JPH0568563A - Ｃ型肝炎ウイルス遺伝子およびその利用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 Ｃ型肝炎ウイルスに由来するペプチドをコー
ドする全遺伝子をクローニングすることにより、Ｃ型肝
炎ワクチンや検査試薬等に有用な核酸断片を得る。 【構成】 単一の日本人のＧＰＴ高値血漿を用いて、Ｃ
型肝炎ウイルスに特有な遺伝子断片をイムノスクリーニ
ング法により複数クローン化して、Ｃ型肝炎ウイルス遺
伝子の全長と考えられるサイズに対応するｃＤＮＡクロ
ーンを得る。本発明で得られるＣ型肝炎ウイルスポリペ
プチドをコードする核酸断片、Ｃ型肝炎ウイルス構成ポ
リペプチド及びこれらを利用したＣ型肝炎ウイルスの各
種検出方法は、特に日本におけるＣ型肝炎ウイルスの検
出において極めて有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はＣ型肝炎の原因ウイルス
(Ｃ型肝炎ウイルス)の全遺伝子、それを構成する遺伝子
断片、Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチド、及びこれら
の利用法に関する。

【０００２】

【発明の背景及び従来技術】ウイルス性肝炎にはＡ型肝
炎(伝染性肝炎)とＢ型肝炎(血清肝炎)の２種類があるこ
とは古くから知られていた。これは主として感染経路の
相違に基づいたもので、Ａ型肝炎は経口感染で流行を起
こし、Ｂ型肝炎は主として血液を介して伝播されるもの
であることが確認された。これらの２つの肝炎の原因ウ
イルスは既に分離同定され、Ａ型肝炎ウイルスはピコル
ナウイルスに属する直径27nmのＲＮＡウイルスであり(F
inestone, S.M. et al., Science 182 p.1026(1973))、
一方、Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルスに属する直
径42nmのエンベロープを有するＤＮＡウイルスであるこ
とが突き止められた(Dane, O.S., et al., Lancet,I p.
695(1970))。現在ではこれらの肝炎ウイルスの免疫血清
学的診断方法が確立され、その予防対応策もほぼ確立さ
れている。

【０００３】これらの２つの肝炎ウイルスの確定診断方
法が確立されるに従い、このいずれにも属さない非Ａ非
Ｂ型肝炎の存在が明らかになってきた(Prince,A.M.,et
al.,Lancet I p.241(1974))。輸血後肝炎は、Ｂ型肝炎
ウイルス表面抗原(HBsAg)のスクリーニングの導入によ
り大幅に減少したがゼロにはならず、しかも、発生した
肝炎患者からは、Ａ型、Ｂ型肝炎の感染の証拠は得られ
なかった。このことから、この肝炎は一般に非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれた。この種の肝炎は、わが国では散発性肝
炎の約50％、輸血後肝炎の約90％以上にのぼり、さらに
慢性肝炎、肝硬変、肝癌の50％以上が非Ａ非Ｂ型肝炎に
起因すると推定されており大きな社会問題となってい
る。

【０００４】これとは別に、インド、ミャンマー、アフ
ガニスタン、または北アフリカなどで経口感染で流行す
る第２のウイルス性非Ａ非Ｂ型肝炎が存在することが明
らかになった(Khuroo,M.S. Am.J.Med., 68p.818(198
0))。これは、一般には水系、または流行性非Ａ非Ｂ型
肝炎と呼ばれている。わが国では、この肝炎の流行は観
察されていないが、渡航者による流行地からの肝炎の輸
入は若干観られるようである(福原ら、第25回日本肝臓
学会総会講演要旨集)。

【０００５】本発明は、上記で言う前者の主に血液を介
して感染する血液型非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルスに関するも
のであり、本明細書中ではこのウイルスをＣ型肝炎ウイ
ルスと呼ぶ。

【０００６】Ｃ型肝炎は、患者血清中のウイルス濃度が
10²〜10³と低いこと、同じ接種材料で再感染を起こした
チンパンジーが存在するなど抗体の存在が疑わしいこ
と、感染実験モデルがチンパンジー、マーモセットに限
られることなどの問題点のため、その研究に困難を来た
している。

【０００７】このため、Ｃ型肝炎については未だウイル
ス本体の分離同定はなされておらず、また、この種類の
肝炎の治療法、及び予防法は確立されてはいない。従
来、この肝炎の診断は除外診断によるしかなかった。す
なわち、患者の血清について診断方法が確立されている
Ａ型、Ｂ型肝炎の検査を行ない、これらの肝炎であるこ
とを否定し、さらに全身感染の一部の症状として肝炎様
症状を示すヘルペス、サイトメガロ、エプスタインバー
ウイルス感染の可能性を否定し、また薬物性やアルコー
ル性肝炎、自己免疫性肝炎を否定してＣ型肝炎として診
断されていた。

【０００８】この肝炎の病因ウイルスが感染性を有する
ことは、1978年アメリカの研究グループにより、チンパ
ンジーを用いた感染実験で証明された(Tabor,E.,et a
l., Lancet I p.463(1978))。しかし、世界中の多くの
努力にもかかわらず、10年以上経た現在も、病因ウイル
スの実態は判明していない。感染チンパンジーの血液や
肝組織を材料として、寒天ゲル内沈降反応、免疫電気向
流法、ラジオイムノアッセイ、蛍光抗体法、電顕法など
のＡ型及びＢ型肝炎の研究で用いられた殆どすべてのア
プローチにより、ウイルスや関連する抗原抗体系の探索
が行なわれてきたが、いまだ確実といわれるものを得る
には至っていない。

【０００９】最近になってＣ型肝炎ウイルスのｃＤＮＡ
を捕らえたという報告が米国のカイロン社(Choo,Q et a
l., Science, 244, p.359(1989); Kuo,G.et al.,Scienc
e, 244,p.362(1989))、及び、自治医科大学の岡本ら(日
本肝臓学会、1990年)によって相次いで発表され、この
ウイルス遺伝子の全容が明らかにされつつある。これま
でに、Ｃ型肝炎の抗体測定試薬としては、カイロン-オ
ーソ社によって開発された市販品(オーソ・ＨＣＶＡｂ
ＥＬＩＳＡテスト)が存在し、これはＣ型肝炎ウイルス
の関連特異的ペプチドをＳＯＤ(ヒトスーパーオキシド
ディスムターゼ)との融合蛋白として酵母で発現させた
抗原を用いたものである。

【００１０】

【発明が解決しようとする問題点】ところで、一般にウ
イルスの違いはその免疫血清学的性状の違い、分子遺伝
学的性状の違いにより診断方法が全く異なってくる。ま
た、株の違いは免疫血清学的性状が一部異なるため、同
一の診断方法では株間の違いにより検出感度の違い、ワ
クチンでは免疫原性、感染防御能の違いが生じてくる。
分子遺伝学的診断方法、例えばＤＮＡプローブ診断にお
いては、プローブとウイルス核酸の間のハイブリダイゼ
ーションは核酸レベルでのホモロジーが非常に高くない
と実用的ではないことが一般に知られている。すなわ
ち、株間での核酸レベルでの差異により、ＤＮＡのハイ
ブリダイゼーションが起こらず、ＤＮＡプローブ診断が
効果的に達成できないケースが予想される。

【００１１】血清型の肝炎として、よく知られ、既によ
く解析されているＢ型肝炎においては、欧米、東南アジ
アなどの地域ごとにメジャーなＢ型肝炎ウイルスのサブ
タイプ、すなわち、その地域に特徴的な流行株が存在す
ることが知られている。従って、本発明の対象となるＣ
型肝炎ウイルスにおいても、地域に特有なウイルス種、
もしくはウイルス株が存在することが考えられる。

【００１２】事実、カイロン−オーソ社のＣ型肝炎検出
用アッセイキットでは日本で流行しているＣ型肝炎患者
血清の全てを検出できないことが明らかになっている
(日本肝臓学会1990年)。この結果は、米国で流行してい
る株と日本で流行している株間の抗原性の差異を反映し
ていると考えられる。従って、特定の地域、例えば特に
日本で流行しているＣ型肝炎ウイルスの診断方法、予防
方法を確立するには、日本でメジャーなＣ型肝炎ウイル
ス株を捕らえる必要がある。

【００１３】また、当該検出系で用いられているいわゆ
るC100抗原は非構造蛋白遺伝子由来であることから、よ
り直接的な診断法や将来のワクチン材料の候補として、
ウイルス構造蛋白の同定とその抗原抗体検出系の確立が
所望されている。

【００１４】

【問題を解決するための手段】このような状況のもと
に、本発明者らはＣ型肝炎の病因ウイルス、もしくはそ
のウイルス遺伝子のクローニングを目的として、研究を
重ねた結果、日本人肝炎患者血清よりＣ型肝炎ウイルス
に由来するペプチドをコードしている全遺伝子をクロー
ニングすることに成功した。

【００１５】すなわち、本発明者らは日本人献血者のＧ
ＰＴ高値血漿を用いて、従来の免疫血清学的方法とは違
った、新しい分子遺伝学的手法を取り入れたイムノスク
リーニング法を駆使した結果、Ｃ型肝炎ウイルスに特有
な遺伝子断片を複数クローン得た。そして、これらの塩
基配列を決定し、各々の配列を照合することにより、Ｃ
型肝炎ウイルス遺伝子の全長と考えられるｃＤＮＡを得
ることに成功した。本発明はこれらの遺伝子断片とこれ
から予測されるポリペプチド並びにその利用法を提供す
るものである。

【００１６】本発明の目的とするような核酸断片をクロ
ーニングするに際しては、研究材料としてＣ型肝炎に感
染した日本人の肝臓、あるいはＣ型肝炎を感染させたチ
ンパンジーの肝臓を用い、ｍＲＮＡを抽出しこれを基に
ｃＤＮＡを合成して、その中から、染色体ＤＮＡとのサ
ブトラクションによりウイルス特異的ｃＤＮＡを選択し
てくることが１つの戦略と考えられる。しかしながら、
これに必要な良好な実験材料を充分な量確保することは
極めて困難である。もう１つの研究材料として、Ｃ型肝
炎感染者あるいは感染チンパンジーの血漿が考慮され得
る。

【００１７】すでにヒトではＣ型肝炎キャリアーの存在
が確認されており、これらの血漿からＨＣＶｃＤＮＡを
クローニングすることにも我々は成功している（特開平
3−103180）。クローニングの際に複数のヒト血漿を出
発材料とすれば、複数種のＨＣＶｃＤＮＡをクローニン
グできるが、それらを１本のＨＣＶゲノムとして連結す
れば複数種のＨＣＶｃＤＮＡ断片からなるキメラゲノム
になる可能性が高い。キメラゲノムは本来のウイルスの
ゲノムを反映していないのであるから、当然、ＨＣＶ感
染症を克服するために必要なあらゆる医療手段および材
料を得るための出発材料としては最適ではない。

【００１８】そこで、我々は単一種ＨＣＶゲノムを確立
するために、単一の日本人血漿を出発材料としてＨＣＶ
ｃＤＮＡのクローニングを行った。その結果、ＨＣＶ−
ＲＮＡの全長と考えられるサイズに対応するｃＤＮＡを
クローニングすることに成功した。

【００１９】このｃＤＮＡは単一種のＨＣＶゲノムの配
列を反映している。一方、これまで報告されているＨＣ
Ｖゲノムの配列は、すべてヒトのプール血漿またはチン
パンジーの血漿を材料としているためＨＣＶの全配列と
してみれば複数種のキメラまたはチンパンジー由来のも
のになっている可能性が高く、今回我々がクローン化し
たＨＣＶｃＤＮＡの配列とは明らかに異なる。

【００２０】血漿中のＣ型肝炎ウイルス濃度は先に述べ
たように10²〜10³程度しかないと推定されることから、
ウイルス核酸の抽出およびｃＤＮＡの合成には1,000倍
程度、ウイルスを濃縮する必要がある。しかしながら、
ヒト血漿は７％前後の蛋白溶液で、ただ単に濃縮するこ
とは不可能であり、除蛋白をしながらウイルスのみを濃
縮する必要がある。本発明者らが用いたポリエチレング
リコール(ＰＥＧ)などの沈澱剤による沈澱形成は、比較
的簡便に行なうことができ、大量の血漿の処理にも適し
ており、ウイルスの失活も少ない温和な方法である。こ
のほかには、超遠心法によるペレッティング、硫安など
の塩類の添加による塩析法、限外濾過、ゲルクロマトグ
ラフィーなどが用いられ得る。上記のようにして1,000
倍程度に濃縮した血漿をグアニジウムチオシアネートで
処理し、フェノール／クロロホルムで抽出を行ない、エ
タノール沈澱により濃縮して、血漿中の全核酸を精製す
る。次にＤＮＡ分解酵素で混入しているヒト由来のＤＮ
Ａを分解し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノー
ル沈澱によりＲＮＡを精製する。精製したＲＮＡよりｃ
ＤＮＡを合成し、λgt11ベクターに挿入しｃＤＮＡライ
ブラリーを作製する。

【００２１】λファージを大腸菌に感染させ、細菌培養
プレートに播種し、42℃で数時間培養する。その後、ニ
トロセルロースフィルター(ＮＣフィルター)をかぶせ数
時間培養し、ＮＣフィルターを剥してレプリカをとる。
このレプリカをブロッキング液で処理し、ＰＢＳなどで
洗浄後、イムノスクリーニングを行なう。すなわち、レ
プリカをＣ型肝炎回復期、あるいは急性期のヒトまたは
チンパンジー血清と反応させ、ＰＢＳなどで洗浄後、酵
素標識抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭと反応させ、洗浄後、
基質溶液と反応させて発色させる。発色したプラークに
対応するファージを選択し、２次スクリーニングを行な
い、再現性のあるクローンを得た。

【００２２】本発明によって得られた遺伝子配列からな
る核酸断片を適当な発現系を用いて発現させ、得られた
Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用
し、Ｃ型肝炎ウイルスの抗体検査に使用することができ
る。その抗体検査法としては、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免
疫測定法）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ウエス
タンブロット法及び凝集法のいずれにも使用することが
可能である。また、発現された蛋白を動物に免疫して、
抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体を調製し、これを用いてＣ型肝
炎ウイルス感染患者の肝組織中のＣ型肝炎ウイルスを検
出することも可能である。

【００２３】さらに、本発明で得られたＣ型肝炎ウイル
ス構成ポリペプチドを抗原として使用すると、Ｃ型肝炎
感染予防のためのワクチンの作製に極めて有用である。

【００２４】また、本発明で得られた遺伝子配列からな
る核酸断片のうち少なくとも10塩基以上を有する遺伝子
断片は、測定サンプル中の核酸とハイブリダイゼーショ
ンさせることによってＣ型肝炎ウイルスを検出する、Ｄ
ＮＡプローブ診断試薬の開発に極めて有用である。

【００２５】さらに、本発明によりＣ型肝炎ウイルス構
成ポリペプチドをコードする核酸配列からなる全遺伝子
断片が得られた結果、その全遺伝子断片またはその一部
を動物培養細胞に導入し、感染させることによって、Ｃ
型肝炎ウイルス粒子が得られる可能性が示唆される。

【００２６】

【発明の効果】このような本発明のＣ型肝炎ウイルスポ
リペプチドをコードする核酸断片、Ｃ型肝炎ウイルス構
成ポリペプチド及びこれらを利用したＣ型肝炎ウイルス
の各種検出方法は、特に日本におけるＣ型肝炎ウイルス
の検出において極めて有用であると考えれらる。

【００２７】以下、実施例に沿って本発明を更に詳細に
説明するが、これらの実施例は本発明の種々の具体例を
説明するものであって、本発明はこれらの実施例に限定
されるものではない。

【００２８】

【実施例１】ヒト血漿の濃縮 ＨＢｓ抗原陰性でＧＰＴ値100以上の一人の日本人血漿
を以下の方法で約1,000倍に濃縮した。まず、ヒト血漿
を粗遠心し、不溶物を除去した。これに１／10量の５Ｍ
塩化ナトリウム液、次いで１／10量の40％(W/W)ポリエ
チレングリコール液(ＰＥＧ6,000和光純薬社製、平均分
子量7500)を４℃にて攪拌しながら添加した。１時間静
置した後、7,000回転で、20分間遠心分離して上清を除
き、沈渣に初めの血漿の約１／20量のＴＮＥ液(10mＭ T
ris-HCl、pH7.4、１mＭ ＥＤＴＡ、140mＭ NaCl)を加え
再溶解した。この溶液を蔗糖の20％、15％、10％及び５
％ＴＮＥ液を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、
４℃、80,000×Ｇの条件で 12時間超遠心分離した。分
離後、上清を除去し沈渣を８mlのＰＢＳに溶解してＧＯ
Ｔ、ＧＰＴ高値ヒト血漿の1,000倍濃縮物とした。

【００２９】

【実施例２】ＧＯＴ、ＧＰＴ高値ヒト血漿濃縮物からのＲＮＡの精製 まず、前記の1,000倍濃縮血漿８mlに５倍量のグアニジ
ウムチオシアネート溶液(４Ｍ グアニジウムチオシアネ
ート、50mＭTris-HCl pH7.6、10mＭＥＤＴＡ、0.1Ｍ ２
-メルカプトエタノール、２％ザルコシル)を加え、攪拌
した後、フェノール／クロロホルム抽出し、グリコーゲ
ンをキャリアーとしてエタノール沈澱により濃縮血漿中
の全核酸を精製した。次に、この全核酸中に存在するヒ
ト由来のＤＮＡを分解するために、２mＭバナジルリボ
ヌクレオチドコンプレックス存在下、RNaseフリーDNase
1.15KU/ml(ベーリンガー／マンハイム社製)、50mＭ Tr
is-HCl pH7.4、１mＭ ＥＤＴＡ、10mＭ MgCl₂の混液400
μl中にて、37℃、30分間処理した。その後、250mＭ Ｅ
ＤＴＡ液16μl、10％ＳＤＳ液８μlを加え反応を停止
し、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱に
よりＲＮＡを精製した。さらに、このＲＮＡ中に存在す
る多量のグリコーゲン及び微量に存在すると思われる不
純物を除去するために、QIAGEN pack-100(QIAGEN社製)
を用いて精製操作を行なった。

【００３０】

【実施例３】ｃＤＮＡライブラリーの構築 前述の方法で精製したＲＮＡの全てを、ｃＤＮＡ合成シ
ステム(アマシャム社製)を用いてｃＤＮＡの合成を行な
った。次に、合成したｃＤＮＡをｃＤＮＡクローニング
λｇｔ11(アマシャム社製)によりλｇｔ11ベクターにク
ローニングした。invitroパッケジーングの結果、1.2×
10⁶プラークフォーミングユニッット(ＰＦＵ)のライブ
ラリーを得た。

【００３１】

【実施例４】Ｃ型肝炎(ＨＣ)回復期及びキャリアー期のチンパンジー
血清によるＨＣウイルス関連クローンのスクリーニング (1)大腸菌ライゼートの調製 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いる１次抗
体はＨＣ回復期及びキャリアー期のチンパンジー血漿で
あることから、高い非特異反応が予想された。そこで、
この非特異反応を抑えるためにスクリーニング用チンパ
ンジー血漿の吸収操作に用いる大腸菌Ｙ1090のライゼー
トを調製した。即ち、単一コロニーからアンピシリン50
μg／mlを含むＬＢ培地(１％Bacto-tryptone(ジフコ社
製)、0.5％Bacto-yeast extract(ジフコ社製)、１％NaC
l、pH7.5)中で37℃、一夜培養した大腸菌Ｙ1090培養液2
0mlを2リットルのＬＢ培地に加え、さらに37℃で一夜培
養した。この培養液を遠心管に移し、9,000回転、10分
間、４℃で遠心分離し、上清を除去して沈渣１ｇ当り４
mlのＲＩＰＡ液(１％デオキシコール酸ナトリウム、１
％ Triton X-100、0.3Ｍ NaCl、0.1％ＳＤＳ、0.1Ｍ Tr
is-HCl pH7.5、１mＭ ＰＭＳＦ)を加えて可溶化し、こ
れをさらに9,000回転、10分間、４℃で遠心分離してそ
の上清を大腸菌ライゼートとした。

【００３２】(2)抗体スクリーニング用レプリカフィル
ターの作製 ＧＯＴ、ＧＰＴ高値ヒト血漿濃縮物中のＲＮＡより構築
したｃＤＮＡライブラリーから、１枚のＬＢプレート
[1.5％ Agar(日水製薬社製)、１％Bacto-tryptone、0.5
％Bacto-yeast extract、１％NaCl pH7.5、50μg／mlア
ンピシリンの入った細菌培養用プレート(ヌンク社製; 2
3cm×23cm)]当り10,000PFUのファージをとり、大腸菌Ｙ
1090に37℃で15分間感染させて、Top Agar 40ml(0.7％A
gar、１％Bacto-tryptone、0.5％Bacto-yeast extrac
t、１％NaCl、pH7.5、50μg／mlアンピシリン)と共に播
種し、42℃で４〜５時間培養した。その後、10mＭ ＩＰ
ＴＧ(シグマ社製)を染み込ませたニトロセルロースフィ
ルター(ＮＣフィルター: Ｓ＆Ｓ社製、Code BA85、23cm
×23cm)をかぶせ、さらに37℃で培養を続けた。３時間
後、ＮＣフィルターをプレートから剥し、ＰＢＳで洗浄
後、ブロッキング液(５％スキムミルク、0.05％ NaN₃を
含むＰＢＳ溶液)に浸し、４℃で一夜振盪した。

【００３３】(3)抗体スクリーニング ブロッキング液中で一夜浸したレプリカフィルターをＰ
ＢＳで洗浄後、ＰＢＳで10倍に希釈したＨＣ回復期及び
キャリアー期のチンパンジー血漿(スクリーニング用血
漿; ＨＣ回復期及びキャリアー期のチンパンジー血漿を
ＰＢＳで５倍希釈し、1/20量の大腸菌ライゼートを加え
て４℃で一夜非特異反応の吸収操作を行ない、さらにＰ
ＢＳで２倍希釈したもの)に浸し、室温で振盪しながら
反応させた。２時間後、ＰＢＳ-Ｔ(0.05％Tween20を含
有するＰＢＳ溶液)で１回につき15分間、計３回レプリ
カフィルターを洗浄の後、各々1,000倍希釈したペルオ
キシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧとＩｇＭヤギ抗体(ＭＢＬ
社製、Fab)の入ったインキュベーションバッファー(１
％牛血清アルブミンを含有するＰＢＳ溶液)に浸し、37
℃で振盪しながら反応させた。１時間後、ＰＢＳ-Ｔで
１回につき15分間、計４回、その後ＰＢＳで５分間洗浄
後、発色液(0.02％ＤＡＢ(シグマ社製)、0.1％NaCl₂・６
H₂O、0.005％H₂O₂)に浸し発色させた。ＮＣフィルター
上で発色したプラークに対応するファージを選択し、２
次スクリーニングを行なった。すなわち、１次スクリー
ニングで選択した各ファージ 200ＰＦＵを別々に挿入断
片のないファージ 200ＰＦＵと共に大腸菌Ｙ1090に感染
させ、90mmシャーレ(ベクトンディッキンソン社製)のＬ
Ｂプレートに播種し、レプリカフィルターを作製した。
これらを上述の方法で抗体スクリーニングし、ＨＣ回復
期あるいはキャリアー期のチンパンジー血漿と再現性よ
く反応するファージを複数クローンを得た。該ファージ
ＤＮＡを常法(実験医学 臨時増刊号、遺伝子工学総集編
５(11)、p.31(1987)参照)に従って精製し、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ(東洋紡社製)切断後、pBluescriptII SK(-)ベ
クターのＥｃｏＲＩ部位に挿入し、サブクローニングを
行なった(Hanahan,D., J. Mol. Biol. 166, p557(1983)
参照)。サブクローニングした該プラスミドｐＢＳ1〜33
をＥｃｏＲＩ切断後、電気泳動で２％アガロースゲルに
展開したところ、１〜２Kbpの挿入断片が確認できた。

【００３４】

【実施例５】ｃＤＮＡクローンの核酸塩基配列とアミノ酸配列 (1)ｃＤＮＡクローンの塩基配列の決定 種々のサイズの遺伝子断片が組み込まれた各プラスミド
ＤＮＡを鋳型とし、標識材料として[α-³²Ｐ]ｄＣＴＰ
(800Ci／mmol)を用いた。Klenow fragmentによるポリメ
ラーゼ反応は宝酒造の７ＤＥＡＺＡシークエンシングキ
ットによって行なった。さらに、８％のポリアクリルア
ミド−８Ｍウレアゲルを用いて、４時間1,800Ｖで電気
泳動し、16時間感光した後、塩基配列を解読した。

【００３５】得られた各クローンの塩基配列を決定し、
それらを重複部分を照合することによりＨＣＶ遺伝子の
全長に相当するｃＤＮＡの塩基配列を決定した。

【００３６】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：9391 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（cDNA to viral RNA） 配列の特徴 起源 生物名：非Ａ非Ｂ型肝炎ウイルス 配列 CACTCCCCTG TGAGGAACTA CTGTCTTCAC GCAGAAAGCG TCTAGCCATG GCGTTAGTAT 60 GAGTGTCGTG CAGCCTCCAG GACCCCCCCT CCCGGGAGAG CCATAGTGGT CTGCGGAACC 120 GGTGAGTACA CCGGAATTGC CAGGACGACC GGGTCCTTTC TTGGATCAAC CCGCTCAATG 180 CCTGGAGATT TGGGCGTGCC CCCGCAAGAC TGCTAGCCGA GTAGTGTTGG GTCGCGAAAG 240 GCCTTGTGGT ACTGCCTGAT AGGGTGCTTG CGAGTGCCCC GGGAGGTCTC GTAGACCGTG 300 CACC ATG AGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA CGT AAC ACC 349 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr 1 5 10 15 AAC CGC CGC CCA CAG GAG GTC AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC GTT 397 Asn Arg Arg Pro Gln Glu Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val 20 25 30 GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG CGC 445 Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg 35 40 45 GCG ATC AGG AAG ACT TCC GAG CGG TCG CAA CCC CGT GGA AGG CGA CAG 493 Ala Ile Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg Arg Gln 50 55 60 CCT ATC CCC AAG GCT CGC CGG CCC GAG GGC AGG GCC TGG GCT CAG CCC 541 Pro Ile Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro 65 70 75 GGG TAT CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC ATG GGG TGG GCA GGA 589 Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Met Gly Trp Ala Gly 80 85 90 95 TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG GAC 637 Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp 100 105 110 CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA 685 Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr 115 120 125 TGC GGC CTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC GTT CCG CTC GTC GGC GGC CCC 733 Cys Gly Leu Ala Asp Leu Met Gly Tyr Val Pro Leu Val Gly Gly Pro 130 135 140 CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCC TTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG 781 Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu 145 150 155 GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAC ATG CCC GGT TGC TCT TTT TCT 829 Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Met Pro Gly Cys Ser Phe Ser 160 165 170 175 ATC TTC CTC TTG GCT CTG CTG TCC TGT CTG ACC GTA CCA GCT TCC GCT 877 Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Val Pro Ala Ser Ala 180 185 190 CAT GAG GTG CGT AAC GCG TCC GGG GTA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC 925 His Glu Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp Cys 195 200 205 TCC AAC TCA AGC ATT GTG TTT GAG GCG GCG GAC TTG ATC ATG CGT ACT 973 Ser Asn Ser Ser Ile Val Phe Glu Ala Ala Asp Leu Ile Met Arg Thr 210 215 220 CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG GGT AAC TCC TCC CGC TGC TGG 1021 Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Gly Asn Ser Ser Arg Cys Trp 225 230 235 GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTC GCG GCC AGG AAT GCT ACC ATC CAC ACT 1069 Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ala Thr Ile His Thr 240 245 250 255 ACG ACA ATA CGA CAC CAC GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT CTC 1117 Thr Thr Ile Arg His His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Leu 260 265 270 TGC TCT GCT ATG TAC GTG GGG GAC CTC TGC GGA TCT GTT TTC CTC GTC 1165 Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val 275 280 285 TCT CAG CTG TTC ACC TTC TCG CCC CGC CGG CAT GCG ACA TTG CAG GAC 1213 Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Ala Thr Leu Gln Asp 290 295 300 TGC AAT TGT TCG ATC TAC CCC GGC CAC GCG TCA GGT CAC CGC ATG GCC 1261 Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Ala Ser Gly His Arg Met Ala 305 310 315 TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTC GTA GTG TCG 1309 Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser 320 325 330 335 CAG TTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTC ATC GAC ATG GTG GCG GGG GCC 1357 Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Ile Asp Met Val Ala Gly Ala 340 345 350 CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GCG GGG AAC 1405 His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Ala Gly Asn 355 360 365 TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTT TTT GCC GGC GTT GAC GGG 1453 Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly 370 375 380 CAC ACC CTC ACA ACG GGG GGG CAC GCT GCC CAC CTC ACC AGC GGG TTC 1501 His Thr Leu Thr Thr Gly Gly His Ala Ala His Leu Thr Ser Gly Phe 385 390 395 GCG GGC CTC TTT ACA CCT GGG CCG TCT CAG AGA ATC CAG CTT ATA AAC 1549 Ala Gly Leu Phe Thr Pro Gly Pro Ser Gln Arg Ile Gln Leu Ile Asn 400 405 410 415 ACC AAT GGC AGT TGG CAC ATC AAC AGG ACT GCC CTG AAC TGC AAT GAC 1597 Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp 420 425 430 TCC CTC CAG ACT GGG TTC CTT GCC GCC CTG TCC TAC ACA TAC AGG TTC 1645 Ser Leu Gln Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Ser Tyr Thr Tyr Arg Phe 435 440 445 AAC TCG TCC GGA TGC CCG GGG CGC ATG GCC AGC TGC CGC TCC ATT GAC 1693 Asn Ser Ser Gly Cys Pro Gly Arg Met Ala Ser Cys Arg Ser Ile Asp 450 455 460 AAG TTC GAC CAG GGA TGG GGT CCC ATC ACT TAT GCT GAT CCT AAA GAC 1741 Lys Phe Asp Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr Tyr Ala Asp Pro Lys Asp 465 470 475 CCG GAC CAG AGG CCT TAT TGC TGG CAC TAC GCA CCA CAA CAG TGT GGT 1789 Pro Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Gln Gln Cys Gly 480 485 490 495 ATC ATA CCC CGG TCC GAG GCG TGC GGT CCA GTG TAT TGC TCT ACC CCA 1837 Ile Ile Pro Arg Ser Glu Ala Cys Gly Pro Val Tyr Cys Ser Thr Pro 500 505 510 AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGT GCC CCT ACG TAT 1885 Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr Tyr 515 520 525 AAC TGG GGG GAT AAT GAG ACG GAC GTG CTG CTC CTA AAC AAC ACG CGG 1933 Asn Trp Gly Asp Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr Arg 530 535 540 CCG CCG CAA GGC AAC TGG TTC GGC TGT ACA TGG ATG AAT AGC ACT GGG 1981 Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met Asn Ser Thr Gly 545 550 555 TTC ACC AAG ACG TGC GGG GCC CCC CCG TGT AAC ATC GGG GGG GTC GGC 2029 Phe Thr Lys Thr Cys Gly Ala Pro Pro Cys Asn Ile Gly Gly Val Gly 560 565 570 575 AAT AAC ACC TTG ACC TGC CCC ACG GAC TGC TTC CGG AAG CAC CCC GAG 2077 Asn Asn Thr Leu Thr Cys Pro Thr Asp Cys Phe Arg Lys His Pro Glu 580 585 590 GCC ACG TAC TCA AAA TGT GGC TCG GGG CCT TGG TTG ACA CCT AGG TGC 2125 Ala Thr Tyr Ser Lys Cys Gly Ser Gly Pro Trp Leu Thr Pro Arg Cys 595 600 605 ATG GTT GAC TAC CCA TAC AGG CTC TGG CAC TAC CCC TGC ACT GTC AAC 2173 Met Val Asp Tyr Pro Tyr Arg Leu Trp His Tyr Pro Cys Thr Val Asn 610 615 620 TTC TCC ATC TTT AAG GTT AGG ATG TAT GTG GGG GGC GTG GAG CAC AGG 2221 Phe Ser Ile Phe Lys Val Arg Met Tyr Val Gly Gly Val Glu His Arg 625 630 635 CTT AAT GCT GCA TGC AAC TGG ACC CGA GGA GAG CGT TGT GAC TTG GAC 2269 Leu Asn Ala Ala Cys Asn Trp Thr Arg Gly Glu Arg Cys Asp Leu Asp 640 645 650 655 GAC AGG GAC AGA TCG GAG CTC AGC CCG TTA CTG CTC TCC ACA ACA GAG 2317 Asp Arg Asp Arg Ser Glu Leu Ser Pro Leu Leu Leu Ser Thr Thr Glu 660 665 670 TGG CAG GTT CTG CCC TGC TCT TTC ACC ACC CTA CCG GCT CTG TCC ACT 2365 Trp Gln Val Leu Pro Cys Ser Phe Thr Thr Leu Pro Ala Leu Ser Thr 675 680 685 GGC TTG ATC CAC CTC CAT CAG AAC ATC GTG GAC GTG CAA TAC CTG TAC 2413 Gly Leu Ile His Leu His Gln Asn Ile Val Asp Val Gln Tyr Leu Tyr 690 695 700 GGT ATA GGG TCA GCG GTT GTC TCC TTT GCA ATC AAA TGG GAG TAT GTC 2461 Gly Ile Gly Ser Ala Val Val Ser Phe Ala Ile Lys Trp Glu Tyr Val 705 710 715 GTG TTG CTT TTC CTT CTC CTG GCG GAC GCG CGC GTC TGT GCC TGC TTG 2509 Val Leu Leu Phe Leu Leu Leu Ala Asp Ala Arg Val Cys Ala Cys Leu 720 725 730 735 TGG ATG ATG CTG CTG ATA GCC CGA GCC GAG GCC GCC TTA GAG AAC CTG 2557 Trp Met Met Leu Leu Ile Ala Arg Ala Glu Ala Ala Leu Glu Asn Leu 740 745 750 GTG GCC CTC AAT GCA GCG TCC GTT GCC GGA GCG CAC GGC ATC CTC TCC 2605 Val Ala Leu Asn Ala Ala Ser Val Ala Gly Ala His Gly Ile Leu Ser 755 760 765 TTC CTC GTG TTC TTC TGT GCC GCT TGG TAC ATC AAG GGC AGG CTG GTC 2653 Phe Leu Val Phe Phe Cys Ala Ala Trp Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Val 770 775 780 CCT GGG GCG GCA TAT GCT TTC TAT GGC GCA TGG CCG CTG CTC CTG CTC 2701 Pro Gly Ala Ala Tyr Ala Phe Tyr Gly Ala Trp Pro Leu Leu Leu Leu 785 790 795 CTC TTG ACA TTA CCA CCA CGA GCT TAC GCC ATG GAC CGG GAG ATG GCT 2749 Leu Leu Thr Leu Pro Pro Arg Ala Tyr Ala Met Asp Arg Glu Met Ala 800 805 810 815 GCA TCG TGC GGA GGC GCG GTT TTT GTG GGT CTG GCA TTA TTG ACC TTG 2797 Ala Ser Cys Gly Gly Ala Val Phe Val Gly Leu Ala Leu Leu Thr Leu 820 825 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Leu Gly Ala 930 935 940 CTG ACG GGC ACG TAC GTC TAT AAT CAC CTC ACC CCA CTG CGG GAT TGG 3181 Leu Thr Gly Thr Tyr Val Tyr Asn His Leu Thr Pro Leu Arg Asp Trp 945 950 955 GCC CAC GCC GGC CTA CGG GAC CTT GCG GTA GCA GTG GAG CCT GTC ACC 3229 Ala His Ala Gly Leu Arg Asp Leu Ala Val Ala Val Glu Pro Val Thr 960 965 970 975 TTC TCT GAC ATG GAG ACC AAG ATC ATC ACC TGG GGG GCA GAC ACC GCG 3277 Phe Ser Asp Met Glu Thr Lys Ile Ile Thr Trp Gly Ala Asp Thr Ala 980 985 990 GCG TGT GGG GAC ATC ATC CTG GGC CTA CCT GTC TCC GCC CGA AGG GGA 3325 Ala Cys Gly Asp Ile Ile Leu Gly Leu Pro Val Ser Ala Arg Arg Gly 995 1000 1005 AGG GAG ATA CTC CTG GGG CCG GCC GAT AGT CTA GTA GGG CAG GGG TGG 3373 Arg Glu Ile Leu Leu Gly Pro Ala Asp Ser Leu Val Gly Gln Gly Trp 1010 1015 1020 CGA CTC CTT GCG CCC ATC ACG GCC TAC TCC CGA CAG ACC CGG GGC CTA 3421 Arg Leu Leu Ala Pro Ile Thr Ala Tyr Ser Arg Gln Thr Arg Gly Leu 1025 1030 1035 CTT GGT TGC ATC ATC ACG AGT CTC ACA GGC CGG GAC AAG AAC CAG GTC 3469 Leu Gly Cys Ile Ile Thr Ser Leu Thr Gly Arg Asp Lys Asn Gln Val 1040 1045 1050 1055 GAG GGG GAG GTT CAA GTG GTC TCC ACC GCA ACA CAA TCT TTC CTG GCG 3517 Glu Gly Glu Val Gln Val Val Ser Thr Ala Thr Gln Ser Phe Leu Ala 1060 1065 1070 ACC TGC GTC AAC GGC GTA TGT TGG ACT GTC TAC CAT GGT GCT GGC TCA 3565 Thr Cys Val Asn Gly Val Cys Trp Thr Val Tyr His Gly Ala Gly Ser 1075 1080 1085 AAG ACT CTA GCC GGC CCA AAA GGC CCA ATC GCC CAG ATG TAC ACT AAT 3613 Lys Thr Leu Ala Gly Pro Lys Gly Pro Ile Ala Gln Met Tyr Thr Asn 1090 1095 1100 GTA GAC CAG GAT CTC GTC GGC TGG CCG GCG CCC CCC GGG GCG CGT TCC 3661 Val Asp Gln Asp Leu Val Gly Trp Pro Ala Pro Pro Gly Ala Arg Ser 1105 1110 1115 CTG ACA CCA TGC ACC TGT GGC AGC TCG GAC CTT TAC TTG GTT ACG AGA 3709 Leu Thr Pro Cys Thr Cys Gly Ser Ser Asp Leu Tyr Leu Val Thr Arg 1120 1125 1130 1135 CAT GCA GAT GTT ATT CCG GTG CGC CGG CGG GGC GAC AAT AGA GGG AGC 3757 His Ala Asp Val Ile Pro Val Arg Arg Arg Gly Asp Asn Arg Gly Ser 1140 1145 1150 TTG CTC TCC CCC AGG CCT GTC TCC TAC TTG AAG GGC 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GCG TAT ATG TCT AAA GCA CAT GGT ACC GAC CCT AAC ATC AGG 4141 Phe Gly Ala Tyr Met Ser Lys Ala His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Arg 1265 1270 1275 ACT GGG GTA AGG ACC ATT ACC ACG GGC GCC CCC ATT ACG TAC TCC ACC 4189 Thr Gly Val Arg Thr Ile Thr Thr Gly Ala Pro Ile Thr Tyr Ser Thr 1280 1285 1290 1295 TAT GGC AAG TTC CTT GCC GAC GGT GGT TGC TCC GGG GGC GCT TAC GAC 4237 Tyr Gly Lys Phe Leu Ala Asp Gly Gly Cys Ser Gly Gly Ala Tyr Asp 1300 1305 1310 ATC ATA ATG TGC GAT GAG TGC CAC TCA ACT GAC TCA ACT ACC ATC TTG 4285 Ile Ile Met Cys Asp Glu Cys His Ser Thr Asp Ser Thr Thr Ile Leu 1315 1320 1325 GGC ATC GGC ACA GTC CTG GAC CAA GCG GAG ACG GCT GGA GCA CGG CTT 4333 Gly Ile Gly Thr Val Leu Asp Gln Ala Glu Thr Ala Gly Ala Arg Leu 1330 1335 1340 GTC GTG CTC GCC ACC GCT ACG CCT CCA GGA TCG GTC ACC GTG CCA CAC 4381 Val Val Leu Ala Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Val Thr Val Pro His 1345 1350 1355 CCC AAT ATC GAG GAG GTG GCC CTG TCG AAC ACT GGA GAG ATC CCC TTC 4429 Pro Asn Ile Glu Glu Val Ala Leu Ser Asn Thr Gly Glu Ile Pro Phe 1360 1365 1370 1375 TAT GGC AAA GCC ATC CCC ATC GAA GCC ATC ATG GGG GGA AGG CAC CTC 4477 Tyr Gly Lys Ala Ile Pro Ile Glu Ala Ile Met Gly Gly Arg His Leu 1380 1385 1390 ATT TTC TGT CAC TCC AAG AAG AAG TGC GAC GAG CTT GCC GCA AAG CTG 4525 Ile Phe Cys His Ser Lys Lys Lys Cys Asp Glu Leu Ala Ala Lys Leu 1395 1400 1405 TCA GGC CTC GGA ATC AAT GCT GTA GCG TAT TAC CGG GGT CTT GAT GTG 4573 Ser Gly Leu Gly Ile Asn Ala Val Ala Tyr Tyr Arg Gly Leu Asp Val 1410 1415 1420 TCC GTC ATA CCG ACC AGC GGA GAC GTC GTT GTC GTG GCA ACA GAC GCT 4621 Ser Val Ile Pro Thr Ser Gly Asp Val Val Val Val Ala Thr Asp Ala 1425 1430 1435 CTA ATG ACG GGC TAT ACC GGT GAC TTT GAT TCA GTG ATC GAC TGT AAT 4669 Leu Met Thr Gly Tyr Thr Gly Asp Phe Asp Ser Val Ile Asp Cys Asn 1440 1445 1450 1455 ACG TGT GTC ACC CAG ACA GTC GAC TTC AGC TTG GAC CCC ACC TTC ACC 4717 Thr Cys Val Thr Gln Thr Val Asp Phe Ser Leu Asp Pro Thr Phe Thr 1460 1465 1470 ATT GAG ACG ACG ACC GTG CCC CAA GAC GCA GTG TCG CGC TCG CAG CGG 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CAA GCC ACG GTG TGC GCC AGG GCT CAG GCC 5101 Pro Tyr Leu Val Ala Tyr Gln Ala Thr Val Cys Ala Arg Ala Gln Ala 1585 1590 1595 CCA CCT CCA TCG TGG GAT CAA ATG TGG AAG TGT CTC ATA CGG CTA AAA 5149 Pro Pro Pro Ser Trp Asp Gln Met Trp Lys Cys Leu Ile Arg Leu Lys 1600 1605 1610 1615 CCC ACG CTG CAC GGG CCA ACG CCC CTG CTG TAT AGG CTA GGG GCC GTC 5197 Pro Thr Leu His Gly Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Arg Leu Gly Ala Val 1620 1625 1630 CAA AAT GAG GTC ACC CTC ACA CAC CCC ATA ACC AAA TAC ATC ATG GCA 5245 Gln Asn Glu Val Thr Leu Thr His Pro Ile Thr Lys Tyr Ile Met Ala 1635 1640 1645 TGC ATG TGG GCC GAC CTG GAA GTC GTC ACC AGC ACC TGG GTG CTG GTA 5293 Cys Met Trp Ala Asp Leu Glu Val Val Thr Ser Thr Trp Val Leu Val 1650 1655 1660 GGC GGA GTC CTC GCA GCT CTG GCC GCA TAT TGC CTG ACA ACA GGC AGT 5341 Gly Gly Val Leu Ala Ala Leu Ala Ala Tyr Cys Leu Thr Thr Gly Ser 1665 1670 1675 GTG GTT ATC GTG GGT AGG ATC ATC TTG TCC GGG AGG CCG GCT GTC GTT 5389 Val Val Ile Val Gly Arg Ile Ile Leu Ser Gly Arg Pro Ala Val Val 1680 1685 1690 1695 CCC GAT AGG GAA GTC CTC TAC CGG GAG TTC GAT GAA ATG GAA GAA TGC 5437 Pro Asp Arg Glu Val Leu Tyr Arg Glu Phe Asp Glu Met Glu Glu Cys 1700 1705 1710 GCC TCG CAC CTC CCT TAC ATC GAA CAG GGA ATG CAA CTC GCC GAG CAA 5485 Ala Ser His Leu Pro Tyr Ile Glu Gln Gly Met Gln Leu Ala Glu Gln 1715 1720 1725 TTC AAG CAG AAG GCG CTC GGG TTG TTG CAA ACA GCC ACC AAG CAG GCG 5533 Phe Lys Gln Lys Ala Leu Gly Leu Leu Gln Thr Ala Thr Lys Gln Ala 1730 1735 1740 GAG GCT GCC GCT CCC GTG GTG GGG TCC AAG TGG CGA GCT TTT GAG ACC 5581 Glu Ala Ala Ala Pro Val Val Gly Ser Lys Trp Arg Ala Phe Glu Thr 1745 1750 1755 TTC TGG GCA AAG CAC ATG TGG AAT TTC ATC AGC GGG ATA CAG TAC TTA 5629 Phe Trp Ala Lys His Met Trp Asn Phe Ile Ser Gly Ile Gln Tyr Leu 1760 1765 1770 1775 GCG GGC TTA TCC ACC CTG CCT GGG AAC CCC GCG ATA GCA TCA CTG ATG 5677 Ala Gly Leu Ser Thr Leu Pro Gly Asn Pro Ala Ile Ala Ser Leu Met 1780 1785 1790 GCA TTC ACA GCC TCT ATC ACC AGC CCG CTC ACC ACC CAG AAC ACC CTC 5725 Ala Phe Thr 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CAG TGG ATG AAC CGG CTG 6061 Arg His Val Gly Pro Gly Glu Gly Ala Val Gln Trp Met Asn Arg Leu 1905 1910 1915 ATA GCG TTC GCT TCG CGG GGT AAC CAT GTC TCC CCC ACG CAC TAT GTG 6109 Ile Ala Phe Ala Ser Arg Gly Asn His Val Ser Pro Thr His Tyr Val 1920 1925 1930 1935 CCT GAG AGC GAC GCC GCA GCG CGT GTC ACT CAG GTC CTC TCC AGC CTT 6157 Pro Glu Ser Asp Ala Ala Ala Arg Val Thr Gln Val Leu Ser Ser Leu 1940 1945 1950 ACC ATC ACC CAG CTG CTG AAG AGG CTC CAC CAG TGG ATT AAT GAG GAC 6205 Thr Ile Thr Gln Leu Leu Lys Arg Leu His Gln Trp Ile Asn Glu Asp 1955 1960 1965 TGT TCT ACG CCG TGT TCC GGC TCG TGG CTG AGG GAT GTT TGG GAC TGG 6253 Cys Ser Thr Pro Cys Ser Gly Ser Trp Leu Arg Asp Val Trp Asp Trp 1970 1975 1980 GTG TGC ACG GTG TTG AGT GAC TTC AAG ACC TGG CTC CAG TCC AAG CTC 6301 Val Cys Thr Val Leu Ser Asp Phe Lys Thr Trp Leu Gln Ser Lys Leu 1985 1990 1995 CTG CCG CGG TTA CCG GGT GTC CCT TTC CTC TCA TGC CAA CGT GGG TAC 6349 Leu Pro Arg Leu Pro Gly Val Pro Phe Leu Ser Cys Gln Arg Gly Tyr 2000 2005 2010 2015 AAG GGA GTC TGG CGG GGG GAC GGC ATC ATG CAC ACC ACC TGC CCA TGT 6397 Lys Gly Val Trp Arg Gly Asp Gly Ile Met His Thr Thr Cys Pro Cys 2020 2025 2030 GGA GCA CAG ATC GCC GGA CAT GTC AAA AAC GGT TCC ATG AGG ATC ATC 6445 Gly Ala Gln Ile Ala Gly His Val Lys Asn Gly Ser Met Arg Ile Ile 2035 2040 2045 GGG CCG AAA ACC TGC AGC AAC ACG TGG CAT GGA ACA TTC CCC ATC AAC 6493 Gly Pro Lys Thr Cys Ser Asn Thr Trp His Gly Thr Phe Pro Ile Asn 2050 2055 2060 GCG TAC ACC ACG GGC CCC TGC ACG CCT TCC CCG GCG CCA AAC TAT TCC 6541 Ala Tyr Thr Thr Gly Pro Cys Thr Pro Ser Pro Ala Pro Asn Tyr Ser 2065 2070 2075 AAG GCG CTG TGG CGG GTG GCT GCT GAG GAG TAC GTG GAG GTC ACG CGG 6589 Lys Ala Leu Trp Arg Val Ala Ala Glu Glu Tyr Val Glu Val Thr Arg 2080 2085 2090 2095 GTG GGG GAT TTC CAC TAC GTG ACG GGC ATA ACC ACC GAC AAC GTA AAG 6637 Val Gly Asp Phe His Tyr Val Thr Gly Ile Thr Thr Asp Asn Val Lys 2100 2105 2110 TGC CCA TGT CAG GTT CCA GCT CCT GAG TTT TTC ACG GAG GTG GAT GGG 6685 Cys Pro Cys Gln Val Pro Ala Pro Glu Phe Phe Thr Glu Val Asp Gly 2115 2120 2125 GTG CGG TTG CAC AGG TAC GCC CCG GTG TGC AAA CCT CTC TTA CGG GAT 6733 Val Arg Leu His Arg Tyr Ala Pro Val Cys Lys Pro Leu Leu Arg Asp 2130 2135 2140 GAG GTT GTA TTC CAG GTC GGG CTC AAT CAA TAC CTG GTT GGG TCA CAG 6781 Glu Val Val Phe Gln Val Gly Leu Asn Gln Tyr Leu Val Gly Ser Gln 2145 2150 2155 CTC CCA TGC GAG CCC GAA CCG GAC GTA GCA GTG CTC ACT TCC ATG CTC 6829 Leu Pro Cys Glu Pro Glu Pro Asp Val Ala Val Leu Thr Ser Met Leu 2160 2165 2170 2175 ACC GAC CCC TCC CAC ATT ACA GCA GAG GCG GCT AAG CGT AGG TTG GCC 6877 Thr Asp Pro Ser His Ile Thr Ala Glu Ala Ala Lys Arg Arg Leu Ala 2180 2185 2190 AGG GGG TCT CCC CCC TCC TTG GCC AGC TCT TCA GCT AGC CAG CTG TCT 6925 Arg Gly Ser Pro Pro Ser Leu Ala Ser Ser Ser Ala Ser Gln Leu Ser 2195 2200 2205 GCG CCC TCC TTG AGG GCG ACA TGC ACT ACC CAT TCT TCC TAT AAT CTT 6973 Ala Pro Ser Leu Arg Ala Thr Cys Thr Thr His Ser Ser Tyr Asn Leu 2210 2215 2220 GAC TCT CCG GAC GTC GAC CTC ATT GAG GCC AAC CTC CTG TGG CGG CAG 7021 Asp Ser Pro Asp Val Asp Leu Ile Glu Ala Asn Leu Leu Trp Arg Gln 2225 2230 2235 GAG ATG GGC GGA AAC ATC ACC CGC GTG GAG TCG GAG AAC AAG GTG GTA 7069 Glu Met Gly Gly Asn Ile Thr Arg Val Glu Ser Glu Asn Lys Val Val 2240 2245 2250 2255 GTT CTA GAC TCT TTC GAG CCG CTT CGA GCG GAG GGG GAT GAG AAT GAA 7117 Val Leu Asp Ser Phe Glu Pro Leu Arg Ala Glu Gly Asp Glu Asn Glu 2260 2265 2270 ATA TCC ATT GCG GCG GAG ATC CTG CGG AAG TCC AAG AAG TTC CCC GCG 7165 Ile Ser Ile Ala Ala Glu Ile Leu Arg Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ala 2275 2280 2285 GCG ATA CCC ATA TGG GCA CGG CCG GAT TAC AAT CCT CCA TTG TTA GAG 7213 Ala Ile Pro Ile Trp Ala Arg Pro Asp Tyr Asn Pro Pro Leu Leu Glu 2290 2295 2300 TCT TGG AAG AAC CCG GAC TAC GTC CCT CCG GTG GTA CAC GGG TGC CCA 7261 Ser Trp Lys Asn Pro Asp Tyr Val Pro Pro Val Val His Gly Cys Pro 2305 2310 2315 TTG CCA CCT GTC AAG GCC CCT CCA ATA CCA CCT CCA CGG AGA AAA AGG 7309 Leu Pro Pro Val Lys Ala Pro Pro Ile Pro Pro Pro Arg Arg Lys Arg 2320 2325 2330 2335 ACG GTT GTC CTG ACG GAC TCC ACC GTG TCT TCT GTT TTG GCG GAG CTC 7357 Thr Val Val Leu Thr Asp Ser Thr Val Ser Ser Val Leu Ala Glu Leu 2340 2345 2350 GCT ACC AAA ACC TTC GGC AGC TCC GAA TTG TCG GCC GCC GAC AGC GGC 7405 Ala Thr Lys Thr Phe Gly Ser Ser Glu Leu Ser Ala Ala Asp Ser Gly 2355 2360 2365 ACG GCG ACC GCC CCT CCT GAC CAG ACC TCC GAC AAC GGC GGC AAA GAC 7453 Thr Ala Thr Ala Pro Pro Asp Gln Thr Ser Asp Asn Gly Gly Lys Asp 2370 2375 2380 TCC GAC GCT GAG TCA TGC TCC TCT ATG CCC CCC CTT GAG GGG GAG CCG 7501 Ser Asp Ala Glu Ser Cys Ser Ser Met Pro Pro Leu Glu Gly Glu Pro 2385 2390 2395 GGG GAC CCC GAT CTC AGT GAC GGG TCT TGG TCT ACC GTG AGC GAG GAG 7549 Gly Asp Pro Asp Leu Ser Asp Gly Ser Trp Ser Thr Val Ser Glu Glu 2400 2405 2410 2415 GCT GGT GAG AGC GTC GTC TGC TGC TCA ATG TCC TAC ACA TGG ACA GGT 7597 Ala Gly Glu Ser Val Val Cys Cys Ser Met Ser Tyr Thr Trp Thr Gly 2420 2425 2430 GCC CTG ATC ACG CCA TGC GCC GCG GAA GAA AGC AAG CTG CCC ATC AAC 7645 Ala Leu Ile Thr Pro Cys Ala Ala Glu Glu Ser Lys Leu Pro Ile Asn 2435 2440 2445 GCG TTG AGC AAC TCT TTG CTG CGC CAT CAC AAC ATG GTC TAC GCC ACG 7693 Ala Leu Ser Asn Ser Leu Leu Arg His His Asn Met Val Tyr Ala Thr 2450 2455 2460 ACA TCC CGC AGC GCG GGC CTG CGG CAG AAG AAG GTC ACC TTT GAC AGA 7741 Thr Ser Arg Ser Ala Gly Leu Arg Gln Lys Lys Val Thr Phe Asp Arg 2465 2470 2475 CTG CAG GTC CTG GAT GAC CAT TAC CGG GAC GTG CTT AAG GAG ATG AAG 7789 Leu Gln Val Leu Asp Asp His Tyr Arg Asp Val Leu Lys Glu Met Lys 2480 2485 2490 2495 GCA AAG GCG TCC ACA GTC AAG GCT AAA CTT CTA TCC ATA GAA GAA GCC 7837 Ala Lys Ala Ser Thr Val Lys Ala Lys Leu Leu Ser Ile Glu Glu Ala 2500 2505 2510 TGC CGC CTG ACG CCC CCA CAT TCG GCC AAA TCC AAG TTT GGC TAT GGG 7885 Cys Arg Leu Thr Pro Pro His Ser Ala Lys Ser Lys Phe Gly Tyr Gly 2515 2520 2525 GCA AAG GAC GTC CGG AAC CTA TCC AGC AGG GCC ATC AAC CAC TTC CGC 7933 Ala Lys Asp Val Arg Asn Leu Ser Ser Arg Ala Ile Asn His Phe Arg 2530 2535 2540 TCC GTG TGG GAG GAC TTG CTG GAG GAC ACT GTG ACA CCA ATT GAC ACC 7981 Ser Val Trp Glu Asp Leu Leu Glu Asp Thr Val Thr Pro Ile Asp Thr 2545 2550 2555 ACC GTC ATG GCA AAG AAT GAG GTT TTC TGC GTC CAA CCA GAG AAG GGA 8029 Thr Val Met Ala Lys Asn Glu Val Phe Cys Val Gln Pro Glu Lys Gly 2560 2565 2570 2575 GGC CAG AAG CCA GCC CGC CTT ATC GTA TTC CCA GAT TTG GGA GTT CGG 8077 Gly Gln Lys Pro Ala Arg Leu Ile Val Phe Pro Asp Leu Gly Val Arg 2580 2585 2590 GTA TGC GAG AAG ATG GCT CTC TAC GAT GTG GTC TCC ACC CTT CCT CAA 8125 Val Cys Glu Lys Met Ala Leu Tyr Asp Val Val Ser Thr Leu Pro Gln 2595 2600 2605 GCC GTG ATG GGC TCC TCA TAC GGA TTC CAG TAC TCT CCC GGG CAG CGG 8173 Ala Val Met Gly Ser Ser Tyr Gly Phe Gln Tyr Ser Pro Gly Gln Arg 2610 2615 2620 GTC GAG TTC CTG GTA AAA GCC TGG AAA TCA AAG AAA AAC CCT ATG GGC 8221 Val Glu Phe Leu Val Lys Ala Trp Lys Ser Lys Lys Asn Pro Met Gly 2625 2630 2635 TTC TCA TAT GAC ACC CGC TGT TTT GAC TCA ACG GTC ACT GAG AAT GAC 8269 Phe Ser Tyr Asp Thr Arg Cys Phe Asp Ser Thr Val Thr Glu Asn Asp 2640 2645 2650 2655 ATC CGT GTT GAG GAG TCA ATT TAC CAA TGT TGT GAC TTG GCC CCC GAA 8317 Ile Arg Val Glu Glu Ser Ile Tyr Gln Cys Cys Asp Leu Ala Pro Glu 2660 2665 2670 GCC AGA CAG GCT ATA AAA TCG CTC ACA GAG CGG CTT TAT ATC GGG GGT 8365 Ala Arg Gln Ala Ile Lys Ser Leu Thr Glu Arg Leu Tyr Ile Gly Gly 2675 2680 2685 CCC CTG ACT AAT TCA AAA GGG CAG AGC TGT GGT TAT CGC CGG TGC CGC 8413 Pro Leu Thr Asn Ser Lys Gly Gln Ser Cys Gly Tyr Arg Arg Cys Arg 2690 2695 2700 GCG AGC GGC GTG CTG ACG ACT AGC TGC GGT AAT ACC CTC ACA TGT TAC 8461 Ala Ser Gly Val Leu Thr Thr Ser Cys Gly Asn Thr Leu Thr Cys Tyr 2705 2710 2715 TTG AAA GCC TCT GCC GCC TGT CGA GCT GCA AAG CTC CAG GAC TGC ACG 8509 Leu Lys Ala Ser Ala Ala Cys Arg Ala Ala Lys Leu Gln Asp Cys Thr 2720 2725 2730 2735 ATG CTC GTG AAC GGG GAC GAC CGT GTC GTT ATC TGC GAA AGC GCG GGA 8557 Met Leu Val Asn Gly Asp Asp Arg Val Val Ile Cys Glu Ser Ala Gly 2740 2745 2750 ACC CAG GAG GAT GCG GCG AGC CTA CGA GTC TTC ACG GAG GCT ATG ACT 8605 Thr Gln Glu Asp Ala Ala Ser Leu Arg Val Phe Thr Glu Ala Met Thr 2755 2760 2765 AGG TAC TCC GCC CCC CCC GGG GAC TTG CCC CAA CCA GAA TAC GAC TTG 8653 Arg Tyr Ser Ala Pro Pro Gly Asp Leu Pro Gln Pro Glu Tyr Asp Leu 2770 2775 2780 GAG TTG ATA ACA TCA TGT TCC TCC AAT GTG TCG GTC GCG CAC GAT GCA 8701 Glu Leu Ile Thr Ser Cys Ser Ser Asn Val Ser Val Ala His Asp Ala 2785 2790 2795 TCT GGC AAA AGG GTG TAC TAC CTC ACT CGC GAT CCC ACC ACC CCC ATC 8749 Ser Gly Lys Arg Val Tyr Tyr Leu Thr Arg Asp Pro Thr Thr Pro Ile 2800 2805 2810 2815 GCA CGG GCT GCG TGG GAA ACA GCT AGA CAC ACT CCA GTT AAC TCC TGG 8797 Ala Arg Ala Ala Trp Glu Thr Ala Arg His Thr Pro Val Asn Ser Trp 2820 2825 2830 CTA GGC AAC ATT ATC ATG TAT GCG CCC ACC TTA TGG GCA AGG ATG ATT 8845 Leu Gly Asn Ile Ile Met Tyr Ala Pro Thr Leu Trp Ala Arg Met Ile 2835 2840 2845 CTG ATG ACC CAT TTC TTC TCC ATC CTT CTA GCT CAG GAG CAA CTT GAA 8893 Leu Met Thr His Phe Phe Ser Ile Leu Leu Ala Gln Glu Gln Leu Glu 2850 2855 2860 AAA GCC CTG GAT TGC CAA ATC TAC GGG GCC TGT TAC TCC ATT GAG CCA 8941 Lys Ala Leu Asp Cys Gln Ile Tyr Gly Ala Cys Tyr Ser Ile Glu Pro 2865 2870 2875 CTT GAC CTA CCT CAG ATC ATT GAA CGA CTC CAT GGT CTT AGC GCA TTT 8989 Leu Asp Leu Pro Gln Ile Ile Glu Arg Leu His Gly Leu Ser Ala Phe 2880 2885 2890 2895 TCA CTC CAT AGT TAC TCT CCA GGT GAG ATC AAT AGG GTG GCT TCA TGC 9037 Ser Leu His Ser Tyr Ser Pro Gly Glu Ile Asn Arg Val Ala Ser Cys 2900 2905 2910 CTC AGG AAA CTT GGG GTA CCG CCC TTG CGA GTC TGG AGA CAT CGG GCC 9085 Leu Arg Lys Leu Gly Val Pro Pro Leu Arg Val Trp Arg His Arg Ala 2915 2920 2925 AGG AAC GTC CGC GCT AAA CTA CTG TCC CAG GGG GGG AGG GCG GCC ACT 9133 Arg Asn Val Arg Ala Lys Leu Leu Ser Gln Gly Gly Arg Ala Ala Thr 2930 2935 2940 TGC GGC AAA TAC CTC TTC AAC TGG GCA GTA AAG ACC AAG CTC AAA CTC 9181 Cys Gly Lys Tyr Leu Phe Asn Trp Ala Val Lys Thr Lys Leu Lys Leu 2945 2950 2955 ACT CCA ATC CCG GCT GCG TCC CAG TTG GAC TTA TCC GGC TGG TTC GTT 9229 Thr Pro Ile Pro Ala Ala Ser Gln Leu Asp Leu Ser Gly Trp Phe Val 2960 2965 2970 2975 GCT GGC TAC AGC GGG GGA GAC ATA TAT CAC AGC CTG TCT CGT GCC CGA 9277 Ala Gly Tyr Ser Gly Gly Asp Ile Tyr His Ser Leu Ser Arg Ala Arg 2980 2985 2990 CCC CGC TGG TTC ATG CTG TGC CTA CTC CTA CTT TCT GTA GGG GTA GGC 9325 Pro Arg Trp Phe Met Leu Cys Leu Leu Leu Leu Ser Val Gly Val Gly 2995 3000 3005 ATC TAC TTG CTC CCC AAT CGA TGAACGGGGA GCTAAACACT CCAGCCAATA 9376 Ile Tyr Leu Leu Pro Asn Arg 3010 GGCCATTTCC TTTTG 9391

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 13/00 7731−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 7/00 7236−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 8114−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/576 Ｚ 9015−2Ｊ

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ｃ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドをコ
   ードする配列表配列番号１に記載の塩基配列（1〜939
   1）及びこれに等価な塩基配列またはその一部の塩基配
   列からなる核酸。
2. 【請求項２】 配列表配列番号１に記載のアミノ酸配列
   （1〜3014）もしくはその一部からなるＣ型肝炎ウイル
   ス構成ポリペプチド。
3. 【請求項３】 前記特許請求の範囲第１項に記載の核酸
   断片を適当な発現ベクターに組み込み、これを宿主細胞
   内で発現させることにより得られる特許請求の範囲第２
   項記載のＣ型肝炎ウイルス構成ポリペプチド。
4. 【請求項４】 前記特許請求の範囲第１項に記載の核酸
   断片のうち少なくとも10塩基以上を有する遺伝子断片を
   核酸プローブとして使用し、測定サンプル中の核酸とハ
   イブリダイゼーションさせることを特徴とするＣ型肝炎
   ウイルスの検出方法。
5. 【請求項５】 前記特許請求の範囲第２項及び３項記載
   のＣ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用
   し、これに特異的な抗体を検出することを特徴とする抗
   Ｃ型肝炎ウイルス抗体の検出方法。
6. 【請求項６】 ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫測定法)、ＲＩ
   Ａ(ラジオイムノアッセイ)、ウエスタンブロット法及び
   凝集法より選ばれる特許請求の範囲第５項記載の抗Ｃ型
   肝炎ウイルス抗体検出方法。
7. 【請求項７】 前記特許請求の範囲第２項及び３項記載
   のＣ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用
   し、調製される抗Ｃ型肝炎ウイルス抗体。
8. 【請求項８】 前記特許請求の範囲第７項記載の抗体を
   使用することを特徴とするＣ型肝炎ウイルス及びこの関
   連抗原の免疫学的検出方法。
9. 【請求項９】 前記特許請求の範囲第２項及び３項記載
   のＣ型肝炎ウイルス構成ポリペプチドを抗原として使用
   し、調製されるＣ型肝炎ワクチン。
10. 【請求項１０】 前記特許請求の範囲第１項記載の塩基
    配列からなる核酸を動物培養細胞に導入、感染して得ら
    れるＣ型肝炎ウイルス粒子。