JPH0575384B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPH0575384B2 JPH0575384B2 JP59188266A JP18826684A JPH0575384B2 JP H0575384 B2 JPH0575384 B2 JP H0575384B2 JP 59188266 A JP59188266 A JP 59188266A JP 18826684 A JP18826684 A JP 18826684A JP H0575384 B2 JPH0575384 B2 JP H0575384B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- acid
- enzyme
- mmol
- buffer
- activity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/873—Proteus
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
- Apparatus For Radiation Diagnosis (AREA)
- Television Signal Processing For Recording (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、新規な２−オキソカルボン酸レダク
ターゼに関する。 ２−オキソカルボン酸を酵素により還元するこ
とはすでに知られている。この還元のためには共
同基質として、ピリジンヌクレオチドを必要とす
る酵素が用いられる。この種の反応の例として
は、ピルビン酸からのＬ−乳酸の製造があげられ
る（ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケミスト
リー47巻1982年2816頁）。さらに２−ヒドロキシ
カルボン酸のラセミ混合物から、光学的対掌体を
選別する微生物により分解することにより、光学
的に純粋な２−ヒドロキシカルボン酸を製造する
ことも公知である（Appl.Environ.Microbiol.45
巻1983年884頁）。しかしピリジンヌクレオチド依
存性のレダクターゼによる酵素的還元は、酸化さ
れたピリジンヌクレオチドを再生するための第二
の酵素をさらに必要とするという欠点を有する。
しかもピリジンヌクレオチドは長期の使用により
分解する。 本発明者らは、これらの欠点を有しない酵素を
見出した。 本発明の目的物は、ピリジンヌクレオチド非依
存性でフラビン基を含有しない２−オキソカルボ
ン酸レダクターゼである。 このオキソカルボン酸レダクターゼは約500000
の分子量を有し、その等電点は4.9にある。その
利用可能なPH域は、最高を6.8とする６〜８であ
る。酵素活性の温度依存性を第１表に示す。24℃
における活性を標準値とし、これを100％とする。
ターゼに関する。 ２−オキソカルボン酸を酵素により還元するこ
とはすでに知られている。この還元のためには共
同基質として、ピリジンヌクレオチドを必要とす
る酵素が用いられる。この種の反応の例として
は、ピルビン酸からのＬ−乳酸の製造があげられ
る（ジヤーナル・オブ・オーガニツク・ケミスト
リー47巻1982年2816頁）。さらに２−ヒドロキシ
カルボン酸のラセミ混合物から、光学的対掌体を
選別する微生物により分解することにより、光学
的に純粋な２−ヒドロキシカルボン酸を製造する
ことも公知である（Appl.Environ.Microbiol.45
巻1983年884頁）。しかしピリジンヌクレオチド依
存性のレダクターゼによる酵素的還元は、酸化さ
れたピリジンヌクレオチドを再生するための第二
の酵素をさらに必要とするという欠点を有する。
しかもピリジンヌクレオチドは長期の使用により
分解する。 本発明者らは、これらの欠点を有しない酵素を
見出した。 本発明の目的物は、ピリジンヌクレオチド非依
存性でフラビン基を含有しない２−オキソカルボ
ン酸レダクターゼである。 このオキソカルボン酸レダクターゼは約500000
の分子量を有し、その等電点は4.9にある。その
利用可能なPH域は、最高を6.8とする６〜８であ
る。酵素活性の温度依存性を第１表に示す。24℃
における活性を標準値とし、これを100％とする。
【表】
この酸化された酵素は45℃で、テトラサイクリ
ンの存在下に燐酸塩緩衝液中で約13時間の半減期
を示す。35℃ではその時間が約55時間であり、還
元されたメチルビオローゲンの存在下での還元状
態では約100時間である。活性経過は１級でない。
８時間又は40時間後にも酸化された酵素では、活
性の減退がみられない。この酵素の活性は
EDTAにより影響を受けない。 唯一の補欠分子族として酸に不安定な硫黄がこ
れまで確認されたが、それはおそらくFe／Ｓ包
接に基因する。フラビン基は分光光度計により検
出できない。 本酵素の活性を、酸化されたメチルビオローゲ
ンにより増強しうることは特に興味がある。
MV++の増加する濃度及びMV+0.15ミリモルの存
在において、初速度は次のように挙動する。
ンの存在下に燐酸塩緩衝液中で約13時間の半減期
を示す。35℃ではその時間が約55時間であり、還
元されたメチルビオローゲンの存在下での還元状
態では約100時間である。活性経過は１級でない。
８時間又は40時間後にも酸化された酵素では、活
性の減退がみられない。この酵素の活性は
EDTAにより影響を受けない。 唯一の補欠分子族として酸に不安定な硫黄がこ
れまで確認されたが、それはおそらくFe／Ｓ包
接に基因する。フラビン基は分光光度計により検
出できない。 本酵素の活性を、酸化されたメチルビオローゲ
ンにより増強しうることは特に興味がある。
MV++の増加する濃度及びMV+0.15ミリモルの存
在において、初速度は次のように挙動する。
【表】
なお２mmの球体中で、0.1モルのトリスアセテ
ート緩衝液（PH7.0）0.3ml、２−オキソ−４−メ
チルペンタノエート2μモル、各同量の酵素量、
ならびに0.2ミリモルの還元されたメチルビオロ
ーゲン及び表中に記載の酸化メチルビオローゲン
濃度で、培養した。 ２−オキソカルボン酸レダクターゼは、この酵
素を含有する微生物例えばプロテウス・ブルガリ
スDSM 7506又はプロテウス・ミラビリスDSM
30 115を機械的に粉砕し、遠心分離し、その上澄
を超遠心分離し、沈殿を洗浄剤溶液中に懸濁さ
せ、固形不純物をさらに超遠心分離して除去する
ことにより得られる。 最初の遠心分離は、粗大な不純物の除去に役立
つ。それは通常5000〜20000ｇで５〜10分間行わ
れる。沈殿を廃棄し、上澄を次いで０〜10℃及び
80000〜120000ｇで、１〜２時間遠心分離する。
得られた沈殿を冷緩衝液中に懸濁させ、さらに
80000〜120000ｇで遠心分離する。沈殿を分散剤
例えばトリートン×100又はツイーン80（いずれも
商品名）及び緩衝液（PH６〜８）と混合し、再度
80000〜120000ｇで遠心分離する。得られた上澄
は酵素を溶解された形で含有している。 意外にもこの新規酵素によれば、種々の２−オ
キソカルボン酸及びそのエステルが、立体特異的
に対応する（2R）−ヒドロキシカルボン酸又はそ
のエステルに還元される。この酸の例は次のもの
である。２−オキソプロパン酸（焦性ぶどう酸）、
３−フルオル−２−オキソプロパン酸、３−メチ
ル−２−オキソペンタン酸（二つの光学的対掌体
の形）、４−メチル−２−オキソペンタン酸、フ
エニルケト酢酸、フエニル焦性ぶどう酸、５−ベ
ンジルオキシ−β−インドリル焦性ぶどう酸、ケ
トこはく酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソ
アジピン酸、２−オキソアゼライン酸、２−オキ
ソセバシン酸、２−オキソウンデカンジカルボン
酸、２−オキソ−４−（メチルチオ）−酪酸、イン
ドリル焦性ぶどう酸、２−オキソ−４−メチルホ
スフイノ酪酸。エステルの１例は、焦性ぶどう酸
エチルエステルである。その還元生成物は、通常
は98％以上光学的に純粋である。光学的純度が
99.5％を越える場合もある。 さらにこの新規酵素はその活性のために、還元
されたピリジンヌクレオチドを必要としない。本
酵素は、電子担体例えば還元された状態のメチル
−又はベンジルビオローゲンから直接に電子を基
質上に移行させることができる。 実施例 １ プロテウス・ミラビリス（DSM 30115）を、
完全培地液（酵母抽出物5.0ｇ、グルコース5.0
ｇ、肉からのペプトン20.0ｇ、K2HPO45.0ｇに水
を加え1000mlとしたもの、PH7.2）中で、N297％
とO2３％の混合ガスを通気しながら35℃で培養
する。粗抽出物中でのより高い酵素活性は、プロ
テウス・ブルガリス（DSM 7506）により得られ
る。しかしその場合は、完全に酸素を遮断して培
養せねばならない。粗抽出物で７〜9U／mg蛋白
質の比酵素活性が得られる。こうして得られた細
胞を、その早期定常相で収得する。湿つた細菌塊
１重量部を20ミリモル燐酸カリウム緩衝液PH7.0
の３部に懸濁し、氷浴中で窒素雰囲気下に、細胞
の90％以上が粉砕されるまで（顕微鏡下に確認）
超音波装置により処理する。 こうして得られら粗抽出物64mlを、４℃及び
10000ｇで10分間遠心分離し、沈殿物を廃棄する。
上澄を100000ｇ及び４℃で90分間遠心分離し、上
澄を廃棄する。沈殿を20ミリモル燐酸カリウム緩
衝液PH7.0の32mlを用いて洗浄し、なお１回
100000ｇで60分間遠心分離し、上澄を廃棄する。
緩衝液32ml中の沈殿を、トリートンＸ−100の0.2
ｇを含有する20ミリモル燐酸カリウム緩衝液（PH
7.0）の32mlに懸濁させる。45分間攪拌したのち、
０℃及び100000ｇで60分間遠心分離する。レダク
ターゼは上澄中に存在し、収率は80％である。 実施例 ２ 合計300U（比活性1.3U／mg蛋白質）の実施例１
により得られた粗抽出物10mlを、セフアクリルＳ
−1000のカラム（床容積425ml）上に供給し、20
ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）により、
４℃及び30ml／時の流下速度で溶離する。約６時
間後に酵素は隔膜粒子と結合している。この活性
を有する分画（55ml）を一緒にして、限外過に
より７mlに濃縮する。この７mlは、24U／mgの比
活性を有する粗抽出物の酵素の90％を含有する。 実施例 ３ 湿つた細菌塊50ｇを実施例１と同様に破砕す
る。最終遠心分離の上澄の容積は限外過により
濃縮されて11mlとなる（500U／mlレダクターゼ
及び37mg蛋白質／ml）。これをセフアロース6Bの
カラム（容積440ml）に供給し、PH7.0の20ミリモ
ル燐酸カリウム緩衝液、トリートンX100の0.05
％及び１ミリモルジチオエリスリートの溶液を用
いて溶離する。一緒にした酵素含有分画を限外
過により35mlに濃縮する。希釈後の再度の限外
過により、10ミリモルの燐酸カリウム緩衝液であ
る溶液35mlが得られる。これを10ミリモル燐酸塩
緩衝液、トリートンX100の0.05％及び１ミリモ
ルジチオエリスリートにより平衡化された、床容
積100mlを有するヒドロキシアパタイトのカラム
（ビオ・ゲルHTP）に供給し、10〜100ミリモル
の直線勾配により燐酸緩衝液と前記添加物を溶離
する。一緒にした酵素含有分画を、限外過によ
り50mlに濃縮する。これは１ml当り蛋白質0.37mg
とレダクターゼ26U／mlを含有する。10ミリモル
のトリス−HCl PH7.5、トリートンX100の0.05
％に対する９時間の透析ののち、35mlの床容積を
有する、DEAE−セフアデツクスA25のカラムに
酵素液を供給し、前記緩衝液中で０〜700ミリモ
ルKClの直線勾配により酵素を溶離する。一緒に
した酵素含有分画を限外過して8.2mlにしたの
ち、300U／mg蛋白質の比活性が得られる
（90U／ml；0.3mg蛋白質／ml）。 実施例 ４ プロテウス・ブルガリス（DSM7506）の湿つ
た細菌塊40ｇを0.01モルのトリス−HCl緩衝液PH
7.5の60ml及び１ミリモルジチオエリスリートに
より懸濁液となし、次いで超音波処理（６℃以
下、40ワツトで30分間）により破砕する。この分
解物を15000ｇで10分間遠心分離し、上澄を
100000ｇで120分間遠心分離する。沈降物を0.01
モルトリス−HCl PH7.5の緩衝液75mlに再懸濁
し、洗剤（ポリオキソエチレン−９−ラウリル−
エーテル、シグマ）１％（ｖ／ｖ）を添加する。
この懸濁液を氷浴中で45分間攪拌したのち、再度
100000ｇで90分間遠心分離する。その上澄は２−
オキソカルボン酸レダクターゼを含有する。 この溶液を、0.1モルトリス−HCl PH7.5、１
ミリモルジチオエリスリート、0.8％（ｖ／ｖ）
洗浄剤及び４ミリモルジチオナイトにより平衡化
しているDEAE−セルロース−カラム（φ2.5cm、
容積90ml）に供給する。前記緩衝液の約２倍カラ
ム容積を用いて溶離したのち、前記緩衝液中の
0.1〜0.7モルKCl（２×225ml）の直線勾配が与え
られる。酵素は約250ミリモルKClで溶離され、
約60mlに含有されている。酵素含有分画を一緒に
し、0.01モルトリス−HCl PH7.5、１ミリモルジ
チオエリスリート、0.4％（ｖ／ｖ）洗浄剤及び
４ミリモルジチオナイトにより平衡化しているヒ
ドロキシアパタイト−カラム（HAビオーゲル、
φ1.5cm、容積40ml）に供給する。前記の平衡緩衝
液（約１カラム容積）を用いて溶離したのち、燐
酸カリウムPH7.5及び前記添加物の０〜150ミリモ
ルの直線勾配により、約60ミリモル燐酸カリウム
緩衝液で酵素を溶離する。一緒にした分画（約30
ml）を、前記緩衝液により平衡化している第二の
DEAE−セルロース−カラム（φ1cm、容積20ml）
に供給する。短時間の後溶離ののち、０〜0.4モ
ルKClの直線勾配により、２−オキソカルボン酸
レダクターゼが再び前記緩衝溶液により溶離され
る。主活性を有する酵素含有分画を一緒にし、
YM30膜（アミコン）による限外過により、約
６mlに濃縮する。この溶液について、0.01モルト
リス−HCl緩衝液PH7.5、0.05モルKCl、及び前記
添加物により平衡化しているセフアロースCl6B
−カラム（φ2.5cm、容積365ml）によりクロマト
グラフイを行う。酵素は、350U／mg蛋白質の比
活性を示す。精製過程を第２表に示す。
ート緩衝液（PH7.0）0.3ml、２−オキソ−４−メ
チルペンタノエート2μモル、各同量の酵素量、
ならびに0.2ミリモルの還元されたメチルビオロ
ーゲン及び表中に記載の酸化メチルビオローゲン
濃度で、培養した。 ２−オキソカルボン酸レダクターゼは、この酵
素を含有する微生物例えばプロテウス・ブルガリ
スDSM 7506又はプロテウス・ミラビリスDSM
30 115を機械的に粉砕し、遠心分離し、その上澄
を超遠心分離し、沈殿を洗浄剤溶液中に懸濁さ
せ、固形不純物をさらに超遠心分離して除去する
ことにより得られる。 最初の遠心分離は、粗大な不純物の除去に役立
つ。それは通常5000〜20000ｇで５〜10分間行わ
れる。沈殿を廃棄し、上澄を次いで０〜10℃及び
80000〜120000ｇで、１〜２時間遠心分離する。
得られた沈殿を冷緩衝液中に懸濁させ、さらに
80000〜120000ｇで遠心分離する。沈殿を分散剤
例えばトリートン×100又はツイーン80（いずれも
商品名）及び緩衝液（PH６〜８）と混合し、再度
80000〜120000ｇで遠心分離する。得られた上澄
は酵素を溶解された形で含有している。 意外にもこの新規酵素によれば、種々の２−オ
キソカルボン酸及びそのエステルが、立体特異的
に対応する（2R）−ヒドロキシカルボン酸又はそ
のエステルに還元される。この酸の例は次のもの
である。２−オキソプロパン酸（焦性ぶどう酸）、
３−フルオル−２−オキソプロパン酸、３−メチ
ル−２−オキソペンタン酸（二つの光学的対掌体
の形）、４−メチル−２−オキソペンタン酸、フ
エニルケト酢酸、フエニル焦性ぶどう酸、５−ベ
ンジルオキシ−β−インドリル焦性ぶどう酸、ケ
トこはく酸、２−オキソグルタル酸、２−オキソ
アジピン酸、２−オキソアゼライン酸、２−オキ
ソセバシン酸、２−オキソウンデカンジカルボン
酸、２−オキソ−４−（メチルチオ）−酪酸、イン
ドリル焦性ぶどう酸、２−オキソ−４−メチルホ
スフイノ酪酸。エステルの１例は、焦性ぶどう酸
エチルエステルである。その還元生成物は、通常
は98％以上光学的に純粋である。光学的純度が
99.5％を越える場合もある。 さらにこの新規酵素はその活性のために、還元
されたピリジンヌクレオチドを必要としない。本
酵素は、電子担体例えば還元された状態のメチル
−又はベンジルビオローゲンから直接に電子を基
質上に移行させることができる。 実施例 １ プロテウス・ミラビリス（DSM 30115）を、
完全培地液（酵母抽出物5.0ｇ、グルコース5.0
ｇ、肉からのペプトン20.0ｇ、K2HPO45.0ｇに水
を加え1000mlとしたもの、PH7.2）中で、N297％
とO2３％の混合ガスを通気しながら35℃で培養
する。粗抽出物中でのより高い酵素活性は、プロ
テウス・ブルガリス（DSM 7506）により得られ
る。しかしその場合は、完全に酸素を遮断して培
養せねばならない。粗抽出物で７〜9U／mg蛋白
質の比酵素活性が得られる。こうして得られた細
胞を、その早期定常相で収得する。湿つた細菌塊
１重量部を20ミリモル燐酸カリウム緩衝液PH7.0
の３部に懸濁し、氷浴中で窒素雰囲気下に、細胞
の90％以上が粉砕されるまで（顕微鏡下に確認）
超音波装置により処理する。 こうして得られら粗抽出物64mlを、４℃及び
10000ｇで10分間遠心分離し、沈殿物を廃棄する。
上澄を100000ｇ及び４℃で90分間遠心分離し、上
澄を廃棄する。沈殿を20ミリモル燐酸カリウム緩
衝液PH7.0の32mlを用いて洗浄し、なお１回
100000ｇで60分間遠心分離し、上澄を廃棄する。
緩衝液32ml中の沈殿を、トリートンＸ−100の0.2
ｇを含有する20ミリモル燐酸カリウム緩衝液（PH
7.0）の32mlに懸濁させる。45分間攪拌したのち、
０℃及び100000ｇで60分間遠心分離する。レダク
ターゼは上澄中に存在し、収率は80％である。 実施例 ２ 合計300U（比活性1.3U／mg蛋白質）の実施例１
により得られた粗抽出物10mlを、セフアクリルＳ
−1000のカラム（床容積425ml）上に供給し、20
ミリモルの燐酸カリウム緩衝液（PH7.0）により、
４℃及び30ml／時の流下速度で溶離する。約６時
間後に酵素は隔膜粒子と結合している。この活性
を有する分画（55ml）を一緒にして、限外過に
より７mlに濃縮する。この７mlは、24U／mgの比
活性を有する粗抽出物の酵素の90％を含有する。 実施例 ３ 湿つた細菌塊50ｇを実施例１と同様に破砕す
る。最終遠心分離の上澄の容積は限外過により
濃縮されて11mlとなる（500U／mlレダクターゼ
及び37mg蛋白質／ml）。これをセフアロース6Bの
カラム（容積440ml）に供給し、PH7.0の20ミリモ
ル燐酸カリウム緩衝液、トリートンX100の0.05
％及び１ミリモルジチオエリスリートの溶液を用
いて溶離する。一緒にした酵素含有分画を限外
過により35mlに濃縮する。希釈後の再度の限外
過により、10ミリモルの燐酸カリウム緩衝液であ
る溶液35mlが得られる。これを10ミリモル燐酸塩
緩衝液、トリートンX100の0.05％及び１ミリモ
ルジチオエリスリートにより平衡化された、床容
積100mlを有するヒドロキシアパタイトのカラム
（ビオ・ゲルHTP）に供給し、10〜100ミリモル
の直線勾配により燐酸緩衝液と前記添加物を溶離
する。一緒にした酵素含有分画を、限外過によ
り50mlに濃縮する。これは１ml当り蛋白質0.37mg
とレダクターゼ26U／mlを含有する。10ミリモル
のトリス−HCl PH7.5、トリートンX100の0.05
％に対する９時間の透析ののち、35mlの床容積を
有する、DEAE−セフアデツクスA25のカラムに
酵素液を供給し、前記緩衝液中で０〜700ミリモ
ルKClの直線勾配により酵素を溶離する。一緒に
した酵素含有分画を限外過して8.2mlにしたの
ち、300U／mg蛋白質の比活性が得られる
（90U／ml；0.3mg蛋白質／ml）。 実施例 ４ プロテウス・ブルガリス（DSM7506）の湿つ
た細菌塊40ｇを0.01モルのトリス−HCl緩衝液PH
7.5の60ml及び１ミリモルジチオエリスリートに
より懸濁液となし、次いで超音波処理（６℃以
下、40ワツトで30分間）により破砕する。この分
解物を15000ｇで10分間遠心分離し、上澄を
100000ｇで120分間遠心分離する。沈降物を0.01
モルトリス−HCl PH7.5の緩衝液75mlに再懸濁
し、洗剤（ポリオキソエチレン−９−ラウリル−
エーテル、シグマ）１％（ｖ／ｖ）を添加する。
この懸濁液を氷浴中で45分間攪拌したのち、再度
100000ｇで90分間遠心分離する。その上澄は２−
オキソカルボン酸レダクターゼを含有する。 この溶液を、0.1モルトリス−HCl PH7.5、１
ミリモルジチオエリスリート、0.8％（ｖ／ｖ）
洗浄剤及び４ミリモルジチオナイトにより平衡化
しているDEAE−セルロース−カラム（φ2.5cm、
容積90ml）に供給する。前記緩衝液の約２倍カラ
ム容積を用いて溶離したのち、前記緩衝液中の
0.1〜0.7モルKCl（２×225ml）の直線勾配が与え
られる。酵素は約250ミリモルKClで溶離され、
約60mlに含有されている。酵素含有分画を一緒に
し、0.01モルトリス−HCl PH7.5、１ミリモルジ
チオエリスリート、0.4％（ｖ／ｖ）洗浄剤及び
４ミリモルジチオナイトにより平衡化しているヒ
ドロキシアパタイト−カラム（HAビオーゲル、
φ1.5cm、容積40ml）に供給する。前記の平衡緩衝
液（約１カラム容積）を用いて溶離したのち、燐
酸カリウムPH7.5及び前記添加物の０〜150ミリモ
ルの直線勾配により、約60ミリモル燐酸カリウム
緩衝液で酵素を溶離する。一緒にした分画（約30
ml）を、前記緩衝液により平衡化している第二の
DEAE−セルロース−カラム（φ1cm、容積20ml）
に供給する。短時間の後溶離ののち、０〜0.4モ
ルKClの直線勾配により、２−オキソカルボン酸
レダクターゼが再び前記緩衝溶液により溶離され
る。主活性を有する酵素含有分画を一緒にし、
YM30膜（アミコン）による限外過により、約
６mlに濃縮する。この溶液について、0.01モルト
リス−HCl緩衝液PH7.5、0.05モルKCl、及び前記
添加物により平衡化しているセフアロースCl6B
−カラム（φ2.5cm、容積365ml）によりクロマト
グラフイを行う。酵素は、350U／mg蛋白質の比
活性を示す。精製過程を第２表に示す。
【表】
応用例
電解槽内で、100ミリモル燐酸カリウム緩衝液
PH7.0、４ミリモルメチルビオローゲン及び40ミ
リモルフエニルピルベートの溶液25mlを、実施例
３による２−オキソ酸レダクターゼ0.5mgにより、
標準甘汞電極に対して−700ミリボルトの電圧に
より還元する。９時間後に電流が5.8ミリアンペ
アから急に降下する。HPLC−分析によると、反
応溶液は予期されるフエニル乳酸88％を含有す
る。希硫酸によりPH1.8に酸性化したのち、エー
テルで抽出する。理論値に対し78％の結晶性残査
は、ナトリウム塩にしたのち、〔α〕RT 589＝21.1°の
旋光度；0.09ミリモル／mlH2Ｏを示す。（2S）−
フエニル乳酸ナトリウムの市販の純粋な標品は、
同じ条件下に測定して−21.4°の数値を示す。同
様にして（Ｒ）−マンデル酸及び（Ｒ）−２−ヒド
ロキシ−４−メチルペンタネートが製造される。 第２表は、フエニルピルベート（＝１）に対す
る２−オキソカルボン酸が還元される相対速度を
示す。３−オキソカルボン酸及びヒドロキシアセ
トンは還元されない。
PH7.0、４ミリモルメチルビオローゲン及び40ミ
リモルフエニルピルベートの溶液25mlを、実施例
３による２−オキソ酸レダクターゼ0.5mgにより、
標準甘汞電極に対して−700ミリボルトの電圧に
より還元する。９時間後に電流が5.8ミリアンペ
アから急に降下する。HPLC−分析によると、反
応溶液は予期されるフエニル乳酸88％を含有す
る。希硫酸によりPH1.8に酸性化したのち、エー
テルで抽出する。理論値に対し78％の結晶性残査
は、ナトリウム塩にしたのち、〔α〕RT 589＝21.1°の
旋光度；0.09ミリモル／mlH2Ｏを示す。（2S）−
フエニル乳酸ナトリウムの市販の純粋な標品は、
同じ条件下に測定して−21.4°の数値を示す。同
様にして（Ｒ）−マンデル酸及び（Ｒ）−２−ヒド
ロキシ−４−メチルペンタネートが製造される。 第２表は、フエニルピルベート（＝１）に対す
る２−オキソカルボン酸が還元される相対速度を
示す。３−オキソカルボン酸及びヒドロキシアセ
トンは還元されない。
【表】
ベート
【表】
ノエート
【表】
ン
Claims (1)
- １ プロテウス・ブルガリスDSM7506から得ら
れ、分子量約500000を有し、等電点4.9及び至適
PH値6.8を有する、ピリジンヌクレオチド非依存
性で、フラビン基不含の２−オキソカルボン酸レ
ダクターゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3332562A DE3332562A1 (de) | 1983-09-09 | 1983-09-09 | 2-oxocarbonsaeurereduktase, ihre herstellung und verwendung |
| DE3332562.6 | 1983-09-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6078579A JPS6078579A (ja) | 1985-05-04 |
| JPH0575384B2 true JPH0575384B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=6208640
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59188266A Granted JPS6078579A (ja) | 1983-09-09 | 1984-09-10 | ２―オキソカルボン酸レダクターゼ |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4622301A (ja) |
| EP (1) | EP0137301B1 (ja) |
| JP (1) | JPS6078579A (ja) |
| AT (1) | ATE50595T1 (ja) |
| CA (1) | CA1226540A (ja) |
| DE (2) | DE3332562A1 (ja) |
| DK (1) | DK428184A (ja) |
| FI (1) | FI87231C (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE68926389T2 (de) * | 1988-02-08 | 1996-08-14 | Daicel Chem | Verfahren zur herstellung optisch aktiver 2-hydroxy-4-phenylbutansäure |
| US5256552A (en) * | 1988-02-08 | 1993-10-26 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Process for the production of optically active 2-hydroxy-4-phenylbutyric acid |
| DE68926417T2 (de) * | 1988-02-12 | 1996-09-12 | Daicel Chem | Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 2-hydroxysäureabkömmlingen |
| JPH0779706B2 (ja) * | 1990-03-22 | 1995-08-30 | 田辺製薬株式会社 | ２―クロロ―３―ヒドロキシ―３―フエニルプロピオン酸エステル類の製法 |
| JPH06141888A (ja) * | 1992-11-05 | 1994-05-24 | Tanabe Seiyaku Co Ltd | Ｄ−マンデル酸の製法 |
| US6261258B1 (en) | 1999-05-03 | 2001-07-17 | Marius Saines | Hemostatic device for angioplasty |
| CA3137479A1 (en) * | 2017-03-03 | 2018-09-07 | Gilead Sciences, Inc. | Processes for preparing acc inhibitors and solid forms thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB1015236A (en) * | 1963-11-06 | 1965-12-31 | Drayton Res Ltd | Graft copolymers |
| DE2426671B2 (de) * | 1974-06-01 | 1976-02-05 | Bayer Ag, 5090 Leverkusen | Schlagzaehe polymermischungen |
| US4020036A (en) * | 1976-04-22 | 1977-04-26 | Phillips Petroleum Company | Thermosetting polyester composition containing normally solid carboxy-containing diene polymer |
| DE3374695D1 (en) * | 1982-09-14 | 1988-01-07 | Degussa | L-2-hydroxy-4-methylpentanoic acid dehydrogenase, process for its production and its use |
-
1983
- 1983-09-09 DE DE3332562A patent/DE3332562A1/de not_active Withdrawn
-
1984
- 1984-08-31 FI FI843436A patent/FI87231C/fi not_active IP Right Cessation
- 1984-09-05 EP EP84110535A patent/EP0137301B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-05 AT AT84110535T patent/ATE50595T1/de active
- 1984-09-05 DE DE8484110535T patent/DE3481430D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-06 CA CA000462542A patent/CA1226540A/en not_active Expired
- 1984-09-07 DK DK428184A patent/DK428184A/da not_active Application Discontinuation
- 1984-09-07 US US06/648,043 patent/US4622301A/en not_active Expired - Lifetime
- 1984-09-10 JP JP59188266A patent/JPS6078579A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6078579A (ja) | 1985-05-04 |
| DK428184D0 (da) | 1984-09-07 |
| EP0137301B1 (de) | 1990-02-28 |
| DE3481430D1 (de) | 1990-04-05 |
| EP0137301A2 (de) | 1985-04-17 |
| FI87231C (fi) | 1992-12-10 |
| DE3332562A1 (de) | 1985-03-28 |
| FI87231B (fi) | 1992-08-31 |
| EP0137301A3 (en) | 1987-05-13 |
| CA1226540A (en) | 1987-09-08 |
| FI843436A0 (fi) | 1984-08-31 |
| ATE50595T1 (de) | 1990-03-15 |
| FI843436L (fi) | 1985-03-10 |
| US4622301A (en) | 1986-11-11 |
| DK428184A (da) | 1985-03-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Upadhya et al. | Stabilization of d‐amino acid oxidase and catalase in permeabilized Rhodotorula gracilis cells and its application for the preparation of α‐ketoacids | |
| EP1326993B1 (en) | Production of alpha-hydroxy-carboxylic acids using a coupled enzyme system | |
| JPS5814198B2 (ja) | Ｎａｄｈ−ペルオキシダ−ゼ、その製法及びこれを用いるｈ↓２ｏ↓２の測定法 | |
| US4622301A (en) | 2-Oxocarboxylic acid reductase and its preparation | |
| CN119931977B (zh) | 酶组合物、产品及其在制备依克多因中的应用 | |
| Sarada et al. | Isolation and characterisation of glutamate dehydrogenase from Mycobacterium smegmatis CDC 46 | |
| EP0099742A1 (en) | Enzymatic reaction process | |
| Vermeij et al. | Purification and properties of coenzyme F390 hydrolase from Methanobacterium thermoautotrophicum (strain Marburg) | |
| Cleary et al. | Enzymatic reduction of D-biotin-d-sulfoxide with cell-free extracts of Escherichia coli | |
| WO2019053560A1 (en) | HIGHLY EFFICIENT ENZYMATIC PROCESS FOR PRODUCING (R) -3-QUINUCLIDINOL | |
| Tynan et al. | Synthesis of a highly substituted N6-linked immobilized NAD+ derivative using a rapid solid-phase modular approach: Suitability for use with the kinetic locking-on tactic for bioaffinity purification of NAD+-dependent dehydrogenases | |
| EP1360285B1 (en) | A method of preparing cross-linked enzyme aggregates | |
| Eisele et al. | Stereoselective Alkylation with Asymmetric Reagents: 2. The Active Center Sulphydryl Groups of Yeast Alcohol Dehydrogenase | |
| JP2556526B2 (ja) | 酵素酸化法 | |
| JP2005117905A (ja) | 光学活性１−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法 | |
| JPS6332492A (ja) | 酵素法によるマンデル酸の左旋性光学活性体の製造方法 | |
| Khoronenkova et al. | Recombinant D-amino acid oxidase with improved properties | |
| KR970002668B1 (ko) | 고정화 히단토이나제 및 이를 사용하여 n-카르바모일-d-아미노산을 제조하는 방법 | |
| JPH047678B2 (ja) | ||
| JP2002085085A (ja) | （ｒ）−プロポキシベンゼン誘導体の製造方法 | |
| JPH0372279B2 (ja) | ||
| JPH09247A (ja) | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
| JP2801694B2 (ja) | 新規酵素 | |
| JPH0655137B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素及びその製造法 | |
| MEISTER et al. | α-Keto acid-activated enzymatic decarboxylation of L-aspartate to L-alanine |