培養の最終細胞濃度は、培養５日後
で１×106乃至1.5×106細胞／mlの範囲内であつ
た。 多核細胞検出のために、感染後６および14日に
細胞塗沫を行い、Wright−Giemsa染色した。５
個以上の核を持つ細胞を多核細胞と考えた。非感
染培養からのクローン化細胞もいくつか多核巨大
細胞を含む；しかし、リング形成は無く、これら
の細胞の数ははるかに少い（0.7％乃至10％）。 免疫螢光陽性細胞をリン酸緩衝化食塩液
（PBS）で洗浄し同じ緩衝液にml当り106細胞の濃
度で再懸濁した。約50λの細胞懸濁液をスライド
上に取り、風乾、アセトン中で10分間、室温で固
定した。スライドは使用するまで−20℃に保管し
た。HTLV−に対する超免疫ウサギ抗血清
（PBSで１／2000に希釈）またはPBSで1/8に希
釈した患者（E.T.）の血清の20マイクロリツト
ルを細胞に適用し、37℃で50分間置いた。ウサギ
またはヒト免疫グロブリンＧに対するフルオレツ
セイン結合抗血清を希釈し、固定した細胞に室温
で30分間適用した。次いでスライドを顕微鏡観察
の前に十分に洗浄した。非感染細胞株およびその
クローンは本試験で常に陰性であつた。 逆転写酵素活性を測定するために、ウイルス粒
子を下記のようにして無細胞上澄液から沈殿させ
た：4MNaCl0.4mlおよび30％（重量／容積）ポ
リエチレングリコール（Carbowax6000）3.6ml
を集めた培養液８mlに加え、その懸濁液を氷冷下
に一夜置いた。懸濁液をSorvall RC−３遠心分
離機を使つて2000rpmで30分間、４℃で遠心分離
した。沈殿を50％（容積／容積）グリセロール
（25ｍＭ Tris−HCl、PH7.5／５ｍＭジチオスレ
イトール／150ｍＭ KCl／0.025％Triton Ｘ−
100）300μに再懸濁した。粒子を0.9％Triton
Ｘ−100／1.5M KClを加えて破砕した。逆転写
酵素（RT）分析はポイエズ（Poiesz）等、プロ
シーデイングズオブザナシヨナルアカデミーオブ
サイエンシズオブユナイテツドステイツオブアメ
リカ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）77巻、7415頁、
1980年記載のようにして行い、培養液ミリリツト
ル当りのcpmで表わした。
ローンに、HTLV−ウイルスを感染させ、
HTLV−の正常な細胞変性効果を克服し、該
標的Ｔ細胞の不死の成育能を保持することを特徴
とするHTLV−ウイルスの製造法。 リンパ様白血病の成人由来である。 新生物性異数性Ｔ細胞株である。 OKT3+、OKT4+およびOKT8-の成熟Ｔ細
胞表現型である。 HTLV−の感染に感受性である。 ２ HTクローンがH4クローンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ HTクローンがH9クローンであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ HTLV−ウイルスが細胞変性効果を示し、
非形質転換性であるヒト向Ｔリンパ性レトロウイ
ルスの変種を含むことを特徴とする特許請求の範
囲第１項記載の方法。 ５ 標的Ｔ細胞がHTLV−を連続的に大量産
生することができることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載の方法。 ６ 標的Ｔ細胞が共培養によつてHTLV−ウ
イルスに感染されることを特徴とする特許請求の
範囲第１項乃至第５項のいずれかひとつに記載の
方法。 ７ 標的Ｔ細胞が無細胞感染によつてHTLV−
ウイルスに感染されることを特徴とする特許請
求の範囲第１項乃至第６項のいずれかひとつに記
載の方法。 技術分野 本発明は後天性免疫不全症候群（エイズ）、前
エイズの患者および健康なキヤリヤーからの細胞
変性または殺細胞効果を持つ（HTLV−）ヒ
ト向Ｔ細胞レトロウイルス（HTLV群）の連続
的産生のための方法ならびにその再現性のある検
出および分離のための細胞系に関する。リンパ様
白血病の成人から誘導され、HTと名付けられた
ひとつの新生物性異数性Ｔ細胞株は、HTLV−
の感染を受け、HTLV−に高度に感受性で
許容性のＴ細胞集団を生じ、ウイルスの大量培
養、分離および生物学的検出に都合がよい。これ
らは、HTLV−ウイルス感染後、無期限の生
育能を生じ、それを保持可能である。 発明の背景 疫学的データから、後天性免疫不全症候群（エ
イズ）は明らかに密接な接触または血液生成物に
よる水平伝達される感染性剤によつて起ることが
強く示唆される。この病気は日和見感染、主とし
てニユーモシステイスカルシニ（Pneumocystis
carcinii）肺炎およびカボジ内腫によつて証明さ
れてはいるものの、基にある障害は絶対的リンパ
球減少およびヘルパーＴリンパ球（OKT4+）数
の減少による患者の細胞性免疫に影響を与えるこ
とである。その上、この病気発病の完全な臨床的
証明の前に、その前駆症、前エイズが説明できな
い慢性リンパ腺症および／またはヘルパーＴ細胞
の一群を含む白血球減少としてしばしば認められ
る。これは患者の重篤な免疫不全につながり、Ｔ
細胞の特異な一群が感染剤の一次的標的であるこ
とを示唆している。エイズまたは前エイズ患者は
しばしば慢性的に巨大細胞ウイルスまたはＢ型ウ
イルス肝炎に感染しているものの、種々の理由か
ら、これらは明らかに免疫反応不全に関係のない
日和見または偶然の感染と思われる。 エイズの原因はヒトＴ細胞向リンパ性レトロウ
イルス（HTLV）であり、これには本発明以前
にヒトＴ細胞白血病／リンパ腫ウイルス、
HTLV−およびHTLV−と呼ばれる二種の
主要な性質の良く判つたヒトのレトロウイルスの
群が含まれる。最も一般に分離されるHTLV−
は主として成人Ｔ細胞癌患者から得られる。血
清疫学的研究、試験管内での生物学的効果および
核酸ハイブリダイゼイシヨンのデータから、
HTLV−は病源学的にこの癌に結びつき、こ
れは最初、日本の南部の、更にカリブ地方および
アフリカの成人がかかる。サブグループの
HTLV（HTLV−）は最初、毛細胞白血病のＴ
細胞変種の患者から分離された。現在までの所、
これが新生物病の患者からHTLV−が分離さ
れた唯一のものである。ウイルスの分離および血
清疫学的データから、両サブグループのHTLV
はエイズ患者に見いだされることがある。 下記の事に基いてHTLV群のレトロウイルス
がエイズの病源学的物質であることが証拠に基い
て示唆される：(1)動物のレトロウイルスが免疫不
全の原因になるという先例がある（ネコのネコ白
血病ウイルス）；(2)HTLV群のレトロウイルスは
向Ｔ細胞性である；(3)これらは好んで「ヘルパ
ー」Ｔ細胞（OKT4+）に感染する；(4)細胞合胞
体形成の誘導で見られるような種々のヒトおよび
哺乳動物細胞に細胞変性効果を持つ；(5)これらは
いくつかのＴ細胞機能を変える；(6)ある場合に
は、感染により選択的にＴ細胞を殺す；および(7)
これらは密接な接触または血液生成物によつて伝
達される。HTLV感染細胞の細胞膜抗原に対す
る抗体の存在がエイズ患者の40％以上の血清に見
られた（エセツクス（Essex）等、サイエンス
（Science）、220巻859頁、1983年）。この抗原はそ
れ以後HTLVのエンブローブの部分とされた
（シヨプバツハ（Schopbach）等、サイエンス
（Science）224巻、503頁、５月４日、1984年およ
びリー（Lee）等、プロシーデイングスオブザナ
シヨナルアカデミーオブサイエンシズオブユナイ
テツドステイツオブアメリカ（Proc.Nat.Acad.
Sci.USA）投稿中、種々の分離されたHTLVの
最初の検出と分離によりふたつの初期の進歩が可
能になつた：インターロイキン２（Il−２）とも
呼ばれるＴ細胞生育因子（TCGF）の発見で、こ
れは正常および新生物性の成熟Ｔ細胞の異つた二
群を定常的な選択的生育を可能にする（ラセツテ
イ（Ruscetti）等、ジヤーナルオブイムノロジー
（J.Immunol.）；119巻、131頁、1977年；および
ポイエズ（Poiesz）等、プロシーデイングズオブ
ザナシヨナルアカデミーオブサイエンシズオブユ
ナイテツドステイツオブアメリカ（Proc.Nat.
Acad.Sci.USA）、77巻、6134頁、1980年および
逆転写酵素測定に基くレトロウイルスの鋭敏な検
出法の開発である。HTLVの分離と伝達の方法
にはウイルスに許容性のＴ細胞を使用する共培養
法が含まれる。共培養実験に正常ヒトＴ細胞を使
用すると標的Ｔ細胞のいくつかに対し不朽化（形
質転換）能を持つふたつのサブグループの
HTLVが優先的に得られる。 しかしながら、HTLV変種（今やHTLV−
と名付けられている）は正常Ｔ細胞に対する不朽
化性を欠き、主としてＴ細胞に細胞変性効果を示
し、そして今やエイズの原因と信じられている。
実際に、このような変種は共培養または無細胞伝
達実験において標的としてのこれらの正常Ｔ細胞
を使つてしばしば、しかし一時的に検出される。
細胞変性効果はHTLVの細胞変性変種に対し高
度に感受性で許容性の、したがつて、ウイルスの
感染後も永久に成育する能力を保持する細胞を見
い出すことより克服される。本発明は、この新規
な不朽化Ｔ細胞集団の同定および性質、およびエ
イズおよび前エイズ患者からのこのようなウイル
スを分離し、連続的に高レベルで産生させること
にこれを使用することを明らかにする。 即ち、本発明は、標的Ｔ細胞として以下の〜
の特徴を有するHTクローンに、HTLV−ウ
イルスを感染させ、HTLV−の正常な細胞変
性効果を克服し、該標的Ｔ細胞の不死の成育能を
保持することを特徴とするHTLV−ウイルス
の製造法である。 リンパ様白血病の成人由来である。 新生物性異数性Ｔ細胞株である。 OKT3+、OKT4+およびOKT8-の成熟Ｔ細
胞表現型である。 HTLV−の感染に感受性である。 上記の標的Ｔ細胞は、これらの分離ウイルス
（HTLV−）の伝達に対して感受性の標的であ
り、これにより連続的なウイルスの大量培養が可
能であり、またこのウイルス自身同志の、および
HTLV−やHTLV−との比較に有用な特異
性のある免疫試薬および核酸プローブの開発を可
能にする。HTLV−およびHTLV−と区別
される生物学効果における違いに加えて、
HTLV−はいくつかの免疫学的分析および形
態学的にこれらの公知のHTLV群と異つている。
しかし、この新しいレトロウイルスも向T4リン
パ性であり、逆転写酵素、患者の血清および動物
の超免疫血清を使つた異族性拮抗ラジオイムノア
ツセイで調べた構造蛋白質の交差反応および合胞
体誘導を含む、HTLV−およびHTLV−と
多くの類似した性質を示す。これらの新たに分離
されたウイルスを総称的にHTLV−は名付け
られた。その蛋白質および遺伝学的情報のいくつ
かに検出される差異と共に、HTLV−がＴ細
胞を殺す能力がHTLV群の他のものからこの変
種を明らかに区別している。 寄 託 本発明に相当する細胞株でH9／HTLV−Bと
名付けるものをATCCNo.CRL8543として1984年
４月19日、アメリカンタイプカルチヤーコレクシ
ヨン（American Type Culture Collection）
（エイテイーシーシー、アメリカ合衆国、メリー
ランド20852−1776、ロツクビル、12301パークロ
ーンドライブ（ATCC、12301Parklawn Drive、
Rockville、Maryland20852−1776 USA）に寄
託した。この寄託により寄託物の永続性が確保さ
れ、また一般に容易に入手できる。H9は本発明
にしたがつた代表的で望ましい細胞株である。 一般的説明 感受性細胞株HTは、試験管内感染の前に、
HTLVについても試験され、プロウイルス配列
が欠除していることも含めてすべての点で陰性で
あつた。前エイズまたはエイズ患者から出たＴ細
胞の短期間培養（TCGFを用いて生育）から集め
たHTLV−を含む濃縮培養液に対し、親のHT
細胞（ポリプレン処理した３×106個の細胞）を
繰返し暴露してHTLV−を連続産生させる。
この濃縮液が逆転写酵素（RT）を持つ粒子を含
むことを最初に見た。細胞増殖が下降した時、通
常培養液に暴露して10乃至20日後に、新鮮な（感
染していない）HT親細胞を培養に加える。感染
親細胞株の培養液はRT活性を持つ粒子について
陽性であり、感染細胞数の約20％が前エイズ血友
病患者（患者E.T.）の血清を用いた間接免疫螢
光分析（IFA）に陽性であつた。E.T.からの血清
も破砕HTLV−の蛋白質に対する抗体を含ん
でいたが、HTLV−またはHTLV−感染細
胞の蛋白質と反応しなかつた。 詳細な説明 既に述べたように、異数性HT細胞株はHTLV
−の連続的増殖の望ましい必要条件を示した。
この細胞株はリンパ様白血病の成人患者から出た
新生物異数性Ｔ細胞株で、螢光活性化セルソータ
ーを使用したサイトフルオロメトリーにより調べ
て成熟Ｔ細胞表現型（OKT3+（62％）、OKT4+
（39％）およびOKT8-）について選択したもので
ある。この細胞の培養は20％ウシ胎児血清と抗生
物質を加えたBPMI／1640中で定常的に保持され
る。この培養を実施例１、第２表に示す。H9ク
ローンが望ましく、H4クローンは二番目に望ま
しい。 HTLV−培養液を後天的免疫不全症候群
（エイズ）患者の培養細胞から分離する。患者の
末梢血白血球をFicoll−Hypaque中でバンド形成
させ、５ｇ／mlフアイトヘムアグルチニン
（PHA−Ｐ）を含む生育培地（RPMI1640、20％
ウシ胎児血清、0.29mg／mlグルタミン）で37℃、
48時間、５％CO2雰囲気下に培養する。次いでこ
の白血球に10％精製Ｔ細胞生育因子（TCGF）を
含む生育培地を加える；望みに応じて、細胞の一
部にアルフアーインターフエロンに対するウサギ
抗体を与えた。その後、この白血球の細胞および
生育培地についてHTLVのサブグループ−
の存在を調べる。下記の中のひとつ以上を示す試
料を陽性と考えた：上澄液にMg依存逆転写酵
素活性が繰返し検出される；電子顕微鏡でウイル
スが観察される；陽性血清者または超免疫血清か
らの抗体によつてウイルス関連抗原が細胞内に表
現される；または、逆転写酵素または電子顕微鏡
観察により検出された粒子が新鮮なヒトの中心の
血液（core blood）、骨髄、または末梢血Ｔリン
パ球に伝達される。免疫学的または核酸分析によ
りHTLV−にもHTLV−にも分類されない
すべての分離ウイルスはHTLV−として分類
した。HTLV−産生細胞培養の細胞は確立さ
れた免疫学的手法を使つて性質を調べた所、ほと
んどT4表現型（OKT4、leu3a陽性）を持つＴリ
ンパ球（Ｅロゼツト受容体、OKT／３および
leu／１陽性）である。この過程はガロ（Gallo）
等によりサイエンス（Science）220巻、865−867
頁、1983年にも記載されている。宿主HT細胞お
よび他のクローン化細胞集団の感染は、エイズま
たは前エイズ患者からのＴ細胞培養の濃縮または
非濃縮培養液にこれらの細胞を暴露すること（無
細胞感染）または共培養によつて起り；すなわ
ち、HT細胞はHTLV−陽性Ｔ細胞培養に対し
暴露されることによつて感染される。通常の無細
胞感染方法は次の通りである：２乃至５×106細
胞をCO2インキユベーター中で37℃、30分間、ポ
リプレン（２ｇ／ml）またはDEAEデキストラン
で処理する。次いでそのインキユベーター内で
（CO2／37℃）１時間、ウイルス接種物（0.1乃至
１ml）に暴露する。細胞を定期的に振とうするこ
とによつて懸濁状態に保つ。１時間置いた後に正
規の生育培地を加える。感染培養がHTLV−
に陽性かどうかを培養１、２および３週間後に調
べる。 HT細胞（クローン）の感染も共培養法−HT
細胞をエイズまたは前エイズ患者からのＴ細胞の
短期培養（約５乃至20日）と種々の比率（通常
１：５）で混合する一によつて行う。HTLV−
陽性は、共培養後、種々の間隔（７、14、21日
等）で感染した受容体細胞にウイルス抗原または
ウイルス核酸配列を検出することによつて行う。
混合培養は生育培地で数ケ月間保持される。 共培養を細胞処理のための標準法にする。細胞
を生育させる標準条件は95％の湿度を与えた空気
と５％CO2の雰囲気下の37℃である。操作におい
て、ヒトの血液からの供与細胞が、共培養をする
ための標的細胞（HT新生物性異数性Ｔ細胞）に
作用するウイルスを生成する。レトロウイルス陽
性細胞の共培養はウイルスを産生し、永久の生育
または不滅の生育（HTLV−およびHT9とし
て）；すなわち不死条件が保持される。 実施例 １ 下記の第１表に示すように、単一細胞HTクロ
ーンをポポビツク（Popovic）等によりネオプラ
ズマ（Neoplasma）18巻、257頁、1971年に、お
よびバツク（Bach）等イムノロジカルレビユー
（Immunol.Rev.）54巻、５頁、1981年に記載され
ているようにして、螢光活性化セルソーターを使
つたサイトフルオロメトリーにより調べて成熟Ｔ
細胞表現型（OKT3+（62％）、OKT4+（39％）お
よびOKT8-）を表わす長期培養異数性HT細胞
株から分離した。この培養は20％ウシ胎児血清お
よび抗生物質を含むRPMI／1640で定常的に保持
した。２×105細胞／培養培地mlの濃度で種母添
加した親細胞培養の最終細胞濃度は、培養５日後
で１×106乃至1.5×106細胞／mlの範囲内であつ
た。 多核細胞検出のために、感染後６および14日に
細胞塗沫を行い、Wright−Giemsa染色した。５
個以上の核を持つ細胞を多核細胞と考えた。非感
染培養からのクローン化細胞もいくつか多核巨大
細胞を含む；しかし、リング形成は無く、これら
の細胞の数ははるかに少い（0.7％乃至10％）。 免疫螢光陽性細胞をリン酸緩衝化食塩液
（PBS）で洗浄し同じ緩衝液にml当り106細胞の濃
度で再懸濁した。約50λの細胞懸濁液をスライド
上に取り、風乾、アセトン中で10分間、室温で固
定した。スライドは使用するまで−20℃に保管し
た。HTLV−に対する超免疫ウサギ抗血清
（PBSで１／2000に希釈）またはPBSで1/8に希
釈した患者（E.T.）の血清の20マイクロリツト
ルを細胞に適用し、37℃で50分間置いた。ウサギ
またはヒト免疫グロブリンＧに対するフルオレツ
セイン結合抗血清を希釈し、固定した細胞に室温
で30分間適用した。次いでスライドを顕微鏡観察
の前に十分に洗浄した。非感染細胞株およびその
クローンは本試験で常に陰性であつた。 逆転写酵素活性を測定するために、ウイルス粒
子を下記のようにして無細胞上澄液から沈殿させ
た：4MNaCl0.4mlおよび30％（重量／容積）ポ
リエチレングリコール（Carbowax6000）3.6ml
を集めた培養液８mlに加え、その懸濁液を氷冷下
に一夜置いた。懸濁液をSorvall RC−３遠心分
離機を使つて2000rpmで30分間、４℃で遠心分離
した。沈殿を50％（容積／容積）グリセロール
（25ｍＭ Tris−HCl、PH7.5／５ｍＭジチオスレ
イトール／150ｍＭ KCl／0.025％Triton Ｘ−
100）300μに再懸濁した。粒子を0.9％Triton
Ｘ−100／1.5M KClを加えて破砕した。逆転写
酵素（RT）分析はポイエズ（Poiesz）等、プロ
シーデイングズオブザナシヨナルアカデミーオブ
サイエンシズオブユナイテツドステイツオブアメ
リカ（Proc.Nat.Acad.Sci.USA）77巻、7415頁、
1980年記載のようにして行い、培養液ミリリツト
ル当りのcpmで表わした。
【表】
【表】
実施例 ２
下記の第２表に示すように、H4受容体Ｔ細胞
クローンとの共培養を、それぞれ患者RFおよび
SNの末梢血からの新鮮な単球を使つて行つた。
患者BKとLSの場合には、外部から加えたTCGF
（10％容積／容積）の存在下に10日間生育したＴ
細胞を使つて共培養を行つた。受容体／供与体
（患者のもの）細胞の比は１：５であつた。混合
培養はRPMI／1640（20％FCSおよび抗生物質）
中、外部からTCGFを加えずに維持した。H9T
細胞クローンの無細胞感染は患者WTのＴ細胞培
養から集めた濃縮培養液を使つて行つた。そのＴ
細胞培養は外部からTCGFを加えて２週間生育さ
せた後、培養液を集めて濃縮した。H9クローン
の細胞はポリプレン（2μｇ／ml）で20分間前処
理し、２×106細胞を粒子RT活性陽性の100倍濃
縮培養液0.5mlに１時間暴露した。 共培養および無細胞感染細胞培養のいずれにお
いてもHTLV−ウイルス表現は試験管内培養
後１月間して測定した。HTLV−表現には相
当の変動があつた（第２表参照）。逆転写酵素
（RT）分析および間接免疫螢光分析（IFA）の詳
細は実施例１を参照のこと。
クローンとの共培養を、それぞれ患者RFおよび
SNの末梢血からの新鮮な単球を使つて行つた。
患者BKとLSの場合には、外部から加えたTCGF
（10％容積／容積）の存在下に10日間生育したＴ
細胞を使つて共培養を行つた。受容体／供与体
（患者のもの）細胞の比は１：５であつた。混合
培養はRPMI／1640（20％FCSおよび抗生物質）
中、外部からTCGFを加えずに維持した。H9T
細胞クローンの無細胞感染は患者WTのＴ細胞培
養から集めた濃縮培養液を使つて行つた。そのＴ
細胞培養は外部からTCGFを加えて２週間生育さ
せた後、培養液を集めて濃縮した。H9クローン
の細胞はポリプレン（2μｇ／ml）で20分間前処
理し、２×106細胞を粒子RT活性陽性の100倍濃
縮培養液0.5mlに１時間暴露した。 共培養および無細胞感染細胞培養のいずれにお
いてもHTLV−ウイルス表現は試験管内培養
後１月間して測定した。HTLV−表現には相
当の変動があつた（第２表参照）。逆転写酵素
（RT）分析および間接免疫螢光分析（IFA）の詳
細は実施例１を参照のこと。
【表】
実施例 ３
HTLV−に対する高度の許容性を選択し、
永続的生育と連続的ウイルス産生を保持するため
に、HT親Ｔ細胞集団の広いクローニングを行つ
た。総計51の単細胞クローンを、供給者として健
康な献血者の末梢血からの照射した単球を使い、
毛細管法および限定希釈法によつて得た。これら
の細胞クローンの生育をHTLV−感染後に比
較した。HTLV−に感受性で許容性である８
種のＴ細胞クローンのウイルス感染に対する反応
の代表的例を第２表に示す。同一実験を２度行
い、各Ｔ細胞クローン２×106細胞を0.1mlの濃縮
ウイルスに暴露した。細胞生育と形態、細胞のウ
イルス抗原の表現および培養液のRT活性を感染
６および14日後に調べた。８クローンすべてウイ
ルスに感受性で許容性であるが、感染後の増殖能
に相当の差異があつた。細胞数は感染６日以内に
最初の細胞数から10％乃至90％減少し、感染した
８クローンすべてに多核（巨大）細胞が常に高比
率に見られた。エイズ患者（E.T.）からの血清
または破砕HTLV−全体に対してつくつた超
免疫ウサギ血清を使つた免疫螢光分析で調べたウ
イルス抗原陽性Ｔ細胞のパーセントは10％乃至80
％の範囲であつた。感染14日後には、８クローン
すべてにおいて、全細胞数およびHTLV−陽
性細胞の比率が上昇した。ウイルス陽性培養には
常に多数の核を含む丸い巨大細胞が見られた。こ
れらの多核巨大細胞はHTLV−およびHTLV
−により誘導されるものと類似しているが、核
が特徴的なリング形成を示す。電子顕微鏡検査か
ら、細胞はかなりの量のウイルスを放出すること
がわかつた。 実施例 ４ HTLV−が感染Ｔ細胞により長期間培養に
おいて連続的に産生されるかどうかを調べるため
に、感染クローン、H4のウイルス産生と生細胞
数を数ケ月にわたつて追跡した。ウイルス産生は
変動するものの、約14日毎にH4／HTLV−細
胞培養から集めた培養液は５ケ月間にわたつて粒
子のRT活性を常に示した。生細胞率は65％乃至
85％の範囲であり、H4／HTLV−と呼ばれる
細胞集団のダブリングタイムは約30乃至40時間で
あつた。したがつて、この永続的に生育するＴ細
胞集団は連続的にHTLV−を産生することが
できる。 H4／HTLV−細胞によつて産生されたウイ
ルスの収量を、庶糖密度勾配による濃縮培養液の
精製と密度勾配から集められた各画分の粒子RT
活性分析により調べた。最高RT活性は他のレト
ロウイルスに類似して密度1.16ｇ／mlの所に見ら
れた。 工業的応用性 本発明の生成物である望ましい細胞株（H9／
HTLV−B）は、今や、エイズの救済および血
液試料中のウイルスに対する抗体の検出のための
ワクチン製造に有用である。
永続的生育と連続的ウイルス産生を保持するため
に、HT親Ｔ細胞集団の広いクローニングを行つ
た。総計51の単細胞クローンを、供給者として健
康な献血者の末梢血からの照射した単球を使い、
毛細管法および限定希釈法によつて得た。これら
の細胞クローンの生育をHTLV−感染後に比
較した。HTLV−に感受性で許容性である８
種のＴ細胞クローンのウイルス感染に対する反応
の代表的例を第２表に示す。同一実験を２度行
い、各Ｔ細胞クローン２×106細胞を0.1mlの濃縮
ウイルスに暴露した。細胞生育と形態、細胞のウ
イルス抗原の表現および培養液のRT活性を感染
６および14日後に調べた。８クローンすべてウイ
ルスに感受性で許容性であるが、感染後の増殖能
に相当の差異があつた。細胞数は感染６日以内に
最初の細胞数から10％乃至90％減少し、感染した
８クローンすべてに多核（巨大）細胞が常に高比
率に見られた。エイズ患者（E.T.）からの血清
または破砕HTLV−全体に対してつくつた超
免疫ウサギ血清を使つた免疫螢光分析で調べたウ
イルス抗原陽性Ｔ細胞のパーセントは10％乃至80
％の範囲であつた。感染14日後には、８クローン
すべてにおいて、全細胞数およびHTLV−陽
性細胞の比率が上昇した。ウイルス陽性培養には
常に多数の核を含む丸い巨大細胞が見られた。こ
れらの多核巨大細胞はHTLV−およびHTLV
−により誘導されるものと類似しているが、核
が特徴的なリング形成を示す。電子顕微鏡検査か
ら、細胞はかなりの量のウイルスを放出すること
がわかつた。 実施例 ４ HTLV−が感染Ｔ細胞により長期間培養に
おいて連続的に産生されるかどうかを調べるため
に、感染クローン、H4のウイルス産生と生細胞
数を数ケ月にわたつて追跡した。ウイルス産生は
変動するものの、約14日毎にH4／HTLV−細
胞培養から集めた培養液は５ケ月間にわたつて粒
子のRT活性を常に示した。生細胞率は65％乃至
85％の範囲であり、H4／HTLV−と呼ばれる
細胞集団のダブリングタイムは約30乃至40時間で
あつた。したがつて、この永続的に生育するＴ細
胞集団は連続的にHTLV−を産生することが
できる。 H4／HTLV−細胞によつて産生されたウイ
ルスの収量を、庶糖密度勾配による濃縮培養液の
精製と密度勾配から集められた各画分の粒子RT
活性分析により調べた。最高RT活性は他のレト
ロウイルスに類似して密度1.16ｇ／mlの所に見ら
れた。 工業的応用性 本発明の生成物である望ましい細胞株（H9／
HTLV−B）は、今や、エイズの救済および血
液試料中のウイルスに対する抗体の検出のための
ワクチン製造に有用である。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US602946 | 1984-04-23 | ||
| US06/602,946 US4647773A (en) | 1984-04-23 | 1984-04-23 | Method of continuous production of retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS |
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Related Child Applications (1)
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| JP5034673A Division JP2686892B2 (ja) | 1984-04-23 | 1993-01-29 | エイズに関係するレトロウイルス（ｈｔｌｖ−ｉｉｉ）の連続的産生のための細胞株 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61500767A JPS61500767A (ja) | 1986-04-24 |
| JPH0568232B2 true JPH0568232B2 (ja) | 1993-09-28 |
Family
ID=24413413
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501923A Granted JPS61500767A (ja) | 1984-04-23 | 1985-04-23 | エイズに関係するレトロウイルス（ｈｔｌｖ―３）の連続的産生のための方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4647773A (ja) |
| JP (1) | JPS61500767A (ja) |
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| GB8324800D0 (en) * | 1983-09-15 | 1983-10-19 | Pasteur Institut | Antigens |
| US9309574B1 (en) | 1984-08-22 | 2016-04-12 | The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Molecular cloning of HIV-1 from immortalized cell lines |
| US4839288A (en) * | 1986-01-22 | 1989-06-13 | Institut Pasteur | Retrovirus capable of causing AIDS, antigens obtained from this retrovirus and corresponding antibodies and their application for diagnostic purposes |
| US5364933A (en) | 1986-03-03 | 1994-11-15 | Institut Pasteur | Methods of immunopurification of antigens of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2) |
| US6514691B1 (en) | 1986-01-22 | 2003-02-04 | Institut Pasteur | Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2 |
| US5112756A (en) * | 1986-06-02 | 1992-05-12 | Canadian Patents And Development Limited | Continuous production of bovine Maedi-Visna-like viral antigens in Cf2Th cells |
| US5019557A (en) * | 1986-09-15 | 1991-05-28 | Pitts Jr Ferris N | Method for the effective treatment of disease conditions in humans associated with HTLV-III infection |
| US5118602A (en) * | 1987-08-26 | 1992-06-02 | The Regents Of The University Of California | Feline T-lymphotropic lentivirus assay |
| FR2689521B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede d'obtention et maintien d'une culture cellulaire viable, infectee par un virus associe a la sclerose en plaques, et produits biologiques derives de ladite culture. |
| FR2689520B1 (fr) * | 1992-04-03 | 1996-07-19 | Bio Merieux | Procede et milieu de culture pour l'obtention de cellules infectees par un virus associe a la sclerose en plaques. |
| WO1993024617A1 (en) * | 1992-05-28 | 1993-12-09 | Medical College Of Wisconsin | Human virus associated with chronic fatigue immune deficiency syndrome (cfids) and assay therefor |
| CA2161671A1 (en) | 1993-04-30 | 1994-11-10 | Robert M. Lorence | Methods of treating and detecting cancer using viruses |
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| FR2716198B1 (fr) * | 1994-02-15 | 1996-04-19 | Bio Merieux | Facteur cytotoxique tel qu'associé à la sclérose en plaques, sa détection et sa quantification. |
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Family Cites Families (3)
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