JPH0575392B2 - - Google Patents
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- JPH0575392B2 JPH0575392B2 JP59281377A JP28137784A JPH0575392B2 JP H0575392 B2 JPH0575392 B2 JP H0575392B2 JP 59281377 A JP59281377 A JP 59281377A JP 28137784 A JP28137784 A JP 28137784A JP H0575392 B2 JPH0575392 B2 JP H0575392B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- culture
- polypeptide
- recombinant
- microorganism
- chlorhexidine
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2/00—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor
- A61L2/16—Disinfection or sterilisation of materials or objects, in general; Accessories therefor using chemical substances
- A61L2/18—Liquid substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N47/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid
- A01N47/40—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides
- A01N47/42—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom not being member of a ring and having no bond to a carbon or hydrogen atom, e.g. derivatives of carbonic acid the carbon atom having a double or triple bond to nitrogen, e.g. cyanates, cyanamides containing —N=CX2 groups, e.g. isothiourea
- A01N47/44—Guanidine; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2103/00—Materials or objects being the target of disinfection or sterilisation
- A61L2103/05—Living organisms or biological materials
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
（産業上の利用分野）
本発明は、組換え微生物の殺菌法に関する。さ
らに詳しくは、インターフエロン活性を有するポ
リペプチドを産生する組換え微生物の培養細胞
を、該ポリペプチドの物理化学的性質および生理
学的性質を損うことなく、該微生物を殺菌法する
方法に関する。 尚、ここで言う組換え微生物は、組換えDNA
技術或いは遺伝子操作技術を用いて造成されたプ
ラスミドもしくはフアージベクターによつて形質
転換されたインターフエロン活性を有するポリペ
プチド産生能を有する微生物を言う。 （従来の技術および発明が解決しようとする問題
点） 組換え微生物の培養物から該微生物の産生する
有用物質を得ようとする場合、培養ならびに該物
質の抽出・精製工程において、用いた組換え微生
物の再増殖防止ならびに培養微生物の殺菌が組換
えDNA実験指針から必要とされる。組換え微生
物が外部にもれないようにするには、培養から精
製までのすべての工程を密閉して行うことも考え
らるが、現実には容易でなく、組換え微生物の培
養後、抽出・精製に移る前に、培養微生物を何ら
かの方法で完全に殺菌することが上記指針から強
く求められている。 微生物の殺菌法としては加熱や菌体破壊などの
物理学的方法や塩素系薬剤、キシレン系薬剤、過
酸化水素などを用いる化学的な方法が用いられて
いるが、これらの殺菌法は微生物を殺菌できても
微生物自身からあるいは微生物培養物から目的と
する物質を抽出・精製して得ようとする場合、該
目的物の本来の性質を損なう場合がある。また、
塩素系薬剤や過酸化水素を使用すると培養容器ま
たはタンクさらには培養システムにおけるパイプ
やバルブなどを腐蝕したり、キシレン系薬剤では
爆発等の不安があり、特に大量の培養組換え微生
物の殺菌には好ましいものではない。 本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、
種々の殺菌法について鋭意研究の結果、クロルヘ
キシジンの塩を含む水溶液、さらに好ましくはグ
ルコン酸クロルヘキシジン水溶液を殺菌剤として
用いることにより上記の問題点を解決することを
見出し本発明を完成するに至つた。 尚、以下の説明では、グルコン酸クロルヘキシ
ジン水溶液を殺菌剤として用いた例について述べ
るが、クロルヘキシジンの塩を主成分とする溶液
（例えばエタノール溶液）であれば水溶液に限る
ものではない。また、該溶液に界面活性剤（例え
ばエマルゲン系界面活性剤）が含まれていてもよ
い。 （問題点解決のための具体的手段） クロルヘキシジン（１，６−di−（4′−chlo−
ropheyldiguanido）hexane）は下記の構造：
らに詳しくは、インターフエロン活性を有するポ
リペプチドを産生する組換え微生物の培養細胞
を、該ポリペプチドの物理化学的性質および生理
学的性質を損うことなく、該微生物を殺菌法する
方法に関する。 尚、ここで言う組換え微生物は、組換えDNA
技術或いは遺伝子操作技術を用いて造成されたプ
ラスミドもしくはフアージベクターによつて形質
転換されたインターフエロン活性を有するポリペ
プチド産生能を有する微生物を言う。 （従来の技術および発明が解決しようとする問題
点） 組換え微生物の培養物から該微生物の産生する
有用物質を得ようとする場合、培養ならびに該物
質の抽出・精製工程において、用いた組換え微生
物の再増殖防止ならびに培養微生物の殺菌が組換
えDNA実験指針から必要とされる。組換え微生
物が外部にもれないようにするには、培養から精
製までのすべての工程を密閉して行うことも考え
らるが、現実には容易でなく、組換え微生物の培
養後、抽出・精製に移る前に、培養微生物を何ら
かの方法で完全に殺菌することが上記指針から強
く求められている。 微生物の殺菌法としては加熱や菌体破壊などの
物理学的方法や塩素系薬剤、キシレン系薬剤、過
酸化水素などを用いる化学的な方法が用いられて
いるが、これらの殺菌法は微生物を殺菌できても
微生物自身からあるいは微生物培養物から目的と
する物質を抽出・精製して得ようとする場合、該
目的物の本来の性質を損なう場合がある。また、
塩素系薬剤や過酸化水素を使用すると培養容器ま
たはタンクさらには培養システムにおけるパイプ
やバルブなどを腐蝕したり、キシレン系薬剤では
爆発等の不安があり、特に大量の培養組換え微生
物の殺菌には好ましいものではない。 本発明者らは、上記の問題点を解決すべく、
種々の殺菌法について鋭意研究の結果、クロルヘ
キシジンの塩を含む水溶液、さらに好ましくはグ
ルコン酸クロルヘキシジン水溶液を殺菌剤として
用いることにより上記の問題点を解決することを
見出し本発明を完成するに至つた。 尚、以下の説明では、グルコン酸クロルヘキシ
ジン水溶液を殺菌剤として用いた例について述べ
るが、クロルヘキシジンの塩を主成分とする溶液
（例えばエタノール溶液）であれば水溶液に限る
ものではない。また、該溶液に界面活性剤（例え
ばエマルゲン系界面活性剤）が含まれていてもよ
い。 （問題点解決のための具体的手段） クロルヘキシジン（１，６−di−（4′−chlo−
ropheyldiguanido）hexane）は下記の構造：
【化】
を有し、広範囲の微生物（特に殺菌類）に対し、
低濃度で迅速な殺菌作用を示す。特に、そのグル
コン酸塩は外用ならびい医療器具等の殺菌消毒剤
として広く使用されている。 本発明は、低濃度のクロルヘキシジンの塩を組
換え微生物の培養液に加えることにより、菌体内
に産生された有用物質の物理学的および生理学的
性質を損うことなく、該微生物を完全に死滅させ
ることにある。クロルヘキシジンの塩は外用や医
療器具等の殺菌消毒に用いられているが、培養微
生物（特に有用物質産生組換え微生物）の殺菌剤
として用いられた例はこれまで知られていない。
クロルヘキシジンの塩には種々のものが知られて
いるが、グルコン酸塩は水溶性も高く使用法も簡
便で、ヒトに対する毒性も低く使用者に危険を及
ぼすこともない。従つて、特に大量に培養された
微生物（特に有用物質産生組換え微生物）を殺菌
する必要がある場合有用である。 グルコン酸クロルヘキシジンは水溶液として用
いることが好ましい。また、殺菌と同時に微生物
が産生する菌体内目的物質を菌体外へ漏出させる
場合は界面活性剤例えば（エマルゲル界面活性
剤）が含有されている水溶液を用いるとよい。 組換え微生物の産生する有用物質の諸性質を損
うことなく該微生物を殺菌しうるグルコン酸クロ
ルヘキシジンの濃度は、用いる組換え微生物の種
類（菌株）や培養濃度または培養に用いる培地の
種類によつて異なるが、最終0.03％から0.5％で
あるのが好ましい。具体的にはグルコン酸クロル
ヘキシジン20％水溶液（例えばヒビテン：住友化
学工業社製）を、グルコン酸クロルヘキシジンが
上記の濃度になるように、組換え微生物培養液に
加えて適当な時間（30分から６時間）撹拌するだ
けでよい。処理温度は、特に制限されないが、有
用物質の性質が損われないよう配慮することが望
まれる。 上記のようにして殺菌された組換え微生物培養
液から菌体（死菌体）を遠心分離により集め、適
当に菌体を破砕後、目的とする有用物質を抽出・
精製する適当な工程へ移る。殺菌剤として添加さ
れたグルコン酸クロルヘキシジンは、精製過程で
容易に除くことが可能である。また、具体的には
以下の実施例および参考例で述べるが、本発明の
殺菌法によつて殺菌された組換え微生物（大腸
菌）から、目的とする有用生理活性ポリペプチド
（ヒト・インターフエロン活性を有するポリペプ
チド）を、その物理化学的および生理学的性質を
損うことなく抽出・精製することができる。 以下の実施例および参考例では、組換え微生物
としてヒト・インターフエロン活性を有するポリ
ペプチド産生能を有する大腸菌形質転換体につい
て述べるが、本発明の殺菌法は大腸菌以外の微生
物にも適用できる。また、有用物質は、ヒト・イ
ンターフエロン活性を有するポリペプチドに限る
ものでもない。 実施例 １ グルコン酸クロルヘキシジンの濃度と殺菌効果 ヒト・インターフエロン活性を有するポリペプ
チドの生産能を有する組換え微生物（大腸菌）
W3110／pIN5T4（特開昭60−24187号公報に開示
のプラスミドpINGIF54上のアンピシリン耐性遺
伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換えた
プラスミドpIN5T4により形質転換された大腸
菌）を、ポリペプトン３％、酵母エキス２％、グ
ルコース２％、KH2PO40.5％、MgSO4・7H2
O0.01％およびテトラサイクリン20μg／mlを含む
培地で36時間、30℃で通気撹拌培養した。この時
の培養液中の該大腸菌の生菌数は１ml当り3.2×
107CFU（colony forming unit）であつた。この
培養液に、20％グルコン酸クロルヘキシジン水溶
液（住友化学工業社製）を、グルコン酸クロルヘ
キシジンとして0.03％から0.18％になるように加
え、30℃で１時間撹拌後、培養液中の大腸菌の生
菌数を調べた。その結果、第１表に示すように、
グルコン酸クロルヘキシジンは低濃度で充分組換
え微生物（大腸菌）を殺菌することが認められ
た。生菌数は培養液１mlから遠心（12000rpm、
５分）して得られる沈澱物を、無菌の生理食塩水
で３回洗浄後、同食塩水１mlを加え、その懸濁液
または食塩水で適当に希釈した懸濁液0.1mlを、
培養に用いた同じ培地（但し２％寒天を含む）上
に塗布し、37℃で24時間培養後生じるコロニーを
計数することにより行つた。生菌数の測定は同じ
サンプルについて最低２回行つた。第１表はその
平均値を示している。 一方、グルコン酸クロルヘキシジン処理および
未処理による目的生産物（この場合ヒト・インタ
ーフエロン活性をを有するポリペプチド）の活性
（抗ウイルス活性）に及ぼす影響を調べた結果、
第１表に示すように、グルコン酸クロルヘキシジ
ンは用いた濃度範囲においては、ほとんど影響が
なかつた。（若干の値のバラツキは希釈率にもと
ずく活性測定の誤差によるものと考えられる）。
なお、抗ウイルス活性は、培養液から遠心分離し
て得られる菌体を、凍結・融合によつて破砕後、
上清について常法に従い測定された。
低濃度で迅速な殺菌作用を示す。特に、そのグル
コン酸塩は外用ならびい医療器具等の殺菌消毒剤
として広く使用されている。 本発明は、低濃度のクロルヘキシジンの塩を組
換え微生物の培養液に加えることにより、菌体内
に産生された有用物質の物理学的および生理学的
性質を損うことなく、該微生物を完全に死滅させ
ることにある。クロルヘキシジンの塩は外用や医
療器具等の殺菌消毒に用いられているが、培養微
生物（特に有用物質産生組換え微生物）の殺菌剤
として用いられた例はこれまで知られていない。
クロルヘキシジンの塩には種々のものが知られて
いるが、グルコン酸塩は水溶性も高く使用法も簡
便で、ヒトに対する毒性も低く使用者に危険を及
ぼすこともない。従つて、特に大量に培養された
微生物（特に有用物質産生組換え微生物）を殺菌
する必要がある場合有用である。 グルコン酸クロルヘキシジンは水溶液として用
いることが好ましい。また、殺菌と同時に微生物
が産生する菌体内目的物質を菌体外へ漏出させる
場合は界面活性剤例えば（エマルゲル界面活性
剤）が含有されている水溶液を用いるとよい。 組換え微生物の産生する有用物質の諸性質を損
うことなく該微生物を殺菌しうるグルコン酸クロ
ルヘキシジンの濃度は、用いる組換え微生物の種
類（菌株）や培養濃度または培養に用いる培地の
種類によつて異なるが、最終0.03％から0.5％で
あるのが好ましい。具体的にはグルコン酸クロル
ヘキシジン20％水溶液（例えばヒビテン：住友化
学工業社製）を、グルコン酸クロルヘキシジンが
上記の濃度になるように、組換え微生物培養液に
加えて適当な時間（30分から６時間）撹拌するだ
けでよい。処理温度は、特に制限されないが、有
用物質の性質が損われないよう配慮することが望
まれる。 上記のようにして殺菌された組換え微生物培養
液から菌体（死菌体）を遠心分離により集め、適
当に菌体を破砕後、目的とする有用物質を抽出・
精製する適当な工程へ移る。殺菌剤として添加さ
れたグルコン酸クロルヘキシジンは、精製過程で
容易に除くことが可能である。また、具体的には
以下の実施例および参考例で述べるが、本発明の
殺菌法によつて殺菌された組換え微生物（大腸
菌）から、目的とする有用生理活性ポリペプチド
（ヒト・インターフエロン活性を有するポリペプ
チド）を、その物理化学的および生理学的性質を
損うことなく抽出・精製することができる。 以下の実施例および参考例では、組換え微生物
としてヒト・インターフエロン活性を有するポリ
ペプチド産生能を有する大腸菌形質転換体につい
て述べるが、本発明の殺菌法は大腸菌以外の微生
物にも適用できる。また、有用物質は、ヒト・イ
ンターフエロン活性を有するポリペプチドに限る
ものでもない。 実施例 １ グルコン酸クロルヘキシジンの濃度と殺菌効果 ヒト・インターフエロン活性を有するポリペプ
チドの生産能を有する組換え微生物（大腸菌）
W3110／pIN5T4（特開昭60−24187号公報に開示
のプラスミドpINGIF54上のアンピシリン耐性遺
伝子をテトラサイクリン耐性遺伝子で置き換えた
プラスミドpIN5T4により形質転換された大腸
菌）を、ポリペプトン３％、酵母エキス２％、グ
ルコース２％、KH2PO40.5％、MgSO4・7H2
O0.01％およびテトラサイクリン20μg／mlを含む
培地で36時間、30℃で通気撹拌培養した。この時
の培養液中の該大腸菌の生菌数は１ml当り3.2×
107CFU（colony forming unit）であつた。この
培養液に、20％グルコン酸クロルヘキシジン水溶
液（住友化学工業社製）を、グルコン酸クロルヘ
キシジンとして0.03％から0.18％になるように加
え、30℃で１時間撹拌後、培養液中の大腸菌の生
菌数を調べた。その結果、第１表に示すように、
グルコン酸クロルヘキシジンは低濃度で充分組換
え微生物（大腸菌）を殺菌することが認められ
た。生菌数は培養液１mlから遠心（12000rpm、
５分）して得られる沈澱物を、無菌の生理食塩水
で３回洗浄後、同食塩水１mlを加え、その懸濁液
または食塩水で適当に希釈した懸濁液0.1mlを、
培養に用いた同じ培地（但し２％寒天を含む）上
に塗布し、37℃で24時間培養後生じるコロニーを
計数することにより行つた。生菌数の測定は同じ
サンプルについて最低２回行つた。第１表はその
平均値を示している。 一方、グルコン酸クロルヘキシジン処理および
未処理による目的生産物（この場合ヒト・インタ
ーフエロン活性をを有するポリペプチド）の活性
（抗ウイルス活性）に及ぼす影響を調べた結果、
第１表に示すように、グルコン酸クロルヘキシジ
ンは用いた濃度範囲においては、ほとんど影響が
なかつた。（若干の値のバラツキは希釈率にもと
ずく活性測定の誤差によるものと考えられる）。
なお、抗ウイルス活性は、培養液から遠心分離し
て得られる菌体を、凍結・融合によつて破砕後、
上清について常法に従い測定された。
【表】
さらに、上述と同じ菌株を用い同様の培養条件
によつて得られた最終生菌数の異なる培養液につ
いて、グルコン酸クロルヘキシジンを0.06％から
0.36％になるよう添加し、先述と同様な方法で生
菌数および抗ウイルス活性を調べた。その結果、
第２表に示すごとく、グルコン酸クロルヘキシジ
ンが0.18％から0.36％では、完全に組換え大腸菌
を殺菌し、しかも該組換え菌の産生するインター
フエロン活性にはほとんど影響しないことが認め
られた。
によつて得られた最終生菌数の異なる培養液につ
いて、グルコン酸クロルヘキシジンを0.06％から
0.36％になるよう添加し、先述と同様な方法で生
菌数および抗ウイルス活性を調べた。その結果、
第２表に示すごとく、グルコン酸クロルヘキシジ
ンが0.18％から0.36％では、完全に組換え大腸菌
を殺菌し、しかも該組換え菌の産生するインター
フエロン活性にはほとんど影響しないことが認め
られた。
【表】
実施例 ２
大量培養における組換え微生物の殺菌
ヒト・インターフエロン活性を有するポリペプ
チドの生産能を有する大腸菌W3110／pIN5T4
（特開昭60−24187号公報に開示のプラスミド
pINGIF54上のアンピシリン耐性遺伝子をテトラ
サイクリン耐性遺伝子で置き換えたプラスミド
pIN5T4により形質転換された大腸菌）を、ポリ
ペプトン３％、酵母エキス２％、グルコース２
％、KH2PO40.5％、MgSO4・7H2O0.01％および
テトラサイクリン20μg／mlを含む培地700で36
時間、30℃で通気撹拌培養した（なお、上記700
の培地には同組成の培地で培養された約１×
109cells／mlの該大腸菌培養液0.5を種菌として
接種して培養された）。 上記の如く培養された大腸菌培養液700に、
20％のグルコン酸クロルヘキシジン水溶液（住友
化学工業社製）をグルコン酸クロルヘキシジンと
して0.15％になるように添加し、30℃で１時間撹
拌後培養液中の生菌数を、実施例１に記した方法
に従つて測定した（なお、殺菌剤添加前の培養液
中の生菌数は５×108CFU／mlであつた）。その
結果、生菌は全く認められなかつた。 次に、殺菌処理前の培養液および上記のように
殺菌処理された培養液から10mlを採取し菌体を遠
心分離後、凍結・融解の繰り返しによつて菌体を
破砕し、そのうち遠心上清液中のインターフエロ
ン活性（抗ウイルス活性）を常法に従つて測定し
た。その結果、両者（殺菌処理前と後）のインタ
ーフエロン（抗ウイルス活性）の比活性は変らな
かつた。また、両者の培養菌体からの抽出液を、
SDSポリアクリルアミド電気泳動にかけてみられ
る蛋白のバンドのパターンも両者変らなかつた。
即ち、大量培養においてもグルコン酸クロルヘキ
シジンによる殺菌処理によつても目的とするイン
ターフエロン活性を有する蛋白が、何ら損なわれ
ることなく抽出されることが確認できた。 また、参考例に記すように、上記のように殺菌
処理された培養菌体から純粋なヒトインターフエ
ロン活性を有するポリペプチド（蛋白）を精製す
ることができた。また、精製標品中には、殺菌剤
として添加したグルコン酸クロルヘキシジンはラ
ジアルパツクC18カラム（ウオーターズ製）を用
いたガスクロマトグラフイーによつても検出され
なかつた。 参考例 実施例２に記したように殺菌処理された培養液
から湿菌体として800ｇを得、以下のようにヒ
ト・インターフエロン活性を有するポリペプチド
の精製を行つた。 まず、上記の菌体を、1mMZnCl2を含む冷却し
た20mMトリス塩酸バツフアー（以下THB）PH
7.4，5.1に懸濁し、氷冷したMantonGaulin社
製ホモジナイザーM15にてホモジナイズした後、
遠心分離し（7000rpm、20分間）上清を得た。こ
れに15％ポリエチレンイミン（以下PEI）水溶液
（pH8.0，HClで調整）を最終濃度0.75％となる様
に加え10分間撹拌後、４℃で２時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離（7000rpm、20分間）で除去
し、上清4.7を得た。この上清を、20mMN−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−プ
ロパンスルフオン酸バツフアー（EPPSバツフア
ー）PH8.6で平衡化した。QAEセフアデツクスＡ
−25（Ｈフアルマンア社製）カラムにかけ、素通
り画分を得た。次に0.1％の２−メルカプトエタ
ノール（以下２−ME）を含む20mMTHBPH7.4
で平衡化したCMセフアロースCL6B（フアルマシ
ア社製）カラムに、この素通り画分をかけ吸着し
た活性画分を０〜0.5MのNaCl直線濃度勾配で溶
出し、インターフエロン活性の高い区分を集め
た。なお、インターフエロン活性は特開昭58−
201995号公報に記載した方法に準じて測定した。
続いてこの画分に50％飽和となる様に硫酸アンモ
ニウムを添加し、塩析を行い、7000rpm、20分間
遠心分離して沈澱を得た。沈澱部を0.3MNaCl及
び0.1％ 2MEを含む20mMリン酸ナトリウムバ
ツフアー（以下、20mMPSB）PH7.4に溶解し、
同バツフアーで平衡化したセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社製）カラムにかけ、最終精製品
として298mgのヒト・インターフエロン活性を有
するポリペプチドを得た（インターフエロンの比
活性1.6〜1.7×106Ｕ／mg蛋白）。このポリペプチ
ドのSDS−PAGEによる純度検定では純度99％以
上であり、また同SDS−PAGEのバンドの位置は
目的とするポリペプチドのバンドの位置と一致し
た。
チドの生産能を有する大腸菌W3110／pIN5T4
（特開昭60−24187号公報に開示のプラスミド
pINGIF54上のアンピシリン耐性遺伝子をテトラ
サイクリン耐性遺伝子で置き換えたプラスミド
pIN5T4により形質転換された大腸菌）を、ポリ
ペプトン３％、酵母エキス２％、グルコース２
％、KH2PO40.5％、MgSO4・7H2O0.01％および
テトラサイクリン20μg／mlを含む培地700で36
時間、30℃で通気撹拌培養した（なお、上記700
の培地には同組成の培地で培養された約１×
109cells／mlの該大腸菌培養液0.5を種菌として
接種して培養された）。 上記の如く培養された大腸菌培養液700に、
20％のグルコン酸クロルヘキシジン水溶液（住友
化学工業社製）をグルコン酸クロルヘキシジンと
して0.15％になるように添加し、30℃で１時間撹
拌後培養液中の生菌数を、実施例１に記した方法
に従つて測定した（なお、殺菌剤添加前の培養液
中の生菌数は５×108CFU／mlであつた）。その
結果、生菌は全く認められなかつた。 次に、殺菌処理前の培養液および上記のように
殺菌処理された培養液から10mlを採取し菌体を遠
心分離後、凍結・融解の繰り返しによつて菌体を
破砕し、そのうち遠心上清液中のインターフエロ
ン活性（抗ウイルス活性）を常法に従つて測定し
た。その結果、両者（殺菌処理前と後）のインタ
ーフエロン（抗ウイルス活性）の比活性は変らな
かつた。また、両者の培養菌体からの抽出液を、
SDSポリアクリルアミド電気泳動にかけてみられ
る蛋白のバンドのパターンも両者変らなかつた。
即ち、大量培養においてもグルコン酸クロルヘキ
シジンによる殺菌処理によつても目的とするイン
ターフエロン活性を有する蛋白が、何ら損なわれ
ることなく抽出されることが確認できた。 また、参考例に記すように、上記のように殺菌
処理された培養菌体から純粋なヒトインターフエ
ロン活性を有するポリペプチド（蛋白）を精製す
ることができた。また、精製標品中には、殺菌剤
として添加したグルコン酸クロルヘキシジンはラ
ジアルパツクC18カラム（ウオーターズ製）を用
いたガスクロマトグラフイーによつても検出され
なかつた。 参考例 実施例２に記したように殺菌処理された培養液
から湿菌体として800ｇを得、以下のようにヒ
ト・インターフエロン活性を有するポリペプチド
の精製を行つた。 まず、上記の菌体を、1mMZnCl2を含む冷却し
た20mMトリス塩酸バツフアー（以下THB）PH
7.4，5.1に懸濁し、氷冷したMantonGaulin社
製ホモジナイザーM15にてホモジナイズした後、
遠心分離し（7000rpm、20分間）上清を得た。こ
れに15％ポリエチレンイミン（以下PEI）水溶液
（pH8.0，HClで調整）を最終濃度0.75％となる様
に加え10分間撹拌後、４℃で２時間放置した。生
じた沈殿を遠心分離（7000rpm、20分間）で除去
し、上清4.7を得た。この上清を、20mMN−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−３−プ
ロパンスルフオン酸バツフアー（EPPSバツフア
ー）PH8.6で平衡化した。QAEセフアデツクスＡ
−25（Ｈフアルマンア社製）カラムにかけ、素通
り画分を得た。次に0.1％の２−メルカプトエタ
ノール（以下２−ME）を含む20mMTHBPH7.4
で平衡化したCMセフアロースCL6B（フアルマシ
ア社製）カラムに、この素通り画分をかけ吸着し
た活性画分を０〜0.5MのNaCl直線濃度勾配で溶
出し、インターフエロン活性の高い区分を集め
た。なお、インターフエロン活性は特開昭58−
201995号公報に記載した方法に準じて測定した。
続いてこの画分に50％飽和となる様に硫酸アンモ
ニウムを添加し、塩析を行い、7000rpm、20分間
遠心分離して沈澱を得た。沈澱部を0.3MNaCl及
び0.1％ 2MEを含む20mMリン酸ナトリウムバ
ツフアー（以下、20mMPSB）PH7.4に溶解し、
同バツフアーで平衡化したセフアクリルＳ−200
（フアルマシア社製）カラムにかけ、最終精製品
として298mgのヒト・インターフエロン活性を有
するポリペプチドを得た（インターフエロンの比
活性1.6〜1.7×106Ｕ／mg蛋白）。このポリペプチ
ドのSDS−PAGEによる純度検定では純度99％以
上であり、また同SDS−PAGEのバンドの位置は
目的とするポリペプチドのバンドの位置と一致し
た。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 組換え微生物の培養物からインターフエロン
活性を有するポリペプチドを抽出・精製する前の
工程において、該微生物の培養液にクロルヘキシ
ジンの塩を加えて該培養物を殺菌することを特徴
とする組換え微生物の殺菌法。 ２ クロルヘキシジンの塩がグルコン酸クロルヘ
キシジンである特許請求の範囲第１項記載の殺菌
法。 ３ グルコン酸クロルヘキシジンを0.03％から
0.5％になるように培養液に加えることを特徴と
する特許請求の範囲第２項記載の殺菌法。 ４ 組換え微生物がインターフエロン活性を有す
るポリペプチドを産生する微生物であることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載の殺菌法。 ５ 上記インターフエロン活性を有するポリペプ
チドがガンマ型インターフエロン活性を有するポ
リペプチドである特許請求の範囲第４項記載の殺
菌法。 ６ インターフエロン活性を有するポリペプチド
を産生する組換え微生物が大腸菌である特許請求
の範囲第４項または第５項に記載の殺菌法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281377A JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
| EP85116457A EP0189587B1 (en) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Method of sterilizing recombinant microorganism |
| AT85116457T ATE48531T1 (de) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Verfahren zum sterilisieren von rekombinantem mikroorganismus. |
| DE8585116457T DE3574675D1 (de) | 1984-12-27 | 1985-12-23 | Verfahren zum sterilisieren von rekombinantem mikroorganismus. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59281377A JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61152275A JPS61152275A (ja) | 1986-07-10 |
| JPH0575392B2 true JPH0575392B2 (ja) | 1993-10-20 |
Family
ID=17638282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59281377A Granted JPS61152275A (ja) | 1984-12-27 | 1984-12-27 | 組換え微生物の殺菌法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0189587B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61152275A (ja) |
| AT (1) | ATE48531T1 (ja) |
| DE (1) | DE3574675D1 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3733921A1 (de) * | 1987-10-07 | 1989-04-20 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur inaktivierung rekombinanter dna |
| US5242931A (en) * | 1988-06-09 | 1993-09-07 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Tricyclic compounds as TXA2 antagonists |
| DE102004006320C5 (de) * | 2004-02-10 | 2012-10-18 | Autoliv Development Ab | Baugruppe bestehend aus einer Sitzlehne und einem Gassack-Modul |
-
1984
- 1984-12-27 JP JP59281377A patent/JPS61152275A/ja active Granted
-
1985
- 1985-12-23 EP EP85116457A patent/EP0189587B1/en not_active Expired
- 1985-12-23 AT AT85116457T patent/ATE48531T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-12-23 DE DE8585116457T patent/DE3574675D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0189587A2 (en) | 1986-08-06 |
| EP0189587A3 (en) | 1986-10-22 |
| ATE48531T1 (de) | 1989-12-15 |
| EP0189587B1 (en) | 1989-12-13 |
| JPS61152275A (ja) | 1986-07-10 |
| DE3574675D1 (de) | 1990-01-18 |
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