JPH0568547A

JPH0568547A - Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な精製熱安定ｄｎａポリメラーゼ

Info

Publication number: JPH0568547A
Application number: JP3191379A
Authority: JP
Inventors: Donald G Comb; ドナルド・ジー・コンブ; Francine Perler; フランシネ・パーラー; Rebecca Kucera; レベツカ・クツセラ; William E Jack; ウイリアム・イー・ジヤツク
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1990-04-26
Filing date: 1991-04-26
Publication date: 1993-03-23
Anticipated expiration: 2016-11-19
Also published as: US5322785A; DE69129773T2; DE69129773D1; JP3229886B2; EP0455430A2; EP0455430B1; DE455430T1; EP0455430A3

Abstract

(57)【要約】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓから入
手可能なかなり熱安定性のある酵素を提供する。この熱
安定酵素は、分子量約９０，０００〜９５，０００ダル
トン、安定化剤不在下での１００℃における半減期約６
０分、及び、オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮＸ−１
００）またはウシ血清アルブミンのような安定化剤存在
下での１００℃における半減期約９５分を有する。熱安
定酵素は３’−５’プルーフリーディングエキソヌクレ
アーゼ活性を有する。熱安定酵素は天然であっても組換
え体であってもよく、ｃＤＮＡクローニングにおける第
２鎖ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定及びＤＮＡ増幅に使
用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は極めて熱安定性のある酵
素に係わる。特に本発明は、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な熱安定性ＤＮＡポ
リメラーゼに係わる。

【０００２】本発明は、１９９０年１２月１１日出願の
米国特許出願第０７／６２６，０５７号の一部係属出願
であり、前記特許は更に１９９０年４月２６日出願の米
国特許出願第０７／５１３，９９４号の一部係属出願で
ある。

【０００３】

【従来の技術】ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの修復及
び複製に関与する酵素ファミリーである。Ｅ．ｃｏｌｉ
のような常温微生物からＤＮＡポリメラーゼを単離する
研究がなされている〔例えば、Ｂｅｓｓｍａｎら，Ｊ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５７）２３３：１７１〜１
７７；Ｂｕｔｔｉｎ及びＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．（１９６６）２４１：５４１９〜５４２
７参照〕。

【０００４】Ｅ．ｃｏｌｉから単離されるＤＮＡポリメ
ラーゼの例としてはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ
Ｉ、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラ
グメント及びＴ４ＤＮＡポリメラーゼを挙げることが
できる。これらの酵素は、例えばニックトランスレーシ
ョンによるＤＮＡの標識、ｃＤＮＡクローニングにおけ
る第二鎖ｃＤＮＡ合成及びＤＮＡ配列決定を含む組換え
ＤＮＡ技術において多様な用途を有する〔Ｍａｎｉａｔ
ｉｓら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８２）参
照〕。最近、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，
６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号が、核酸
配列を増幅、検出及び／またはクローニングする方法に
上記酵素を使用することを開示した。一般にはポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と称されるこの方法は、既存の
核酸を増幅するために、ポリメラーゼ、プライマー及び
ヌクレオチド三リン酸を使用する。

【０００５】上記のＤＮＡポリメラーゼは、ただ１つの
塩基を選択して塩基対形成する段階の結果としてＤＮＡ
合成が起った場合に通常のＤＮＡ複製よりもはるかに高
い正確さでＤＮＡ複製するプルーフリーディング機能を
付与する３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有する
〔Ｂｒｕｔｌｅｇ，Ｄ．及びＫｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７２）２４７：２４１
〜２４８〕。３’−５’プルーフリーディングエキソヌ
クレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、プルー
フリーディングエキソヌクレアーゼを持たないポリメラ
ーゼと比較した場合、塩基取込みエラー率が実質的によ
り低い〔Ｃｈａｎｇ，Ｌ．Ｍ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．（１９７７）２５２：１８７３〜１８８０〕。

【０００６】Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓのよ
うな好熱菌からＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製する
研究も行われている。Ｃｈｉｅｎ，Ａ．ら，Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．（１９７６）１２７：１５５０〜１１５
７は、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓＹＴ１株から至適温度８
０℃でＤＮＡポリメラーゼを単離及び精製することを開
示している。Ｃｈｉｅｎらの精製方法は４ステップの方
法である。これらのステップは、粗抽出物の調製、ＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー、ホスホセ
ルロースクロマトグラフィー及びＤＮＡセルロースクロ
マトグラフィーである。Ｋａｌｅｄｉｎら，Ｂｉｏｋｈ
ｙｍｉｙａｙ（１９８０）４５：６４４〜６５１も、
Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓＹＴ１株の細胞からＤＮＡポリ
メラーゼを単離及び精製することを開示している。Ｋａ
ｌｅｄｉｎらの精製方法は６ステップの方法である。こ
れらのステップは、粗抽出物の単離、硫酸アンモニウム
沈澱、ＤＥＡＥ−セルロースクロマトグラフィー、ヒド
ロキシアパタイトによる分画、ＤＥＡＥ−セルロースに
よる分画、及び一重鎖ＤＮＡ−セルロースクロマトグラ
フィーである。

【０００７】米国特許第４，８８９，８１８号は、一重
鎖ＤＮＡ−セルロースクロマトグラフィーに代えてホス
ホセルロースクロマトグラフィーを加えたＫａｌｅｄｉ
ｎの方法と実質的に同一の方法によって調製される、分
子量約８６，０００〜９０，０００ダルトンを有する
Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の精製熱安定ＤＮＡポリメ
ラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を開示している。更に
欧州特許出願第０２５８０１７号は、前述のＰＣＲ法に
使用するのに好ましい酵素としてＴａｑポリメラーゼを
開示している。

【０００８】研究によって、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
は５’−３’ポリメラーゼ依存性エキソヌクレアーゼ機
能を有するが、３’−５’プルーフリーディングエキソ
ヌクレアーゼ機能を有さないことが示されている〔Ｌａ
ｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１
９８９）２６４：１１，ｐ．６４２７〜６４３７；Ｂｅ
ｒｎａｄ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：２１
９〕。結果としてＴａｑＤＮＡポリメラーゼは塩基取込
みエラーを起こしがちであり、このことが所定の用途に
おける使用を望ましくないものにしている。例えば、誤
取込み発生がランダムな故にどの複製遺伝子もエラーを
含み得るという理由で、増幅遺伝子をクローニングしよ
うとする試みは問題である。複製サイクルのどこでエラ
ーが生じるかに従って（例えば初期複製サイクルにおい
て）、増幅されたＤＮＡ全体が誤って取り込まれた塩基
を含み、突然変異遺伝子産物を生じ得る。更に研究は、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの熱安定性は１００℃におい
ては数分以下であることを示した。

【０００９】従ってこの分野において、前述のＤＮＡポ
リメラーゼプロセスを改善するのに使用し得る、３’−
５’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有
する熱安定性の高い精製ＤＮＡポリメラーゼを得たい、
生産したいという願望がある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、ＤＮＡの重合
を触媒するＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な熱安
定酵素を提供する。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可
能な熱安定酵素は、見掛けの分子量約９０，０００〜９
５，０００ダルトン、安定化剤不在下での１００℃にお
ける半減期約６０分、オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１００）またはウシ血清アルブミンのような安定
化剤の存在下での１００℃における半減期約９５分を有
するＤＮＡポリメラーゼである。

【００１１】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な９
０，０００〜９５，０００ダルトンの熱安定ＤＮＡポリ
メラーゼをコードするＤＮＡは単離されており、本発明
の熱安定酵素を得る別の手段を提供する。

【００１２】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓは３’−５’プル
ーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有する。こ
れは、上記プルーフリーディング活性を有する高度に好
熱性のポリメラーゼの最初の例である。結果として、
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ
ポリメラーゼのような３’−５’プルーフリーディング
エキソヌクレアーゼ機能のない熱安定ポリメラーゼより
はるかに高い正確さを有する。更にＴ．ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼより十
分に高い熱安定性または温度９６℃〜１００℃における
より大きな半減期を有する。最後に、前述のＰＣＲ反応
のごときＤＮＡ複製に使用する場合には、Ｔ．ｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、より少ない数のサイ
クルにおいてより少ない量のターゲットＤＮＡを増幅す
ることでＴａｑポリメラーゼより優れている。

【００１３】本発明の好ましい熱安定酵素は、Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓ株ＮＳ−Ｃ（ＤＳＭ番号５４７３）から
入手可能なＤＮＡポリメラーゼである。Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓは、１９８５年にイタリアのナポリ近海の海底
火口で確認された。この生物Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓは
高度に好熱性であり、硫黄代謝し、古細菌であり、５５
℃〜９８℃で増殖する〔Ｎｅｕｎｅｒら，Ａｒｃｈ．Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９０）１５３：２０５〜２０
７〕。

【００１４】天然タンパク質を回収するために、Ｂｅｌ
ｋｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８
５）１４２：１８１〜１８６（この開示内容は参照によ
り本明細書の一部を構成するものとする）に記載の方法
のような任意の適当な方法を使用してＴ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓを増殖させることができる。

【００１５】細胞増殖後にかかる酵素を単離及び精製す
る１つの好ましい方法は、以下のような複数のステップ
から成る方法を使用して行われる。

【００１６】まず細胞を、凍結させてあればそれを融解
し、緩衝液Ａ（１０ｍＭＫ_３ＰＯ_４緩衝液，ｐＨ７．
４；１．０ｍＭＥＤＴＡ，１．０ｍＭ β−メルカプ
トエタノール）のような適当な緩衝液中に懸濁させ、超
音波処理し、遠心分離する。次いで上清を、Ａｆｆｉｇ
ｅｌｂｌｕｅカラム（Ｂｉｏｒａｄ）のような核酸に
結合するタンパク質に高度に親和性を示すカラムに通
す。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓの上清中に存在する核酸と
多くのタンパク質とがカラムを通過し、カラム容積の数
倍量の低塩緩衝液（ｐＨ約７．０）でカラムを洗浄する
ことにより除去される。洗浄後、緩衝液Ａ中の０．１〜
２．０ＭＮａＣｌのような直線濃度勾配で酵素を溶出
する。ピークのＤＮＡポリメラーゼ活性を透析し、ホス
ホセルロースカラムに掛ける。このカラムを洗浄し、緩
衝液Ａ中の０．１〜１．０ＭＮａＣｌのような直線濃
度勾配で酵素活性を溶出する。ピークのＤＮＡポリメラ
ーゼ活性を透析し、ＤＮＡセルロースカラムに掛ける。
このカラムを洗浄し、緩衝液Ａ中の０．１〜１．０Ｍ
ＮａＣｌの直線濃度勾配でＤＮＡポリメラーゼ活性を溶
出する。ＤＮＡポリメラーゼ活性を含むフラクションを
プールし、緩衝液Ａで透析し、高性能液体クロマトグラ
フィーカラム（ＨＰＬＣ）ｍｏｎｏ−Ｑカラム（アニオ
ン交換体）に掛ける。この酵素を再度、緩衝液Ａ中の
０．０５〜１．０ＭＮａＣｌのような直線濃度勾配で
溶出する。熱安定性ポリメラーゼ活性を有するフラクシ
ョンをプールし、希釈し、ＨＰＬＣｍｏｎｏ−Ｓカラ
ム（カチオン交換体）に掛ける。酵素を再度、緩衝液Ａ
中の０．０５〜１．０ＭＮａＣｌのような直線濃度勾
配で溶出する。この段階で酵素は純度約５０％である。
５０ｍＭＮａＣｌを補充した緩衝液Ａで繰返し透析す
ることによりより低い分子量の夾雑タンパク質を沈澱さ
せることで、酵素を更に精製することができる。

【００１７】分子量９７，４００ダルトンのホスホリル
ラーゼＢのような分子量が既知のタンパク質標準と比較
し、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能なＤＮＡポリ
メラーゼの見掛けの分子量は、約９０，０００〜９５，
０００ダルトンである。しかしながら、高度好熱菌由来
のタンパク質としてのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼは、完全に変性できないことまたは他の固有
の特性のために異常な相対分子量位置に電気泳動され得
ることを理解されたい。本発明の熱安定性酵素の厳密な
分子量は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子のコード配列から決定し得る。溶出物の分子量
は、例えばタンパク質分子量マーカーを使用するＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）のような任意の方法によって決定し得る。

【００１８】ポリメラーゼ活性は、ＤＮａｓｅ処理した
または活性化したＤＮＡ中に放射性標識デオキシヌクレ
オチドを取込ませ、次いで取込まれなかったデオキシヌ
クレオチドをＤＮＡ基質から分離することにより測定す
るのが好ましく、ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡを含む酸
不溶性フラクション中の放射能の量に比例する〔Ｌｅｈ
ｍａｎ，Ｉ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９
５８）２３３：１６３，この開示内容は参照により本明
細書の一部を構成するものとする〕。

【００１９】本発明のＤＮＡポリメラーゼの１００℃に
おける半減期は約６０分である。ＤＮＡポリメラーゼの
熱安定性または半減期は、単一の放射性標識デオキシヌ
クレオチドを除く全てのアッセイ成分（緩衝液、ＭｇＣ
ｌ_２，デオキシヌクレオチド及び活性化ＤＮＡ）の存在
下に、当該温度で酵素をプレインキュベートすることに
より決定される。４〜１８０分間の所定の時間間隔で少
量のアリコートを取り出し、前述の方法を使用してポリ
メラーゼ活性を測定する。

【００２０】ＤＮＡポリメラーゼの１００℃における半
減期は、ＴＲＩＴＯＮＸ−１００（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａ
ｓＣｏ．）として一般に公知の非イオン界面活性剤オ
クトキシノール、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
のような安定化剤の存在下に測定することもできる。非
イオン界面活性剤ポリオキシエチル化（２０）ソルビタ
ンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０，ＩＣＩＡｍｅ
ｒｉｃａｓＩｎｃ．）及びエトキシル化アルキルフェノ
ール（ノニル）（ＩＣＯＮＯＬＮＰ−４０，ＢＡＳＦ
ＷｙａｎｄｏｔｔｅＣｏｒｐ．）を使用することも
できる。安定化剤は、反応混合物に加えた少量の酵素が
試験管の側面に付着しないように、またその高次構造が
変化して酵素活性を低下することのないように使用され
る。安定化剤ＴＲＩＴＯＮＸ−１００またはＢＳＡの
存在下でのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能なＤＮ
Ａポリメラーゼの１００℃における半減期は、約９５分
である。

【００２１】本発明の熱安定酵素は、この酵素をコード
する遺伝子がＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムＤＮＡから
クローニングされているので、組換えＤＮＡ技術によっ
て生産することもできる。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａポリメラーゼに対する完全なコード配列は、バクテリ
オファージＮＥＢ６１９由来の約１４ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ制限フラグメントから誘導することができる。このフ
ァージは、１９９０年４月２４日付けでＡｍｅｒｉｃａ
ｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
（ＡＴＣＣ）に寄託されており、寄託番号ＡＴＣＣ４０
７９５を有する。

【００２２】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼの組換え体の生産は一般に以下のステップを含む。ま
ず、天然形の、または天然形ポリメラーゼから分断され
ていてもいなくてもよく且つポリメラーゼ活性に作用し
てもしなくてもよい他の配列との融合体としての、活性
形ポリメラーゼをコードするＤＮＡを単離する。次いで
遺伝子を、原核または真核宿主／ベクター系のいずれか
において発現するための適当な調節配列に操作的に連結
する。このベクターは、適当な宿主内での形質転換及び
維持に必要な全ての機能をコードし、しかもＴ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓポリメラーゼ発現のための選択可能なマー
カー及び／または調節配列をコードし得るのが好まし
い。活性な組換え熱安定ポリメラーゼは、連続的にまた
は発現誘発後に形質転換宿主培養系によって産生され得
る。活性熱安定ポリメラーゼは、宿主細胞内からまたは
タンパク質が細胞膜を通して分泌されるのであれば培地
から回収することができる。

【００２３】上記ステップの各々は多数の方法で実施す
ることができるが、本発明においては、Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをクロ
ーニングする際にＥ．ｃｏｌｉ中でそれ自体の調節配列
からポリメラーゼを発現させると、ポリメラーゼ遺伝子
の不安定性、ポリメラーゼ遺伝子の高頻度の突然変異、
緩慢な細胞増殖、及びある程度の細胞死をもたらすこと
が判った。

【００２４】理論に制約されたくはないが、この不安定
性は少なくとも一部にはＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子を分断するイントロンの存在に起因
すると考えられる。イントロンは、遺伝子のコード領域
を分断する介在ＤＮＡの広がりである（タンパク質コー
ド領域はエキソンと呼ばれる）。イントロンは無意味な
配列を含むこともあるし、タンパク質をコードすること
もある。機能タンパク質を形成するためには、成熟ｍＲ
ＮＡがタンパク質に翻訳される前に、イントロンはｍＲ
ＮＡ前駆体からスプライシングされねばならない。イン
トロンは元来は真核細胞中で同定されたが、近年、ある
種の原核細胞においてもその同定が記載された〔ｋｒａ
ｉｎｅｒ及びｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎａｎｄＳｐｌｉｃｉｎｇ（１９８８），Ｂ．
Ｄ．Ｈａｍｅｓ及びＤ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編集，ＩＲＬ
Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード及びワシントンＤ．
Ｃ．，ｐｐ．１３１〜２０６）参照〕。イントロンを含
む遺伝子がｍＲＮＡに転写される場合、イントロンは自
己スプライスして成熟ｍＲＮＡを形成するか、または細
胞因子がイントロンをｍＲＮＡ前駆体から除去する必要
がある。Ｉｄ．菌のイントロンは、スプライシングに遺
伝子特異的な補因子を必要とすることが多い。例えばＢ
ａｃｉｌｌｕｓイントロンはＥ．ｃｏｌｉ．Ｉｄ．にお
いてはスプライシングされ得ない。

【００２５】しかしながら、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子内の介在ＤＮＡ配
列が転写され、翻訳され、それから産生されるペプチド
が、ｍＲＮＡレベルではなくてタンパク質レベルでスプ
ライシングされることを示唆する幾つかの証拠がある。
従って、どこでスプライシングが行われるかにかかわら
ず本発明においては、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＴ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを発現させるために、
このポリメラーゼをＥ．ｃｏｌｉ系中で発現させる前に
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ介在配列を
欠失させることが必要である。勿論、Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを含む組換えベクターは、イ
ントロンをスプライシングするのに適当な因子を有する
系、例えばＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ系中で発現させる
こともできる。更に、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ遺伝子
は、かかるイントロンをスプライシングするのに適当な
因子を有する哺乳動物発現系においても発現し得ると考
えられる。

【００２６】更に、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ熱安定ポリ
メラーゼの発現が、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのクローニング及
び発現の間しっかりと制御されることも好ましい。本発
明を実現するのに有効なベクターは、以下の制御特性の
一部または全部を賦与することにより、種々の程度に制
御されたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現を
提供すべきである：（１）ポリメラーゼの開始部位に直
接隣位するかまたは融合タンパク質としての転写開始の
プロモーターまたは部位、（２）遺伝子発現を開始及び
停止するのに使用し得るオペレーター、（３）優れた翻
訳のためのリボソーム結合部位、及び（４）優れた安定
性のための転写または翻訳終結部位。Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓポリメラーゼのクローニング及び発現に使用する
のに適当なベクターとしては、ファージ及びプラスミド
を挙げることができる。ファージの例としてはλｇｔｌ
ｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、λＤａｓｈ（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）及びλＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を挙
げることができる。プラスミドの例としてはｐＢＲ３２
２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）、ｐＳＰ７３（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＧＷ７（ＡＴ
ＣＣ番号４０１６６）、ｐＥＴ３Ａ〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇら，Ｇｅｎｅ（１９８７）５６：１２５〜１３５〕及
びｐＥＴｌｌＣ〔ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ（１９９０）１８５：６０〜８９〕を挙げるこ
とができる。

【００２７】形質転換及び感染形質転換、ファージ感染及び細胞培養に対しては標準的
な方法が存在する〔Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（１９８２）〕。プラスミド形質転換に使
用し得る多数のＥ．ｃｏｌｉ株のなかで好ましい株とし
ては、ＪＭ１０１（ＡＴＣＣ番号３３８７６）、ＸＬ１
（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＲＲＩ（ＡＴＣＣ番号３１
３４３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びｐｌｙｓＳ〔Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０），
上掲〕を挙げることができる。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１、
ＥＲ１５７８及びＥＲ１４５８〔Ｒａｌｅｉｇｈら，
Ｎ．Ａ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８８）１６：１５６３
〜１５７５〕は、λファージに使用し得る株であり、Ｙ
１０８９はλｇｔｌｌ溶原ファージに使用し得る。Ｙ１
０８９中で中間溶原菌（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙｓｏ
ｇｅｎｓ）を調製する〔Ａｒａｓｕら，Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔａｌＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ（１９８７）６
４：２８１〜２８９〕場合には、培養物をλｇｔｌｌ組
換えファージで、１回の大量ファージ投与で感染させる
かまたはファージを含む溶菌化宿主と同時培養すること
により感染させる。好ましくは感染したＹ１０８９細胞
を誘導物質ＩＰＴＧの存在下に３７℃で増殖させると、
溶解欠陥宿主／ファージ系中で組換えタンパク質が構築
される。

【００２８】熱安定ポリメラーゼのゲノムＤＮＡ発現ラ
イブラリーの構築及びスクリーニング選択する遺伝子を
スクリーニングする最も一般的な方法は、（１）他の生
物由来の相同遺伝子にハイブリダイズする、（２）宿主
欠陥の相補性によって活性を選択する、（３）特異抗体
との反応性を検出する、または（４）酵素活性をスクリ
ーニングすることによる。抗体検出は、完全な活性酵素
ではなくて酵素の一部分の発現のみを必要とするので好
ましい。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ポリメラーゼ遺伝子の不安定性は、他の方法によってう
まく行くものをより難しくしたであろう。

【００２９】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡは、ランダ
ム断片または制限酵素断片としてゲノムライブラリーを
構築するのに使用することができるが、後者の方法が好
ましい。ＥｃｏＲＩ粒子はＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノ
ムＤＮＡから、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａ．ＬａｂｏｒａｔｏｔｙＭａ
ｎｕａｌ（１９８２）（この開示内容は参照により本明
細書の一部を構成するものとする）に記載のごとき標準
的なＤＮＡ制限法を使用して調製するのが好ましい。Ｂ
ａｍＨＩ、ＮｒｕＩ及びＸｂａＩといった他の制限酵素
を使用することもできる。

【００３０】抗体を使用してプラスミド及びファージの
両方をスクリーニングする方法が可能であるが〔Ｙｏｕ
ｎｇ及びＤａｖｉｓ，ＰＮＡＳ（１９８３）８０：１１
９４〜１１９８〕、本発明では、ファージ系がよりうま
く作用する傾向にあり、従って第１ライブラリーに好ま
しいという知見を得た。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ制御領
域がＥ．ｃｏｌｉ中で機能するかどうか不確実であるた
めに、λｇｔｌｌ及びλＺａｐＩＩのような全ての必要
な発現制御領域を与えるファージベクターが好ましい。
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡをλｇｔｌｌのＥｃｏＲ
Ｉ部位にクローニングすることにより、Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓポリメラーゼは、βガラクトシダーゼとの融合
タンパク質としてまたはそれ自体の内在性プロモーター
から発現させ得る。

【００３１】一旦形成したならば、Ｙｏｕｎｇ及びＤａ
ｖｉｓ，ＰＮＡＳ（１９８３），上掲に記載のごとく標
準的な抗体プラークハイブリダイゼーション方法を使用
し、マウス抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ抗血清で発現ライブラリーをスクリーニングする。

【００３２】発現ライブラリーをスクリーニングするの
に使用するマウス抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリ
メラーゼ抗血清は、Ｈａｒｌｏｗ及びＣａｎｅ，Ａｎｔ
ｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕ
ａｌ（１９８８）ＣＳＨＰｒｅｓｓ（この開示内容は
参照により本明細書の一部を構成するものとする）に記
載の方法のごとき標準的な方法を使用して調製すること
ができる。ほとんどの血清はＥ．ｃｏｌｉタンパク質に
反応するので、発現ライブラリーをスクリーニングする
際にバックグラウンド反応を減少させるために、Ｅ．ｃ
ｏｌｉタンパク質に対してＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリ
メラーゼ抗血清を標準的な方法によって予め吸収させる
ことが好ましい。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
抗血清に反応するファージを回収し、プラークを精製す
る〔Ｙｏｕｎｇ及びＤａｖｉｓ，ＰＮＡＳ（１９８
３），上掲〕。

【００３３】全遺伝子の一部分をコードするＴ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼＤＮＡは、例えばｐＢ
Ｒ３２２、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、Ｍ１３またはｐＵ
Ｃ１９中でサブクローニングすることができる。所望で
あれば、例えばＳａｎｇｅｒのチェインターミネーター
法（ｄｉｄｅｏｘｙｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｎｇｍｅｔｈｏｄ）〔Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．，Ｎｉｃｋ
ｌｅｎ，Ｓ．及びＣｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．，ＰＮＡＳ
（１９７７）７４：５４６３〜５４６７〕によってＤＮ
Ａ配列を決定し得る。

【００３４】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼのＤＮＡコード領域の同定及び発現Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列が得
られたことを決定する方法は幾つか存在する。これは例
えば、組換えＤＮＡによって産生されたタンパク質のア
ミノ末端配列を天然タンパク質と比較したり、組換えＤ
ＮＡが、天然Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼに特異的な抗体と結合するタンパク質を産生するか決
定するなどである。更に、Ｗａｎｇら，ＦＡＳＥＢＪ
ｏｕｒｎａｌ（１９８９）３：２０の研究は、ＤＮＡポ
リメラーゼ配列の所定の領域が特に高度に保存されてい
ることを示唆している。結果として、クローン化遺伝子
の推定アミノ酸配列を、ヒトＤＮＡポリメラーゼ及び
Ｅ．ｃｏｌｉファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼのよう
な既知のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列と比較する
ことにより、かかる領域の相同性が確定されれば、組換
えＤＮＡが実際にＤＮＡポリメラーゼをコードする強力
な証拠となる。

【００３５】一旦同定したならば、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、例
えばｐＥＴ３Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔまたはｐＵＣ
１９のようなＥ．ｃｏｌｉ由来のプラスミド、ｐＢＳ１
１０、ｐＴＰ５及びｐＣ１９４のようなＢａｃｉｌｌｕ
ｓＳｕｂｔｉｌｉｓ由来のプラスミド、ｐＳＨ１９及
びｐＳＨ１５のような酵母由来のプラスミド、λファー
ジのようなバクテリオファージ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのようなバクテリア、
レトロウイルスのような動物ウイルス、Ｂａｃｕｌｏｖ
ｉｒｕｓのような昆虫ウイルスのごとき適当な発現ベク
ター中にクローニングすることができる。

【００３６】前記したように本発明においては、Ｔ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮ
Ａは、図６に示したヌクレオチド１７７６〜３３８９に
広がる１６１４ｂｐのイントロンまたは介在配列を含
む。従ってＥ．ｃｏｌｉのような宿主細胞中で過剰発現
する前に、イントロンをコードするＤＮＡ配列を欠失さ
せるのが好ましい。ＤＮＡ配列を欠失させ、従ってイン
トロンをｉｎｖｉｔｒｏでスプライシングするのに使
用し得る多数の方法が当業者には公知である。１つの方
法は、スプライス部位または欠失されるべき領域近傍の
コード領域において唯一の制限酵素部位を同定すること
を含む。制限フラグメント間のギャップを架橋するため
の二重オリゴマーが合成される。アミノ末端制限フラグ
メントと、架橋オリゴと、カルボキシ末端制限フラグメ
ントからなる３つの部分を連結すると、イントロンが欠
失した完全な遺伝子となる。

【００３７】別の方法は上述の方法の変形であり、イン
トロン内ではあるがコード配列境界に近い唯一の部位を
制限酵素で切断することにより、イントロンの大部分を
欠失させる。イントロンの大部分の欠失部を含む直線形
プラスミドを合わせて連結する。ｆ１へルパーファージ
ＩＲ１で重感染することによるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ベクター組換え体から一重鎖ファージを産生させる。一
重鎖オリゴマーを所望の最終配列を用いて合成し、一部
欠失イントロンファージＤＮＡにアニールする。こうし
てイントロンの残りの部分が外にループ化される。Ｅ．
ｃｏｌｉ株ＣＪ２３６中で原ファージを産生させること
により、Ｋｕｎｋｅｌの突然変異誘発法〔Ｍｅｔｈｏｄ
ｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ１５４：３６７（１
９８７）〕を使用してイントロンが完全欠失した短縮体
（ｃｏｎｔｒｕｃｔｓ）を回収することができる。

【００３８】イントロンを欠失させる更に別の方法はＤ
ＮＡ増幅を使用する〔例えばＭａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＭａｎｕａｌ（１９８９）第２巻，第２版参
照，この開示内容は参照により本明細書の一部を構成す
るものとする〕。簡単に言えば、遺伝子のアミノ側半分
及びカルボキシル側半分を増幅し、次いで連結するため
のプライマーを産生する。

【００３９】上述の方法を使用してイントロンをｉｎ
ｖｉｔｒｏで欠失させたならば、天然スプライス部位は
不明となり得る。従って当業者には、活性酵素を産生す
る結果となろう幾つかの人工的なスプライス部位が存在
することが予想されよう。

【００４０】一旦イントロンを欠失させたならば、例え
ばＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼをその内
在性調節要素から分離し、次いでポリメラーゼ遺伝子
を、Ｔ７発現ベクターのような極めて正確に制御された
プロモーターに操作的に連結することにより、Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを過剰発現させるこ
とができる〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ（１９８
７）５６：１２５〜１３５，この論文は参照により本明
細書の一部を構成するものとする〕。強力なプロモータ
ーの挿入は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の両末端近傍の都合の良い制限標的部位とベク
ター上のプロモーター近傍の相和性のある制限標的部位
とを同定するか、または特定部位の突然変異誘発〔Ｋｕ
ｎｋｅｌ（１９８４），上掲〕を使用して制限標的部位
を生成し、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子をベクター内に、かかる強力プロモーターの転写
及び翻訳制御下にあるような向きで移入することにより
行なうことができる。

【００４１】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼは、遺伝子の発現を増大するためのＴ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の上流にある強力なリ
ボソーム結合部位を使用することにより過剰発現させる
こともできる〔Ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎｏ，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７
４）７１：１３４２〜１３４６参照，この論文は参照
により本明細書の一部を構成するものとする〕。

【００４２】組換えベクターは、形質転換及びファージ
感染の標準的な方法を使用して適当な宿主内に導入す
る。例えばＣｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，ＰＮＡＳ（１９７
２）６９：２１１０（この開示内容は参照により本明細
書の一部を構成するものとする）に記載のような塩化カ
ルシウム法をＥ．ｃｏｌｉに対して使用する。Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓの形質転換は、Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ら，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒａｎｄＧｅｎｅｒａｌＧｅｎｅｔｉｃ
ｓ（１９７９）１６８：１１１（この開示内容は参照に
より本明細書の一部を構成するものとする）の方法に従
って実施される。酵母の形質転換は、Ｐａｒｅｎｔら，
Ｙｅａｓｔ（１９８５）１：８３〜１３８（この開示内
容は参照により本明細書の一部を構成するものとする）
の方法に従って実施される。所定の植物細胞は、Ｓｈａ
ｗ，Ｃ．Ｈ．らＧｅｎｅ（１９８３）２３：３１５（こ
の開示内容は参照により本明細書の一部を構成するもの
とする）に記載の方法に従ってＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ
ｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓで形質転換することがで
きる。動物細胞の形質転換は、例えばＶｉｒｏｌｏｇｙ
（１９７３）５２：４５６（この開示内容は参照により
本明細書の一部を構成するものとする）に記載の方法に
従って実施される。Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓによる昆虫
細胞の形質転換は、例えばＢｉｏｔｅｏｈｎｏｌｏｇｙ
（１９８８）６：４７（この開示内容は参照により本明
細書の一部を構成するものとする）に記載の方法に従っ
て実施される。

【００４３】形質転換体は、使用する宿主細胞に従って
かかる細胞に適した標準的な方法を使用して培養する。
例えばＥ．ｃｏｌｉを培養するためには、３０℃〜４２
℃のＬＢ培地（Ｍａｎｉａｔｉｓ，上掲）中で中程度の
対数増殖期または定常期になるまで細胞を増殖させる。

【００４４】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼは形質転換宿主細胞培養系から、例えば培養細胞また
は培養液から抽出することにより単離及び精製すること
ができる。

【００４５】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼを培養細胞から抽出する場合には、培養後に細胞を例
えば遠心分離のような当業者には公知の方法によって回
収する。次いで回収した細胞を適当な緩衝液中に懸濁さ
せ、超音波処理、リゾチーム及び／または凍結−融解に
よって崩壊する。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメ
ラーゼを含む粗抽出物を遠心分離及び／または濾過によ
って得る。

【００４６】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼを培養液中に、単独で、または例えばマルトース結合
タンパク質のような分泌タンパク質を含む融合タンパク
質として分泌させる場合には、上清を細胞から当業者に
は公知の方法で分離する。

【００４７】培養液上清または細胞抽出物中に含まれる
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの分離及び
精製は、上述の方法によって、または公知の分離及び精
製方法を適当に組合せた方法によって実施することがで
きる。かかる方法としては例えば、塩沈澱及び溶剤沈澱
のような溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル
濾過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のよ
うな分子量の相違を利用する方法、イオン交換カラムク
ロマトグラフィーのような電荷の相違を利用する方法、
アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和
性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーの
ような疎水性の相違を利用する方法、並びに、等電点電
気泳動のような等電点の相違を利用する方法を挙げるこ
とができる。

【００４８】組換え酵素を単離及び精製する１つの好ま
しい方法は、以下のような多段階方法を使用して行われ
る。

【００４９】まず細胞を、凍結させてあればそれを融解
し、緩衝液Ａ（１００ｍＭＮａＣｌ，２５ｍＭＴｒ
ｉｓｐＨ７．５，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリ
セロール，０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のよ
うな適当な緩衝液中に懸濁させ、溶解し、遠心分離す
る。次いで、透明になった粗抽出物を約３０分間で７５
℃に加熱する。変性タンパク質を遠心分離によって除去
する。次いで上清を、Ａｆｆｉｇｅｌｂｌｕｅカラム
（Ｂｉｏｒａｄ）のような核酸に結合するタンパク質に
高い親和性を示すカラムに通す。上清溶液中に存在する
核酸と、多くのタンパク質とがカラムを通過し、カラム
容積の数倍量の低塩緩衝液（ｐＨ約７．０）でカラムを
洗浄することにより除去される。洗浄後、緩衝液Ａ中の
０．１Ｍ〜１．５ＭＮａＣｌのような直線濃度勾配で
酵素を溶出する。活性フラクションをプールし、透析
し、ホスホセルロースカラムに掛ける。このカラムを洗
浄し、緩衝液Ｂ（１００ＭＮａＣｌ，１５ｍＭＫ_３
ＰＯ_４，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０％グリセロール，
０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，ｐＨ６．８）中
の０．１〜１．０ＭＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出す
る。フラクションを回収し、各フラクションにＢＳＡを
加える。ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するフラクション
をプールする。得られたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ
ポリメラーゼは、前述の標準的な生成物精製方法によっ
て更に精製することができる。

【００５０】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼの安定化及び使用長期保存するためには、本発明の熱安定酵素を緩衝液：
０．０５ＭＮａＣｌ，０．０１ＭＫ_３ＰＯ_４（ｐＨ
７．４），０．１ｍＭＥＤＴＡ及び５０％グリセロー
ル中で−２０℃で保存する。

【００５１】本発明のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼは、かかる酵素が必要であるまたは望ましい
任意の目的に使用することができる。例えば、ｃＤＮＡ
クローニングにおける第２鎖ｃＤＮＡ合成及びＤＮＡ配
列決定を含む組換えＤＮＡ技術において使用し得る〔Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら，上掲参照〕。

【００５２】本発明のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼを化学的または遺伝学的に変性して３’−
５’エキソヌクレアーゼ機能を失活し、このような変性
酵素が望ましい任意の目的、例えばＤＮＡ配列決定に使
用することができる。

【００５３】例えば、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼ遺伝子にランダムに突然変異原を与え、次い
で、エキソヌクレアーゼ活性を失っているがポリメラー
ゼ活性は失っていない突然変異体をスクリーニングする
ことにより、遺伝学的に変性したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼを単離することができる。或い
は、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ＰＮＡＳ（１９８５）８
２：４８８〜４９２（この開示内容は参照により本明細
書の一部を構成するものとする）に記載の特定部位の突
然変異誘発技術を使用し、遺伝学的に変性したＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを単離することも好
ましい。

【００５４】更に本発明のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａポリメラーゼは、例えば米国特許第４，６８３，１９
５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５
９号に記載の方法によってＤＮＡを増幅するために使用
することもできる。

【００５５】実用化に好ましい本発明の実施例を説明す
るために以下の実施例を与える。これら実施例は説明の
ためのものであって、請求の範囲に記載したもの以外に
本発明は制限されないことを理解されたい。

【００５６】実施例ＩＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来の
熱安定ＤＮＡポリメラーゼの精製Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ株ＮＳ
−Ｃ（ＤＳＭ番号５４７３）を、１００リットル発酵槽
において１０ｇ／ｌの硫黄成分を含むＢｅｌｋｉｎら
（上掲）によって記載された培地中で最高維持温度約８
０℃で２日間増殖させた。細胞を室温に冷却し、未使用
の硫黄をデカントすることによって分離し、遠心分離に
よって回収し、−７０℃で保存した。細胞の収量は１リ
ットル当たり０．８ｇであった。

【００５７】上述のごとき得られた細胞１８３ｇを、
０．１ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ（１０ｍＭＫ_３Ｐ
Ｏ_４緩衝液，ｐＨ７．４；１．０ｍＭＥＤＴＡ，１．
０ｍＭβ−メルカプトエタノール）５５０ｍｌ中に懸濁
させ、４℃で５分間超音波処理した。溶解物を４℃，１
５，０００ｇで３０分間遠心分離した。上清を４７０ｍ
ｌのＡｆｆｉｇｅｌｂｌｕｅカラム（Ｂｉｏｒａｄ）
に通した。次いでカラムを０．１ＭＮａＣｌを含む緩
衝液Ａ１０００ｍｌで洗浄し、２０００ｍｌの緩衝液Ａ
中の０．１〜２．０ＭＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出し
た。ＤＮＡポリメラーゼは約１．３ＭＮａＣｌに単一
のピークとして溶出し、カラムに掛けた活性の８０％を
占めた。ＤＮＡポリメラーゼ（４３５ｍｌ）のピーク活
性を４リツトルの緩衝液Ａで透析し、次いで０．１Ｍ
Ｎａｃｌを含む緩衝液Ａで平衡化した８０ｍｌのホスホ
セルロースカラムに掛けた。カラムを０．１ＭＮａＣ
ｌを含む緩衝液Ａ１６０ｍｌで洗浄し、１０００ｍｌ
の緩衝液Ａ中の０．１〜１．０ＭＮａＣｌ直線濃度勾
配で酵素活性を溶出した。活性は０．６ＭＮａＣｌに
単一のピークとして溶出し、カラムに掛けた活性の７４
％を占めた。プールした活性（１５０ｍｌ）を９００ｍ
ｌの緩衝液Ａに対して透析し、４２ｍｌのＤＮＡ−セル
ロースカラムに掛けた。カラムを０．１ＭＮａＣｌを
含む緩衝液Ａ８４ｍｌで洗浄し、緩衝液Ａ中の０．１〜
１．０ＭＮａＣｌ直線濃度勾配で酵素活性を溶出し
た。ＤＮＡポリメラーゼ活性は０．３ＭＮａＣｌに単
一のピークとして溶出し、カラムに掛けた活性の８０％
を占めた。活性をプールし（９３ｍｌ）、プールしたフ
ラクションを、０．０５ＭＮａＣｌを含む緩衝液Ａ２
リットルに対して透析し、１．０ｍｌＨＰＬＣｍｏ
ｎｏ−Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に掛けた。ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性を、１００ｍｌの緩衝液Ａ中の０．
０５Ｍ〜１．０ＭＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。
ＤＮＡポリメラーゼ活性は０．１ＭＮａＣｌに単一の
ピークとして溶出し、カラムに掛けた活性の１６％を占
めた。プールしたフラクション（３．０ｍｌ）を緩衝液
Ａで希釈して６ｍｌとし、１．０ｍｌＨＰＬＣｍｏ
ｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に掛け、１００
ｍｌの緩衝液Ａ中の０．０５〜１．０ＭＮａＣｌ線形
勾配で溶出した。活性は０．１９ＭＮａＣｌに単一の
ピークとして溶出し、カラムに掛けた活性の７５％を占
めた。

【００５８】ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と、これに次ぐＣｏｏｍａｓｓｉ
ｅＢｌｕｅより敏感なコロイド染色（ＩＳＳＰｒｏ
ｂｌｕｅ）使用のタンパク質染色〔Ｎｅｕｈｏｆｆら，
Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｉｓｉｓ（１９８８）９：２
５５〜２６２〕とによって、ＤＮＡポリメラーゼ調製物
が純度約５０％であることが決定された。９０，０００
〜９５，０００ダルトンに１つのバンドと、１８，００
０ダルトンに二重線のバンドとの２つの主要バンドが存
在した（図１Ａ）。約８０，０００〜８５，０００ダル
トンには極めて小さなバンドが見える。この精製レベル
ではポリメラーゼは、ポリメラーゼタンパク質１ｍｇ当
たりのポリメラーゼ活性３０，０００〜５０，０００単
位という特異的活性を有した。個々のＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルにおいて精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポ
リメラーゼを含むゲルレーンを１８個の薄片に裁断する
ことにより、９０，０００〜９５，０００ダルトンにお
ける染色バンドの同定を検証した。０．１％ＳＤＳ及び
１００μｇ／ｍｌＢＳＡを含む緩衝液中でゲル薄片を
破砕することにより、埋め込まれていたタンパク質をゲ
ルから溶出した。溶出したタンパク質を、グアニジンＨ
Ｃｌに晒すことにより変性し、次いでＨａｇｅｒ及びＢ
ｕｒｇｅｓｓ，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ（１９８０）１０９：７６〜８６に記載のご
とく変性剤を希釈することにより再生した。既に記載さ
れているように放射性標識^３２Ｐ−ｄＣＴＰの酸不溶性
ＤＮＡ内への取込み（既存文献の通り）によってポリメ
ラーゼ活性を測定し、（実施例Ｖに記載のごとき、^３Ｈ
標識ＤＮＡの酸可溶性形態への遊離によって測定され
る）エキソヌクレアーゼ活性を測定した。図１Ｂに示す
ように、９０，０００〜９５，０００ダルトンのバンド
のみが、有意なポリメラーゼ活性またはエキソヌクレア
ーゼ活性を示した。

【００５９】ＤＮＡポリメラーゼ調製物を、０．０５Ｍ
ＮａＣｌを含む緩衝液Ａに対して透析した。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって決定すると、１８，０００ダルトンの
タンパク質の多くが溶液から沈澱した。タンパク質定量
分析によってＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼの収量は０．５ｍｇであると決定され、これは、出発
粗抽出物中に存在した全活性の６．５％を占めた。

【００６０】精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
を電気泳動し、タンパク質検出のための既に記載されて
いるＣｏｏｍａｓｓｉｅＢｌｕｅまたはコロィド染色
（ＩＳＳＰｒｏｂｌｕｅ）で染色した。１つの濃く染
色されたタンパク質のバンドが９０，０００〜９５，０
００ダルトンに見られた。この分子量の決定は、同じゲ
ル上での以下のマーカータンパク質の移動と比較する
（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ）ことにより行なった：ミオシン２００，
０００ダルトン；ホスホリラーゼＢ９７，４００ダル
トン；ＢＳＡ６８，０００ダルトン；オボアルブミン
４３，０００ダルトン；カルボニックアンヒドラーゼ
２９，０００ダルトン；ｂ−ラクトグロブリン１８，
４００ダルトン；リゾチーム１４，３００ダルトン。

【００６１】実施例ＩＩＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のク
ローニングＡ．マウス抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ抗血清の生産マウス免疫感作（実施例Ｉの方法で得られた）ポリメラーゼタンパク質
０．４ｍｇを含む溶液３ｍｌを４℃で約０．３ｍｌに濃
縮し、２匹のマウスに接種した。精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓポリメラーゼ調製物はＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌ
ｕｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて約８５〜９５ｋ
Ｄａｌ、７５〜８５ｋＤａｌ及び１０〜２５ｋＤａｌの
二重線の４つのバンドを構成した。実施例Ｉに示したよ
うに、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは約９０〜
９５ｋＤａｌである。両方のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポ
リメラーゼ抗血清が、免疫原中に存在する４つ全てのタ
ンパク質を認識した。

【００６２】免疫感作方法は以下の通りである。マウス
１に、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）中の上述
のごとく調製したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
２０μｇを腹腔内（ＩＰ）免疫した。７日後、両マウス
にＦＣＡ中のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ５０
μｇをＩＰ免疫した。２７日後両マウスに、マウス１に
は不完全フロイントアジュバント中のＴ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓポリメラーゼ３０μｇを、マウス２にはＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ５０μｇをＩＰ免疫した。
２週間後にマウス１から、２０日後にマウス２から採血
した。この血液から標準的な方法〔Ｈａｒｌｏｗ及びＬ
ａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙＭａｎｕａｌ（１９８８）〕によって血清を調製
した。

【００６３】抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗
血清を、１％ＢＳＡ，０．１％アジ化ナトリウム，０．
１％ＰＭＳＦを含むＴＢＳＴＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ，０．２％Ｔｗｅｅ
ｎ２０及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で
希釈した。

【００６４】Ｅ．Ｃｏｌｉ溶解物に対する抗Ｔ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓボリメラーゼ抗血清の予備吸収ほとんどの血清がＥ．ｃｏｌｉに反応するので、ライブ
ラリーまたは組換え抗原をスクリーニングする際のバッ
クグラウンド反応を減少するために、Ｅ．ｃｏｌｉタン
パク質に対するＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗
血清を以下の方法によって予め吸収させた。まずＥ．ｃ
ｏｌｉ細胞ペーストを融解し、音波処理によって溶解
し、可溶性タンパク質をＡｆｆｉｇｅｌ１０（Ｂｉｏ
ｒａｄ）に製造業者指示に従って結合させた。Ｅ．ｃｏ
ｌｉ樹脂４ｍｌをＴＢＳ（洗剤を含まないＴＢＳＴＴ）
で２回洗浄し、血清０．３５ｍｌをＴＢＳＴＴ，１％Ｂ
ＳＡ，０．１％アジ化ナトリウムで約１〜５倍に希釈
し、樹脂と４℃で一晩混合した。遠心分離することによ
り樹脂をペレット化し、それを洗浄した。予め吸収させ
た血清を回収したものを１〜１７倍に希釈し、使用する
まで−２０℃で凍結保存した。

【００６５】スクリーニングにおいては、予め吸収させ
た血清を上述のごとく希釈して終濃度１：２００とし
た。

【００６６】Ｂ．Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
遺伝子用プローブの同定 λｇｔｌｌ発現ライブラリーの構築 λｇｔｌｌ発現ライブラリーを以下のように免疫学的ス
クリーニングし、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
遺伝子用プローブを得た。

【００６７】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡを以下のよ
うに一部消化した。４μｇのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡを、４０μｌの反応用ＥｃｏＲＩ緩衝液（ＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液＝５０ｍＭＮａＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ７．５，２０ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭＢＭ
Ｅ）中の５単位のＥｃｏＲＩを用い３７℃で消化した。
３μｌの１００ｍＭＥＤＴＡを１５μｌ試料の各々
に、３０、４５及び６０分後に加えた。２μｇのＴ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡを、２０μｌの反応用ＥｃｏＲ
Ｉ緩衝液中の２０単位のＥｃｏＲＩで３７℃で９０分間
消化し、２μｌの１００ｍＭＥＤＴＡを加えることに
より反応を停止した。各消化生成物０．２μｇをアガロ
ースゲル上で電気泳動し、消化の程度をモニターした。
約３μｇのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡＥｃｏＲＩ
粒子（６０分間消化生成物からは１４μｌ及び９０分間
消化生成物からは１９μｌ）をプールして“ＥｃｏＲＩ
プール”を形成し、６５℃で１５分間加熱した。

【００６８】ＥｃｏＲＩプール０．５μｌを、反応用標
準連結緩衝液（連結緩衝液＝６６ｍＭＴｒｉｓｐＨ
７．５，１ｍＭＡＴＰ，１ｍＭスペルミジン，１０
ｍＭＭｇＣｌ_２，１５ｍＭＤＴＴ及び２ｍｇ／ｍｌゼ
ラチン）５μｌ及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮｏ．２０２）０．５μ
ｌ中でＥｃｏＲＩ切断の細菌性アルカリホスファターゼ
処理したλｇｔｌｌＤＮＡ０．２８μｇに連結した。こ
の連結は１６℃で一晩かけて行なった。この連結反応生
成物４μｌを、製造業者指示に従ってＧｉｇａｐａｃｋ
Ｇｏｌｄ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用してパッケー
ジングした。室温で２時間インキュベートした後、パッ
ケージングしたファージをＳＭ（ＳＭ＝１００ｍＭＮ
ａＣｌ，８ｍＭＭｇＳＯ_４，５０ｍＭＴｒｉｓｐ
Ｈ７．５，０．０１％ゼラチン）５００μｌとクロロホ
ルム３滴とで希釈した。パッケージングしたＥｃｏＲＩ
ライブラリーを試料Ｖ６−１と名付け、これは１．１×
１０^５個の個別ファージからなった。ファージ感染には
Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ１５７８を使用した。

【００６９】λｇｔｌｌ発現ライブラリーの免疫学的ス
クリーニング上記生産した抗血清の１：２００希釈物で第１ファージ
ライブラリーをスクリーニングした〔Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．
Ａ．及びＲ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
３）２２２：７７８〜７８２〕。抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓＤＮＡポリメラーゼ抗血清に反応した３６のファー
ジ（Ｖ１０−２２〜Ｖ１０−５５）を回収し、１６のフ
ァージをプラーク精製した。

【００７０】Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２株Ｙ１０８９を溶原
化するために１６の抗体陽性ファージを使用した。溶原
体を熱安定ＤＮＡポリメラーゼ活性についてスクリーニ
ングしたが、活性は検出されなかった。

【００７１】これら１６の溶解物について得られたウェ
スタンブロット〔Ｔｏｗｂｉｎら，ＰＮＡＳ（１９７
９）７６：４３５０〜４３５４〕を、抗Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓポリメラーゼ抗血清でプローブした。Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗血清に反応したこれら溶
解物由来の全てのタンパク質はＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ポリメラーゼより小さく、更にβ−ガラクトシダーゼよ
りも小さかった。これは、いずれもβ−ガラクトシダー
ゼとの融合タンパク質ではないことを示唆している。

【００７２】全抗血清由来のエピトープ特異抗体をアフ
ィニティー精製するために、１６の抗体陽性ファージの
うちの８つを使用した〔Ｂｅａｌｌ及びＭｉｔｃｈｅｌ
ｌ，Ｊ．ＩｍｍｕｍｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ
（１９８６）８６：２１７〜２２３〕。

【００７３】８種のアフィニティー精製血清を使用し、
精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ及びＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓ粗溶解物の両方のウェスタンプロットを
プローブした。ＮＥＢ６１８プラークから精製した抗
体は、精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ及び
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ粗溶解物中でＴ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓポリメラーゼと特異的に反応した。このことは、
ファージＮＥＢ６１８が、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポ
リメラーゼのアミノ末端の約３８ｋＤａｌをコードする
強力な証拠となった。

【００７４】ファージＮＥＢ６１８の特性及びＥｃｏ
ＲＩ挿入体のサブクローニングウェスタンプロット解析は、ファージＮＥＢ６１８
が、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ抗血清を結合
する大きさが約１５〜４０ｋＤａｌの幾つかのペプチド
を合成することを示唆した。ファージＮＥＢ６１８由
来のＤＮＡを培養液から標準的な方法〔Ｍａｎｉａｔｉ
ｓら，上掲〕で精製した。ＮＥＢ６１８ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩで消化すると１．３及び１．７ｋｂの断片を生じ
た。ＮＥＢ６１８ＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化断片をＥ
ｃｏＲＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＤＮＡに
連結した。２０μｇのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋を
４０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の４０単位のＥｃｏＲＩ
で、まず３７℃で３時間、次いで６５℃で１５分間消化
した。ＮＥＢ６１８ＤＮＡ１０μｇを４０μｌの
ＥｃｏＲＩ緩衝液中の４０単位のＥｃｏＲＩで、まず３
７℃で７５分間、次いで６５℃で１５分間消化した。Ｅ
ｃｏＲＩで切断したＮＥＢ６１８ＤＮＡ１．７５μ
ｇをＥｃｏＲＩで切断したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ
＋２０ｎｇに、１０μｌの連結用緩衝液中の１μｌのＴ
４ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏ
ｌａｂｓＮｏ．２０２）で連結した。連結は１６℃で
一晩かけて行なった。ＪＭ１０１ＣａＣｌコンピテン
ト細胞（Ｍａｎｉａｔｉｓら，上掲〕を５μｌの連結用
混合物で形質転換した。検査した２４の組換え体のう
ち、１つを除き全てが１．７ｋｂの断片を含んでおり、
クローンＶ２７−５．４は１．３ｋｂのＴ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓＤＮＡ断片を含んでいた。

【００７５】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼマウ
ス抗血清由来の抗体を、（１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
をコードする）Ｖ２７−５．４由来の溶解物及び（ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔにおいて１．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片をコードする）Ｖ２７−５．７由来の溶解物において
前述のごとくアフィニティー精製し、精製または粗の
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのいずれかを含む
ウェスタンブロットストリップと反応させた。Ｖ２７−
５．４の溶解物上で選択された抗体は、粗及び精製の両
調製物においてＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼと
反応した。更に、天然Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラ
ーゼのＮ末端タンパク質配列から最初の３つのアミノ酸
（メチオニン−イソロイシン−ロイシン）は、Ｖ２７−
５．４クローンにおける推定読取り枠（ｏｐｅｎｒｅ
ａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）（ＯＲＭ）と同じであった。

【００７６】上記結果から、Ｖ２７−５．４はＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端をコードする
と結論される。Ｖ２７−５．４の１．３ｋｂのＥｃｏＲ
Ｉ断片は図６のヌクレオチド１〜１２７４からなる。挿
入ＤＮＡは、このクローンによって合成される最大のペ
プチドをコードするのに十分に大きいが、全Ｔ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓポリメラーゼには十分の大きさでない。

【００７７】Ｃ．Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ第二ライブラ
リーの構築及びスクリーニング上述の抗体スクリーニングは、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ポリメラーゼのアミノ末端側半分をコードするＤＮＡ断
片を同定した。全遺伝子をコードするのに十分大きい断
片を見付けるために、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡの
制限消化物を、クローンＶ２７−５．４に含まれるポリ
メラーゼ遺伝子のアミノ末端側半分でプローブした。制
限消化は、以下の酵素を１．５〜２００Ｕ加えた制限酵
素緩衝液（ＲＥＢ，制限酵素緩衝液＝５０ｍＭＮａＣ
ｌ，１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５，２０ｍＭＭｇ
Ｃｌ_２，１０ｍＭＢＭＥ）３９μｌ中にＴ．ｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡ１．２μｇを含むマスターミックスを
使用し、別個の試験管内で実施した：１．５ＵＡｖｒ
ＩＩ，９ＵＥａｅＩ，１０ＵＮｈｅＩ，２０ＵＮｏ
ｔＩ，９ＵＳｐｅＩ，２０ＵＸｈｏＩ，３０ＵＸ
ｂａＩ，２０ＵＳａｃＩ，１０ＵＢａｍＨＩ，２０Ｕ
ＣｌａＩ，２０ＵＨｉｎｄＩＩＩ，２０ＵＰｓｔ
Ｉ，１２ＵＮａｅＩ，１０ＵＳｃａＩ，１２ＵＸ
ｍｎＩ，２０ＵＥｃｏＲＶ，２０ＵＳａＩ，２０Ｕ
ＥｃｏＲＩ，２００ＵＥａｇＩ，２０ＵＤｒａ
Ｉ，５ＵＨａｐＩ，８ＵＮｒｕＩ，４ＵＳｎａＢ
Ｉ，８ＵＳｔｕＩ，１０ＵＢｃｌＩ，８ＵＢｇｌ
ＩＩ，１０ＵＲｓａＩ，１０ＵＨａｅＩＩＩ，８Ｕ
ＡｌｕＩ，４ＵＨｉｎｃＩＩ，１０ＵＰｖｕＩＩ，
６ＵＳｓｐＩ。１μｌの１０ｍｇ／ｍｌＢＳＡをＨ
ｉｎｃＩＩ消化物に加えた。緩衝液中のＮａＣｌを０ｍ
Ｍとしたことを除き、ＢａｌＩ消化物を前述のごとく調
製した。ＢｃｌＩ消化物は５０℃で、それ以外の全ての
消化物は３７℃で一晩インキュベートした。消化物をア
ガロースゲル上で電気泳動し、ＮＣに移入した〔Ｓｏｕ
ｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７５）９
８：５０３〜５１７〕。濾過物を放射性標識Ｖ２７−
５．４ＤＮＡでプローブし、オートラジオグラフィー
によってハイブリダイゼーションを検出した。ほとんど
の消化物においてＶ２７−５．４ＤＮＡが２０ｋｂより
大きい断片にハイブリダイズした。但し、ＢａｍＨＩ
（約１４ｋｂ）、ＥｃｏＲＩ（１．３ｋｂ）、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ（約２．４，５．４ｋｂ）、ＸｂａＩ（約８ｋ
ｂ）、ＣｌａＩ（約４．４，５．５ｋｂ）、ＢａｌＩ
（約８．５ｋｂ）、ＨｉｎｃＩＩ（約２．１，約２．４
ｋｂ）、ＮｒｕＩ（約５．５ｋｂ）、ＢｇｌＩＩ（約
２．９ｋｂ）、ＨａｅＩＩＩ（約１．３，約１．４ｋ
ｂ）及び多数の小バンドを与えたＲｓａＩは例外であっ
た。

【００７８】天然タンパク質の大きさをもとにすると
２．４〜３ｋｂと推算される全ポリメラーゼ遺伝子をコ
ードするのに十分に大きい単一の断片を与えた消化物
は、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＮｒｕＩであった。

【００７９】ＢａｍＨＩライブラリー λＤａｓｈＩＩを使用してＢａｍＨＩゲノムλを構築し
た。λＤａｓｈＩＩは、１０〜２０ｋｂのＢａｍＨＩ
ＤＮＡ断片をクローニングするのに使用し得るＢａｍＨ
Ｉ置換ベクターである。前述のごとくＢａｍＨＩで消化
したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムＤＮＡ２５〜７５
ｎｇを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．５μｌを含む標準連
結用緩衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
Ｎｏ．２０２）５μｌ中でＢａｍＨＩで消化した仔ウ
シ腸ホスファターゼ処理λＤａｓｈＩＩＤＮＡ０．
５μｇに連結した。連結反応物３μｌを前述のごとくパ
ッケージングした（ＧｉｇａｐａｃｋＰｌｕｓ，Ｓｔ
ｒａｔａｇｅｎｅ）。λＤａｓｈＩＩライブラリー由来
の８，０００のプラークのプラークリフトを、クローン
Ｖ２７−５．４由来のゲル精製した１．３ｋｂの標識Ｅ
ｃｏＲＩ断片（Ｍａｎｉａｔｉｓら，上掲）でプローブ
した。２．５％のファージが１．３ｋｂＥｃｏＲＩ
ＤＮＡ断片にハイブリダイズし、そのうちの２つをプラ
ーク精製した（クローンλＮＥＢ６１９及びλＶ５６
−９）。両ファージとも１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に
ハイブリダイズし、約８ｋｂのＸｂａＩ断片及び約５．
５ｋｂのＮｒｕＩ断片を含む１２〜１５ｋｂのＢａｍＨ
Ｉ断片を含んでいた。ＢａｍＨＩ挿入体をｐＢＲ３２２
内にサブクローニングした。この断片を含むコロニーは
増殖が極めて乏しく、前述のポリメラーゼアッセイに基
づくと、検出可能なレベルの熱安定ＤＮＡポリメラーゼ
を産生しなかった。

【００８０】ＸｂａＩライブラリーＸｂａＩで消化したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓをｐＵＣ１
９のＸｂａＩ部位にクローニングした。コロニーリフト
を、放射性標識Ｖ２７−５．４ＤＮＡでプローブした。
陽性クローンは検出されなかった。

【００８１】λＮＥＢ６１９（ＢａｍＨＩライブラリ
ー）中のＢａｍＨＩ挿入体由来のＸｂａＩ断片をｐＵＣ
１９のＸｂａＩ部位にサブクローニングした。ＢａｍＨ
Ｉで消化したＮＥＢ６１９ＤＮＡ約０．３μｇ
を、ＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１９ＤＮＡ０．１μ
ｇに、標準連結用緩衝液２０μｌ中のＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ（ｎｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓＮ
ｏ．２０２）２μｌを使用して連結した。連結体を１６
℃で一晩インキュベートした。ＣａＣｌコンピテントＪ
Ｍ１０１細胞及びＸＬ−１細胞を、連結用ミックス５μ
ｌで形質転換し、３７℃で一晩インキュベートした（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら，上掲）。コロニーリフトを、Ｖ２７
−５．４ＤＮＡ由来の精製した１．３ｋｂの放射性標識
ＥｃｏＲＩ断片でプローブしたが、陽性物は検出されな
かった。コンピテントＲＲＩ細胞を連結用ミックス１０
μｌで形質転換し、３０℃で一晩インキュベートした。
微小コロニーを回収し、ミニプラスミド調製物（ｂｏｉ
ｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ，Ｍａｎｉａｔｉｓら，上
掲）を分析した。これらクローンのほとんどが約８ｋｂ
のＸｂａＩ断片を含んでいた。この後者の実験は理論的
には、ＢａｍＨＩクローンは増殖が不十分であり、やは
りゆっくりと増殖するＸｂａＩコロニー由来のＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを
単離する機会が増えるであろうと説明される。更に、イ
ンキュベーション温度がよリ低いと、細胞１個当たりの
ｐＵＣ１９プラスミドのコピーがより少ない結果とな
る。かかる帰結は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラー
ゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉとって有害である証拠を与える
ものである。前述のポリメラーゼ活性アッセイを行なっ
たが、かかるクローンにおいては熱安定ポリメラーゼ活
性は検出されなかった。制限解析は、ＸｂａＩクローン
が全ポリメラーゼ遺伝子を含むであろうことを示唆した
（図２参照）。

【００８２】ＮｒｕＩライブラリーＮｒｕＩで切断したＮＥＢ６１９ＤＮＡ（前記Ｂａ
ｍＨＩライブラリー）約０．３μｇを、ＨｉｎｃＩＩで
切断したｐＵＣ１９ＤＮＡ０．１μｇに、ＸｂａＩ
ライブラリーに対して記載したのと全く同様に連結し
た。ここでも、細胞を３７℃でインキュベートしたとき
にはハイブリダイゼーションによる陽性は認められなか
ったが、形質転換体を３０℃でインキュベートすると多
数の微小コロニーが認められた。かかる微小コロニーの
大部分は約５．５ｋｂのＮｒｕＩ挿入体を含んでいた。
前述のポリメラーゼ活性アッセイを行なったが、かかる
コロニーにおいて熱安定ポリメラーゼ活性は検出されな
かった。かかるコロニーの解析により、Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓポリメラーゼ転写の方向がｐＵＣ１９における
ｌａｃＺと同じであった場合は、コロニーは３７℃で増
殖せず、かなり不安定であることが判った。しかしなが
ら、クローンＮｒｕ２１におけるようにＴ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓポリメラーゼ転写の方向がｐＵＣ１９における
ｌａｃＺと反対であるコロニーはより安定であった。こ
のことは、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの転写
がＥ．ｃｏｌｉに不利であることを示しており、全遺伝
子をクローニングするのがなぜこれほど難しいかを説明
するものである。制限マッピング解析は、ＮｒｕＩクロ
ーンが全ポリメラーゼ遺伝子を含むであろうことを示唆
した（図２参照）。

【００８３】ポリメラーゼの直接クローニングに係わる
結論Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓは約９０〜９５ｋＤａｌであ
り、全遺伝子をコードするのに約２．４〜３．０ｋｂの
ＤＮＡを必要とするであろう。前述のＢａｍＨＩ、Ｘｂ
ａＩ及びＮｒｕＩクローンにおいて認められた、Ｔ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子のアミノ末端をコ
ードする１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の制限マッピング
解析は、３つ全てのクローンが全ポリメラーゼ遺伝子を
含むことを示唆している。これらのより大きなクローン
の全てはＥ．ｃｏｌｉ中で不安定であった。従って、ポ
リメラーゼをクローニングする以下のような別の方法を
試験した。

【００８４】Ｄ．Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
遺伝子の第２半片のクローニング全Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子をＥ．ｃ
ｏｌｉ中でその内在制御下にクローニングした場合、遺
伝子中に突然変異が生起すると考えられている。不活性
突然変異体の選別を回避するために、各々が独立に不活
性であり、従って選択されない２つ以上の断片でＴ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓゲノムからポリメラーゼ遺伝子をクロ
ーニングした。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓゲノムの制限マ
ッピングを、どの制限酵素が、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ポリメラーゼ遺伝子の第２半片をクローニングするのに
適した断片を産生するか決定するために使用した。この
データは、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現
がＥ．ｃｏｌｉにとって有害であることを示唆したが、
クローニング領域内または領域外のＤＮＡ配列自体も有
害である。従って、全遺伝子をコードし得る最小寸法の
断片が最良の選択物であることが判った。制限解析は、
恐らくポリメラーゼ遺伝子を完成し得る、１．３ｋｂア
ミノ末端ＥｃｏＲＩ断片の３’末端に隣位する約１．６
ｋｂのＥｃｏＲＩ断片があることを示唆した（図２参
照）。

【００８５】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の第２半片用のハイブリダイゼーションプロー
ブ従来のクローンはいずれも熱安定ポリメラーゼ活性を発
現しなかったので、コード配列において突然変異を蓄積
し、従って遺伝子の第２半片の適当なソースとはならな
かったようである。従って、ゲノムから下流断片をクロ
ーニングするために、ハイブリダイゼーションプローブ
が必要であった。クローンＮｒｕ２１（Ｎｒｕ２１クロ
ーンは、ポリメラーゼ遺伝子の開始部から約３００ｂｐ
上流から始まる約５．５ｋｂの挿入体を含む）由来の約
３．２ｋｂのＮｄｅＩ／ＣｌａＩ断片をｐＳＰ７３（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングし、クローンＮＣ
ｌｌを産生した。ＣａＣｌコンピテントＲＲＩ細胞を前
述のごとく連結用混合物で形質転換した。形質転換体の
ミニプラスミド調製物を、ＮｄｅＩ及びＣｌａＩで消化
することにより分析し、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓの３．
２ｋｂのＮｄｅＩ／ＣｌａＩ断片を含むクローンＮＣｌ
ｌを同定した。このクローンはＥ．ｃｏｌｉ中で安定で
あった。ｐＮＣｌｌ挿入体の配列を決定した〔Ｓａｎｇ
ｅｒら，ＰＮＡＳ（１９７７）７４：５４６３〜５４６
７〕。ＣｌａＩ末端は、Ｖ２７−５．４配列（Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼのアミノ末端をコードする
１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片）と同一であった。この
１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片配列由来のプライマーを使
用し、１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ連結部及びそれに続く部
分を配列決定した。ＮｄｅＩ末端はベクター内のプライ
マーから配列決定した。

【００８６】ＥｃｏＲＩゲノムライブラリーのスクリー
ニング１０μｇのＮＣ１１を１００μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中
の３０ＵのＥｃｏＲＩで、３０℃で２時間消化した。電
気泳動後にＤＥ−８１ペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ）上で
約１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を精製した。約１．６ｋ
ｂのＥｃｏＲＩ断片を放射性標識し、元のＥｃｏＲＩλ
ｇｔ１１ライブラリーをプローブするのに使用した。前
述のごとく、感染及びプラークリフトを行なった。３つ
の陽性物が確定され、プラークを精製した。全てが約
１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含んでいたが、幾つかは
更に他の挿入体も含んでいた。

【００８７】更にλＺａｐＩＩ中でＥｃｏＲＩライブラ
リーを構築した。２μｇのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａを２０μｌのＥｃｏＲＩ緩衝液中の２０ＵのＥｃｏＲ
Ｉで３７℃で５時間消化し、次いで１５分間６５℃で処
理した。約１５ｎｇのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ／
ＥｃｏＲＩを、ＥｃｏＲＩで切断したホスファターゼ処
理λＺａｐＩＩＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）０．
５μｇに、５μｌの連結用緩衝液中の０．５μｌのＴ４
ＤＮＡリガーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂ
ｓＮｏ．２０２）で、１６℃で一晩かけて連結した。
連結したＤＮＡ４μｌをパッケージングした（Ｇｉｇ
ａＰａｃｋＧｏｌｄ，ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。前述
のごとく、感染及びプラークリフトを行なった。約１，
５００のファージを、前述のごとく放射性標識した約
１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片でプローブした。５つのハ
イブリダイゼーション陽性プラークを回収し、３つをプ
ラーク精製した。製造業者指示（ｓｔｒａｔａｇｅｎ
ｅ）に従うｉｎｖｉｖｏでのＤＮＡ切り出しによっ
て、２つのファージ（ＮＥＢ６２０及びＶ１０９−
２）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ組換え体として回収し
た。両方とも、約１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片と、互い
に異なる第２断片とを含んでいた。５’末端の配列を決
定すると、これは、ＮＣｌｌから決定された配列（Ｃｌ
ａＩ／ＮｄｅＩ断片）に対応していた（図２参照）。こ
のＥｃｏＲＩ断片は、Ｗａｎｇら（上掲）によって記載
されたＴ４ＤＮＡポリメラーゼファミリー相同領域の
６分の３を含む。１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は、図６
のヌクレオチド１２６９〜２８５６からなる。

【００８８】１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片及びＣｌａＩ
／ＮｄｅＩ断片の配列は、１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
がポリメラーゼ遺伝子を完成するのに必要であり得るこ
とを示唆した。１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含むλＺ
ａｐＩＩファージ（Ｖ１１０−１〜Ｖ１１０−７）は、
ＮＥＢ６２０に対してと同様に標識プローブを使用し
て同定された。製造業者指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
に従うｉｎｖｉｖｏでのＤＮＡ切り出しによって、２
つのファージ（Ｖ１１０−２及びＶ１１０−４）をｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔ組換え体として回収した。両方と
も、約１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片と、互いに異なる第
２断片とを含んでいた。この１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片は、Ｎｃｌｌの重複領域と同一の配列を有しており、
図６のヌクレオチド２８５１〜４７７１からなる。

【００８９】全Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺
伝子をＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ及びＮｒｕＩ断片としてク
ローニングすると、これらは不安定であり且つそこから
は活性酵素が検出されなかった。更に遺伝子を４つの断
片（１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、約１．６ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ断片、約１．９ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、及び停止
コドンを含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片）中でクロー
ニングした。１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片は安定してポ
リメラーゼのアミノ末端部分を発現した。

【００９０】実施例ＩＩＩ活性Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼのクロ
ーニングバクテリオファージＮＥＢ６１９（ＡＴＣＣ番号４０７
９５）の１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片上で発見された
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子の配列を、
Ｂａｎｇｅｒら，ＰＮＡＳ（１９７７）７４：５４６３
〜５４６７の方法を使用して決定した。１．３ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片の５’末端（位置ヌクレオチド（ＮＴ）
１）から始まる５８３７ｂｐの連続ＤＮＡ配列（配列番
号：１）を決定した（図６参照）。

【００９１】ＤＮＡ配列解析から、ポリメラーゼ遺伝子
が、１．３ｋｂＥｃｏＲＩ断片中のＮＴ２９１から始ま
ることが決定された。ＮＴ５３９７から始まる翻訳停止
部位も位置決定された。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメ
ラーゼの見掛けの分子量は約９０〜９５ｋＤａｌである
ので、遺伝子は〜２９００ｂｐであることが推定され
た。代わりに、５１０６ｂｐの読取り枠（ｏｐｅｎｒ
ｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）（ＯＲＦ）を、１７０２個
のアミノ酸（ａａ）または〜１８５ｋＤａｌのコード量
をもっと確定した。

【００９２】図７にその例を示した他のＤＮＡポリメラ
ーゼとの配列の相同性を比較することによって、Ｔ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺伝子が、ＤＮＡポリメ
ラーゼコンセンサス相同領域ＩＩＩ〔ｗａｎｇ，Ｔ．
ら，ＦＡＳＥＢＪｏｕｒｎａｌ（１９８９）３：１４
〜２１（この開示内容は参照により本明細書の一部を構
成するものとする）〕においてイントロンまたは介在配
列によって割込みされていることが判った。コンセンサ
スＤＮＡポリメラーゼ相同領域ＩＩＩの保存アミノ酸を
図７に示す。この図では、保存されているアミノ酸に下
線を引いてある。図７から判るように、Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓ相同領域ＩＩＩの左側部（配列番号：２）はＮ
Ｔ１７３７から始まり、ＡｓｎＳｅｒ残基から後はコ
ンセンサス配列との相同性が失われている。Ｔ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓ相同領域ＩＩＩの右側部（配列番号：３）
は、ＮＴ３３８４、即ちＡｓｎＳｅｒ残基の位置で再び
開始している。２つのＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラ
ーゼアミノ酸配列は、ＡｓｎＳｅｒ残基が図７のよう
に重複するように配置されている場合、ＤＮＡポリメラ
ーゼ相同領域ＩＩＩにうまく合致することが立証され
た。

【００９３】相同データを使用し、ＤＮＡポリメラーゼ
相同領域ＩＩＩの左半分と右半分とを分ける介在配列が
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ中に存在することが予測
された。

【００９４】１つの好ましい実施態様においては、介在
配列スプライス部位近傍のコード領域にある唯一の制限
酵素部位を同定することにより、介在配列を欠失させ
た。合成二重鎖オリゴヌクレオチドを合成し、２つの制
限断片間のギャップを架橋するために使用した。カルボ
キシ末端制限断片と、架橋オリゴヌクレオチドと、アミ
ノ末端制限断片と、発現ベクターとの複数部分を順次連
結すると、無傷のポリメラーゼ遺伝子を含み且つ介在配
列が欠失した発現ベクターを形成する結果となる。

【００９５】特に、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリ
メラーゼ遺伝子を含み且つ介在配列が欠失した本発明の
発現ベクターを構築するのに使用するＤＮＡ断片または
配列は以下のようになる。

【００９６】１．ＮｄｅＩ部位は、プラスミドＶ２７−
５．４における特定オリゴヌクレオチド突然変異誘発
〔Ｋｕｎｋｅｌら，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ（１９８７）１５４：３６７：３８２〕によ
って、ポリメラーゼコード領域の開始コドンがＮｄｅＩ
部位に含まれるように形成される：元来の配列・・・ＴＴＴＡＴＧ・・・（ヌクレオチド２８８〜２９３）新たな配列・・・ＣＡＴＡＴＧ・・・新たに形成されたＮｄｅＩ部位からＣｌａＩ部位までの
配列（約５２８塩基対）を発現ベクターの構築に使用し
た。

【００９７】２．ＮＣｌｌのＣｌａＩ及びＰｖｕＩ部位
間の約８９９ｂｐの配列（実施例ＩＩのＤ）。

【００９８】３．図１２に示したような、他の断片由来
のＰｖｕＩ部位とＢｓｕ３６Ｉ部位とを連結する介在配
列にまたがる合成二重鎖。

【００９９】図１２においては、１行目はスプライス部
位の５’末端の元来の配列（ヌクレオチド１７２１〜１
７８４，配列番号：１）を示し、２行目はスプライス部
位の３’末端の元来の配列（ヌクレオチド３３７５〜３
４１５，配列番号：１）を示し、３行目及び４行目は合
成二重鎖オリゴヌクレオチドの配列を示す。

【０１００】４．バクテリオファージＮＥＢ６１９由
来の約２５００塩基対のＢｓｕ３６１〜ＢａｍＨＩ断片
（実施例ＩＩのＣ）。

【０１０１】５．ｐＥＴｌｌｃ〔Ｓｔｕｄｉｅｒ，ｍｅ
ｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０）
１８５：６６〜８９〕由来の、ベクター主鎖を示す約６
２００の塩基対のＢａｍＨＩ〜ＮｄｅＩ断片であって、ａ）遺伝子１０タンパク質のためのＴ７ｐｈｉ１０
プロモーター及びリボソーム結合部位と、ｂ）アンピシリン耐性遺伝子と、ｃ）ｌａｃＩ^ｑ遺伝子と、ｄ）プラスミド複製起点と、ｅ）リボソーム転写終結部（ｒｒｎｂ）の４回反復部
〔Ｓｉｍｏｎｓら，Ｇｅｎｅ（１９８７）５３：８５〜
９６〕。

【０１０２】上記ＤＮＡ断片１〜５を、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを使用し適当な条件下に順次連結した。制限解析
によって正しい構築体を同定し、ｐＰＲ９６９と名付け
た（図８参照）。ｐＰＲ９６９を使用してＥ．ｃｏｌｉ
株ＲＲＩを形質転換し、この株をＮＥＢ６８７と名付
けた。ＮＥＢ６８７の試料を１９９０年１２月７日付
けでＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅｃｕｌｔｕｒｅＣ
ｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ番号６８４８７
を得た。

【０１０３】別の好ましい実施態様においては、介在配
列を欠失させたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ遺
伝子をＳｔｕｄｉｅｒのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現
ベクターｐＥＴｌｌＣ〔Ｓｔｕｄｉｅｒ，（１９９
０），上掲〕の誘導体内にクローニングした。この組換
えプラスミドＶ１７４−１Ｂ１を使用してＥ．ｃｏｌｉ
株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを形質転換し、株１７
５−１Ｂ１を産生し、ＮＥＢ６７１と名付けた（図５及
び図１０参照）。

【０１０４】ＮＥＢ６７１の試料を１９９０年１０月
１７日付けでＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕ
ｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ番号６
８４４７を得た。

【０１０５】介在配列を欠失させたポリメラーゼの分子
量の推定値と実測値とを比較すると差が現れた。領域Ｉ
ＩＩにおける介在配列を除去した後のポリメラーゼの推
定分子量は１３２ｋｂであり、一方、天然（実施例Ｉ参
照）または組換え（実施例ＩＶ）ポリメラーゼの実測分
子量は９５ｋｂである。理論に固執したくはないが、こ
の分子量の差は、相同領域ＩとＩＩＩの間のイントロン
に起因するものと考えられる。この知見は、相同領域Ｉ
ＩＩとＩの距離は、ｐｏｌαファミリーでは１５〜１３
５個のアミノ酸で変化する〔Ｗａｎｇ，（１９８９），
上掲〕という知見に基づいている。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓにおいては、かかる領域を分断する４０７個のアミ
ノ酸または約４４ｋＤがある。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ＤＮＡポリメラーゼはヒトｐｏｌαと極めて類似してい
るが、保存された相同領域ＩとＩＩＩの間の３６０個の
アミノ酸には全く類似性がない。

【０１０６】更に、ＰＡＧＥによって決定されるよう
に、約３５ｋＤの熱安定エンドヌクレアーゼは、本発明
のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼクローン
によっても産生される（実施例Ｘ参照）。このエンドヌ
クレアーゼを、標準的なイオン交換クロマトグラフィー
によって均質に精製し、そのアミノ末端における配列を
決定した。エンドヌクレアーゼの最初の３０個のアミノ
酸は、ポリメラーゼクローンのヌクレオチド３５３４
（配列番号：１）の位置で開始するところからコードさ
れるアミノ酸に対応する。これは、他の公知のポリメラ
ーゼとの相同性を欠いたポリメラーゼの部分に対応す
る。このエンドヌクレアーゼは抗Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼ抗血清と反応しない。エンドヌク
レアーゼがポリメラーゼからスプライシングされる厳密
な機構は未知であるが、これはＥ．ｃｏｌｉ及びＴ．ｌ
ｉｔｏｒａｌｉｓの両方において自発的に生じる。

【０１０７】実施例ＩＶ組換えＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの精
製Ｅ．ｃｏｌｉＮＥＢ６７１（ＡＴＣＣ番号６８４４
７）を１００リットル発酵槽内の、トリプトン１０ｇ／
リットル、酵母抽出物５ｇ／リットル、ＮａＣｌ５ｇ／
リットル及びアンピシリン１００ｍｇ／リットルを含む
培地中で３５℃で増殖させ、対数増殖期の中頃に０．３
ｍＭＩＰＴＧで誘発し、更に４時間インキュベートし
た。遠心分離によって細胞を回収し、−７０℃で貯蔵し
た。

【０１０８】細胞５８０ｇを溶かし、緩衝液Ａ（１００
ｍＭＮａＣｌ，２５ｍＭＫ_３ＰＯ_４ｐＨ７．０，
０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００及び１０％グリセロール）中に懸濁し、合計容量
２４００ｍｌとした。Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーを通
すことにより細胞を溶解した。粗抽出物を遠心分離によ
って清澄化した。清澄化した粗抽出物の容量を上記緩衝
液で２２００ｍｌに調整し、３０分間で７５℃に加熱し
た。遠心分離によって粒状物質を除去すると、残りの上
清は約３１２０ｍｇの可溶性タンパク質を含んでいた。

【０１０９】上清を、ホスホセルロースカラム（５×１
１ｃｍ；ベッド容積２１６ｍｌ）に直列に連結させたＤ
ＥＡＥ−セファロースカラム（５×１３ｃｍ；ベッド容
積２５５ｍｌ）に掛けた。大量の酵素を含むＤＥＡＥ−
セファロースの流動フラクションは直ぐにホスホセルロ
ースカラムに到達した。両カラムを３００ｍｌの緩衝液
Ａで洗浄し、２つのカラムを引き離し、ホスホセルロー
スカラム上のタンパク質を、２リットルの緩衝液Ａ中の
０．１Ｍ〜１ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。

【０１１０】カラムフラクションをＤＮＡポリメラーゼ
活性についてアッセイした。簡単に述べると、１〜４μ
ｌのフラクションを、各３０μＭのｄＮＴＰ及び^３Ｈ−
標識ＴＴＰ，０．２ｍｇ／ｍｌ活性化仔ウシ胸腺ＤＮＡ
及び１００μｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡを含む１×
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１
０ｍＭＫＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２４℃
においてｐＨ８．８），１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２Ｓ
Ｏ_４，２ｍＭＭｇＳＯ_４及び０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００）５０μｌ中で７５℃で５〜１０分間インキュ
ベートした。この混合物をＷｈａｔｍａｎ３ｍｍフィル
ターに与え、フィルターを、まず１０％ＴＣＡで３回、
次いで冷たいエタノールで２回洗浄した。フィルターを
乾燥した後、^３Ｈ−ＴＴＰのＤＮＡへの取込みを表わす
結合放射能を測定した。活性フラクションをプールし、
各プールにおける酵素活性レベルを前述のアッセイ条件
を使用して評価した。但し、ｄＮＴＰレベルをそれぞれ
２００μＭに高めた。かかる条件下で酵素活性１単位と
は、７５℃で３０分間に１０ｎｍｏｌｅのｄＮＴＰを酸
不溶性物質に取り込ませる酵素の量と定義した。

【０１１１】６６ｍｇのタンパク質を含む容量３００ｍ
ｌの活性フラクションを、緩衝液Ｂ（４００ｍＭＮａ
Ｃｌ，１０ｍＭＫ_３ＰＯ_４（ｐＨ７．０），０．１
ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及
び１０％グリセロール）で平衡化したヒドロキシルアパ
タイトカラム（２．５×５ｃｍ；ベッド容積２５ｍｌ）
に掛けた。タンパク質を、２５０ｍｌの緩衝液Ｂ中の１
０ｍＭ〜５００ｍＭのＫ_３ＰＯ_４直線濃度勾配で溶出し
た。２７ｍｇのタンパク質を含む容量５９ｍｌの活性フ
ラクションをプールし、緩衝液Ｃ（２００ｍＭＮａＣ
ｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．１
ｍＭＥＤＴＡ，０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００
及び１０％グリセロール）に対して透析した。

【０１１２】透析物を、ヘパリン−セファロースカラム
（１．４×４ｃｍ；ベッド容積６ｍｌ）に掛け、２０ｍ
ｌの緩衝液Ｃで洗浄した。カラムには１００ｍｌの緩衝
液Ｃ中の２００ｍＭ〜７００ｍＭのＮａＣｌ直線濃度勾
配を与えた。１６ｍｇのタンパク質を含む容量４０ｍｌ
の活性フラクションをプールし、緩衝液ｃに対して透析
した。

【０１１３】透析物を、Ａｆｆｉ−ｇｅｌＢｌｕｅク
ロマトグラフィーカラム（１．４×４ｃｍ；ベッド容積
６ｍｌ）に掛け、２０ｍｌの緩衝液で洗浄し、タンパク
質を、９５ｍｌの緩衝液Ｃ中に形成した０．２Ｍ〜２Ｍ
のＮａＣｌ直線濃度勾配で溶出した。１１ｍｇのタンパ
ク質を含む容量３０ｍｌの活性フラクションを、２００
ｍＭＫｃｌ，１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
４），１ｍＭＤＴＴ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，０．１
％ＴＲｉｔｏｎＸ−１００，１００μｇ／ｍｌＢＳ
Ａ及び５０％グリセロールを含む保存用緩衝液に対して
透析した。

【０１１４】上記の得られたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡポリメラーゼは、２０，０００〜４０，０００単位
／ｍｇの比活性を有した。

【０１１５】組換えＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラー
ゼの特性組換え及び天然のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ
は、５〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル中で電気泳動
すると、同じ見掛けの分子量を有した。組換えＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼは天然酵素の熱安定性を保
持している。組換えＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラー
ゼは天然Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼと同じ
３’−−−＞５’エキノヌクレアーゼ活性を有し、更に
ｄＮＴＰによる阻害にも敏感である。

【０１１６】実施例ＶＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子の過剰発現イントロンを欠失させたＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡ
ポリメラーゼ遺伝子、例えば実施例ＩＩＩで得たＶ１７
４−１Ｂ１を、クローン化Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａポリメラーゼを最高に発現させる多数の方法またはそ
の組合せに使用することができる。

【０１１７】このような方法の１つは、Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をその内在性調節要
素から分離し、次いでポリメラーゼ遺伝子を高度に厳密
に制御されたプロモーター、例えばＴ７発現ベクター
〔Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，Ｇｅｎｅ（１９７８）５６：
１２５〜１３５〕に操作的に連結することからなる。強
力なプロモーターの挿入は、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡポリメラーゼ遺伝子の両端部近傍の都合の良い制限
標的部位と、ベクター上のプロモーター近傍の相和性の
ある制限標的部位とを同定するか、または特定部位の突
然変異誘発〔Ｋｕｎｋｅｌ，（１９８４），上掲〕を使
用して制限標的部位を生成し、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をベクター内に、強力なプロ
モーターの転写及び翻訳制御下にあるような方向で移入
することにより行ない得る。

【０１１８】更にＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメ
ラーゼは、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ
遺伝子の発現を増大するための該遺伝子の上流にある強
力なリボソーム結合部位を利用することにより過剰発現
させることができる〔ｓｈｉｎｅ及びＤａｌｇａｒｎ
ｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
（１９７４）７１：１３４２〜１３４６（この論文は参
照により本明細書の一部を構成するものとする）参
照〕。

【０１１９】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼの発現を増大する別の方法は、Ｅ．ｃｏｌｉよりも有
効に使用される開始コドンを含むように、特定部位突然
変異誘発または再合成によって遺伝子のＤＮＡ配列を変
更することからなる。

【０１２０】最後に、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼは、酵母及びＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓのよう
な真核細胞系中でより安定であり得る。Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、発酵槽内の適当な抗生
物質を含む富栄養培地中で増殖させることにより、Ｔ．
ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を保有す
るクローンから生産することもできる。そうして遠心分
離によって細胞を回収し、音波処理によって破壊し、
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ活性を含む
粗細胞抽出物を生産する。

【０１２１】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ活性を含む粗抽出物を、実施例Ｉに記載の方法または
標準的な生成物精製方法、例えばアフィニティークロマ
トグラフィー、またはイオン交換クロマトグラフィーに
よって精製する。

【０１２２】実施例ＶＩＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの３’→
５’エキソヌクレアーゼ突然変異体の生産ａｓｐ１４１及びｇｌｕ１４３に対するコドンをアラニ
ンをコードするように変える特定部位突然変異誘発を使
用し、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いたＴ．
ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを構築した。ｐ
ｈｉ２９〔Ｃｅｌｌ（１９８９）５９：２１９〜２２
８）〕ＤＮＡポリメラーゼＩ〔Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８
８）２４０：１９９〜２０１〕及びＴ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ〔米国特許第４，９４２，１３０号〕を含む、エ
キソヌクレアーゼ活性が低下していると報告されている
ｐＮＡポリメラーゼ変異体を生産するために特定部位突
然変異誘発が使用されている。

【０１２３】本発明のポリメラーゼの特定部位突然変異
誘発は、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，ＰＡＮＳ１９８５）
８２：４８８〜４９２（この開示内容は参照により本明
細書の一部を構成するものとする）に記載された方法の
変形を使用して行なった。Ｖ２７〜５．４プラスミド
（実施例ＩＩのＢ参照）を、特定部位突然変異体を構築
するために使用した。Ｖ２７−５．４は、ｐＢｌｕｅｓ
ｃｒｉｐｔＳＫ＋において１．３ｋｂのＥｃｏＲＩ断片
をコードする。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＣＪ２３６〔Ｋｕｎｋｅ
ｌら，ＭｅｔｈｏｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１
９８７）１５４：３６７〜３８２〕（Ｖ２７−５．４プ
ラスミドを含む、デオキシチミジンの代わりにデオキシ
ウラシルを取込んだ株）を、ｆ１へルパーファージＩＲ
ｌ〔Ｖｉｒｏ１ｏｇｙ，（１９８２）１２２：２２２〜
２２６〕で重感染し、一重鎖型のプラスミドを生産し
た。

【０１２４】簡単に述べると、以下の方法で特定部位突
然変異体を構築した。まず、３５塩基の長さの突然変異
オリゴヌクレオチドプライマーを標準的な方法を使用し
て合成した。このオリゴヌクレオチドを一重鎖の鋳型に
ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーション後、Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼを使用してオリゴヌクレオチドを
伸長させた。得られた二重鎖ＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼで処理することによりクローン化環状ｄｓＤＮＡ
に変換した。突然変異後に求めるものを含むプラスミド
を、下記のごとく変更塩基に重なるＰｖｕＩ部位の形成
により同定した。１つのこのようなプラスミドを同定
し、ｐＡＪＧ２と名付けた。

【０１２５】アミノ酸残基１４１、１４２及び１４３の
元来の配列及び変更後の配列は、である。変更されたものをスクリーニングするのに使用
される新たに形成されたＰｖｕＩ部位には下線を引いて
ある。まん中のコドンは変更されているが、この新たな
コドンによってコードされるアミノ酸は変更前と同じで
あることに留意されたい。

【０１２６】Ｖ１７４−１Ｂ１由来の約１２０ｂｐのＣ
ｌａＩ〜ＮｃｏＩ断片（実施例ＩＩＩ参照）を、上述の
置換体ｐＡＪＧ２を保有する対応する断片で置き換え、
ｐＣＡＳ４を生産した（図９参照）。ｐＣＡＳ４はＶ１
７４−１Ｂ１とは４塩基対、即ち上記の塩基対だけ異な
る。

【０１２７】Ｅ，ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙ
ｓＳ〔ｍｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
（１９９０）１８５：６０〜８９〕をｐＣＡＳ４で形質
転換し、株ＮＥＢ６８１を生産した。突然変異Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼの発現はＩＰＴＧを加える
ことにより誘発した。

【０１２８】ＮＥＢ６８１の試料は１９９０年１１月８
日付けでＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託し、ＡＴＣＣ番号６８４
７３を得ている。

【０１２９】天然Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメ
ラーゼと、Ｅ．ｃｏｌｉＮＥＢ６８１から単離したエ
キソヌクレアーゼ欠失変異体とにおける相対エキソヌク
レアーゼ活性を、均一に［^３Ｈ］標識したＥ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡ基質を使用して決定した。野生型Ｔ．ｌｉｔｏｒ
ａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、ＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．が現在販売している高度
精製ロットから入手した。エキソヌクレアーゼ欠失変異
体は、エキソヌクレアーゼアッセイを妨害する夾雑物を
除去するためにＤＥＡＥセファロースカラム及びホスホ
セルロースカラムを通して部分精製した。Ｔ．ｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（２５℃におけるｐＨ８．８），１０ｍＭ
ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，５ｍＭＭ
ｇＳＯ_４，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と、０．
１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンと、３μｇ／ｍｌの
ＤＮＡ基質（比活性２００，０００ｃｐｕｍ／μｇ）と
を含む反応液０．１ｍｌに、図１１に示した量の単位の
ポリメラーゼを加え、反応液の蒸発を防ぐために反応液
の上に鉱油を重層した。この反応液に更に、野生型酵素
のエキソヌクレアーゼ活性を阻害すると既に示されてい
るｄＮＴＰを２０μＭ含有させた。全反応混合物を７０
℃で６０分間インキュベートし、次いで０．０８ｍｌを
取り出し、（無傷のＤＮＡの沈澱を助長するために）音
波処理した０．５ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ０．０２
ｍｌと１０％トリクロロ酢酸０．２ｍｌとを４℃で混合
した。混合後、反応混合物を氷上で５分間インキュベー
トし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離器において４℃で５
分間かけてペレット形成した。０．２５ｍｌの上清をシ
ンチレーション用液体と混合し、カウントした。バック
グラウンドに対して補正した試料カウントの結果を図１
１に示す。

【０１３０】図１１に示したようにエキソヌクレアーゼ
欠失変異体は、天然ポリメラーゼが明らかにエキソヌク
レアーゼ活性を示す条件下で、ｄＮＴＰが存在してもし
なくても実質的にエキソヌクレアーゼ活性はもたない。
バックグラウンドの２倍以上の活性レベルが検出された
と少なめに見積もっても、このことは、エキソヌクレア
ーゼ活性がこの変異体においては少なくとも６０分の１
に低下していることを意味する。

【０１３１】実施例ＶＩＩＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ半減期決定実施例Ｉに記載のごとく精製したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼの熱安定性または半減期を以下の
方法で決定した。精製Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼを、緩衝液（７０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（２５℃におけるｐＨ８，８），１７ｍＭ硫酸アンモ
ニウム，７ｍＭＭｇＣｌ_２，１０ｍＭβ−メルカプト
エタノール，各２００μＭのデオキシヌクレオチド及び
２００μｇ／ｍｌＤＮａｓｅ処理したＤＮＡ）中で１０
０℃でプレインキュベートした。時間ゼロで初期試料を
採取し、１０、２０、４０、６０、９０、１２０、１５
０及び１８０分後に、５％の酵素混合物に等価の少量の
アリコートを採取した。既に記載のごとくデオキヌクレ
オチドのＤＮＡへの取込みを決定することによりポリメ
ラーゼ活性を測定した。

【０１３２】ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ
から入手したＴａｑＤＮＡポリメラーゼ試料に上記ア
ッセイを実施した。時間ゼロにおいて初期試料を採取
し、４、７及び１０分後に、５％の酵素混合物に等価の
少量のアリコートを採取した。図３に示したように、
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの１００℃
における半減期は６０分であり、Ｔａｑポリメラーゼの
１００℃における半減期は４．５分である。

【０１３３】図３に示したように、安定化剤不在下での
Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの１００℃
における半減期は６０分であり、安定化剤ＴＲＩＴＯＮ
Ｘ−１０（０．１５％）またはＢＳＡ（１００μｇ／
ｍｌ）の存在下での半減期は９５分である。これは、安
定剤が存在してもしなくても１００℃における半減期は
４．５分であるＴａｑＤＮＡポリメラーゼとは著しい
対照であった（図３）。

【０１３４】実施例ＶＩＩＩ３’−５’プルーフリーディング活性の決定１．Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼのデオ
キヌクレオチドの不在または存在に対する応答ポリメラーゼに付随するエキソヌクレアーゼ活性のレベ
ルは、デオキシヌクレオチドに対して著しく異なる応答
を示す。非プルーフリーディング３’−５’エキソヌク
レアーゼは、デオキシヌクレオチドの存在によってもた
らされる共在重合によって１０倍またはそれ以上に刺激
されるが、プルーフリーディング３’−５’エキソヌク
レアーゼは、共在重合によって完全に阻害される〔Ｌｅ
ｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．ＡＲＢ（１９６７）３６：６４
５〕。

【０１３５】エキソヌクレアーゼ機能が十分に性状解析
されているＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ
（Ｔ４ポリメラーゼ，クレノウフラグメント）を、重合
用緩衝液（７０ｍＭＴｒｉｓ（２４℃におけるｐＨ
８．８），２ｍＭＭｇＣｌ_２，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ
及び１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中で１μｇ
の^３Ｈ−チミジン標識二重鎖ＤＮＡ（１０^５ＣＰＭ／μ
ｇ）とインキュベートした。７０℃（好熱ポリメラー
ゼ）または３７℃（常温ポリメラーゼ）において３時間
（実験１）または４時間（実験２）インキュベートした
後に、酸可溶性放射性標識塩基を測定することによりエ
キソヌクレアーゼ加水分解塩基を定量化した。

【０１３６】表１に示したように、５’−３’エキソヌ
クレアーゼ活性を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
は、デオキシヌクレオチドが３０μＭ存在するときに刺
激またはエキソヌクレアーゼ活性を示す。しかしなが
ら、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＴ４ポリメラーゼ，
クレノウフラグメントまたはＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡポリメラーゼのような３’−５’プルーフリーディ
ングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、
この逆、即ちデオキシヌクレオチドの存在に対する阻害
応答を示した。

【０１３７】

【表１】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼと、十分に
性状解析されたＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントとのデオキシヌクレオチドの存在また
は不在に対する応答の類似性を更に図４に示す。いずれ
かのポリメラーゼ２０単位を、３０μＭのデオキシヌク
レオチドの存在下または不在下に、前記重合用緩衝液３
５０μｌ中で９μｇの^３Ｈ−チミジン標識二重鎖ＤＮＡ
（１０^５ＣＰＭ／μｇ）と一緒にインキュベートした。
各時点で５０μｌを取り出し、酸可溶性放射性標識塩基
のレベルを測定した。図４に示したように、Ｔ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの挙動と、十分に性状
解析された３’−５’プルーフリーディングエキソヌク
レアーゼを含むＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレ
ノウフラグメントの挙動とは極めて類似している。

【０１３８】２．デオキシヌクレオチド濃度増大に対す
るＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの応答ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、重合に際し
て存在するデオキシヌクレオチドのレベルによって、デ
オキシヌクレオチドのレベルが重合に影響する程度にお
いて影響される。デオキシヌクレオチドレベルが酵素の
Ｋｍ（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ定数）に対して増加するに従
って、重合速度も増加する。重合速度に感受性を示すポ
リメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能においては、エキ
ソヌクレアーゼ活性の変化はデオキシヌクレオチド濃度
の増加と平行する。重合速度が増加するとプルーフリー
ディング３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は著しく低
下するが、重合依存性の５’−３’エキソヌクレアーゼ
活性は一緒に増加する。

【０１３９】デオキシヌクレオチド濃度を１０μＭから
１００μＭに増加した場合で、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ
ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ機能を他のポ
リメラーゼの十分に性状解析されたエキソヌクレアーゼ
機能と比較した。インキュベーション時間を３０分間と
し（１）に記載したのと同様にエキソヌクレアーゼ活性
を測定した。表２にまとめたように、Ｔ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’プルーフリー
ディングエキソヌクレアーゼを有することが知られてい
るポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡＰｏｌ．Ｉの
クレノウフラグメント）と同様にデオキシヌクレオチド
レベルの増加に応答した。この応答はこのプルーフリー
ディング機能を持たないことが知られているポリメラー
ゼＴａｑＤＮＡポリメラーゼの応答と対照的であった。
このポリメラーゼはデオキシヌクレオチドレベルの増加
に対し、その５’−３’エキソヌクレアーゼ活性に起因
するエキソヌクレアーゼ機能の上昇を伴って応答した。

【０１４０】

【表２】３．デオキシヌクレオチドの均衡状態から不均衡状態へ
の変化に対するＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラ
ーゼの応答重合は、ＤＮＡ合成の際に存在する４つ全てのデオキシ
ヌクレオチドに同じレベルで依存する。もしデオキシヌ
クレオチドレベルが等しくないと、ポリメラーゼの重合
速度は低下し、誤った塩基をより挿入しやすくなる。こ
のような状態はプルーフリーディング３’−５’エキソ
ヌクレアーゼ活性を多いに増加させるが、５’−３’エ
キソヌクレアーゼ活性を低下させる〔Ｌｅｈｍａｎ，
Ｉ．Ｒ．，ＡＲＢ（１９６７）３６：６４５〕。

【０１４１】均衡レベルのデオキシヌクレオチド（３０
μＭ）及びｄＣＴＰが他の３種のデオキシヌクレオチド
レベルの１／１０または１／１００のレベルで存在する
ことを特徴とする２種類の不均衡レベルのデオキシヌク
レオチドと一緒にＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメ
ラーゼをインキュベートした。次いでＴ．ｌｉｔｏｒａ
ｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの応答を、３’−５’または
５’−３’いずれかのエキソヌクレアーゼ機能を有する
３種類のポリメラーゼの応答と比較した。全てのアッセ
イは（１）に記載のごとく実施した。但し、ｄＣＴＰ濃
度は表に示す通りとした。表３に示すように、Ｔ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、プルーフリーデ
ィング３’−５’エキソヌクレアーゼ含有ポリメラーゼ
に対して予測した挙動を示し、デオキシヌクレオチドプ
ールの不均衡（ｉｍｂａｌａｎｃｅ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ＤＮＡポリメラーゼＩのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、即ち
クレノウフラグメントのプルーフリーディングポリメラ
ーゼのものと同様にエキソヌクレアーゼ活性を増大し
た。この応答とは対照的に、ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼのエキソヌクレアーゼは、重合が阻害されるところま
で不均衡が高まるまで影響されなかった。

【０１４２】

【表３】４．エキソヌクレアーゼ活性の方向性プルーフリーディングエキソヌクレアーゼはＤＮＡにお
いて３’−５’の方向性を有するが、ＤＮＡポリメラー
ゼに付随する非プルーフリーディングエキソヌクレアー
ゼは５’−３’の方向性を有する。Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌ
ｉｓＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼの活性の
方向を識別するために、５’末端をブロックしたアデノ
ウイルスＤＮＡを使用した。このＤＮＡの５’末端はタ
ンパク質でブロックしてあるので、５’−３’方向性の
酵素活性はこの二重鎖ＤＮＡを消化することはできない
が、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはプルーフリーディ
ングエキソヌクレアーゼ含有ポリメラーゼのような３’
−５’方向性の酵素活性はアデノウイルスＤＮＡを消化
することができる。

【０１４３】２５単位のエキソヌクレアーゼＩＩＩまた
は２０単位のＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラー
ゼ、（十分に性状解析された３’−５’エキソヌクレア
ーゼ活性を有する）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼもしくは
（かかる活性を欠いている）ＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを、５μｇのアデノウイルスＤＮＡと一緒に、７０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃におけるｐＨ８．８），
２ｍＭＭｇＣｌ_２及び１００μｇ／ｍｌＢＳＡの存在
下に、３７℃（Ｔ４ポリメラーゼ及びエキソヌクレアー
ゼＩＩＩ）または７０℃（Ｔａｑポリメラーゼ及びＴ．
ｌｉｔｏｒａｌｉｓポリメラーゼ）で最高３０分間イン
キュベートした。各インキュベーション終了時には、ア
デノウイルスＤＮＡのフェノール抽出によって酵素活性
を停止させ、次いで、２０ｍＭＴｒｉｓ（２５℃にお
けるｐＨ７．９），１０ｍＭ酢酸マグネシウム，５０ｍ
Ｍ酢酸カリウム及び１ｍＭＤＴＴ中で３７℃で１時
間ＨｐａＩ消化した。これらのＤＮＡ断片にアガロース
ゲル電気泳動を実施し、経時的分解及びその結果の二重
鎖ＤＮＡ断片の損失について得られたバターンを評価し
た。

【０１４４】エキソヌクレアーゼＩＩＩ、Ｔ．ｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は５’末端
をブロックしたアデノウイルスＤＮＡに由来する二重鎖
ＤＮＡ断片を消失させており、これはその３’末端の被
攻撃容易性（ｖｕｌｎｅｒａｂｉｌｉｔｙ）を示唆す
る。これとは対照的に、重合依存性の５’−３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
にはＤＮＡ断片の消失は見られなかった。

【０１４５】実施例ＩＸＰＣＲ法におけるＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメ
ラーゼの効能更に、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼのポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行する能力を検査し
た。ＣｌａＩ消化によって切断したＭ１３ｍｐ１８Ｄ
ＮＡを種々の量で含む実施例ＩＶに記載の緩衝液１００
μｌにおいて、４３５５ｂｐ及び２８９５ｂｐの２つの
断片を生産し、担体ＤＮＡとして存在する仔ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ２００ｎｇと一緒にインキュベートし、全ての非特
異的吸着作用を低下させた。前進及び逆進プライマーを
１μＭ存在させた（前進プライマー＝５’ｄ（ＣＣＡＧ
ＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＴＴ）３’及び
逆進プライマー＝５’（ＣＧＣＣＡＧＧＧＴＴＴＴＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣ）３’）。これらのプライマー
は、上記４３５５ｂｐの断片上にある１ｋｂのＤＮＡ配
列を、Ｍ１３ｍｐ１８の全ＤＮＡの１４％を占める配列
にフランキングする。更に、ｄＮＴＰ，１００μｇ／ｍ
ｌＢＳＡ，１０％ＤＭＳＯを各２００μＭと、（０．
５％ＮＰ４０及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０の存在下
または不在下に）Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメ
ラーゼまたは（０．１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存
在下または不在下に）Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼのいずれかを２．５単位とを存在させた。初
期サイクルは、９５℃で５分間、５０℃で５分間（この
間にポリメラーゼ及びＢＳＡを添加した）、及び７０℃
で５分間とした。それぞれ後に続くＰＣＲサイクルのセ
グメントは、９３℃で１分間、５０℃で１分間及び７０
℃で５分間とした。０、１３、２３及び４０サイクル後
に、１００μｌ容量から２０μｌの量を取り出し、エチ
ジウムプロミド使用のアガロースゲル電気泳動を実施
し、１ｋｂのＤＮＡ配列の増幅を定量化した。

【０１４６】２８ｎｇ及び２．８ｎｇで存在するこのタ
ーゲットＤＮＡ配列を用いた最初の実験は、Ｔ．ｌｉｔ
ｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ連鎖反
応を触媒する能力を確定した。収量は、Ｔ．ａｑｕａｔ
ｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼに見られるものに匹敵して
おり、２倍より大きくはなかった。

【０１４７】しかしながらポリメラーゼ機能の差が最も
明らかであったのは、より低いレベルのターゲットＤＮ
Ａ配列、２．８ｆｇ（フェムトグラム）においてであっ
た。各サイクルにおけるＤＮＡの伸長において最高のポ
リメラーゼ安定性及び／または効率を要求する条件下
で、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼは、２
３サイクルにおいてＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリ
メラーゼより４倍以上に増幅されたＤＮＡを産生した。

【０１４８】増幅に多くのサイクルが必要であることは
ＰＣＲ法で望ましくない夾雑物の生成を伴なうが故に、
この極めて少量のＤＮＡをより少ないサイクルで増幅す
る能力はＰＣＲの多くの用途で重要である。

【０１４９】実施例Ｘ組換えＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓイントロンコード化エン
ドヌクレアーゼの精製実施例ＩＶに記載のごとく増殖させたＥ．ｃｏｌｉＮ
ＥＢ６７１（ＡＴＣＣ番号６８４４７）を融解し（７０
ｇ）、２００μｇ／ｍｌのリゾチームを含む緩衝液Ａ中
に懸濁し、終容量３００ｍｌとした。この混合物を、ま
ず３７℃で２分間、次いで７５℃で３０分間インキュベ
ートした。暖まったままの混合物を２２，０００×ｇで
３０分間遠心分離し、上清を回収し、熱安定エンドヌク
レアーゼを更に精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ由来の全てのヌ
クレアーゼは熱処理によって失活し、この段階での調製
物は、イントロンがコードされたエンドヌクレアーゼの
性状解析に使用することができるであろう。この酵素
を、７５℃の上清液中にやはり存在する組換えＴ．ｌｉ
ｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼから分離するため
に、上清液をＤＥＡＥ−セファロースカラム（５ｃｍ×
５ｃｍ，ベッド容積１００ｍｌ）に通し、２００ｍｌの
緩衝液Ａで洗浄した。実質的に全てのＤＮＡポリメラー
ゼ活性がカラムを通過するが、エンドヌクレアーゼ活性
は付着する。エンドヌクレアーゼ活性を、１リットルの
緩衝液Ａ中に形成した０．１Ｍ〜０．８ＭのＮａＣｌ直
線濃度勾配で溶出した。エンドヌクレアーゼ活性は約
０．４ＭＮａＣｌに溶出し、１０ｍＭＫＣｌ，２０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２４℃におけるｐＨ８．
８），１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４，１０ｍＭＭｇ
ＳＯ_４，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及び反応
混合物０．０５ｍｌ当たり１μｇのｐＢＲ３２２ＤＮ
Ａを含む緩衝液中でアッセイした。反応混合物を７５℃
でインキュベートし、ＤＮＡの切断の程度をアガロース
ゲル電気泳動によって決定した。より低い温度ではエン
ドヌクレアーゼ活性はわずかしかまたは全く検出されな
かった。ピーク活性を含むチューブをプールし、緩衝液
Ａに対し一晩透析し、ホスホセルロースカラム（２．５
ｃｍ×６．５ｃｍ，ベッド容積３２ｍｌ）に掛け、緩衝
液Ａで洗浄し、エンドヌクレアーゼ活性を、緩衝液Ａ中
に形成した０．１Ｍ〜１．５ＭのＮａＣｌ直線濃度勾配
で溶出した。酵素は約０．８ＭＮａＣｌに溶出した。
活性フラクションをプールし、緩衝液Ａに対し一晩透析
し、次いでＨＰＬＣＭｏｎｏ−Ｓカラム（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）を通し、０．０５Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌの
直線濃度勾配で溶出した。活性は単一のピークとして溶
出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると均質であった。Ｃｏｏ
ｍａｓｓｉｅＢｌｕｅ染色によって３３〜３７ｋｄの
単一バンドが検出され、また、このバンドをゲルから溶
出し再生したときには、ゲル上で検出された唯一のエン
ドヌクレアーゼ活性を含んでいた。

【０１５０】この酵素は、種々のＤＮＡ上に好ましい切
断部位を有する。λＤＮＡ上には幾つかの迅速な切断部
位と多数の緩慢な切断部位とがある。プラスミドｐＢＲ
３２２においては酵素は、長時間インキュベーションに
おいて３つの部位を迅速に、幾つかの他の部位をゆっく
りと切断する。ｐＢＲ３２２における迅速な部位の２つ
の配列は、位置１６４における部位：５’ＴＴＧＧＴＴＡＴＧＣＣＧＧＴＡＣＴＧＣＣＧＧＣＣＴＣＴＴ３’ ３’ＡＡＣＣＡＡＴＡＣＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡ５’ 位置２４１１における部位：５’ＴＴＧＡＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＡＣＣＧＣＴＣＧＣＣＧＣＡＧ３’ ３’ＡＡＣＴＣＡＣＴＣＧＡＣＴＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＧＣＧＴＣ５’ と決定された。

【０１５１】従って、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のエ
ンドヌクレアーゼは、酵母由来の報告された、イントロ
ンがコードされた他のエンドヌクレアーゼに、切断部位
の３’側に４つの塩基の伸長部があることで類似してい
る。

【０１５２】本発明の熱安定エンドヌクレアーゼは、か
かる活性が望まれる遺伝子操作技術に使用することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例ＩのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの
写真である。

【図２】図１Ａのゲルのレーン２から溶出したタンパク
質のポリメラーゼ活性及びエキソヌクレアーゼ活性を示
すグラフである。

【図３】バクテリオファージＮＥＢ６１９のＢａｍＨ
Ｉ断片内に完全に含まれるＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮ
Ａポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＸｂａ断片の
制限部位マップである。

【図４】Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ及
びＴａｑＤＮＡポリメラーゼの１００℃における半減
期を示すグラフである。

【図５】デオキシヌクレオチドの存在または不在に対す
る、Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ及びク
レノウフラグメントの応答を示すグラフである。

【図６】天然ＤＮＡ（ＮＥＢ６１９のＢａｍＨＩ断
片）及びＥ．ｃｏｌｉＮＥＢ６７１及びＮＥＢ６８７に
おけるＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼ遺伝
子の構成を示す制限部位マップである。

【図７】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ断片とＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片の一部分とを
含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａ
ｍＨＩ制限断片の部分ヌクレオチド配列のうち位置１〜
１５６０を示す図である。

【図８】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ断片とＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片の一部分とを
含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａ
ｍＨＩ制限断片の部分ヌクレオチドの配列のうち位置１
５６１〜３１２０を示す図である。

【図９】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥｃ
ｏＲＩ断片とＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片の一部分とを
含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢａ
ｍＨＩ制限断片の部分ヌクレオチドの配列のうち位置３
１２１〜４７４０を示す図である。

【図１０】１．３ｋｂ、１．６ｋｂ及び１．９ｋｂのＥ
ｃｏＲＩ断片とＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ断片の一部分と
を含むバクテリオファージＮＥＢ６１９の１４ｋｂのＢ
ａｍＨＩ制限断片の部分ヌクレオチドの配列のうち位置
４７４１〜５８３７を示す図である。

【図１１】ＤＮＡポリメラーゼコンセンサス相同領域Ｉ
ＩＩのアミノ酸とＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ相同領域（ア
イランド）ＩＩＩのアミノ酸との比較である。

【図１２】ベクターｐＰＲ９６９を表わす図である。

【図１３】ベクターｐＣＡＳ４を表わす図である。

【図１４】ベクターＶ１７４−１Ｂ１を表わす図であ
る。

【図１５】実施例ＶＩで構築したＴ．ｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼ変異体が、検出可能な３’−５’
エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることを説明するグ
ラフである。

【図１６】実施例ＩＩＩで使用したプライマーのヌクレ
オチド配列である

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/54 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者フランシネ・パーラーアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 02146、ブロークライン、フウーラー・ストリート・74・エイ (72)発明者レベツカ・クツセラアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01915、ビバリー、ネツプターン・ストリート・28 (72)発明者ウイリアム・イー・ジヤツクアメリカ合衆国、マサチユーセツツ・ 01969、ロウリイ、ボツクスフオード・ロード・207

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＮＡの重合を触媒する、Ｔｈｅｒｍｏ
ｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な精製
熱安定酵素。
【請求項２】分子量約９０，０００〜９５，０００ダ
ルトンを有する請求項１に記載の熱安定酵素。
【請求項３】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有
する請求項１に記載の熱安定酵素。
【請求項４】３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が失
活している請求項３に記載の熱安定酵素。
【請求項５】前記酵素がＥ．ｃｏｌｉＮＥＢ６８
１から入手可能である請求項４に記載の熱安定酵素。
【請求項６】安定化剤の不在下に１００℃で約６０分
の半減期を有する請求項１に記載の熱安定酵素。
【請求項７】安定化剤の存在下に１００℃で約９５分
の半減期を有する請求項１に記載の熱安定酵素。
【請求項８】前記安定化剤が非イオン界面活性剤であ
る請求項７に記載の熱安定酵素。
【請求項９】前記非イオン界面活性剤が、オクトキシ
ノール、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート
及びエトキシル化ノニルフェノールからなる群から選択
される請求項８に記載の熱安定酵素。
【請求項１０】前記安定化剤がタンパク質である請求
項７に記載の熱安定酵素。
【請求項１１】前記タンパク質が、ウシ血清アルブミ
ン及びゼラチンからなる群から選択される請求項１０に
記載の熱安定酵素。
【請求項１２】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓから入手可能な熱安定酵素のアミノ末端部分
をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項１３】前記単離ＤＮＡ配列の長さが約１．３
ｋｂである請求項１２に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項１４】前記単離ＤＮＡが図６のヌクレオチド
１〜１２７４からなる請求項１３に記載の単離ＤＮＡ配
列。
【請求項１５】請求項１３に記載の単離ＤＮＡ配列を
含むベクター。
【請求項１６】前記ベクターがバクテリオファージＮ
ＥＢ６１８である請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓから入手可能な熱安定酵素の中間部分をコー
ドする単離ＤＮＡ配列。
【請求項１８】前記単離ＤＮＡ配列の長さが約１．６
ｋｂである請求項１７に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項１９】前記単離ＤＮＡが図６のヌクレオチド
１２６９〜２８５６からなる請求項１８に記載の単離Ｄ
ＮＡ配列。
【請求項２０】請求項１９に記載の単離ＤＮＡ配列を
含むベクター。
【請求項２１】前記ベクターがバクテリオファージＮ
ＥＢ６２０である請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓから入手可能な熱安定酵素のカルボキシ末端
部分をコードする単離ＤＮＡ配列。
【請求項２３】前記単離ＤＮＡ配列の長さが約１．９
ｋｂである請求項２２に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項２４】前記単離ＤＮＡが図６のヌクレオチド
２８５１〜４７７１からなる請求項２３に記載の単離Ｄ
ＮＡ配列。
【請求項２５】請求項２３に記載の単離ＤＮＡ配列を
含むベクター。
【請求項２６】前記ベクターがプラスミドＶ１５３−
２である請求項２５に記載のベクター。
【請求項２７】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼまたはその一部分を生産
するために、適切な読み取り枠となるように請求項１７
に記載の単離ＤＮＡ配列と操作的に連結された請求項１
３に記載の単離ＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項２８】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼまたはその一部分を生産
するために、適切な読み取り枠となるように操作的に連
結された請求項２３に記載の単離ＤＮＡ配列を更に含む
請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】請求項１に記載の熱安定酵素をコード
する単離ＤＮＡ配列。
【請求項３０】請求項２９に記載のＤＮＡ配列を含む
ベクター。
【請求項３１】請求項３０に記載のベクターによって
形質転換された微生物宿主。
【請求項３２】バクテリオファージＮＥＢ６１９の
約１４ｋｂのＢａｍＨＩ制限断片内に含まれる請求項２
９に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３３】図６のＤＮＡ配列からなる請求項２９
に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３４】ヌクレオチド１７７６〜３３８９が欠
失している請求項３３に記載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３５】プラスミドｐＰＲ９６９の約４ｋｂの
ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩ制限断片からなる請求項２９に記
載の単離ＤＮＡ配列。
【請求項３６】請求項３３に記載のＤＮＡを含むベク
ター。
【請求項３７】請求項３４に記載のＤＮＡを含むベク
ター。
【請求項３８】前記ベクターがプラスミドＶ１７４−
１Ｂ１である請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】前記ベクターがプラスミドｐＰＲ９６
９である請求項３７に記載のベクター。
【請求項４０】請求項３８または請求項３９に記載の
ベクターによって形質転換された微生物宿主。
【請求項４１】前記形質転換体がＥ．ｃｏｌｉＮＥ
Ｂ６７１である請求項４０に記載の形質転換体。
【請求項４２】前記形質転換体がＥ．ｃｏｌｉＮＥ
Ｂ６８７である請求項４０に記載の形質転換体。
【請求項４３】Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下で
請求項４０、４１または４２のいずれか一項に記載の形
質転換微生物宿主を培養し、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼを回収するこ
とからなるＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
【請求項４４】請求項４３に記載の方法よって生産さ
れたＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤ
ＮＡポリメラーゼ。
【請求項４５】（ａ）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ
ｌｉｔｏｒａｌｉｓから全ＤＮＡを精製するステップ
と、（ｂ）ステップ（ａ）の全ＤＮＡから、ＤＮＡポリメ
ラーゼをコードするＤＮＡを単離するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）で単離したＤＮＡから介在ＤＮ
Ａを除去するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）のＤＮＡを適当なベクターに連
結するステップと、（ｅ）ステップ（ｄ）のベクターで宿主を形質転換す
るステップと、（ｆ）ステップ（ｅ）の形質転換宿主をＴ．ｌｉｔｏ
ｒａｌｉｓＤＮＡポリメラーゼの発現に適した条件下に
培養するステップと、（ｇ）Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉ
ｓＤＮＡポリメラーゼを回収するステップとからなるＴ
ｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓＤＮＡポ
リメラーゼの製造方法。
【請求項４６】前記単離ＤＮＡが図６のＤＮＡからな
る請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】前記介在ＤＮＡを、図６のヌクレオチ
ド約１７６１〜１７７５及び３３８４〜３３９２にまた
がるスプライス部位で除去し、それによって図８のコン
センサス領域ＩＩＩに対応するコンセンサス領域を形成
する請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】前記介在ＤＮＡが図６のヌクレオチド
１７７６〜３３８９からなる請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】ｐＢＲ３２２の二重鎖ＤＮＡを位置１
６４及び位置２４１１で切断する、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃ
ｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓから入手可能な熱安定エン
ドヌクレアーゼ。
【請求項５０】分子量約３３，０００〜３７，０００
ダルトンを有する請求項４９に記載の熱安定エンドヌク
レアーゼ。
【請求項５１】更に、請求項４９に記載の熱安定エン
ドヌクレアーゼをコードする請求項３３に記載の単離Ｄ
ＮＡ。
【請求項５２】エンドヌクレアーゼをコードする配列
がヌクレオチド３５３４から始まる請求項５１に記載の
単離ＤＮＡ。