JPH0576356A - Ｆｇｆムテインの製造法 - Google Patents
Ｆｇｆムテインの製造法Info
- Publication number
- JPH0576356A JPH0576356A JP3127435A JP12743591A JPH0576356A JP H0576356 A JPH0576356 A JP H0576356A JP 3127435 A JP3127435 A JP 3127435A JP 12743591 A JP12743591 A JP 12743591A JP H0576356 A JPH0576356 A JP H0576356A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- leu
- gly
- lys
- ser
- arg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】糖鎖結合部位を導入したＦＧＦムテインの製造
法を開発する。 【構成】少なくとも１個の糖鎖結合部位を導入したＦＧ
ＦムテインをコードするＤＮＡを含有するベクターで形
質転換したリンパ球系動物細胞を培地に培養することに
より、当該ムテインを製造した。 【効果】糖鎖結合部位に導入したＦＧＦムテインを効率
良く生産することができる。
法を開発する。 【構成】少なくとも１個の糖鎖結合部位を導入したＦＧ
ＦムテインをコードするＤＮＡを含有するベクターで形
質転換したリンパ球系動物細胞を培地に培養することに
より、当該ムテインを製造した。 【効果】糖鎖結合部位に導入したＦＧＦムテインを効率
良く生産することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、形質転換されたリンパ
球系動物細胞，および線維芽細胞成長因子(以下、ＦＧ
Ｆと略称することもある。)ムテインの製造法に関す
る。
球系動物細胞，および線維芽細胞成長因子(以下、ＦＧ
Ｆと略称することもある。)ムテインの製造法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)は、ペプチ
ド性細胞成長因子で、等電点が塩基性のｂＦＧＦと酸性
のａＦＧＦがあり、共に全アミノ酸配列が明らかにされ
ている［F. Eschら：Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ
８５：6507（1985）およびK.A.Thomasら：Proc. Natl.
Acad. Sci. ＵＳＡ８２：6409 (1985)]。ＦＧＦは、in
vitro では３Ｔ３細胞や血管内皮細胞を含む中胚葉由
来細胞に対して増殖促進作用を、in viro では血管新
生作用を示すことが知られている［D．Gospodarowicz
ら：Endocrine Reviews ８：95(1987)]。中でもＦＧＦ
の血管新生作用は細胞増殖作用と相まって、損傷，火傷
の治療薬，血栓症，動脈硬化症などの予防治療薬として
用いられるものである。天然に存在するＦＧＦは極めて
微量で、これを取得するのは困難であったが、最近遺伝
子組換え技術を用いた製造法が開発された。遺伝子組換
え技術を用いたbＦＧＦおよびaＦＧＦの製造について
は、Biochem. Biophys. Res. Commun. １ ４６：470(198
7), Biotechnology ５：960(1987), The Journal of B
iologicalChemistry ２６３：16471（1988）, The Jour
nal of Biological Chemistry ２６３：18452(1988),
The Journal of Biological Chemistry ２６３：162
97(1988)などの報告がある。ＦＧＦムテインに関して
は、Biochem．Biophys. Res. Commun． １５１：701（1
988), The Journal of Biological Chemistry ２６３：
18452(1988)にＦＧＦに存在するＣys残基をＳerに置換
したムテインについて記載されている。
ド性細胞成長因子で、等電点が塩基性のｂＦＧＦと酸性
のａＦＧＦがあり、共に全アミノ酸配列が明らかにされ
ている［F. Eschら：Proc. Natl. Acad. Sci. ＵＳＡ
８５：6507（1985）およびK.A.Thomasら：Proc. Natl.
Acad. Sci. ＵＳＡ８２：6409 (1985)]。ＦＧＦは、in
vitro では３Ｔ３細胞や血管内皮細胞を含む中胚葉由
来細胞に対して増殖促進作用を、in viro では血管新
生作用を示すことが知られている［D．Gospodarowicz
ら：Endocrine Reviews ８：95(1987)]。中でもＦＧＦ
の血管新生作用は細胞増殖作用と相まって、損傷，火傷
の治療薬，血栓症，動脈硬化症などの予防治療薬として
用いられるものである。天然に存在するＦＧＦは極めて
微量で、これを取得するのは困難であったが、最近遺伝
子組換え技術を用いた製造法が開発された。遺伝子組換
え技術を用いたbＦＧＦおよびaＦＧＦの製造について
は、Biochem. Biophys. Res. Commun. １ ４６：470(198
7), Biotechnology ５：960(1987), The Journal of B
iologicalChemistry ２６３：16471（1988）, The Jour
nal of Biological Chemistry ２６３：18452(1988),
The Journal of Biological Chemistry ２６３：162
97(1988)などの報告がある。ＦＧＦムテインに関して
は、Biochem．Biophys. Res. Commun． １５１：701（1
988), The Journal of Biological Chemistry ２６３：
18452(1988)にＦＧＦに存在するＣys残基をＳerに置換
したムテインについて記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、アミノ
酸配列を修飾し、糖鎖付加部位を導入することによっ
て、ＦＧＦの安定性、細胞における産生能、分子当りの
細胞増殖活性の上昇、細胞外への分泌能の付与、さらに
未知の生物活性の賦活化がなされるであろうと考え、少
なくとも１個の糖鎖結合部位を導入したＦＧＦムテイ
ン，それをコードするＤＮＡ，該ＤＮＡを含有するベク
ター，該ベクターで形質転換された形質転換体，および
該形質転換体において宿主が酵母または動物細胞である
ものを用いて糖鎖を結合したムテインを製造する方法に
つき発明をし、特許出願した(日本特許願平成２年第１
０９０１４号，ヨーロッパ特許出願第９０１０７７３
７.０号，米国特許出願第５１１,４６９号)。このよう
な糖鎖を付加したＦＧＦムテインを工業的にさらに大量
に生産できれば、医薬としての供給を容易にすることが
できることとなる。
酸配列を修飾し、糖鎖付加部位を導入することによっ
て、ＦＧＦの安定性、細胞における産生能、分子当りの
細胞増殖活性の上昇、細胞外への分泌能の付与、さらに
未知の生物活性の賦活化がなされるであろうと考え、少
なくとも１個の糖鎖結合部位を導入したＦＧＦムテイ
ン，それをコードするＤＮＡ，該ＤＮＡを含有するベク
ター，該ベクターで形質転換された形質転換体，および
該形質転換体において宿主が酵母または動物細胞である
ものを用いて糖鎖を結合したムテインを製造する方法に
つき発明をし、特許出願した(日本特許願平成２年第１
０９０１４号，ヨーロッパ特許出願第９０１０７７３
７.０号，米国特許出願第５１１,４６９号)。このよう
な糖鎖を付加したＦＧＦムテインを工業的にさらに大量
に生産できれば、医薬としての供給を容易にすることが
できることとなる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記した
事情に鑑み、糖鎖を付加したＦＧＦムテインをさらに大
量に生産する方法につき鋭意研究した結果、さらに工業
的に有利に糖鎖付加ＦＧＦムテインを製造しうる本発明
を完成した。本発明は、(１)、少なくとも１個の糖鎖結
合部位を導入した線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)ムテイン
をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換した
リンパ球系動物細胞，および(２)、 上記(１)のリンパ球
系動物細胞を培地に培養し、培養物中に糖鎖の結合した
ＦＧＦムテインを生成蓄積せしめることを特徴とする当
該ムテインの製造法である。
事情に鑑み、糖鎖を付加したＦＧＦムテインをさらに大
量に生産する方法につき鋭意研究した結果、さらに工業
的に有利に糖鎖付加ＦＧＦムテインを製造しうる本発明
を完成した。本発明は、(１)、少なくとも１個の糖鎖結
合部位を導入した線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)ムテイン
をコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換した
リンパ球系動物細胞，および(２)、 上記(１)のリンパ球
系動物細胞を培地に培養し、培養物中に糖鎖の結合した
ＦＧＦムテインを生成蓄積せしめることを特徴とする当
該ムテインの製造法である。
【０００５】本発明のムテインにおける変異させる前の
ＦＧＦとしては、酸性ＦＧＦでもよく、塩基性ＦＧＦで
もよい。また、温血哺乳動物のＦＧＦのいずれのもので
もよい。その代表例としてはたとえば、ヒト,ウシ,ラッ
トのbＦＧＦが挙げられる。さらに具体的には、 Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇ
ly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys
−Ｓer−Ａsp−Ｐro [I](配列表:配列番号１) で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好まし
い。さらに、一般式 Ｐro−Ａla−Ｌeu−Ｐro−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｓ
er−Ｇly−Ａla−Ｐhe−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe
−Ｌys−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−
Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉ
le−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly
−Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−
Ｉle−Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇ
lu−Ａrg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly
−Ｖal−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−
Ｍet−Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａ
la−Ｓer−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ａsp−Ｇlu−Ｃys
−Ｐhe−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−
Ａsn−Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａ
rg−Ｌys−Ｔyr−Ｙ−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−
Ｌeu−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌ
eu−Ｇly−Ｚ−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln−
Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−Ｓ
er−Ａla−Ｌys−Ｓer [II] 〔式中、ＹはＴhrまたはＳerを示し、ＹがＴhrのときＺ
はＳerを、ＹがＳerのときＺはＰroをそれぞれ示す。〕
で表わされるポリペプチドが好ましい。
ＦＧＦとしては、酸性ＦＧＦでもよく、塩基性ＦＧＦで
もよい。また、温血哺乳動物のＦＧＦのいずれのもので
もよい。その代表例としてはたとえば、ヒト,ウシ,ラッ
トのbＦＧＦが挙げられる。さらに具体的には、 Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇ
ly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys
−Ｓer−Ａsp−Ｐro [I](配列表:配列番号１) で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好まし
い。さらに、一般式 Ｐro−Ａla−Ｌeu−Ｐro−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｓ
er−Ｇly−Ａla−Ｐhe−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe
−Ｌys−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−
Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉ
le−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly
−Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−
Ｉle−Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇ
lu−Ａrg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly
−Ｖal−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−
Ｍet−Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａ
la−Ｓer−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ａsp−Ｇlu−Ｃys
−Ｐhe−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−
Ａsn−Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａ
rg−Ｌys−Ｔyr−Ｙ−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−
Ｌeu−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌ
eu−Ｇly−Ｚ−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln−
Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−Ｓ
er−Ａla−Ｌys−Ｓer [II] 〔式中、ＹはＴhrまたはＳerを示し、ＹがＴhrのときＺ
はＳerを、ＹがＳerのときＺはＰroをそれぞれ示す。〕
で表わされるポリペプチドが好ましい。
【０００６】さらに、アミノ酸配列： Ｐro−Ａla−Ｌeu−Ｐro−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｓ
er−Ｇly−Ａla−Ｐhe-Pro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−
Ｌys−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｌ
ys−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle
−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−
Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−Ｉ
le−Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇlu
−Ａrg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly−
Ｖal−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍ
et−Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａla
−Ｓer−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ａsp−Ｇlu−Ｃys−
Ｐhe−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−Ａ
sn−Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａrg
−Ｌys−Ｔyr−Ｔhr−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−
Ｌeu−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌ
eu−Ｇly−Ｓer−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln
−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−
Ｓer−Ａla−Ｌys−Ｓer [III](配列表:配列番号２) を含有するヒトbＦＧＦが好ましい。
er−Ｇly−Ａla−Ｐhe-Pro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−
Ｌys−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｌ
ys−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle
−Ｈis−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−
Ｖal−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−Ｉ
le−Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇlu
−Ａrg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly−
Ｖal−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍ
et−Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａla
−Ｓer−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ａsp−Ｇlu−Ｃys−
Ｐhe−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−Ａ
sn−Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａrg
−Ｌys−Ｔyr−Ｔhr−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−
Ｌeu−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌ
eu−Ｇly−Ｓer−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln
−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−
Ｓer−Ａla−Ｌys−Ｓer [III](配列表:配列番号２) を含有するヒトbＦＧＦが好ましい。
【０００７】またさらに、アミノ酸配列: Ｐro−Ａla−Ｌeu−Ｐro−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ｇly−Ｇ
ly−Ａla−Ｐhe−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−Ｌys
−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｌys−
Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−Ｈ
is−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｖal
−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−Ｖal−
Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇlu−Ａ
rg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｖal
−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍet−
Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａla−Ｓ
er−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｐhe
−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−Ａsn−
Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａrg−Ｌ
ys−Ｔyr−Ｓer−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−Ｌeu
−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌeu−
Ｇly−Ｓer−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln−Ｌ
ys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−Ｓer
−Ａla−Ｌys−Ｓer [IV](配列表:配列番号３) を含有するラットＦＧＦが好ましい。
ly−Ａla−Ｐhe−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−Ｌys
−Ａsp−Ｐro−Ｌys−Ａrg−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｌys−
Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−Ｈ
is−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｖal
−Ａrg−Ｇlu−Ｌys−Ｓer−Ａsp−Ｐro−Ｈis−Ｖal−
Ｌys−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ａla−Ｇlu−Ｇlu−Ａ
rg−Ｇly−Ｖal−Ｖal−Ｓer−Ｉle−Ｌys−Ｇly−Ｖal
−Ｃys−Ａla−Ａsn−Ａrg−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍet−
Ｌys−Ｇlu−Ａsp−Ｇly−Ａrg−Ｌeu−Ｌeu−Ａla−Ｓ
er−Ｌys−Ｃys−Ｖal−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｐhe
−Ｐhe−Ｐhe−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｓer−Ａsn−
Ａsn−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ａrg−Ｓer−Ａrg−Ｌ
ys−Ｔyr−Ｓer−Ｓer−Ｔrp−Ｔyr−Ｖal−Ａla−Ｌeu
−Ｌys−Ａrg−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌys−Ｌeu−
Ｇly−Ｓer−Ｌys−Ｔhr−Ｇly−Ｐro−Ｇly−Ｇln−Ｌ
ys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐro−Ｍet−Ｓer
−Ａla−Ｌys−Ｓer [IV](配列表:配列番号３) を含有するラットＦＧＦが好ましい。
【０００８】ａＦＧＦとしては、ヒト由来のもの、ウシ
由来のものが挙げられる。ウシaＦＧＦのアミノ酸配列
としては、 Ｐhe−Ａsn−Ｌeu−Ｐro−Ｌeu−Ｇly−Ａsn−Ｔyr−Ｌ
ys−Ｌys−Ｐro−Ｌys−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｓer
−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−
Ｌeu−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ｔhr−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｔ
hr−Ｌys−Ａsp−Ａrg−Ｓer−Ａsp−Ｇln−Ｈis−Ｉle
−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｃys−Ａla−Ｇlu−Ｓer−
Ｉle−Ｇly−Ｇlu−Ｖal−Ｔyr−Ｉle−Ｌys−Ｓer−Ｔ
hr−Ｇlu−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｐhe−Ｌeu−Ａla−Ｍet
−Ａsp−Ｔhr−Ａsp−Ｇly−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｇly−
Ｓer−Ｇln−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｌ
eu−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｇlu−Ａsn
−Ｈis−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ｉle−Ｓer−Ｌys−
Ｌys−Ｈis−Ａla−Ｇlu−Ｌys−Ｈis−Ｔrp−Ｐhe−Ｖ
al−Ｇly−Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ａrg−Ｓer
−Ｌys−Ｌeu−Ｇly−Ｐro−Ａrg−Ｔhr−Ｈis−Ｐhe−
Ｇly−Ｇln−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐ
ro−Ｌeu−Ｐro−Ｖal−Ｓer−Ｓer−Ａsp [V](配列
表:配列番号４)
由来のものが挙げられる。ウシaＦＧＦのアミノ酸配列
としては、 Ｐhe−Ａsn−Ｌeu−Ｐro−Ｌeu−Ｇly−Ａsn−Ｔyr−Ｌ
ys−Ｌys−Ｐro−Ｌys−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｓer
−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｔyr−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−
Ｌeu−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ｔhr−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｔ
hr−Ｌys−Ａsp−Ａrg−Ｓer−Ａsp−Ｇln−Ｈis−Ｉle
−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｃys−Ａla−Ｇlu−Ｓer−
Ｉle−Ｇly−Ｇlu−Ｖal−Ｔyr−Ｉle−Ｌys−Ｓer−Ｔ
hr−Ｇlu−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｐhe−Ｌeu−Ａla−Ｍet
−Ａsp−Ｔhr−Ａsp−Ｇly−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｇly−
Ｓer−Ｇln−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｌ
eu−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｇlu−Ａsn
−Ｈis−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ｉle−Ｓer−Ｌys−
Ｌys−Ｈis−Ａla−Ｇlu−Ｌys−Ｈis−Ｔrp−Ｐhe−Ｖ
al−Ｇly−Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ａrg−Ｓer
−Ｌys−Ｌeu−Ｇly−Ｐro−Ａrg−Ｔhr−Ｈis−Ｐhe−
Ｇly−Ｇln−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐ
ro−Ｌeu−Ｐro−Ｖal−Ｓer−Ｓer−Ａsp [V](配列
表:配列番号４)
【０００９】さらに、ヒトaＦＧＦのアミノ酸配列とし
ては、 Ｐhe−Ａsn−Ｌeu−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｔyr−Ｌ
ys−Ｌys−Ｐro−Ｌys−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｓer
−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−
Ｌeu−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ｔhr−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｔ
hr−Ａrg−Ａsp−Ａrg−Ｓer−Ａsp−Ｇln−Ｈis−Ｉle
−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｓer−Ａla−Ｇlu−Ｓer−
Ｖal−Ｇly−Ｇlu−Ｖal−Ｔyr−Ｉle−Ｌys−Ｓer−Ｔ
hr−Ｇlu−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍet
−Ａsp−Ｔhr−Ａsp−Ｇly−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｇly−
Ｓer−Ｇln−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｌ
eu−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｇlu−Ａsn
−Ｈis−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ｉle−Ｓer−Ｌys−
Ｌys−Ｈis−Ａla−Ｇlu−Ｌys−Ａsn−Ｔrp−Ｐhe−Ｖ
al−Ｇly−Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｓer−Ｃys
−Ｌys−Ａrg−Ｇly−Ｐro−Ａrg−Ｔhr−Ｈis−Ｔyr−
Ｇly−Ｇln−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐ
ro−Ｌeu−Ｐro−Ｖal−Ｓer−Ｓer−Ａsp [VI](配列
表:配列番号５） が好ましい。ＦＧＦとしては、なかでもヒト塩基性ＦＧ
Ｆが好ましい。
ては、 Ｐhe−Ａsn−Ｌeu−Ｐro−Ｐro−Ｇly−Ａsn−Ｔyr−Ｌ
ys−Ｌys−Ｐro−Ｌys−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｃys−Ｓer
−Ａsn−Ｇly−Ｇly−Ｈis−Ｐhe−Ｌeu−Ａrg−Ｉle−
Ｌeu−Ｐro−Ａsp−Ｇly−Ｔhr−Ｖal−Ａsp−Ｇly−Ｔ
hr−Ａrg−Ａsp−Ａrg−Ｓer−Ａsp−Ｇln−Ｈis−Ｉle
−Ｇln−Ｌeu−Ｇln−Ｌeu−Ｓer−Ａla−Ｇlu−Ｓer−
Ｖal−Ｇly−Ｇlu−Ｖal−Ｔyr−Ｉle−Ｌys−Ｓer−Ｔ
hr−Ｇlu−Ｔhr−Ｇly−Ｇln−Ｔyr−Ｌeu−Ａla−Ｍet
−Ａsp−Ｔhr−Ａsp−Ｇly−Ｌeu−Ｌeu−Ｔyr−Ｇly−
Ｓer−Ｇln−Ｔhr−Ｐro−Ａsn−Ｇlu−Ｇlu−Ｃys−Ｌ
eu−Ｐhe−Ｌeu−Ｇlu−Ａrg−Ｌeu−Ｇlu−Ｇlu−Ａsn
−Ｈis−Ｔyr−Ａsn−Ｔhr−Ｔyr−Ｉle−Ｓer−Ｌys−
Ｌys−Ｈis−Ａla−Ｇlu−Ｌys−Ａsn−Ｔrp−Ｐhe−Ｖ
al−Ｇly−Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａsn−Ｇly−Ｓer−Ｃys
−Ｌys−Ａrg−Ｇly−Ｐro−Ａrg−Ｔhr−Ｈis−Ｔyr−
Ｇly−Ｇln−Ｌys−Ａla−Ｉle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐ
ro−Ｌeu−Ｐro−Ｖal−Ｓer−Ｓer−Ａsp [VI](配列
表:配列番号５） が好ましい。ＦＧＦとしては、なかでもヒト塩基性ＦＧ
Ｆが好ましい。
【００１０】本発明におけるムテインは、少なくとも１
個の糖鎖結合部位を有するムテインであり、さらに元の
ペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したもの
であってもよい。該変異としては、たとえばアミノ酸の
付加，構成アミノ酸の欠損，他のアミノ酸への置換が挙
げられる。上記糖鎖結合部位としては、糖鎖結合部位を
構成するアミノ酸配列が、式Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ (式中、
Ｘはアミノ酸残基を、ＹはＴhr，ＳerまたはＣysをそれ
ぞれ示す。)で表わされる配列が挙げられる。糖鎖結合
部位としては、具体的にはＡsn−Ｘ−Ｔhr，Ａsn−Ｘ−
Ｓer，Ａsn−Ｘ−Ｃys，(ＸはＰro以外のいずれのアミ
ノ酸でもよい)のアミノ酸配列が分子中に生ずればよ
い。糖タンパク質において糖鎖がタンパク質に結合する
部位についてはある種の規則性の存在することが知られ
ている。即ち糖鎖はタンパク質中のＡsn残基に結合す
る。このＡsnを含むアミノ酸配列は Asparagine sequ
on と呼ばれる配列をしており、上記の三つのアミノ酸
からなる配列で表わされる。これらは例えば下記の文献
に記されている。 ＦＥＢＳ Letters １０８：３４１(1979), Biochem. J. ２０３：７６１(1982), Biochem. J. ２０９：３３１(1983), ＦＥＢＳ Letters ９６：１７９(1978)。 上記式におけるＸとしては、Ｐro以外のアミノ酸が好ま
しく、 さらにはＧly,Ｔyr，Ａrg，Ｓer，Ｌys，Ｖalま
たはＡlaが好ましい。 さらに、 Ｘとしては、Ｇly, Ｌy
s, Ｖal, Ａlaが好ましい。上記式におけるＹとしては、
ＴhrまたはＳerが好ましい。
個の糖鎖結合部位を有するムテインであり、さらに元の
ペプチドあるいは蛋白質のアミノ酸配列が変異したもの
であってもよい。該変異としては、たとえばアミノ酸の
付加，構成アミノ酸の欠損，他のアミノ酸への置換が挙
げられる。上記糖鎖結合部位としては、糖鎖結合部位を
構成するアミノ酸配列が、式Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ (式中、
Ｘはアミノ酸残基を、ＹはＴhr，ＳerまたはＣysをそれ
ぞれ示す。)で表わされる配列が挙げられる。糖鎖結合
部位としては、具体的にはＡsn−Ｘ−Ｔhr，Ａsn−Ｘ−
Ｓer，Ａsn−Ｘ−Ｃys，(ＸはＰro以外のいずれのアミ
ノ酸でもよい)のアミノ酸配列が分子中に生ずればよ
い。糖タンパク質において糖鎖がタンパク質に結合する
部位についてはある種の規則性の存在することが知られ
ている。即ち糖鎖はタンパク質中のＡsn残基に結合す
る。このＡsnを含むアミノ酸配列は Asparagine sequ
on と呼ばれる配列をしており、上記の三つのアミノ酸
からなる配列で表わされる。これらは例えば下記の文献
に記されている。 ＦＥＢＳ Letters １０８：３４１(1979), Biochem. J. ２０３：７６１(1982), Biochem. J. ２０９：３３１(1983), ＦＥＢＳ Letters ９６：１７９(1978)。 上記式におけるＸとしては、Ｐro以外のアミノ酸が好ま
しく、 さらにはＧly,Ｔyr，Ａrg，Ｓer，Ｌys，Ｖalま
たはＡlaが好ましい。 さらに、 Ｘとしては、Ｇly, Ｌy
s, Ｖal, Ａlaが好ましい。上記式におけるＹとしては、
ＴhrまたはＳerが好ましい。
【００１１】本出願に記載の方法により生産される糖鎖
付加型bＦＧＦに付加する糖鎖の種類は、一般に知られ
ている糖タンパクに見い出される糖ならば何でもよく、
特に種類を問わない。例えば、Ｎ−アセチルグリコサミ
ン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラク
トース、フコース、シアル酸などをあげることが出来
る。また、糖鎖の長さは、１種以上の糖が付加しておれ
ばよい。好ましくは、１０〜２０の糖鎖をもつbＦＧＦ
をあげることが出来る。
付加型bＦＧＦに付加する糖鎖の種類は、一般に知られ
ている糖タンパクに見い出される糖ならば何でもよく、
特に種類を問わない。例えば、Ｎ−アセチルグリコサミ
ン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラク
トース、フコース、シアル酸などをあげることが出来
る。また、糖鎖の長さは、１種以上の糖が付加しておれ
ばよい。好ましくは、１０〜２０の糖鎖をもつbＦＧＦ
をあげることが出来る。
【００１２】該アミノ酸の付加としては、少なくとも１
個のアミノ酸が付加しているものが挙げられる。該構成
アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧＦ構成
アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。該他のアミ
ノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦＧＦ構成ア
ミノ酸が別のアミノ酸で置換されているものが挙げられ
る。ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加している
ムテインにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、
ペプチドを発現する際に用いられる開始コドンに基因す
るメチオニンや、シグナルペプチドは含まれないもので
ある。付加されているアミノ酸の数としては、少なくと
も１個であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でも
よい。ＦＧＦと少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が
欠損しているムテインにおける欠損している構成アミノ
酸の数としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何
個でもよい。
個のアミノ酸が付加しているものが挙げられる。該構成
アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧＦ構成
アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。該他のアミ
ノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦＧＦ構成ア
ミノ酸が別のアミノ酸で置換されているものが挙げられ
る。ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加している
ムテインにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、
ペプチドを発現する際に用いられる開始コドンに基因す
るメチオニンや、シグナルペプチドは含まれないもので
ある。付加されているアミノ酸の数としては、少なくと
も１個であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でも
よい。ＦＧＦと少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が
欠損しているムテインにおける欠損している構成アミノ
酸の数としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何
個でもよい。
【００１３】該欠損している構成アミノ酸の例として
は、たとえばヒトbＦＧＦのアミノ末端側１０残基（ア
ミノ末端のＭet−Ｐro−から−Ｓerまで），ヒトbＦＧ
Ｆのアミノ末端側１４残基（アミノ末端のＭet−Ｐro−
から−Ｐroまで），ヒトbＦＧＦのアミノ末端側４１残
基（アミノ末端のＭet−Ｐro−から−Ｖalまで），ヒト
bＦＧＦのカルボキシル末端側６１残基（第８６位のＬy
sからカルボキシル末端のＳerまで）などが挙げられ
る。さらに、bＦＧＦの少なくとも１個の構成アミノ酸
が欠損しているムテインとして、bＦＧＦのカルボキシ
ル末端側の７〜４６個のアミノ酸残基が欠損しているム
テインが挙げられる。該欠損の好ましい例としては、ヒ
トbＦＧＦのアミノ酸番号１０１以降のアミノ酸配列 〃 １０５ 〃 〃 １１４ 〃 〃 １１８ 〃 〃 １２３ 〃 〃 １２９ 〃 〃 １３７ 〃 が欠損したものが挙げられる。
は、たとえばヒトbＦＧＦのアミノ末端側１０残基（ア
ミノ末端のＭet−Ｐro−から−Ｓerまで），ヒトbＦＧ
Ｆのアミノ末端側１４残基（アミノ末端のＭet−Ｐro−
から−Ｐroまで），ヒトbＦＧＦのアミノ末端側４１残
基（アミノ末端のＭet−Ｐro−から−Ｖalまで），ヒト
bＦＧＦのカルボキシル末端側６１残基（第８６位のＬy
sからカルボキシル末端のＳerまで）などが挙げられ
る。さらに、bＦＧＦの少なくとも１個の構成アミノ酸
が欠損しているムテインとして、bＦＧＦのカルボキシ
ル末端側の７〜４６個のアミノ酸残基が欠損しているム
テインが挙げられる。該欠損の好ましい例としては、ヒ
トbＦＧＦのアミノ酸番号１０１以降のアミノ酸配列 〃 １０５ 〃 〃 １１４ 〃 〃 １１８ 〃 〃 １２３ 〃 〃 １２９ 〃 〃 １３７ 〃 が欠損したものが挙げられる。
【００１４】ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミ
ノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテインにおける
置換される前の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の
数としては、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよ
い。置換される前の構成アミノ酸の例としては、システ
イン,システイン以外のものが挙げられる。システイン
が特に好ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシ
ステイン以外のものとしては、アスパラギン酸,アルギ
ニン,グリシン,バリンなどが挙げられる。置換される前
の構成アミノ酸がシステインである場合には、置換され
たアミノ酸としては、たとえば中性アミノ酸が好まし
い。該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリ
シン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイシン,チロシ
ン,フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプトファン,セリ
ン,スレオニン,メチオニンなどが挙げられる。特に、セ
リン,スレオニンが好ましい。置換される前の構成アミ
ノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換され
た別のアミノ酸としては、たとえば、アミノ酸の親水
性,疎水性あるいは電荷の点で、置換される前のアミノ
酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。具体的には置換さ
れる前のアミノ酸がアスパラギン酸の場合には、置換さ
れたあとのアミノ酸としてアスパラギン,スレオニン,バ
リン,フェニルアラニン,アルギニンなどが挙げられる
が、特にアスパラギン,アルギニンが好ましい。置換さ
れる前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換されたあ
とのアミノ酸としてグルタミン,スレオニン,ロイシン,
フェニルアラニン,アスパラギン酸が挙げられるが、特
にグルタミンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸
がグリシンである場合には、置換されたあとのアミノ酸
としては、スレオニン,ロイシン,フェニルアラニン,セ
リン,グルタミン酸,アルギニンなどが挙げられ、特にス
レオニンが好ましい。
ノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテインにおける
置換される前の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の
数としては、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよ
い。置換される前の構成アミノ酸の例としては、システ
イン,システイン以外のものが挙げられる。システイン
が特に好ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシ
ステイン以外のものとしては、アスパラギン酸,アルギ
ニン,グリシン,バリンなどが挙げられる。置換される前
の構成アミノ酸がシステインである場合には、置換され
たアミノ酸としては、たとえば中性アミノ酸が好まし
い。該中性アミノ酸の具体例としては、たとえば、グリ
シン,バリン,アラニン,ロイシン,イソロイシン,チロシ
ン,フェニルアラニン,ヒスチジン,トリプトファン,セリ
ン,スレオニン,メチオニンなどが挙げられる。特に、セ
リン,スレオニンが好ましい。置換される前の構成アミ
ノ酸がシステイン以外のものである場合には、置換され
た別のアミノ酸としては、たとえば、アミノ酸の親水
性,疎水性あるいは電荷の点で、置換される前のアミノ
酸とは異なる性質をもつものを選ぶ。具体的には置換さ
れる前のアミノ酸がアスパラギン酸の場合には、置換さ
れたあとのアミノ酸としてアスパラギン,スレオニン,バ
リン,フェニルアラニン,アルギニンなどが挙げられる
が、特にアスパラギン,アルギニンが好ましい。置換さ
れる前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換されたあ
とのアミノ酸としてグルタミン,スレオニン,ロイシン,
フェニルアラニン,アスパラギン酸が挙げられるが、特
にグルタミンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸
がグリシンである場合には、置換されたあとのアミノ酸
としては、スレオニン,ロイシン,フェニルアラニン,セ
リン,グルタミン酸,アルギニンなどが挙げられ、特にス
レオニンが好ましい。
【００１５】置換される前の構成アミノ酸がセリンであ
る場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、メチ
オニン,アラニン,ロイシン,システイン,グルタミン,ア
ルギニン,アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオ
ニンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がバリン
である場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、
セリン,ロイシン,プロリン,グリシン,リジン,アスパラ
ギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ましい。置換さ
れる前の構成アミノ酸がイソロイシンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，グリシ
ン，バリン，アラニン，ロイシン，チロシン，フェニル
アラニン，ヒスチジン，トリプトファン，メチオニンが
挙げられるが、特にセリンが好ましい。置換される前の
元の構成アミノ酸としては、アスパラギン酸,アルギニ
ン,グリシン,セリン,バリンが好ましい。置換されたあ
とのアミノ酸としては、アスパラギン,グルタミン,アル
ギニン,スレオニン,メチオニン,セリン,ロイシンが好ま
しい。置換されたムテインの最も好ましいものとして
は、構成アミノ酸であるシステインがセリンに置換され
たものが最も好ましい。該アミノ酸の付加，構成アミノ
酸の欠損，他のアミノ酸への置換の好ましい例として
は、たとえばバイオケミカル・アンド・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical an
d BiophysicalResearch Communications)第１５１巻
第７０１−７０８頁(１９８８年)，ヨーロッパ特許出願
公開No.２８１,８２２号公報，日本特許出願特願平１−
１５６６２号明細書（ヨーロッパ特許出願第８９１０１
１６２.９号，公開第３２６,９０７号公報に対応)に記
載のbＦＧＦムテインが挙げられる。
る場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、メチ
オニン,アラニン,ロイシン,システイン,グルタミン,ア
ルギニン,アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオ
ニンが好ましい。置換される前の構成アミノ酸がバリン
である場合には、置換されたあとのアミノ酸としては、
セリン,ロイシン,プロリン,グリシン,リジン,アスパラ
ギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ましい。置換さ
れる前の構成アミノ酸がイソロイシンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，グリシ
ン，バリン，アラニン，ロイシン，チロシン，フェニル
アラニン，ヒスチジン，トリプトファン，メチオニンが
挙げられるが、特にセリンが好ましい。置換される前の
元の構成アミノ酸としては、アスパラギン酸,アルギニ
ン,グリシン,セリン,バリンが好ましい。置換されたあ
とのアミノ酸としては、アスパラギン,グルタミン,アル
ギニン,スレオニン,メチオニン,セリン,ロイシンが好ま
しい。置換されたムテインの最も好ましいものとして
は、構成アミノ酸であるシステインがセリンに置換され
たものが最も好ましい。該アミノ酸の付加，構成アミノ
酸の欠損，他のアミノ酸への置換の好ましい例として
は、たとえばバイオケミカル・アンド・バイオフイジカ
ル・リサーチ・コミュニケーションズ(Biochemical an
d BiophysicalResearch Communications)第１５１巻
第７０１−７０８頁(１９８８年)，ヨーロッパ特許出願
公開No.２８１,８２２号公報，日本特許出願特願平１−
１５６６２号明細書（ヨーロッパ特許出願第８９１０１
１６２.９号，公開第３２６,９０７号公報に対応)に記
載のbＦＧＦムテインが挙げられる。
【００１６】本発明のムテインは、上記した糖鎖結合部
位を有するムテインにさらに付加，欠損，置換の２つま
たは３つが組み合わさったものでもよい。なかでも、上
記した糖鎖結合部位を有するムテインに、さらに少なく
とも１個のヒト塩基性bＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミ
ノ酸で置換されているムテインが好ましい。特に、上記
した糖鎖結合部位を有するムテインにさらにヒトbＦＧ
Ｆの６９位および８７位のＣysがそれぞれＳerに置換さ
れたムテインが好ましい。本発明のムテインを製造する
ためには、従来の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指
向性変異誘発技術（Site-directed mutagenesis）が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサ
ー（Lather, R. F.）及びジェイ・ピー・レコック（ Le
coq, J. P. ），ジェネティック・エンジニアリング（
GeneticEngineering）、アカデミックプレス社（１９８
３年）第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレ
オチドに指示された変異誘発はエム・スミス（ Smith,
M. )及びエス・ギラム( Gillam, S. )、ジェネティッ
ク・エンジニアリング:原理と方法、プレナムプレス社
(１９８１年)３巻１−３２頁に示されている。
位を有するムテインにさらに付加，欠損，置換の２つま
たは３つが組み合わさったものでもよい。なかでも、上
記した糖鎖結合部位を有するムテインに、さらに少なく
とも１個のヒト塩基性bＦＧＦ構成アミノ酸が別のアミ
ノ酸で置換されているムテインが好ましい。特に、上記
した糖鎖結合部位を有するムテインにさらにヒトbＦＧ
Ｆの６９位および８７位のＣysがそれぞれＳerに置換さ
れたムテインが好ましい。本発明のムテインを製造する
ためには、従来の組換えＤＮＡ技術に加え、特定部位指
向性変異誘発技術（Site-directed mutagenesis）が採
用される。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサ
ー（Lather, R. F.）及びジェイ・ピー・レコック（ Le
coq, J. P. ），ジェネティック・エンジニアリング（
GeneticEngineering）、アカデミックプレス社（１９８
３年）第３１−５０頁、に示されている。オリゴヌクレ
オチドに指示された変異誘発はエム・スミス（ Smith,
M. )及びエス・ギラム( Gillam, S. )、ジェネティッ
ク・エンジニアリング:原理と方法、プレナムプレス社
(１９８１年)３巻１−３２頁に示されている。
【００１７】本発明のムテインをコードする構造遺伝子
を製造するためには、たとえば、(a) ＦＧＦの構造遺伝
子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌク
レオチドプライマーと雑種形成させる、(b) ＤＮＡポリ
メラーゼによりプライマーを伸長させ、突然変異性ヘテ
ロ二量体(heteroduplex)を形成させる、及び(c) この突
然変異性ヘテロ二量体を複製する。オリゴヌクレオチド
プライマーの大きさは、突然変異を導入すべき遺伝子領
域へのプライマーの安定な雑種形成に必要な条件によ
り、また現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によって決まる。オリゴヌクレオチドで指示される突
然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドを設計するに
当たって、考慮すべき因子(例えば全体の大きさ、突然
変異サイトを迂回する部分の大きさ)は、エム・スミス
及びエス・ギラム(前掲)によって記述されている。概し
て、オリゴヌクレオチドの全長は、突然変異サイトでの
安定でユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから５´及び３´末端までの伸長部
分（extensions)は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌク
レアーゼ活性による突然変異の編集をさけるのに十分な
大きさとする。本発明に従って突然変異誘発に使用され
るオリゴヌクレオチドは、通常、約１２個ないし約２４
個の塩基、好ましくは約 １４個ないし約２０個の塩
基、更に好ましくは約１４個ないし約１８個の塩基を含
有する。これらは通常、変更されるコドンの少なくとも
約３個の塩基３´側を含有する。
を製造するためには、たとえば、(a) ＦＧＦの構造遺伝
子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮＡを突然変異オリゴヌク
レオチドプライマーと雑種形成させる、(b) ＤＮＡポリ
メラーゼによりプライマーを伸長させ、突然変異性ヘテ
ロ二量体(heteroduplex)を形成させる、及び(c) この突
然変異性ヘテロ二量体を複製する。オリゴヌクレオチド
プライマーの大きさは、突然変異を導入すべき遺伝子領
域へのプライマーの安定な雑種形成に必要な条件によ
り、また現在利用可能なオリゴヌクレオチド合成法の限
界によって決まる。オリゴヌクレオチドで指示される突
然変異誘発に使用するオリゴヌクレオチドを設計するに
当たって、考慮すべき因子(例えば全体の大きさ、突然
変異サイトを迂回する部分の大きさ)は、エム・スミス
及びエス・ギラム(前掲)によって記述されている。概し
て、オリゴヌクレオチドの全長は、突然変異サイトでの
安定でユニークな雑種形成を最適化するような長さであ
り、突然変異サイトから５´及び３´末端までの伸長部
分（extensions)は、ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌク
レアーゼ活性による突然変異の編集をさけるのに十分な
大きさとする。本発明に従って突然変異誘発に使用され
るオリゴヌクレオチドは、通常、約１２個ないし約２４
個の塩基、好ましくは約 １４個ないし約２０個の塩
基、更に好ましくは約１４個ないし約１８個の塩基を含
有する。これらは通常、変更されるコドンの少なくとも
約３個の塩基３´側を含有する。
【００１８】たとえば、アミノ酸が付加されているムテ
インを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作る
方法としては、付加するアミノ酸配列をコードする遺伝
子を合成あるいは、制限酵素消化による断片とし、これ
をＦＧＦ遺伝子の適当な箇所にＤＮＡリガーゼにより挿
入あるいは付加する。またＦＧＦ遺伝子に適当な制限酵
素の認識部位が存在しない場合には、前述の特定部位指
向性変異法により制限酵素認識部位を新たに生成すれば
よい。たとえば、ＦＧＦ構成アミノ酸が欠損しているム
テインを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作
る方法としては、三つの場合が考えられる。ひとつはＦ
ＧＦのアミノ末端を欠損させる場合、二つめはＦＧＦの
中央部分を欠損させる場合、三つにはＦＧＦのカルボキ
シル末端を欠損させる場合である。
インを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作る
方法としては、付加するアミノ酸配列をコードする遺伝
子を合成あるいは、制限酵素消化による断片とし、これ
をＦＧＦ遺伝子の適当な箇所にＤＮＡリガーゼにより挿
入あるいは付加する。またＦＧＦ遺伝子に適当な制限酵
素の認識部位が存在しない場合には、前述の特定部位指
向性変異法により制限酵素認識部位を新たに生成すれば
よい。たとえば、ＦＧＦ構成アミノ酸が欠損しているム
テインを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を作
る方法としては、三つの場合が考えられる。ひとつはＦ
ＧＦのアミノ末端を欠損させる場合、二つめはＦＧＦの
中央部分を欠損させる場合、三つにはＦＧＦのカルボキ
シル末端を欠損させる場合である。
【００１９】アミノ末端を欠損させる場合には欠損させ
ようとするアミノ酸配列のカルボキシル末端をコードす
る遺伝子のコドンをＭetをコードするＡＴＧに特定部位
指向性変異法を用いて変更し、さらにそのコドンの５´
末端側に適当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロ
モーターとの連結(ligation)を容易にさせる。アミノ酸
配列をその中央部分で欠損させる場合には欠損させたい
配列をコードする遺伝子の５´および３´末端側にユニ
ークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変異法を用
いて生成し、この部位を酵素によって消化して抜きと
り、 再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的のアミ
ノ酸を欠損したＦＧＦをコードする遺伝子ができ上る。
このとき制限酵素消化により読み取り枠がずれないよう
にすることは云うまでもない。
ようとするアミノ酸配列のカルボキシル末端をコードす
る遺伝子のコドンをＭetをコードするＡＴＧに特定部位
指向性変異法を用いて変更し、さらにそのコドンの５´
末端側に適当な制限酵素の認識部位を生成せしめ、プロ
モーターとの連結(ligation)を容易にさせる。アミノ酸
配列をその中央部分で欠損させる場合には欠損させたい
配列をコードする遺伝子の５´および３´末端側にユニ
ークな制限酵素の認識部位を特定部位指向性変異法を用
いて生成し、この部位を酵素によって消化して抜きと
り、 再連結によって遺伝子をもとにつなげば目的のアミ
ノ酸を欠損したＦＧＦをコードする遺伝子ができ上る。
このとき制限酵素消化により読み取り枠がずれないよう
にすることは云うまでもない。
【００２０】カルボキシル末端側のアミノ酸配列を欠損
させる場合には、欠損させたい配列のアミノ末端側のア
ミノ酸をコードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変
異によってストップコドンに変更すればよい。たとえ
ば、構成アミノ酸がシステインであってこれを置換した
ムテインを得る目的の場合において、変異ＦＧＦ遺伝子
をつくる方法は、たとえば、Ｃysを発現するコドンを消
失させるか、又はそれが別のアミノ酸を暗号化するよう
に変更させる合成ヌクレオチドプライマーを使用して、
Ｃysを発現させるコドンＴＧＣまたはＴＧＴに特定部位
指向性変異誘発を行なわせるものである。たとえば、ヒ
トbＦＧＦのシステイン(２５位)をセリンに変えるため
に、プライマーをＦＧＦ遺伝子のセンス鎖と雑種形成さ
せる。たとえば、好ましいヌクレオチドプライマーとし
ては ５´−ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴ−
３´(配列表:配列番号６) が挙げられる(下線は変更されたコドンを示す)。
させる場合には、欠損させたい配列のアミノ末端側のア
ミノ酸をコードする遺伝子のコドンを特定部位指向性変
異によってストップコドンに変更すればよい。たとえ
ば、構成アミノ酸がシステインであってこれを置換した
ムテインを得る目的の場合において、変異ＦＧＦ遺伝子
をつくる方法は、たとえば、Ｃysを発現するコドンを消
失させるか、又はそれが別のアミノ酸を暗号化するよう
に変更させる合成ヌクレオチドプライマーを使用して、
Ｃysを発現させるコドンＴＧＣまたはＴＧＴに特定部位
指向性変異誘発を行なわせるものである。たとえば、ヒ
トbＦＧＦのシステイン(２５位)をセリンに変えるため
に、プライマーをＦＧＦ遺伝子のセンス鎖と雑種形成さ
せる。たとえば、好ましいヌクレオチドプライマーとし
ては ５´−ＣＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＴＡＧＡＧＣＣＧＣＴ−
３´(配列表:配列番号６) が挙げられる(下線は変更されたコドンを示す)。
【００２１】システイン(６９位)をセリンに変えるとき
の好ましいプライマーとしては ５´−ＡＡＣＧＡＴＴＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣ−３´
(配列表:配列番号７) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 シ
ステイン(８７位)をセリンに変えるときの好ましいプラ
イマーとしては ５´−ＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴ−
３´(配列表:配列番号８) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 シ
ステイン(９２位)をセリンに変えるときの好ましいプラ
イマーとしては ５´−ＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣ−
３´(配列表:配列番号９) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 Ｃ
ys(２５位)で第一塩基のＴ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。さらに Ｃys(６９位)で
は第１塩基のＴ→Ａ,第２塩基のＴ→Ｃ転位,Ｃys(８７
位,９２位)では第２塩基のＧ→Ｃ転位によりシステイン
からセリンへの変化が起る。
の好ましいプライマーとしては ５´−ＡＡＣＧＡＴＴＡＧＣＧＣＴＣＡＣＴＣ−３´
(配列表:配列番号７) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 シ
ステイン(８７位)をセリンに変えるときの好ましいプラ
イマーとしては ５´−ＧＴＡＡＣＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＧＣＴＡＧＴ−
３´(配列表:配列番号８) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 シ
ステイン(９２位)をセリンに変えるときの好ましいプラ
イマーとしては ５´−ＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＴＣＡＴＣＣ−
３´(配列表:配列番号９) が挙げられる。(下線は変更されたコドンを示す)。 Ｃ
ys(２５位)で第一塩基のＴ→Ａの転位により、システイ
ンからセリンへの変化が起る。さらに Ｃys(６９位)で
は第１塩基のＴ→Ａ,第２塩基のＴ→Ｃ転位,Ｃys(８７
位,９２位)では第２塩基のＧ→Ｃ転位によりシステイン
からセリンへの変化が起る。
【００２２】特定部位指向性変異によりbＦＧＦムテイ
ン蛋白質を産生させる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異
を行ってもよいこと、すなわち、アミノ酸に対応してい
るＤＮＡのコドンは縮退していることを認識しておかな
ければならない。たとえば、構成アミノ酸がシステイン
以外のアミノ酸であってこれを他のアミノ酸に置換した
ムテインを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を
作る方法としては、システインの場合と同様にして、オ
リゴヌクレオチドプライマーによるコドンの変更を行
う。ただしオリゴヌクレオチドプライマーのデザインは
どのアミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもな
い。
ン蛋白質を産生させる時に、ＤＮＡ配列に複数個の変異
を行ってもよいこと、すなわち、アミノ酸に対応してい
るＤＮＡのコドンは縮退していることを認識しておかな
ければならない。たとえば、構成アミノ酸がシステイン
以外のアミノ酸であってこれを他のアミノ酸に置換した
ムテインを得る目的の場合における変異ＦＧＦ遺伝子を
作る方法としては、システインの場合と同様にして、オ
リゴヌクレオチドプライマーによるコドンの変更を行
う。ただしオリゴヌクレオチドプライマーのデザインは
どのアミノ酸を変更するかで異なることは云うまでもな
い。
【００２３】プライマーは、ＦＧＦ遺伝子の１本鎖がク
ローン化されたＭ１３〔 Yanisch−Perror, C., Vieir
a, J. Messing,ジーン（Gene）,３３ １０３−１１９
(１９８５)，Messing J. メソッズ・イン・エンジーモ
ロジー（Methods in Enzymology),１０１ ２０−７８
(１９８３)〕，fd〔R. Ｈerrman et al. モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティック(Mol. Gen. Gen
et.),１７７２３１(１９８０)〕,又はφ×１７４〔M. S
mith and S. Gillam,ジェネティック・エンジニアリ
ング（Genetic Engineering), Plenum Press,Vol.３,
ppl−３２(１９８１)〕のような１本鎖ファージへ雑種
形成される。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセン
ス鎖のいずれでも運搬できることは認められる。ファー
ジがアンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を
暗号づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一
致以外にもプライマーは突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場
合があってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬す
る時には、欠損させるコドンと対合をつくるトリプレッ
ト中の適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含
有するセンス鎖の領域に対して相補的でない場合があっ
てもよい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及
びエス・ギラム(前掲)によって記述されている。温度は
通常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０℃
ないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、プライマーは
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼI、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵 素又は他の適当なＤＮＡポリメラーゼと
の反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ずる
dsＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガー
ゼでの処理によって閉鎖環dsＤＮＡへ変換される。１本
鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアーゼ
処理によって破壊できる。生ずる突然変異成形ヘテロ二
量体は、被感染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換
するのに使用される。宿主によるヘテロ二量体の複製で
は、双方の鎖から子孫ができる。複製に続いて、突然変
異株の鎖の子孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当な
ベクターへ挿入し、このベクターを適当な宿主生物又は
細胞の形質転換に使用する。
ローン化されたＭ１３〔 Yanisch−Perror, C., Vieir
a, J. Messing,ジーン（Gene）,３３ １０３−１１９
(１９８５)，Messing J. メソッズ・イン・エンジーモ
ロジー（Methods in Enzymology),１０１ ２０−７８
(１９８３)〕，fd〔R. Ｈerrman et al. モレキュラー
・アンド・ジェネラル・ジェネティック(Mol. Gen. Gen
et.),１７７２３１(１９８０)〕,又はφ×１７４〔M. S
mith and S. Gillam,ジェネティック・エンジニアリ
ング（Genetic Engineering), Plenum Press,Vol.３,
ppl−３２(１９８１)〕のような１本鎖ファージへ雑種
形成される。ファージが遺伝子のセンス鎖、アンチセン
ス鎖のいずれでも運搬できることは認められる。ファー
ジがアンチセンス鎖を運搬する時には、別のアミノ酸を
暗号づけたトリプレットを決定するこのコドンとの不一
致以外にもプライマーは突然変異させるコドンを含有す
るセンス鎖の領域とコドンの縮退のために同一でない場
合があってもよい。同様にファージがセンス鎖を運搬す
る時には、欠損させるコドンと対合をつくるトリプレッ
ト中の適当な不一致以外は、突然変異させるコドンを含
有するセンス鎖の領域に対して相補的でない場合があっ
てもよい。雑種形成に使用される条件はエム・スミス及
びエス・ギラム(前掲)によって記述されている。温度は
通常、約０℃ないし７０℃、もっと一般的には約１０℃
ないし５０℃の範囲にある。雑種形成後、プライマーは
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼI、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵 素又は他の適当なＤＮＡポリメラーゼと
の反応によってファージＤＮＡ上で伸長される。生ずる
dsＤＮＡは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガー
ゼでの処理によって閉鎖環dsＤＮＡへ変換される。１本
鎖領域を含有するＤＮＡ分子はＳ１エンドヌクレアーゼ
処理によって破壊できる。生ずる突然変異成形ヘテロ二
量体は、被感染能力をもつ宿主生物又は細胞を形質転換
するのに使用される。宿主によるヘテロ二量体の複製で
は、双方の鎖から子孫ができる。複製に続いて、突然変
異株の鎖の子孫から突然変異株遺伝子を単離し、適当な
ベクターへ挿入し、このベクターを適当な宿主生物又は
細胞の形質転換に使用する。
【００２４】次に、突然変異化された遺伝子を運搬する
ファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。ＤＮ
Ａを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由来
のpＢＲ３２２[ジーン(gene),２, ９５(１９７７)],pＢ
Ｒ３２５[ジーン,４,１２１(１９７８)],pＵＣ１２[ジ
ーン,１９,２５９(１９８２)],pＵＣ１３[ジーン,１９,
２５９(１９８２)]、枯草菌由来のpＵＢ１１０[バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Ｂiochemical and Ｂiophysical Ｒesearch Ｃ
ommunication),１１２,６７８(１９８３)]などが挙げら
れるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持さ
れるものであれば、いずれをも用いることができる。
ファージＤＮＡを単離し、プラスミドへ組み込む。ＤＮ
Ａを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌由来
のpＢＲ３２２[ジーン(gene),２, ９５(１９７７)],pＢ
Ｒ３２５[ジーン,４,１２１(１９７８)],pＵＣ１２[ジ
ーン,１９,２５９(１９８２)],pＵＣ１３[ジーン,１９,
２５９(１９８２)]、枯草菌由来のpＵＢ１１０[バイオ
ケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケー
ション（Ｂiochemical and Ｂiophysical Ｒesearch Ｃ
ommunication),１１２,６７８(１９８３)]などが挙げら
れるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持さ
れるものであれば、いずれをも用いることができる。
【００２５】プラスミドに組み込む方法としては、たと
えば、Ｔ．Ｍaniatis ら,モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning) コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabor
atory），第２３９頁（１９８ ２）に記載の方法などが
挙げられる。
えば、Ｔ．Ｍaniatis ら,モレキュラー・クローニング
(Ｍolecular Ｃloning) コールド・スプリング・ハー
バー・ラボラトリー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabor
atory），第２３９頁（１９８ ２）に記載の方法などが
挙げられる。
【００２６】クローン化された遺伝子は、発現に適した
ビークル(ベクター)中のプロモーターの下流に連結して
発現型ベクターを得ることができる。ベクターとして
は、上記の大腸菌由来のプラスミド(例、pＢＲ３２２,p
ＢＲ３２５,pＵＣ１２, pＵＣ１３),枯草菌由来プラス
ミド(例、pＵＢ １１０,pＴＰ５,pＣ１９４),酵母由来
プラスミド(例、pＳＨ１９,pＳＨ１５),あるいはλファ
ージなどのバクテリオファージおよびレトロウイルス,
ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスなどがあげられ
る。該遺伝子はその５´末端に翻訳開始コドンとしての
ＡＴＧを有し、また３´末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。遺
伝子産物を培地中に分泌生産させるためには、該遺伝子
の５´末端に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
を、または該シグナルペプチドをコードするＤＮＡおよ
びシグナルペプチド−プロペプチド(プレ・プロ領域)を
コードするＤＮＡを連結するのが好ましい。該遺伝子を
発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本
発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現
に用いるリンパ球系動物細胞に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。例えばＳＶ４０由
来のプロモーター、サイトメガロウイルスのプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、と
りわけレトロウイルスのプロモーターが好ましい。
ビークル(ベクター)中のプロモーターの下流に連結して
発現型ベクターを得ることができる。ベクターとして
は、上記の大腸菌由来のプラスミド(例、pＢＲ３２２,p
ＢＲ３２５,pＵＣ１２, pＵＣ１３),枯草菌由来プラス
ミド(例、pＵＢ １１０,pＴＰ５,pＣ１９４),酵母由来
プラスミド(例、pＳＨ１９,pＳＨ１５),あるいはλファ
ージなどのバクテリオファージおよびレトロウイルス,
ワクシニアウイルスなどの動物ウイルスなどがあげられ
る。該遺伝子はその５´末端に翻訳開始コドンとしての
ＡＴＧを有し、また３´末端には翻訳終止コドンとして
のＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。遺
伝子産物を培地中に分泌生産させるためには、該遺伝子
の５´末端に、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ
を、または該シグナルペプチドをコードするＤＮＡおよ
びシグナルペプチド−プロペプチド(プレ・プロ領域)を
コードするＤＮＡを連結するのが好ましい。該遺伝子を
発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本
発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現
に用いるリンパ球系動物細胞に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。例えばＳＶ４０由
来のプロモーター、サイトメガロウイルスのプロモータ
ー、レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、と
りわけレトロウイルスのプロモーターが好ましい。
【００２７】このようにして構築されたムテインをコー
ドする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを
用いて、リンパ球系動物細胞を形質転換し、形質転換体
を製造する。宿主としての動物細胞としては、リンパ球
系細胞ならいかなるものでもよい。たとえば、マウスミ
エローマ由来細胞株、ヒトミエローマ由来細胞株などが
挙げられる。該マウスミエローマ由来細胞株の例として
は、たとえばマウスミエローマ由来細胞株Ｓp２／０−
Ａg１４細胞［M. Shulmanら，Nature 276: 269(197
8)］，Ｐ３−Ｘ６３−Ａg８［G. Koehlerら，Nature 25
6: 495(1975)］，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａg４−１［G. Ko
ehlerら，Eur. J. Immunol.6: 511(1976)］などが挙げ
られる。該ヒトミエローマ由来細胞株の例としては、た
とえばＳＫＯ−００７［L. Olssonら，Proc. Natl. Aca
d. Sci. 77: 5429(1980)］，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１
２［C. M. Croceら，Nature 288: 488(1980)］などが挙
げられる。リンパ球系動物細胞を形質転換するには、た
とえばヴィロロジー(Ｖirology) ５２,４５６(１９７
３)に記載の方法あるいはエレクトロポレーション法な
どにより行われる。
ドする塩基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターを
用いて、リンパ球系動物細胞を形質転換し、形質転換体
を製造する。宿主としての動物細胞としては、リンパ球
系細胞ならいかなるものでもよい。たとえば、マウスミ
エローマ由来細胞株、ヒトミエローマ由来細胞株などが
挙げられる。該マウスミエローマ由来細胞株の例として
は、たとえばマウスミエローマ由来細胞株Ｓp２／０−
Ａg１４細胞［M. Shulmanら，Nature 276: 269(197
8)］，Ｐ３−Ｘ６３−Ａg８［G. Koehlerら，Nature 25
6: 495(1975)］，Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａg４−１［G. Ko
ehlerら，Eur. J. Immunol.6: 511(1976)］などが挙げ
られる。該ヒトミエローマ由来細胞株の例としては、た
とえばＳＫＯ−００７［L. Olssonら，Proc. Natl. Aca
d. Sci. 77: 5429(1980)］，ＧＭ１５００６ＴＧ−Ａ１
２［C. M. Croceら，Nature 288: 488(1980)］などが挙
げられる。リンパ球系動物細胞を形質転換するには、た
とえばヴィロロジー(Ｖirology) ５２,４５６(１９７
３)に記載の方法あるいはエレクトロポレーション法な
どにより行われる。
【００２８】本発明のムテインをコードするプラスミド
を保持させる目的で、大腸菌を該プラスミドで形質転換
し、形質転換体を作成してもよい。該 E. coliとして
は、 たとえば E. coli ＤＨ１[Proc. Natl.Acad. Sci.
ＵＳＡ, ６０, １６０(１９６８)],ＪＭ１０３[Nucleic
acids Research,９,３０９ (１９８１)],ＪＡ２２１[J
ournal of Molecular Biology,１２０,５１７(１９７
８)], ＨＢ１０１[Journal of Molecular Biology, ４
１, ４５９ (１９６９)], Ｃ６００[Genetics,３９,４
４０ (１９５４)],ＭＭ２９４[Proc. Natl. Acad. Sc
i.ＵＳＡ,７３,４１７４(１９７６)]などが挙げられる。
大腸菌を形質転換するには、たとえば Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ＵＳＡ,６９,２１１０(１９７２),Gene,１７,
１０７(１９８２), Molecular Cloning, ColdSpring
Harbor Laboratories,page２４９,１９８２などに記載
の方法に従って行なわれる。
を保持させる目的で、大腸菌を該プラスミドで形質転換
し、形質転換体を作成してもよい。該 E. coliとして
は、 たとえば E. coli ＤＨ１[Proc. Natl.Acad. Sci.
ＵＳＡ, ６０, １６０(１９６８)],ＪＭ１０３[Nucleic
acids Research,９,３０９ (１９８１)],ＪＡ２２１[J
ournal of Molecular Biology,１２０,５１７(１９７
８)], ＨＢ１０１[Journal of Molecular Biology, ４
１, ４５９ (１９６９)], Ｃ６００[Genetics,３９,４
４０ (１９５４)],ＭＭ２９４[Proc. Natl. Acad. Sc
i.ＵＳＡ,７３,４１７４(１９７６)]などが挙げられる。
大腸菌を形質転換するには、たとえば Proc. Natl. Ac
ad. Sci. ＵＳＡ,６９,２１１０(１９７２),Gene,１７,
１０７(１９８２), Molecular Cloning, ColdSpring
Harbor Laboratories,page２４９,１９８２などに記載
の方法に従って行なわれる。
【００２９】このようにして、ムテインをコードする塩
基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターで形質転換
された形質転換体であるリンパ球系動物細胞が得られ
る。該形質転換体を培地に培養することにより、ムテイ
ンを産生させる。宿主がリンパ球系動物細胞である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２
０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地[サイエンス (Ｓcie
nce)１２２,５０１(１９５２)],ＤＭＥＭ培地[ヴィロロ
ジー(Ｖirology),８,３９６(１９５９)],ＲＰＭＩ１６
４０培地[ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(Ｔhe Ｊournal of the Ａmeri
can Ｍedical Ａssociation)１９９,５１９(１９６
７)], １９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Ｐroceeding of theＳociety for the Ｂiologcal
Ｍedicine）７３,１(１９５０)]などが挙げられる。pＨ
は約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４
０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて
通気や撹拌を加える。上記培養物からムテインを分離精
製するには、 例えば下記の方法により行うことができ
る。ムテインが培地中に分泌される場合には、培養物か
ら遠心により細胞を除いた培養上清からムテインを精製
する。ムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集
め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩
衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、
フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび(または)凍
結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離によりムテインを得る方法などが適宜用い得る。と
りわけ、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ま
しい。
基配列を有する組換えＤＮＡを含むベクターで形質転換
された形質転換体であるリンパ球系動物細胞が得られ
る。該形質転換体を培地に培養することにより、ムテイ
ンを産生させる。宿主がリンパ球系動物細胞である形質
転換体を培養する際、培地としては、たとえば約５〜２
０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地[サイエンス (Ｓcie
nce)１２２,５０１(１９５２)],ＤＭＥＭ培地[ヴィロロ
ジー(Ｖirology),８,３９６(１９５９)],ＲＰＭＩ１６
４０培地[ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディ
カル・アソシエーション(Ｔhe Ｊournal of the Ａmeri
can Ｍedical Ａssociation)１９９,５１９(１９６
７)], １９９培地［プロシーディング・オブ・ザ・ソサ
イエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン
（Ｐroceeding of theＳociety for the Ｂiologcal
Ｍedicine）７３,１(１９５０)]などが挙げられる。pＨ
は約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４
０℃、培養時間は約１５〜６０時間行い、必要に応じて
通気や撹拌を加える。上記培養物からムテインを分離精
製するには、 例えば下記の方法により行うことができ
る。ムテインが培地中に分泌される場合には、培養物か
ら遠心により細胞を除いた培養上清からムテインを精製
する。ムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出するに
際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集
め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤を含む緩
衝液に懸濁して菌体外に目的の蛋白を溶出させる方法、
フレンチプレス、超音波、リゾチームおよび(または)凍
結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心
分離によりムテインを得る方法などが適宜用い得る。と
りわけ、リゾチームと超音波処理を併用する方法が好ま
しい。
【００３０】上記上澄液からムテインを精製するには、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙
げられる。さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセ
ルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を
除くことができる。たとえば、中性附近のトリスなどの
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液
をかけ、素通り画分を集めることは有効である。また、
さらにＣＭセルロースなどを担体としたイオン交換クロ
マトグラフィーにかけることにより、ムテインを担体に
吸着させ、塩溶液を用いてこれを溶出させることができ
る。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥することができ
る。上記精製にあたっては、どのフラクションに目的と
する本発明のムテインが含まれているかについて、たと
えば抗ＦＧＦ抗体なかでも抗ＦＧＦモノクローナル抗体
（例、ヨーロッパ特許出願公開第２８８,６８７号公報
記載の方法で製造されるモノクローナル抗体）を用いる
免疫学的測定法により、検索することができる。
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうこ
とができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩
析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、
限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用
する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の
差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電
点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙
げられる。さらに具体的には、上記上澄液をＤＥＡＥセ
ルロースなどを担体としたイオン交換クロマトグラフィ
ーにかけることにより、夾雑する核酸や酸性蛋白質等を
除くことができる。たとえば、中性附近のトリスなどの
緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロースカラムに上澄液
をかけ、素通り画分を集めることは有効である。また、
さらにＣＭセルロースなどを担体としたイオン交換クロ
マトグラフィーにかけることにより、ムテインを担体に
吸着させ、塩溶液を用いてこれを溶出させることができ
る。これらの溶出液は透析後、凍結乾燥することができ
る。上記精製にあたっては、どのフラクションに目的と
する本発明のムテインが含まれているかについて、たと
えば抗ＦＧＦ抗体なかでも抗ＦＧＦモノクローナル抗体
（例、ヨーロッパ特許出願公開第２８８,６８７号公報
記載の方法で製造されるモノクローナル抗体）を用いる
免疫学的測定法により、検索することができる。
【００３１】本発明のムテインは、ムテイン産生時の産
生能が向上され、また多くの場合形質転換体の外に分泌
されるので、工業的大量製造に有利である。このように
して得られたムテインは、糖鎖を付加したものである。
また、本発明のムテインは、安定性が向上し、血中消失
時間が延長され、しかも活性が向上されているので、医
薬等として有利に用いることができる。このようにして
得られるムテインは線維芽細胞の増殖を促進させる作用
を有し、毒性は低いので火傷,創傷,術後組織などの治癒
促進剤,あるいは血管新生作用による血栓症や動脈硬化
症などの治療薬として用いることができる。 また、細胞
培養を促進させるための試薬として用いることができ
る。本発明のムテインを医薬として用いるには、そのま
ま粉末として、または他の薬理学的に許容されうる担
体,賦形剤,希釈剤とともに医薬組成物 (例、注射剤,錠
剤,カプセル剤,液剤,軟膏)として、哺乳温血動物(例、
ヒト,マウス,ラット,ハムスター,ウサギ,犬,ネコ)に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ
糖やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って
行なわれる。錠剤,カプセル剤等の医薬組成物も常法に
従って調製しうる。本発明のムテインを上記した医薬と
して用いる場合には、たとえば上記した温血動物に、投
与ルート,症状などを考慮して、１日量約１ngないし１
００μg／kgの中から適当量を選んで投与される。また、
本発明のムテインを細胞培養を促進させるための試薬
として用いる場合、培地１ｌあたり約０.０１〜１０μ
g、さらに好ましくは約０.１〜１０μgとなるように培
地に加えることが好ましい。
生能が向上され、また多くの場合形質転換体の外に分泌
されるので、工業的大量製造に有利である。このように
して得られたムテインは、糖鎖を付加したものである。
また、本発明のムテインは、安定性が向上し、血中消失
時間が延長され、しかも活性が向上されているので、医
薬等として有利に用いることができる。このようにして
得られるムテインは線維芽細胞の増殖を促進させる作用
を有し、毒性は低いので火傷,創傷,術後組織などの治癒
促進剤,あるいは血管新生作用による血栓症や動脈硬化
症などの治療薬として用いることができる。 また、細胞
培養を促進させるための試薬として用いることができ
る。本発明のムテインを医薬として用いるには、そのま
ま粉末として、または他の薬理学的に許容されうる担
体,賦形剤,希釈剤とともに医薬組成物 (例、注射剤,錠
剤,カプセル剤,液剤,軟膏)として、哺乳温血動物(例、
ヒト,マウス,ラット,ハムスター,ウサギ,犬,ネコ)に対
して非経口的または経口的に安全に投与することができ
る。注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ
糖やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って
行なわれる。錠剤,カプセル剤等の医薬組成物も常法に
従って調製しうる。本発明のムテインを上記した医薬と
して用いる場合には、たとえば上記した温血動物に、投
与ルート,症状などを考慮して、１日量約１ngないし１
００μg／kgの中から適当量を選んで投与される。また、
本発明のムテインを細胞培養を促進させるための試薬
として用いる場合、培地１ｌあたり約０.０１〜１０μ
g、さらに好ましくは約０.１〜１０μgとなるように培
地に加えることが好ましい。
【００３２】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、 ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ Ｃommision on Ｂiochemical Ｎomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学
異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を
示すものとする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly :グリシン Ａla :アラニン Ｖal :バリン Ｌeu :ロイシン Ｉle :イソロイシン Ｓer :セリン Ｔhr :スレオニン Ｃys :システイン Ｍet :メチオニン Ｇlu :グルタミン酸 Ａsp :アスパラギン酸 Ｌys :リジン Ａrg :アルギニン Ｈis :ヒスチジン Ｐhe :フェニールアラニン Ｔyr :チロシン Ｔrp :トリプトファン Ｐro :プロリン Ａsn :アスパラギン Ｇln :グルタミン 本明細書および図面において、ヒトbＦＧＦの構成アミ
ノ酸の番号は、上記式[III]のアミノ酸配列のＮ末端の
Ｐroを第１番目とする。
アミノ酸などを略号で表示する場合、 ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ Ｃommision on Ｂiochemical Ｎomenclature によ
る略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくもの
であり、その例を下記する。また、アミノ酸に関し光学
異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ−体を
示すものとする。 ＤＮＡ :デオキシリボ核酸 cＤＮＡ :相補的デオキシリボ核酸 Ａ :アデニン Ｔ :チミン Ｇ :グアニン Ｃ :シトシン ＲＮＡ :リボ核酸 dＡＴＰ :デオキシアデノシン三リン酸 dＴＴＰ :デオキシチミジン三リン酸 dＧＴＰ :デオキシグアノシン三リン酸 dＣＴＰ :デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ :アデノシン三リン酸 Ｔdr :チミジン ＥＤＴＡ :エチレンジアミン四酢酸 ＳＤＳ :ドデシル硫酸ナトリウム Ｇly :グリシン Ａla :アラニン Ｖal :バリン Ｌeu :ロイシン Ｉle :イソロイシン Ｓer :セリン Ｔhr :スレオニン Ｃys :システイン Ｍet :メチオニン Ｇlu :グルタミン酸 Ａsp :アスパラギン酸 Ｌys :リジン Ａrg :アルギニン Ｈis :ヒスチジン Ｐhe :フェニールアラニン Ｔyr :チロシン Ｔrp :トリプトファン Ｐro :プロリン Ａsn :アスパラギン Ｇln :グルタミン 本明細書および図面において、ヒトbＦＧＦの構成アミ
ノ酸の番号は、上記式[III]のアミノ酸配列のＮ末端の
Ｐroを第１番目とする。
【００３３】以下の実施例で得られた発現プラスミドを
保持する大腸菌 E. coli ＤＭ１／pＴＢ１１９０および
発現プラスミドを有するマウスミエローマＳp／１１９
０−１６は、財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)および通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に、
〔表１〕に示す受託番号で〔表１〕に示す受託日から寄
託されている。
保持する大腸菌 E. coli ＤＭ１／pＴＢ１１９０および
発現プラスミドを有するマウスミエローマＳp／１１９
０−１６は、財団法人発酵研究所(ＩＦＯ)および通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に、
〔表１〕に示す受託番号で〔表１〕に示す受託日から寄
託されている。
【表１】
【００３４】参考例１ (1) ヒトbＦＧＦムテイン(糖鎖付加型)発現用プラスミ
ドpＴＢ１１６３,１１６４,１１６５,１１６６の構築 ヨーロッパ特許出願公開第２８１,８２２号公報に記載
のプラスミドpＴＢ６７５を制限酵素NcoIで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ Klenow 断片反応により付着末端を平
滑化したのち、 ClaIで切断してヒトbＦＧＦ構造遺伝
子、３´側非翻訳領域、ＳＶ４０由来ポリ(Ａ)付加領域
およびpＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子、複製
開始点を含む３.８kbＤＮＡ断片を得た。また、ヨーロ
ッパ特許出願公開第２２５,７０１号公報に記載のプラ
スミドpＴＢ５０３をClaI−Hind IIIで切断し、ＭuＬＶ
ＬＴＲ領域を含む１.１kbＤＮＡ断片を得た。さらにプ
ラスミドpＴＢ１０６( Cell Struct. Funct. １２,２
０５(１９８７))をHgiAIで切断して１.０kbＤＮＡ断片
(ＳＶ４０プロモーター領域およびヒトＩＬ−２cＤＮＡ
リーダー配列を含む)を分離精製した。Ｔ４ポリメラー
ゼ反応により末端を平滑化したのちHind IIIで切断し
て、０.６４kbＤＮＡ断片を得た。これら３種のＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラスミドp
ＴＢ１００１を得た。pＴＢ１００１の構造を第１図に
示す。pＴＢ１００１は、ＭuＬＶ ＬＴＲとＳＶ４０初
期プロモーターの支配下にＩＬ−２リーダー配列と読取
枠を合わせて連結されたヒトbＦＧＦの構造遺伝子(−９
〜１４６アミノ酸)が発現する構築を有する。
ドpＴＢ１１６３,１１６４,１１６５,１１６６の構築 ヨーロッパ特許出願公開第２８１,８２２号公報に記載
のプラスミドpＴＢ６７５を制限酵素NcoIで切断し、Ｄ
ＮＡポリメラーゼ Klenow 断片反応により付着末端を平
滑化したのち、 ClaIで切断してヒトbＦＧＦ構造遺伝
子、３´側非翻訳領域、ＳＶ４０由来ポリ(Ａ)付加領域
およびpＢＲ３２２由来アンピシリン耐性遺伝子、複製
開始点を含む３.８kbＤＮＡ断片を得た。また、ヨーロ
ッパ特許出願公開第２２５,７０１号公報に記載のプラ
スミドpＴＢ５０３をClaI−Hind IIIで切断し、ＭuＬＶ
ＬＴＲ領域を含む１.１kbＤＮＡ断片を得た。さらにプ
ラスミドpＴＢ１０６( Cell Struct. Funct. １２,２
０５(１９８７))をHgiAIで切断して１.０kbＤＮＡ断片
(ＳＶ４０プロモーター領域およびヒトＩＬ−２cＤＮＡ
リーダー配列を含む)を分離精製した。Ｔ４ポリメラー
ゼ反応により末端を平滑化したのちHind IIIで切断し
て、０.６４kbＤＮＡ断片を得た。これら３種のＤＮＡ
断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結し、プラスミドp
ＴＢ１００１を得た。pＴＢ１００１の構造を第１図に
示す。pＴＢ１００１は、ＭuＬＶ ＬＴＲとＳＶ４０初
期プロモーターの支配下にＩＬ−２リーダー配列と読取
枠を合わせて連結されたヒトbＦＧＦの構造遺伝子(−９
〜１４６アミノ酸)が発現する構築を有する。
【００３５】次に、pＴＢ１００１をHind IIIで切断し
て得られた、ヒトＩＬ−２リーダー配列に連結したヒト
bＦＧＦ遺伝子を含む１.３kbＤＮＡ断片をプラスミドp
ＵＣ１１９（宝酒造株式会社）の Hind III部位にクロ
ーニングした。合成オリゴヌクレオチド５´−ＧＴＡＡ
ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴ(配列表：配列番
号１０)をプライマーとして、in vitro ミュータゲネシ
スシステムバージョン２（Amersham社）キットを用い所
定の方法に従って site-directed mutagenesis を行な
いＣＮ３変換体(ＩＬ−ＣＮ３−１５５：ＩＬ−２リー
ダー配列とhbＦＧＦムテインＣＮ３−９〜１４６の構造
遺伝子を有する。)(プラスミドpＴＢ１１５８)を得た。
さらに、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、
同様の方法にて、ＣＳ２／ＣＮ３変換体(ＩＬ−ＣＮ２
／ＣＮ３−１５５：ＩＬ−２リーダー配列とhbＦＧＦム
テインＣＳ２ＣＮ３の−９〜１４６の構造遺伝子を有す
る。)(プラスミドpＴＢ１１６０)を得た。また、 合成オ
リゴヌクレオチド３１mer ５´−ＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＴＴＴ
ＧＴＧＡＣＡＡＧＴ−３´(配列表：配列番号１１) を用いて、ヒトbＦＧＦアミノ酸No.−９(Ｍet)〜−１
(Ｌeu)を除去しＩＬ−２リーダー配列と成熟型ヒトbＦ
ＧＦ(アミノ酸No.１(Pro)〜１４６)遺伝子を連結したも
のを、上記 kit を使用して作製した(ＩＬ−Ｆ１４６)
(プラスミドpＴＢ１１５５)。これに、上記のＣＮ３変換
用およびＣＳ２変換用合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、変換体ＩＬ−ＣＮ３−１４６(ＩＬ−２リーダー配
列とhbＦＧＦムテインＣＮ３の１〜１４６の構造遺伝子
を有する。)(プラスミドpＴＢ１１５９)およびＩＬ−Ｃ
Ｓ２／ＣＮ３−１４６（ＩＬ−２リーダー配列とhbＦＧ
ＦＣＳ２／ＣＮ３の１〜１４６の構造遺伝子を有す
る。）（プラスミドpＴＢ１１６１）を得た。
て得られた、ヒトＩＬ−２リーダー配列に連結したヒト
bＦＧＦ遺伝子を含む１.３kbＤＮＡ断片をプラスミドp
ＵＣ１１９（宝酒造株式会社）の Hind III部位にクロ
ーニングした。合成オリゴヌクレオチド５´−ＧＴＡＡ
ＣＡＴＴＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴ(配列表：配列番
号１０)をプライマーとして、in vitro ミュータゲネシ
スシステムバージョン２（Amersham社）キットを用い所
定の方法に従って site-directed mutagenesis を行な
いＣＮ３変換体(ＩＬ−ＣＮ３−１５５：ＩＬ−２リー
ダー配列とhbＦＧＦムテインＣＮ３−９〜１４６の構造
遺伝子を有する。)(プラスミドpＴＢ１１５８)を得た。
さらに、合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして、
同様の方法にて、ＣＳ２／ＣＮ３変換体(ＩＬ−ＣＮ２
／ＣＮ３−１５５：ＩＬ−２リーダー配列とhbＦＧＦム
テインＣＳ２ＣＮ３の−９〜１４６の構造遺伝子を有す
る。)(プラスミドpＴＢ１１６０)を得た。また、 合成オ
リゴヌクレオチド３１mer ５´−ＣＴＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＧＧＧＡＣＴＧＴＴＴ
ＧＴＧＡＣＡＡＧＴ−３´(配列表：配列番号１１) を用いて、ヒトbＦＧＦアミノ酸No.−９(Ｍet)〜−１
(Ｌeu)を除去しＩＬ−２リーダー配列と成熟型ヒトbＦ
ＧＦ(アミノ酸No.１(Pro)〜１４６)遺伝子を連結したも
のを、上記 kit を使用して作製した(ＩＬ−Ｆ１４６)
(プラスミドpＴＢ１１５５)。これに、上記のＣＮ３変換
用およびＣＳ２変換用合成オリゴヌクレオチドを使用し
て、変換体ＩＬ−ＣＮ３−１４６(ＩＬ−２リーダー配
列とhbＦＧＦムテインＣＮ３の１〜１４６の構造遺伝子
を有する。)(プラスミドpＴＢ１１５９)およびＩＬ−Ｃ
Ｓ２／ＣＮ３−１４６（ＩＬ−２リーダー配列とhbＦＧ
ＦＣＳ２／ＣＮ３の１〜１４６の構造遺伝子を有す
る。）（プラスミドpＴＢ１１６１）を得た。
【００３６】このようにして得られた変換遺伝子を含む
pＵＣ１１９を各々NcoI−Hind IIIで切断して、変換遺
伝子を含む１.１kbＤＮＡ断片を分離し、それぞれのＤ
ＮＡ断片と、前記の動物細胞用発現型プラスミドpＴＢ
１００１から得た３.１kb ClaI−Hind IIIＤＮＡ断片お
よび１.４kb ClaI−NcoI ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ反応により連結して、以下の発現型プラスミドを構
築した。 pＴＢ１１６２：ＩＬ−Ｆ１４６ pＴＢ１１６３：ＩＬ−ＣＮ３−１４６ pＴＢ１１６４：ＩＬ−ＣＳ２/ＣＮ３−１４６ pＴＢ
１１６５：ＩＬ−ＣＮ３−１５５ pＴＢ１１６６：ＩＬ−ＣＳ２/ＣＮ３−１５５(2) ヒト
bＦＧＦムテイン(糖鎖付加型)を発現するプラスミドpＴ
Ｂ１１７８およびpＴＢ１１７９の構築：プラスミドpＴ
Ｂ１１５９およびpＴＢ１１５８を有するE. coli ＭＶ
１１８４からそれぞれ調整されたＭ１３ファージssＤＮ
Ａと、合成プライマー５´−ＧＴＡＡＣＧＧＧＴＡＧＣ
ＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴ−３´とから Site-directed m
utage-nesis kit（アマシヤム社、英国）を用いて部位
特異的突然変異を行なった。得られたミュータント ファ
ージからＲＦＤＮＡを調整し、NcoI−Hind IIIで切断し
て、１.１kbのＤＮＡ断片を得た。この二つの断片を用
いて、上記(1)項と同様の方法でヒトbＦＧＦムテインを
発現する二つのプラスミドpＴＢ１１７８(ＩＬ−ＣＮ２
３−１４６)およびpＴＢ１１７９(ＩＬ−ＣＮ２３−１
５５)を構築した。
pＵＣ１１９を各々NcoI−Hind IIIで切断して、変換遺
伝子を含む１.１kbＤＮＡ断片を分離し、それぞれのＤ
ＮＡ断片と、前記の動物細胞用発現型プラスミドpＴＢ
１００１から得た３.１kb ClaI−Hind IIIＤＮＡ断片お
よび１.４kb ClaI−NcoI ＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ反応により連結して、以下の発現型プラスミドを構
築した。 pＴＢ１１６２：ＩＬ−Ｆ１４６ pＴＢ１１６３：ＩＬ−ＣＮ３−１４６ pＴＢ１１６４：ＩＬ−ＣＳ２/ＣＮ３−１４６ pＴＢ
１１６５：ＩＬ−ＣＮ３−１５５ pＴＢ１１６６：ＩＬ−ＣＳ２/ＣＮ３−１５５(2) ヒト
bＦＧＦムテイン(糖鎖付加型)を発現するプラスミドpＴ
Ｂ１１７８およびpＴＢ１１７９の構築：プラスミドpＴ
Ｂ１１５９およびpＴＢ１１５８を有するE. coli ＭＶ
１１８４からそれぞれ調整されたＭ１３ファージssＤＮ
Ａと、合成プライマー５´−ＧＴＡＡＣＧＧＧＴＡＧＣ
ＡＴＴＣＡＣＴＣＣＴＴ−３´とから Site-directed m
utage-nesis kit（アマシヤム社、英国）を用いて部位
特異的突然変異を行なった。得られたミュータント ファ
ージからＲＦＤＮＡを調整し、NcoI−Hind IIIで切断し
て、１.１kbのＤＮＡ断片を得た。この二つの断片を用
いて、上記(1)項と同様の方法でヒトbＦＧＦムテインを
発現する二つのプラスミドpＴＢ１１７８(ＩＬ−ＣＮ２
３−１４６)およびpＴＢ１１７９(ＩＬ−ＣＮ２３−１
５５)を構築した。
【００３７】実施例１ ヒトbＦＧＦムテイン(糖鎖付加型)を発現し、かつネオ
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpＴＢ１１９
０，１１９１，１１９２，１１９３の構築 プラスミドpＴＫ６１（Sasadaら，Cell Structure and
Function １２：２０５−２１７，１９８７）よりチミ
ジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子を含む２kbのＰvuII断片を切
り出し、Hind IIIリンカーを付加してプラスミドpＢＲ
３２２のHind III部位に挿入した。このプラスミドをBg
ｌII−SmaIで切断してＴＫ遺伝子の構造遺伝子領域を除
去し、プラスミドpＴＢ６（ Sasadaら，Cell Structur
e andFunction 12: 205-217,1987)由来ネオマイシン
耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む１kbのBgｌII−Sma
ＩＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドpＮＥＯＥＲ５を
得た。一方、参考例１に記載のプラスミドpＴＢ１１６
４をHind IIIで限定分解し、アルカリフォスファターゼ
処理したのち、５.６kbＤＮＡ断片を分離精製した。こ
のＤＮＡ断片と、前記プラスミドpＮＥＯＥＲ５から分
離精製した１.９kb Hind IIIＤＮＡ断片(ＨＳＶ ＴＫ
遺伝子由来プロモーター領域とポリ［Ａ］付加領域およ
びネオマイシン耐性遺伝子を含む)を混合しＴ４ＤＮＡ
リガーゼ反応で環状化したのち、大腸菌ＤＨ１を形質転
換してアンピシリン耐性コロニーを得た。ミニスクリー
ニング法によって得られたプラスミドの制限酵素による
切断パターンをもとに、pＴＢ１１６４のbＦＧＦ遺伝子
３′非翻訳領域にあるHind III部位に、ＦＧＦ遺伝子と
同方向にネオマイシン耐性遺伝子を含む１.９kb Hind I
IIＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドpＴＢ１１９０を
得た。pＴＢ１１９０は、ＩＬ−２リーダー配列に連結
したbＦＧＦＣＳ２／ＣＮ３−１４６遺伝子が、ＭuＬＶ
ＬＴＲおよびＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの下流に
組み込まれ、かつ、ネオマイシン耐性遺伝子発現用ユニ
ットが同一プラスミド上に存在する動物細胞用発現プラ
スミドである。このようにして得られたプラスミドpＴ
Ｂ１１９０を大腸菌に保持させるため、E. coli ＤＨ１
を形質転換し、形質転換体E. coli ＤＨ１／pＴＢ１１
９０(ＩＦＯ １５０４２，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９４３)
を得た。
マイシン耐性遺伝子を有するプラスミドpＴＢ１１９
０，１１９１，１１９２，１１９３の構築 プラスミドpＴＫ６１（Sasadaら，Cell Structure and
Function １２：２０５−２１７，１９８７）よりチミ
ジンキナーゼ(ＴＫ)遺伝子を含む２kbのＰvuII断片を切
り出し、Hind IIIリンカーを付加してプラスミドpＢＲ
３２２のHind III部位に挿入した。このプラスミドをBg
ｌII−SmaIで切断してＴＫ遺伝子の構造遺伝子領域を除
去し、プラスミドpＴＢ６（ Sasadaら，Cell Structur
e andFunction 12: 205-217,1987)由来ネオマイシン
耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む１kbのBgｌII−Sma
ＩＤＮＡ断片を挿入して、プラスミドpＮＥＯＥＲ５を
得た。一方、参考例１に記載のプラスミドpＴＢ１１６
４をHind IIIで限定分解し、アルカリフォスファターゼ
処理したのち、５.６kbＤＮＡ断片を分離精製した。こ
のＤＮＡ断片と、前記プラスミドpＮＥＯＥＲ５から分
離精製した１.９kb Hind IIIＤＮＡ断片(ＨＳＶ ＴＫ
遺伝子由来プロモーター領域とポリ［Ａ］付加領域およ
びネオマイシン耐性遺伝子を含む)を混合しＴ４ＤＮＡ
リガーゼ反応で環状化したのち、大腸菌ＤＨ１を形質転
換してアンピシリン耐性コロニーを得た。ミニスクリー
ニング法によって得られたプラスミドの制限酵素による
切断パターンをもとに、pＴＢ１１６４のbＦＧＦ遺伝子
３′非翻訳領域にあるHind III部位に、ＦＧＦ遺伝子と
同方向にネオマイシン耐性遺伝子を含む１.９kb Hind I
IIＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドpＴＢ１１９０を
得た。pＴＢ１１９０は、ＩＬ−２リーダー配列に連結
したbＦＧＦＣＳ２／ＣＮ３−１４６遺伝子が、ＭuＬＶ
ＬＴＲおよびＳＶ４０初期遺伝子プロモーターの下流に
組み込まれ、かつ、ネオマイシン耐性遺伝子発現用ユニ
ットが同一プラスミド上に存在する動物細胞用発現プラ
スミドである。このようにして得られたプラスミドpＴ
Ｂ１１９０を大腸菌に保持させるため、E. coli ＤＨ１
を形質転換し、形質転換体E. coli ＤＨ１／pＴＢ１１
９０(ＩＦＯ １５０４２，ＦＥＲＭ ＢＰ−２９４３)
を得た。
【００３８】次に、pＴＢ１１９０をBamHI−ClaＩで切
断して得られた５.３kb ＤＮＡ断片(pＴＢ３２２由来の
複製開始点，アンピシリン耐性遺伝子および上記のＴＫ
プロモーターを付加したネオマイシン耐性遺伝子を含
む)およびClaＩ−PstＩで切断して得られた１.６kb Ｄ
ＮＡ断片(ＭuＬＶ ＬＴＲおよびＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーター領域を含む)と、参考例１に記載したpＴＢ１
１６６をPstＩ−BamHIで切断して得られた０.６kb ＤＮ
Ａ断片を連結して、プラスミドpＴＢ１１９１(ＩＬ−Ｃ
Ｓ２／ＣＮ３−１５５発現用)を構築した。さらに、参
考例１に記載したプラスミドpＴＢ１１７８およびpＴＢ
１１７９を用いて、pＴＢ１１９１の構築と同様の方法
により、pＴＢ１１９２(ＩＬ−ＣＮ２３−１４６発現
用)およびpＴＢ１１９３(ＩＬ−ＣＮ２３−１５５発現
用)をそれぞれ構築した。pＴＢ１１９０およびpＴＢ１
１９１が保持するhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコ
ードするＤＮＡ配列とそれがコードするhbＦＧＦムテイ
ンＣＳ２／ＣＮ３のアミノ酸配列をそれぞれ〔図４〕
(配列表：配列番号１２)および〔図５〕（配列表：配列
番号１３）に示す。pＴＢ１１９２およびpＴＢ１１９３
が保持するhbＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮ
Ａ配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３の
アミノ酸配列をそれぞれ〔図６〕(配列表：配列番号１
４)および〔図７〕（配列表：配列番号１５）に示す。
断して得られた５.３kb ＤＮＡ断片(pＴＢ３２２由来の
複製開始点，アンピシリン耐性遺伝子および上記のＴＫ
プロモーターを付加したネオマイシン耐性遺伝子を含
む)およびClaＩ−PstＩで切断して得られた１.６kb Ｄ
ＮＡ断片(ＭuＬＶ ＬＴＲおよびＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーター領域を含む)と、参考例１に記載したpＴＢ１
１６６をPstＩ−BamHIで切断して得られた０.６kb ＤＮ
Ａ断片を連結して、プラスミドpＴＢ１１９１(ＩＬ−Ｃ
Ｓ２／ＣＮ３−１５５発現用)を構築した。さらに、参
考例１に記載したプラスミドpＴＢ１１７８およびpＴＢ
１１７９を用いて、pＴＢ１１９１の構築と同様の方法
により、pＴＢ１１９２(ＩＬ−ＣＮ２３−１４６発現
用)およびpＴＢ１１９３(ＩＬ−ＣＮ２３−１５５発現
用)をそれぞれ構築した。pＴＢ１１９０およびpＴＢ１
１９１が保持するhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコ
ードするＤＮＡ配列とそれがコードするhbＦＧＦムテイ
ンＣＳ２／ＣＮ３のアミノ酸配列をそれぞれ〔図４〕
(配列表：配列番号１２)および〔図５〕（配列表：配列
番号１３）に示す。pＴＢ１１９２およびpＴＢ１１９３
が保持するhbＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮ
Ａ配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３の
アミノ酸配列をそれぞれ〔図６〕(配列表：配列番号１
４)および〔図７〕（配列表：配列番号１５）に示す。
【００３９】実施例２ ミエローマ細胞への遺伝子の導入 実施例１で得られた発現プラスミドpＴＢ１１９０を用
いてマウスミエローマ細胞Ｓp２／Ｏ−Ａg１４(ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１５８１)を形質転換し、形質転換体マウ
スミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９０を得
た。また同様の方法により、pＴＢ１１９１，pＴＢ１１
９２またはpＴＢ１１９３を用いてマウスミエローマＳp
２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９１，マウスミエローマＳ
p２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９２およびマウスミエロ
ーマＳp２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９３をそれぞれ得
ることができる。マウスミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４
／pＴＢ１１９０を１０％ＦＣＳを含むＤ・ＭＥＭ培地で
培養を行い、late log期の増殖状態のものを次に使用し
た。一方、発現プラスミドＤＮＡは、SalＩ部位などで
一ケ所を切断し、直鎖状のものを使用した。細胞がlate
log状態に達した時、トリプシンおよびＥＤＴＡで処理
することで細胞をシャーレから遊離させ、これを４℃，
１０００rpm ５′遠心し、回収した。沈澱した細胞を氷
冷したＰＢＳに再懸濁し、一部をとって細胞数を計測
し、残りは再び遠心により沈澱として回収した。この細
胞は、計測された細胞数に基づいて１×１０7cells／ｍ
ｌとなるように氷冷したＰＢＳに懸濁した。エレクトロ
ポレーション用ディスポーザブルキュベット(バイオ・
ラッド社製)１本につき０.５ｍｌの細胞懸濁液を入れ、
さらに導入しようとするプラスミドＤＮＡを５μg加
え、軽く撹拌後氷中で５分放置した。これをジーンパル
サー(バイオラッド社)にセットし、１２５μＦＤ，３０
０Ｖの条件で電場を与えた。キュベットを氷中に戻し１
０分間放置し、細胞を１０％ＦＣＳ Ｄ・ＭＥＭ培地で
２０倍に希釈し、０.５ｍｌ／wellとなるよう２４穴リ
ンブロディッシュに播種した。２４時間後、培地に１mg
／ｍｌとなるよう溶かしたＧ４１８(ギブコ)を１wellあ
たり０.５ｍｌづつ加え１〜２週間培養した。この結
果、遺伝子の導入された細胞が得られ、これらについて
培養上清中のＦＧＦムテイン量を測定した。他の形質転
換体についても同様に行なうことができる。
いてマウスミエローマ細胞Ｓp２／Ｏ−Ａg１４(ＡＴＣ
Ｃ ＣＲＬ−１５８１)を形質転換し、形質転換体マウ
スミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９０を得
た。また同様の方法により、pＴＢ１１９１，pＴＢ１１
９２またはpＴＢ１１９３を用いてマウスミエローマＳp
２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９１，マウスミエローマＳ
p２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９２およびマウスミエロ
ーマＳp２／Ｏ−Ａg１４／pＴＢ１１９３をそれぞれ得
ることができる。マウスミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４
／pＴＢ１１９０を１０％ＦＣＳを含むＤ・ＭＥＭ培地で
培養を行い、late log期の増殖状態のものを次に使用し
た。一方、発現プラスミドＤＮＡは、SalＩ部位などで
一ケ所を切断し、直鎖状のものを使用した。細胞がlate
log状態に達した時、トリプシンおよびＥＤＴＡで処理
することで細胞をシャーレから遊離させ、これを４℃，
１０００rpm ５′遠心し、回収した。沈澱した細胞を氷
冷したＰＢＳに再懸濁し、一部をとって細胞数を計測
し、残りは再び遠心により沈澱として回収した。この細
胞は、計測された細胞数に基づいて１×１０7cells／ｍ
ｌとなるように氷冷したＰＢＳに懸濁した。エレクトロ
ポレーション用ディスポーザブルキュベット(バイオ・
ラッド社製)１本につき０.５ｍｌの細胞懸濁液を入れ、
さらに導入しようとするプラスミドＤＮＡを５μg加
え、軽く撹拌後氷中で５分放置した。これをジーンパル
サー(バイオラッド社)にセットし、１２５μＦＤ，３０
０Ｖの条件で電場を与えた。キュベットを氷中に戻し１
０分間放置し、細胞を１０％ＦＣＳ Ｄ・ＭＥＭ培地で
２０倍に希釈し、０.５ｍｌ／wellとなるよう２４穴リ
ンブロディッシュに播種した。２４時間後、培地に１mg
／ｍｌとなるよう溶かしたＧ４１８(ギブコ)を１wellあ
たり０.５ｍｌづつ加え１〜２週間培養した。この結
果、遺伝子の導入された細胞が得られ、これらについて
培養上清中のＦＧＦムテイン量を測定した。他の形質転
換体についても同様に行なうことができる。
【００４０】実施例３ ヒトbＦＧＦムテイン（糖鎖付加型）を産生するマウス
ミエローマ細胞株の樹立 実施例２に記載した方法により、糖鎖付加型ヒトbＦＧ
Ｆムテイン発現用プラスミドpＴＢ１１９０をマウスミ
エローマＳp２／Ｏ−Ａg１４細胞に導入した。得られた
Ｇ４１８（ゲネチシン，ギブコ）１mg／ml耐性細胞を、
リミティングダイリューション法によりクローニングし
た。ミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４細胞の形質転換体で
ある各クローンを２４穴プレートに播種し、８０％コン
フルエントまで増殖させたのち、０.５％牛胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地０.５mlに液替して２日間培養した。
各クローンの培養液について、Mol. Cell. Biol. ８，
５８８(1988)に記載の方法によりＦＧＦ活性を測定した
結果を〔表２〕に示した。
ミエローマ細胞株の樹立 実施例２に記載した方法により、糖鎖付加型ヒトbＦＧ
Ｆムテイン発現用プラスミドpＴＢ１１９０をマウスミ
エローマＳp２／Ｏ−Ａg１４細胞に導入した。得られた
Ｇ４１８（ゲネチシン，ギブコ）１mg／ml耐性細胞を、
リミティングダイリューション法によりクローニングし
た。ミエローマＳp２／Ｏ−Ａg１４細胞の形質転換体で
ある各クローンを２４穴プレートに播種し、８０％コン
フルエントまで増殖させたのち、０.５％牛胎児血清を
含むＤＭＥＭ培地０.５mlに液替して２日間培養した。
各クローンの培養液について、Mol. Cell. Biol. ８，
５８８(1988)に記載の方法によりＦＧＦ活性を測定した
結果を〔表２〕に示した。
【表２】 ──────────────────────────── 培養液中の 形質転換体 ＦＧＦ活性(ng/ml) ──────────────────────────── Ｓp２／Ｏ−1190−12 １.８ Ｓp２／Ｏ−1190−16 ６.２ （IFO 50325,FERM P-12216） ──────────────────────────── Ｓp２／Ｏ−Ａg１４(親株) ＜０.０１ ──────────────────────────── またＦＧＦ活性の検出されたクローン培養液についてウ
エスタンブロッティングをおこなった結果、抗bＦＧＦ
抗体と反応する約２０kdaのバンドが検出され、これら
のクローンは糖鎖付加型bＦＧＦムテインを産生、分泌
していることが確認された。
エスタンブロッティングをおこなった結果、抗bＦＧＦ
抗体と反応する約２０kdaのバンドが検出され、これら
のクローンは糖鎖付加型bＦＧＦムテインを産生、分泌
していることが確認された。
【００４１】
【発明の効果】本発明のリンパ球系動物細胞を宿主とす
る形質転換体は、効率良く少なくとも１個の糖鎖結合部
位を導入したＦＧＦムテインを効率良く生産するので、
工業的大量生産の際に有利である。
る形質転換体は、効率良く少なくとも１個の糖鎖結合部
位を導入したＦＧＦムテインを効率良く生産するので、
工業的大量生産の際に有利である。
【００４２】
配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu 1 5 10 15 Lys Ser Asp Pro 20
【００４３】配列番号：２ 配列の長さ：１４６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 Lys Ser 145
【００４４】配列番号:３ 配列の長さ：１４５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe 1 5 10 15 Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg 20 25 30 Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro 35 40 45 His Val Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile 50 55 60 Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg 65 70 75 80 Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Glu Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg 85 90 95 Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Ser Ser 100 105 110 Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys 115 120 125 Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys 130 135 140 Ser 145
【００４５】配列番号：４ 配列の長さ：１４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Asn Leu Pro Leu Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 1 5 10 15 Ser Asn Gly Gly Tyr Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Lys Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Cys Ala 35 40 45 Glu Ser Ile Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Phe 50 55 60 Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn 65 70 75 80 Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys His Trp Phe Val Gly Leu Lys 100 105 110 Lys Asn Gly Arg Ser Lys Leu Gly Pro Arg Thr His Phe Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140
【００４６】配列番号：５ 配列の長さ：１４０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Phe Asn Leu Pro Pro Gly Asn Tyr Lys Lys Pro Lys Leu Leu Tyr Cys 1 5 10 15 Ser Asn Gly Gly His Phe Leu Arg Ile Leu Pro Asp Gly Thr Val Asp 20 25 30 Gly Thr Arg Asp Arg Ser Asp Gln His Ile Gln Leu Gln Leu Ser Ala 35 40 45 Glu Ser Val Gly Glu Val Tyr Ile Lys Ser Thr Glu Thr Gly Gln Tyr 50 55 60 Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser Gln Thr Pro Asn 65 70 75 80 Glu Glu Cys Leu Phe Leu Glu Arg Leu Glu Glu Asn His Tyr Asn Thr 85 90 95 Tyr Ile Ser Lys Lys His Ala Glu Lys Asn Trp Phe Val Gly Leu Lys 100 105 110 Lys Asn Gly Ser Cys Lys Arg Gly Pro Arg Thr His Tyr Gly Gln Lys 115 120 125 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Leu Pro Val Ser Ser Asp 130 135 140
【００４７】配列番号：６ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： CGTTCTTGCT GTAGAGCCGC T 21
【００４８】配列番号：７ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： AACGATTAGC GCTCACTC 18
【００４９】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： GTAACAGACT TAGAAGCTAG T 21
【００５０】配列番号：９ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： TCGAAGAAGA AAGACTCATC C 21
【００５１】配列番号：１０ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： GTAACATTCT TAGAAGCCAG T 21
【００５２】配列番号：１１ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴：プライマー 配列： CTCGGGCAAG GCGGGACTGT TTGTGACAAG T 31
【００５３】配列番号：１２ 配列の長さ：４４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異を導入したcＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： CCC GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC CAC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC CTG 96 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC 144 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT 192 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA 240 Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 AGA TTA CTG GCT TCT AAG AAT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA 288 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Asn Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC ACC 336 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA TCC 384 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 105 120 125 AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT GCT 432 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 AAG AGC TGA 441 Lys Ser trm 145
【００５４】配列番号：１３ 配列の長さ：４６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異を導入したcＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： ATG GCA GCC GGG AGC ATC ACC ACG CTG CCC GCA TTG CCC GAG GAT GGC 48 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC CAC TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG 96 Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu 20 25 30 TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC CTG CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA 144 Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg 35 40 45 GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT 192 Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu 50 55 60 CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT ATC AAA GGA GTG AGC GCT AAT 240 Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Ser Ala Asn 65 70 75 80 CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA AGA TTA CTG GCT TCT AAG AAT 288 Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Asn 85 90 95 GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC 336 Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr 100 105 110 AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC ACC AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA 384 Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys 115 120 125 CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA TCC AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA 432 Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys 130 135 140 GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT GCT AAG AGC TGA 468 Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser trm 145 150 155
【００５５】配列番号：１４ 配列の長さ：４４１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異を導入したｃＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： CCC GCA TTG CCC GAG GAT GGC GGC AGC GGC GCC TTC CCG CCC GGC CAC 48 Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His 1 5 10 15 TTC AAG GAC CCC AAG CGG CTG TAC TGC AAA AAC GGG GGC TTC TTC CTG 96 Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu 20 25 30 CGC ATC CAC CCC GAC GGC CGA GTT GAC GGG GTC CGG GAG AAG AGC GAC 144 Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp 35 40 45 CCT CAC ATC AAG CTA CAA CTT CAA GCA GAA GAG AGA GGA GTT GTG TCT 192 Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser 50 55 60 ATC AAA GGA GTG AAT GCT ACC CGT TAC CTG GCT ATG AAG GAA GAT GGA 240 Ile Lys Gly Val Asn Ala Thr Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 AGA TTA CTG GCT TCT AAG AAT GTT ACG GAT GAG TGT TTC TTT TTT GAA 288 Arg Leu Leu Ala Ser Lys Asn Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu 85 90 95 CGA TTG GAA TCT AAT AAC TAC AAT ACT TAC CGG TCA AGG AAA TAC ACC 336 Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr 100 105 110 AGT TGG TAT GTG GCA CTG AAA CGA ACT GGG CAG TAT AAA CTT GGA TCC 384 Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser 115 120 125 AAA ACA GGA CCT GGG CAG AAA GCT ATA CTT TTT CTT CCA ATG TCT GCT 432 Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala 130 135 140 AAG AGC TGA 441 Lys Ser trm 145
【００５６】配列番号：１５ 配列の長さ：４６８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：変異を導入したcＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列： ATG GCA GCC GGG AGC ATC ACC ACG CTG CCC GCA TTG CCC GAG GAT GGC 48 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly 1 5 10 15 GGC AGC G
【図１】参考例１で用いられた、プラスミドｐＴＢ１０
０１の構造を示す。
０１の構造を示す。
【図２】実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１１９
０の構築図を示す。
０の構築図を示す。
【図３】実施例１で得られた、プラスミドpＴＢ１１９
１の構築図を示す。
１の構築図を示す。
【図４】実施例１で得られた、pＴＢ１１９０が保持す
るhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコードするＤＮＡ
配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ
３のアミノ酸配列を示す。
るhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコードするＤＮＡ
配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ
３のアミノ酸配列を示す。
【図５】実施例１で得られた、pＴＢ１１９１が保持す
るhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコードするＤＮＡ
配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ
３のアミノ酸配列を示す。
るhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ３をコードするＤＮＡ
配列とそれがコードするhbＦＧＦムテインＣＳ２／ＣＮ
３のアミノ酸配列を示す。
【図６】実施例１で得られたpＴＢ１１９２が保持するh
bＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮＡ配列とそ
れがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３のアミノ酸配
列を示す。
bＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮＡ配列とそ
れがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３のアミノ酸配
列を示す。
【図７】実施例１で得られたpＴＢ１１９３が保持するh
bＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮＡ配列とそ
れがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３のアミノ酸配
列を示す。
bＦＧＦムテインＣＮ２３をコードするＤＮＡ配列とそ
れがコードするhbＦＧＦムテインＣＮ２３のアミノ酸配
列を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (2)
- 【請求項１】少なくとも１個の糖鎖結合部位を導入した
線維芽細胞成長因子(ＦＧＦ)ムテインをコードするＤＮ
Ａを含有するベクターで形質転換したリンパ球系動物細
胞。 - 【請求項２】 請求項１記載のリンパ球系動物細胞を培
地に培養し、培養物中に糖鎖の結合したＦＧＦムテイン
を生成蓄積せしめることを特徴とする当該ムテインの製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3127435A JPH0576356A (ja) | 1990-05-31 | 1991-05-30 | Ｆｇｆムテインの製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2-143388 | 1990-05-31 | ||
| JP14338890 | 1990-05-31 | ||
| JP3127435A JPH0576356A (ja) | 1990-05-31 | 1991-05-30 | Ｆｇｆムテインの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576356A true JPH0576356A (ja) | 1993-03-30 |
Family
ID=26463394
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3127435A Withdrawn JPH0576356A (ja) | 1990-05-31 | 1991-05-30 | Ｆｇｆムテインの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0576356A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001064915A1 (fr) * | 2000-03-02 | 2001-09-07 | Biowindow Gene Development Inc. Shanghai | Nouveau polypeptide, facteur 1-25 analogue au facteur humain de croissance du fibroblaste, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
-
1991
- 1991-05-30 JP JP3127435A patent/JPH0576356A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001064915A1 (fr) * | 2000-03-02 | 2001-09-07 | Biowindow Gene Development Inc. Shanghai | Nouveau polypeptide, facteur 1-25 analogue au facteur humain de croissance du fibroblaste, et polynucleotide codant pour ce polypeptide |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3802292B2 (ja) | 上皮細胞に特異的な成長因子をコードするｄｎａ | |
| EP0640619B2 (en) | Erythropoietin analogs with additional glycosylation sites | |
| EP1961425B1 (en) | Methods and erythropoeitin analogs for the prevention and treatment of anemia | |
| KR100467751B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| KR101229995B1 (ko) | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 | |
| US5491220A (en) | Surface loop structural analogues of fibroblast growth factors | |
| US5559093A (en) | N-terminally truncated hst-1 is a platelet-increasing factor | |
| US7361738B2 (en) | Megakaryocyte stimulating factors | |
| US20110256586A1 (en) | Methods and Compositions for the Prevention and Treatment of Anemia | |
| CA1323317C (en) | Production of fibroblast growth factor | |
| CN101014626A (zh) | 糖基化免疫球蛋白以及含有糖基化免疫球蛋白的免疫粘附素 | |
| US5851990A (en) | bFGF mutein and its production | |
| JPH05306297A (ja) | 新規なハイブリド形質転換成長因子 | |
| US5525708A (en) | Covalent dimer of kit ligand | |
| JPH05178897A (ja) | 機能性ポリペプチド | |
| JP3877226B2 (ja) | ケラチノサイト成長因子の精製法 | |
| US5750371A (en) | Water-soluble mutein of FGF receptor, DNA and production thereof | |
| EP0730651B1 (en) | Surface loop structural analogues of fibroblast growth factors | |
| JP3287869B2 (ja) | ヒト神経成長因子２の製造法 | |
| JPH0576356A (ja) | Ｆｇｆムテインの製造法 | |
| US5464943A (en) | DNA encoding glycosylated FGF and production thereof | |
| Cannon-Carlson et al. | Expression, purification, and characterization of recombinant human interleukin-13 from NS-0 cells | |
| EP0420222A1 (en) | Mutein of acidic FGF, and its production | |
| US5338833A (en) | Carboxy terminal IL-6 muteins | |
| US5360896A (en) | Glycosylated FGF |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19980806 |